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灰色小克银汉霉及其培养方法和菌剂以及应用

阅读：519发布：2020-05-16

专利汇可以提供灰色小克银汉霉及其培养方法和菌剂以及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及微生物领域，具体公开了一株灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)，所述灰色小克银汉霉的保藏编号为CGMCC No.11115。本发明还公开了一种灰色小克银汉霉的培养方法以及含有该灰色小克银汉霉的菌剂。另外，本发明还公开了该灰色小克银汉霉以及菌剂在百菌清降解中的应用。采用本发明提供的灰色小克银汉霉对百菌清污染的土壤进行原位生物修复，不破坏植物生长所需的土壤环境，不会产生二次污染，可原地处理，操作简单，可在短时间内高效降解土壤中的百菌清，降低其在环境中的毒性，达到保护土壤环境，保证食品安全的目的，克服了物理和化学修复方法对土壤原生态系统带来很大干扰，可能引发二次污染，投资成本大的缺点。，下面是灰色小克银汉霉及其培养方法和菌剂以及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一株灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)，其特征在于，所述灰色小克银汉霉的保藏编号为CGMCC No.11115。
2.一种灰色小克银汉霉的培养方法：其特征在于，将权利要求1所述的灰色小克银汉霉接种至以下培养基中进行培养：
含有18-22g/L的葡萄糖和3-7g/L的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基。
3.一种灰色小克银汉霉的培养方法：其特征在于，将权利要求1所述的灰色小克银汉霉接种至PDA固体培养基中进行培养。
4.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的灰色小克银汉霉的菌体作为活性成分。
5.权利要求1所述的灰色小克银汉霉、权利要求4所述的菌剂在降解百菌清中的应用。
6.一种降解百菌清的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的灰色小克银汉霉和/或权利要求4所述的菌剂与含有百菌清的环境接触，以对环境中的百菌清进行降解。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述含有百菌清的环境包括土壤或水体。

说明书全文

灰色小克银汉霉及其培养方法和菌剂以及应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，涉及一株灰色小克银汉霉，具体地，涉及一株具有降解百菌清功能的灰色小克银汉霉，所述灰色小克银汉霉的培养方法，含有所述灰色小克银汉霉作为活性成分的菌剂，以及它们在降解百菌清中的应用。

背景技术

[0002] 百菌清(Chloratholonil)，即四氯间苯二甲腈，是一种高效广谱的芳香族杀菌剂，至今适用于农业生产中已经超过40年。百菌清对由真菌引起的瓜果类经济作物病害有良好的防治效果，且至今无抗药性报导，因此在世界上得到广泛的应用。百菌清除了能防治多种作物的病害外，还可以用作杀螨剂、杀线虫剂、杀藻剂、工业灭霉剂和植物生长调节剂等。在美国年使用量为5000吨，而在中国年产量超过8000吨。尽管百菌清对哺乳动物不是高毒的，但对于鱼类、鸟类和水生无脊椎动物是高毒的。另外，人类接触该农药可以引起皮炎、眼睛和皮肤的严重刺激和胃肠的疾病。百菌清被列为人类潜在的致癌物质。由于广泛使用，在蔬果和自然生态环境中都检测到该农药残留。

[0003] 大量研究表明，微生物降解修复技术投入成本较物理化学方法要低、且具有可行性和高效性，是一项己经获得科研学术界认可的、可操作性强的对环境无二次污染的环境污染物原位修复技术。目前微生物降解修复技术已广泛用于土壤和水体污染治理和工业废水的生物处理，在氯代有机污染物上去除氯原子不仅可以降低微生物降解中遇到的反抗而且可以减少连续降解过程中形成有毒的中间代谢产物，因此脱氯反应对于氯代有机污染物的微生物脱毒显得非常重要。己经报道的百菌清降解研究主要集中在共代谢降解方面，目前不需要外加碳源降解高浓度百菌清研究的还很少。

[0004] 物理法和化学法也可修复百菌清，但物理法修复不彻底，进一步处理困难；化学方法成本较高，不适合于面源污染的修复。微生物是环境中污染物降解的主力军，利用微生物或酶进行污染环境的修复被公认为是一种安全、有效、廉价和无二次污染的方法，具有广阔的应用前景。因此，研究百菌清农药的微生物降解与修复具有重要的意义。

[0005] 生物法修复百菌清即利用原土壤中的土著微生物或向污染环境补充经过驯化的高效微生物，在优化的操作条件下，通过一系列生物反应，将百菌清降解为无毒无害的物质从而修复被污染土壤。因此筛选出一株高效百菌清降解菌株对修复被污染土壤至关重要。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于开发一种对水和土壤中的百菌清具有高效降解性能的微生物菌株，从而能够简单快捷的对环境中的百菌清进行有效的降解。

[0007] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)，所述灰色小克银汉霉的保藏编号为CGMCC No.11115。

[0008] 第二方面，本发明提供了一种灰色小克银汉霉的培养方法，该方法包括将如上所述的灰色小克银汉霉接种至以下培养基中进行培养：

[0009] 含有18-22g/L的葡萄糖和3-7g/L的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。

[0010] 第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的灰色小克银汉霉的菌体作为活性成分。

[0011] 第四方面，本发明提供了如上所述的灰色小克银汉霉和如上所述的菌剂在降解百菌清中的应用。

[0012] 第五方面，本发明提供了一种降解百菌清的方法，该方法包括：将如上所述的灰色小克银汉霉和/或如上所述的菌剂与含有百菌清的环境接触，以对环境中的百菌清进行降解。

[0013] 采用本发明提供的灰色小克银汉霉对百菌清污染的土壤进行原位生物修复，不破坏植物生长所需的土壤环境，不会产生二次污染，可原地处理，操作简单。本发明中的菌株可在短时间内高效降解土壤中的百菌清，降低其在环境中的毒性，达到保护土壤环境，保证食品安全的目的，从而克服了物理和化学修复方法对土壤原生态系统带来很大干扰，可能引发二次污染，投资成本大的缺点，具有较高的经济效益和社会效益。

[0014] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

[0015] 生物保藏

[0016] 本发明的菌株为灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.11115。

具体实施方式

[0017] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0018] 第一方面，本发明提供了一株灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)，其中，所述灰色小克银汉霉的保藏编号为CGMCC No.11115。

[0019] 本发明的灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)分离自安徽宣城百菌清污染大棚土壤。

[0020] 所述分离的方法可以为本领域常规的用于新菌株筛选的方法，例如，土壤环流分离结合稀释平板纯化法。

[0021] 所述土壤环流分离结合稀释平板纯化法例如可以为：

[0022] 将500g采自安徽宣城百菌清污染的大棚土壤置于环流富集装置中，加入2L的真菌液体培养基作为环流液，启动蠕动泵进行富集。富集过程中根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。富集结束后，取下层液体进行平板划线纯化分离。将下层液体分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8倍，吸取适量稀释液涂布于含有50、100、200和300mg/L百菌清的PDA固体培养基上，30℃培养3天后取菌株划线分离。其中，所述真菌液体培养基中含有20g/L的葡萄糖和5g/L的马铃薯粉，pH为6.8-7.0。所述PDA固体培养基即马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基，英文全称为Potato Dextrose Agar Medium。所述PDA固体培养基可以商购获得，例如可以为购自北京奥博星生物技术有限责任公司牌号为02-023的商品。

[0023] 本发明从纯化出的菌株中获得了一株对百菌清耐抗性最强的菌株，并对其进行了DNA提取与鉴定。所述DNA提取可以采用索莱宝真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio fungi DNA kit)，并按照试剂盒中说明书操作以提取该菌株的基因组DNA。

[0024] 鉴定结果显示，该菌株的基因组序列具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，属于毛霉目灰色小克银汉霉，并于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11115。

[0025] 本发明提供的灰色小克银汉霉经过培养能够产生大量的灰色小克银汉霉的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述灰色小克银汉霉增殖即可，例如可以按照0.2-0.5g干重/m3的接种量将灰色小克银汉霉的活菌体接种于真菌液体培养基中，并且在好氧条件下，在28-35℃的温度下培养16-72小时后，得到培养液。

[0026] 本发明可以进一步分离上述培养液中的灰色小克银汉霉的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

[0027] 根据本发明，用于培养灰色小克银汉霉的培养基可以为本领域常规的真菌培养基。但本发明的发明人发现，在含有如下成分的培养基中对灰色小克银汉霉进行培养，能够进一步促进菌体的生长：含有18-22g/L、优选20g/L的葡萄糖和3-7g/L、优选5g/L的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。所述PDA固体培养基和上述相同。

[0028] 本发明的发明人在研究的过程中发现，如上所述的灰色小克银汉霉能够对百菌清农药进行有效的降解，且能够以百菌清为唯一碳源进行生长。

[0029] 第二方面，本发明提供了一种灰色小克银汉霉的培养方法：其中，将如上所述的灰色小克银汉霉接种至以下培养基中进行培养：

[0030] 含有18-22g/L、优选20g/L的葡萄糖和3-7g/L、优选5g/L的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。

[0031] 所述PDA固体培养基如上所述。

[0032] 根据本发明，对所述灰色小克银汉霉进行培养的条件可以为本领域常规对霉菌进行培养的条件，例如，在有氧条件下，培养的温度可以为28-35℃。

[0033] 第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的灰色小克银汉霉(Cunninghamella bertholletiae)的菌体作为活性成分。

[0034] 本发明的发明人在研究过程中发现，本发明提供的上述灰色小克银汉霉的死菌体和活菌体均能够有效的将环境中的百菌清进行降解。因此，如上所述的菌剂中的灰色小克银汉霉的菌体可以为活菌体，也可为死菌体，还可以为活菌体和死菌体的混合菌体，但优选为活菌体。

[0035] 根据本发明，对所述菌剂中所述灰色小克银汉霉的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

[0036] 另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的辅料等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

[0037] 另外，本发明提供的灰色小克银汉霉还可以和其他菌体进行复配制备成混合菌剂，以进一步提高其效率。

[0038] 根据本发明，所述菌剂可以为菌液的形式，也可以为干粉的形式，本领域技术人员可以根据实际的需要自行选择。所述菌液例如可以为使用上述的真菌液体培养基培养所获得的灰色小克银汉霉菌液。所述干粉例如可以为将前述的培养至对数期的灰色小克银汉霉菌液经冷冻干燥后获得的干粉。

[0039] 第四方面，本发明提供了如上所述的灰色小克银汉霉和如上所述的菌剂在降解百菌清中的应用。

[0040] 第五方面，本发明提供了一种降解百菌清的方法，该方法包括：将如上所述的灰色小克银汉霉和/或如上所述的菌剂与含有百菌清的环境接触，以对环境中的百菌清进行降解。

[0041] 本发明优选在所述灰色小克银汉霉能够存活的条件下对环境中的百菌清进行降解。其中，术语“灰色小克银汉霉能够存活”是指在含有百菌清的环境中，至少大于5％，优选至少大于10％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“灰色小克银汉霉能够存活的条件”是指环境中至少包括灰色小克银汉霉能够存活的最基本条件，例如，温度、营养源等，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

[0042] 根据本发明，优选的，为了进一步提高所述灰色小克银汉霉在环境中的生存能力，还可以向需要修复的环境中加入适宜所述灰色小克银汉霉生长的营养源，例如，在本发明的第二方面所提及的培养基。

[0043] 根据本发明，含有百菌清的环境可以包括任何含有百菌清的环境，例如，所述含有百菌清的环境可以包括含有百菌清的土壤或水体。

[0044] 根据本发明，对加入至所述含有百菌清的环境中的灰色小克银汉霉的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述灰色小克银汉霉能够在所述含有百菌清的环境中起作用并且对所述百菌清进行有效降解即可。加入的所述灰色小克银汉霉的形式，例如，可以为菌液的形式，也可以为菌体沉淀的形式，还也可以为干粉的形式。

[0045] 本发明的发明人发现，本发明提供的灰色小克银汉霉对百菌清的降解具有剂量和时间效应，例如，在一定的范围内，对百菌清的降解率会随着所述灰色小克银汉霉浓度的升高或者时间的延长而提高。

[0046] 因此，本发明对加入的灰色小克银汉霉的数量没有特别的限制，这可以根据所述含有百菌清的环境中的百菌清的含量来决定，例如，当所述环境中的百菌清含量较高或所述环境对于所述灰色小克银汉霉的生存较不利时，可以提高所述灰色小克银汉霉的接种量；当所述环境中的百菌清含量较低或所述环境对所述灰色小克银汉霉的生存的影响较小时，可以减少所述灰色小克银汉霉的接种量。

[0047] 根据本发明，当所述含有百菌清的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的灰色小克银汉霉对百菌清的降解效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少30重量％，更优选为40-60重量％。

[0048] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0049] 以下实施例中：

[0050] 真菌液体培养基的配制方法为：取20g葡萄糖和5g马铃薯粉，用去离子水配制成1L的液体培养基，并调节pH至6.8-7.0。

[0051] 无机盐培养基的配制方法为：取1.5g的KH2PO4，0.5g的K2HPO4，1.5g的NH4NO3，0.2g的MgSO4和1g的NaCl，用去离子水配制成1L的溶液，并调节pH至6.0～7.5。

[0052] 百菌清含量的测定方法：

[0053] 水相中，将含有百菌清的液体倒入50mL离心管中，加入10mL石油醚振荡萃取5分钟，再加入10mL石油醚振荡萃取5分钟，静置后取上清液10mL向其中加入无水硫酸钠0.4g，脱水振荡1分钟，之后取4mL于40℃旋转蒸发仪旋转至干，再用2mL色谱纯丙酮溶解再稀释10倍，使用下述的气相色谱条件检测百菌清含量。

[0054] 土壤中，称取5g烘干土，加入体积比例为1:1的丙酮和水10mL，静置30分钟，振荡5分钟后离心取上清液，加入5mL石油醚振荡萃取5分钟，如此重复三次，静置后取上清液10mL向其中加入无水硫酸钠0.4g，脱水振荡1分钟，之后取4mL于40℃旋转蒸发仪旋转至干，再用2mL色谱纯丙酮溶解再稀释10倍，使用下述的气相色谱条件检测百菌清含量。

[0055] 气相色谱条件为：

[0056] 柱子：HT-Pesticides 1；检测器：ECD检测器；进样口温度：260℃；柱温：240℃；检测器温度：280℃；分流比：60；进样量：1μL；尾吹60mL/min；柱压：60kpa；载气流量：1.25mL/min。

[0057] 百菌清的降解率＝(未处理的样本中百菌清的含量-处理后样本中百菌清的含量)/未处理的样本中百菌清的含量×100％

[0058] 制备例

[0059] 将本发明的灰色小克银汉霉在真菌液体培养基中活化2次，所述活化在28-30℃下进行10-12小时，使得菌体浓度达到50g干重/m3，得到活化的灰色小克银汉霉，于4℃保存备用。

[0060] 实施例1

[0061] 本实施例用于说明本发明的灰色小克银汉霉在水体中对百菌清的降解性能。

[0062] 将无机盐液体培养基于121℃灭菌15min，冷却至室温后，向其中添加百菌清农药，使得百菌清的含量达到20mg/L。

[0063] 将真菌液体培养基在115℃下灭菌20min，冷却至室温后，将上述活化的灰色小克银汉霉用灭菌后的真菌液体培养基培养至对数期；然后取对数期培养液，3000r/min下离心5分钟获得灰色小克银汉霉干菌体。

[0064] 称取0.5g干菌体加入10mL上述含百菌清的无机盐液体培养基中，使得灰色小克银汉霉的接种量达到50g干重/m3，然后在170rpm，30±1℃下培养24h后用气相色谱仪检测百菌清的降解率。

[0065] 经检测发现百菌清的降解率为89.25％。

[0066] 实施例2

[0067] 本实施例用于说明本发明的灰色小克银汉霉在土壤中对百菌清的降解性能。

[0068] 将真菌液体培养基在115℃下灭菌20min，冷却至室温后，接入上述活化的灰色小克银汉霉用灭菌后的真菌液体培养基培养至对数期；然后取对数期培养液，3000r/min下离心5min获得灰色小克银汉霉干菌体。

[0069] 将获得的上述干菌体均匀施用于百菌清含量为10mg/kg土壤中，使得土壤中真菌的含量达到9g干重/m3。在土壤表面覆盖多孔地膜，使得土壤温度保持在20-35℃。每周灌溉和翻耕土壤，使得土壤中水份含量保持在40-60重量％。48小时后用气相色谱仪检测百菌清的降解率。

[0070] 经检测发现百菌清的降解率为81.26％。

[0071] 对比例1

[0072] 本对比例用于说明自然状态下百菌清的降解情况。

[0073] 按照实施例1的方法操作，不同的是，不向含百菌清的无机盐液体培养基中加入0.5g干菌体。

[0074] 经检测发现百菌清的降解率为6％。

[0075] 对比例2

[0076] 本对比例用于说明自然状态下百菌清的降解情况。

[0077] 按照实施例2的方法操作，不同的是，不向百菌清含量为10mg/kg土壤中加入干菌体。

[0078] 经检测发现百菌清的降解率为5％。

[0079] 由实施例1和对比例1的比较，以及实施例2和对比例2的比较可以看出，灰色小克银汉霉对土壤和水体中的百菌清有明显的去除效果，可广泛应用于修复含有百菌清污染的环境，对修复土壤和生态环境问题有着重大的意义。

[0080] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0081] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0082] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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