一株多环芳烃高效降解菌及其应用
阅读：281发布：2020-05-12
专利汇可以提供一株多环芳烃高效降解菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 土壤 环境 微 生物 领域，特别是涉及一株多环芳 烃 高效降解菌及其应用。本发明的珊瑚色诺卡氏菌应用在治理多环芳烃污染土壤中，所述珊瑚色诺卡氏菌为珊瑚色诺卡氏菌JY-41 CCTCC M 2019673；还提供一种微生物菌剂及其制备方法，所述微生物菌剂至少包括珊瑚色诺卡氏菌JY-41或其后代。另外提供一种微生物菌剂在治理多环芳烃污染土壤中的方法。本发明的珊瑚色诺卡氏菌及微生物菌剂可弥补传统物理与 化学修复 技术的不足，能降解复杂污染物、修复面广，具有实施成本低、经济环保、操作简单等优点，有利于大规模推广应用。，下面是一株多环芳烃高效降解菌及其应用专利的具体信息内容。
1.珊瑚色诺卡氏菌在治理多环芳烃污染土壤中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述珊瑚色诺卡氏菌为珊瑚色诺卡氏菌JY-41，保藏编号为CCTCC M 2019673。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述珊瑚色诺卡氏菌JY-41含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
4.一种用于治理多环芳烃污染土壤的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂至少包括珊瑚色诺卡氏菌或其后代，所述珊瑚色诺卡氏菌为珊瑚色诺卡氏菌JY-41，保藏编号为CCTCC M 2019673。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还包括糊精、豆粕粉、生物炭中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂对土壤中芘和苯并(a)芘的75天降解率达到73％以上。
7.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
1)将珊瑚色诺卡氏菌JY-41CCTCC M 2019673接种于种子培养基中，培养12～36h；
2)按照珊瑚色诺卡氏菌发酵培养基体积的2～10％接种于发酵培养基中培养；
3)除去水分，获得珊瑚色诺卡氏菌菌体细胞；
4)加入糊精，混合；
5)加入豆粕粉，混合；
6)加入生物炭，混合。
8.根据权利要求7所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，还包括以下条件中的一个或几个：
1)步骤1)中所述珊瑚色诺卡氏菌JY-41 CCTCC M 2019673培养温度为28～32℃；
2)步骤2)中发酵培养基中菌体浓度不小于6.0×107cfu/mL；
3)步骤4)中菌体细胞与糊精质量比为1:0.8～1.5；
4)步骤5)中菌体细胞与豆粕粉质量比为1:10.0～30.0；
5)步骤5)中所述豆粕粉的细度为100目；
6)步骤6)中菌体细胞与生物炭质量比1:20.0～40.0。
9.一种微生物菌剂在治理多环芳烃污染土壤中的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
1)将权利要求4-6任一所述的微生物菌剂加入多环芳烃污染的土壤，用量为土壤质量的1-10％；
2)在土壤中加入营养液，用量为微生物菌剂质量的0.01-0.08％；
3)过程中每天翻动土壤。
10.如权利要求1所述的应用、7-9任一所述的方法，其特征在于，所述多环芳烃选自以下中的一种或多种：萘、菲、蒽、芴、荧蒽、芘、 苯并(a)芘。
一株多环芳烃高效降解菌及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)是有包括两个及两个以上镶嵌在一起的芳香环组成在一起的一大类有机化合物，是一类广泛存在于土壤环境中的持久性有机污染物(Persistent Organic Pollutants,POPs)，已鉴定出的种类有100多种。由于多环芳烃其免疫毒性、遗传毒性和致癌性，美国环保局(USEPA)已经将16种PAHs列为“优先控制污染物”名单中，欧盟、中国等国际组织和国家也将一些PAHs列为优先控制和削减的有机污染物。
[0003] 近年来，由于污水灌溉、化肥及农药施用、农作物秸秆的燃烧、石油开采、石油加工和化石燃料燃烧等，引起的环境PAHs污染日趋严重。同时，由于大气、水等环境中的大部分PAHs通过大气干湿沉降或沉积进入土壤，使土壤成为环境中PAHs主要的储存库。我国多环芳烃土壤环境污染形势非常严峻，尤其在污水灌溉区、市郊及工矿企业周边土壤中受到高浓度PAHs污染。因此，开发高效、安全、经济、环境友好的PAHs污染土壤修复技术，已成为当前环境科学研究亟待解决的问题。
[0004] 多环芳烃污染土壤的修复技术主要包括物理修复、化学修复、植物修复和微生物修复。微生物修复主要是通过土壤中微生物的新陈代谢活动将污染物转化为低毒或无毒的化合物以到达修复土壤的目的，在人为控制的条件下对环境中污染物的分解与去除起到促进作用，最终使土壤恢复原始状态。微生物修复多环芳烃污染土壤具有操作简单、经济适用，不会对环境造成二次污染、适用于低浓度、大面积污染点的治理，成为目前多环芳烃污染修复的研究热点。近年来，国内外研究人员已经发现了多株可以降解多环芳烃的微生物菌株，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、红球菌(Rhodococcus sp.)、硝基黄杆菌(Diaphorobacter sp.)、热带假丝酵母菌(Candida tropicals)、木霉菌(Trichoderma sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、噬氨副球菌(Paracoccus aminovorans)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)等。但是微生物修复也存在一些局限性，如对污染物不能进行全部修复，效果不彻底；针对不同的污染物不同的微生物对其降解效率、降解周期和底物偏好等性质上存在较大；在不同环境中微生物的适应能力不同，降低了修复效果，与实验室降解效果存在差异。因此，获得环境适应性强、降解效能高效稳定的多环芳烃类物质降解菌株、制备环境适应性能力强的微生物菌剂是进行有效的多环芳烃生物降解与环境修复的前提条件。
发明内容
[0005] 鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一株多环芳烃高效降解菌及其应用，用于解决现有技术中的问题。
[0006] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供珊瑚色诺卡氏菌在治理多环芳烃污染土壤中的应用，所述多环芳烃高效降解菌经鉴定为放线菌中的诺卡氏菌属珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline)，所述珊瑚色诺卡氏菌保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种名称为珊瑚色诺卡氏菌JY-41，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期2019年8月28日，保藏号为CCTCC M 2019673。
[0007] 所述珊瑚色诺卡氏菌JY-41含有如SEQ ID NO.1所示的基因序列。
[0008] 本发明第二方面提供一种用于治理多环芳烃污染土壤的微生物菌剂，所述微生物菌剂至少包括珊瑚色诺卡氏菌JY-41或其后代。
[0010] 优选的，所述微生物菌剂对芘和苯并(a)芘的75天降解率达到73％以上。
[0011] 所述75天降解率即为第75天时土壤中多环芳烃相对于第0天的降解率。
[0012] 所述芘和苯并(a)芘的75天降解率通过如下方法检测获得：
[0014] 2)每150g土壤中加入10g微生物菌剂，混合后，于25℃放置；
[0016] [C(终)-C(始)]/C(始)*100％ ①
[0017] 其中，C(终)为经过不同天数培养后检测的芘和苯并(a)芘的浓度之和，C(始)为第0天时芘和苯并(a)芘的浓度之和。
[0018] 75天降解率即C(终)为将第75天的检测浓度代入公式1计算所得的降解率。
[0019] 本发明第三方面提供一种微生物菌剂的制备方法，至少包括以下步骤：
[0020] (1)纯种扩大培养
[0023] 将(1)中获得的种子按照发酵培养基体积的2～10％接种于发酵培养基中培养，珊瑚色诺卡氏菌发酵培养基中菌体浓度不小于6.0×107cfu/mL。
[0024] (3)菌体细胞分离
[0025] 除去水分，获得珊瑚色诺卡氏菌菌体细胞。
[0026] (4)微生物菌剂制备
[0027] 分别按照菌体细胞与糊精质量比1:0.8～1.5加入糊精，混合，形成菌-糊精混合物；按照菌体细胞：豆粕粉质量比1:10.0～30.0加入豆粕粉，混合；按照菌体细胞：生物炭质量比1:20.0～40.0加入生物炭，搅拌，即得微生物菌剂。
[0028] 优选地，步骤1中所述珊瑚色诺卡氏菌JY-41培养温度为28～32℃。
[0029] 优选地，步骤4中所述豆粕粉的细度为100目。
[0030] 本发明第四方面提供一种微生物菌剂在治理多环芳烃污染土壤中的方法，将含珊瑚色诺卡氏菌JY-41或其后代的微生物菌剂加入多环芳烃污染的土壤
[0031] 所述多环芳烃选自以下中的一种或多种：萘、菲、蒽、芴、荧蒽、芘、 苯并(a)芘。
[0032] 优选的，所述微生物菌剂的使用量为土壤质量的1-10％。
[0033] 优选的，再在土壤中加入所用微生物菌剂质量的0.01-0.08％的营养液，营养液配方为：硝酸钠(NaNO3)2.0-2.5g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0-1.5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5-2.0g/L，硫酸镁(MgSO4)0.02-0.06g/L氯化钠(NaCl)0.2-0.5g/L。
[0034] 优选的，在修复过程中每天翻动土壤一次。
[0035] 如上所述，本发明的一株多环芳烃高效降解菌及其应用，具有以下有益效果：
[0036] 1.本发明的复合微生物制剂对芘和苯并(a)芘的75天降解率达到73％以上，对恢复污染环境生态系统具有重要意义。
[0037] 2.大大提高微生物菌剂的作用面积，增强微生物的环境适应能力和污染物去除能力，大大提高土壤修复效果。
[0039] 图1显示为本发明的微生物菌剂对芘去除效果图。
[0040] 图2显示为本发明的微生物菌剂对苯并(a)芘去除效果图。
[0041] 图3显示为本发明的微生物菌剂对PHAs去除效果图。
具体实施方式
[0042] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0043] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0044] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0045] 本发明第一方面提供一株多环芳烃高效降解菌，所述多环芳烃高效降解菌经鉴定为放线菌中的诺卡氏菌属珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline)，所述珊瑚色诺卡氏菌保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种名称为珊瑚色诺卡氏菌JY-41，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期2019年8月28日，保藏号为CCTCC M 2019673。
[0046] 本发明第二方面提供一种微生物菌剂，所述微生物菌剂至少包括珊瑚色诺卡氏菌JY-41或其后代。
[0047] 本发明第三方面提供一种微生物菌剂的制备方法，所述制备方法至少包括以下步骤：
[0048] (1)纯种扩大培养
[0050] (2)液体发酵培养
[0051] 将(1)中获得的珊瑚色诺卡氏菌种子按照发酵培养基体积的2～10％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床150～200rpm转速下，28～32℃培养24～72h后制得菌体浓度不小于6.0×107cfu/mL的珊瑚色诺卡氏菌发酵培养基。
[0052] (3)菌体细胞分离
[0053] 用澄清型碟式离心机离心除去(2)中发酵培养基中水分，获得珊瑚色诺卡氏菌菌体细胞。
[0054] (4)微生物菌剂制备
[0055] 将上述步骤(3)中获得的菌体细胞，分别按照菌体细胞与糊精质量比1:0.8～1.5的比例加入糊精后混合均匀，形成菌-糊精混合物；再按照菌体细胞与豆粕粉质量比1:10.0～30.0的比例加入细度为100目豆粕粉，搅拌混合均匀；最后按照菌体细胞与生物炭质量比1:20.0～40.0的比例加活性炭，搅拌混合均匀，即获得多环芳烃降解微生物复合菌剂。
[0057] 所述氮源选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆粕粉、大豆粉、硫酸铵中的一种或几种，所述氮源的含量为0.5g/100mL～3g/100mL；
[0058] 所述种子培养基的pH优选范围为pH6.5～7.5，此pH范围内微生物生长速度较快、生长状态良好。
[0059] 所述步骤(2)中，所述发酵培养基的组分包括：碳源、氮源、磷酸盐和水。
[0060] 发酵培养基中的碳源选自葡萄糖、甘油、糖蜜中的一种或几种，所述碳源的含量为1.0g/100mL～3.0g/100mL；
[0061] 发酵培养基中的氮源选自酵母膏、玉米浆、大豆粉、豆粕中的一种或几种，氮源的含量为0.5g/100mL～4.0g/100mL；
[0062] 发酵培养基中的磷酸盐的含量为0.01g/100mL～0.1g/100mL，磷酸盐包括：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠；
[0063] 在一实施例中，发酵培养基的配方为：水、糖蜜2.5g/100mL～3.5g/100mL、酵母膏0.2g/100mL～0.5g/100mL、豆粕2.5g/100mL～5.0g/100mL、磷酸氢二钾0.02g/100mL～
0.08g/100mL，pH为5.8～6.8。
0.08g/100mL，pH为5.8～6.8。
[0065] 所述步骤(4)中所述多环芳烃污染土壤含有芴、菲、荧蒽、芘、苯并(a)蒽、苯并(a)芘中的一种或多种多环芳烃类污染物质。
[0066] 本发明第四方面提供一种珊瑚色诺卡氏菌JY-41在治理多环芳烃污染土壤中的应用。
[0067] 所述多环芳烃选自以下中的一种或多种：萘、菲、蒽、芴、荧蒽、芘、 苯并(a)芘。
[0068] 本发明第五方面提供一种微生物菌剂在治理多环芳烃污染土壤中的应用，将上述微生物复合菌剂加入多环芳烃污染的土壤。
[0069] 较佳的，再加入所用微生物菌剂质量的0.01-0.08％的营养液，进行修复多环芳烃土壤。
[0070] 所述营养液配方为：硝酸钠(NaNO3)2.0-2.5g/L，磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0-1.5g/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5-2.0g/L，硫酸镁(MgSO4)0.02-0.06g/L，氯化钠(NaCl)0.2-0.5g/L。
[0071] 较佳的，在修复过程中每天翻动土壤一次以使微生物菌剂在土壤中均匀分布。
[0072] 实施例1、珊瑚色诺卡氏菌JY-41的筛选
[0073] 1.培养基配制方法或配方
[0074] 基础培养基组成：
[0075] KH2PO4 1.0g/L、Na2HPO4 3.0g/L、NH4Cl 4.0g/L、MgS04·7H20 6.5g/L，FeS04·7H20 0.01g/L。
[0076] 选择性无机盐液体培养基：
[0077] 用正己烷将菲和芘分别配置成母液，用0.22μm有机滤膜过滤灭菌后依次加入灭好菌的基础培养基中，使菲和芘的终浓度分别达到200mg/L，均匀摇晃，正己烷挥发后待用。
[0078] 选择性无机盐固体培养基：
[0079] 向基础培养基中加入体积分数为2.0％的琼脂粉，灭菌后冷却至82℃左右，在超净台中依次加入用正己烷配置的菲和芘母液，使菲和芘的终浓度分别达到200mg/L，缓慢摇晃至均勾，铺平板，静置待正己烷挥发后使用。
[0080] 液体种子培养基：
[0081] 酵母提取物5.0g/L、蛋白胨10.0g/L，、NaCI 10.0g/L，灭菌前调节培养基pH至6.8～7.2。
[0082] 摇瓶发酵复筛培养基：
[0083] KH2PO4 1.0g/L、K2HPO4 3.0g/L、NH4Cl 5.0g/L、酵母膏0.5g/L、NaCI 3.0g/L、菲0.2g/L，芘0.2g/L。
[0084] 2.菌种筛选
[0085] (1)菌种富集培养
[0086] 分别取5g上海金山石化厂附近土壤，分别加入含有菲和芘的选择性无机盐液体培养基中，温度为30℃，在180rpm转速下培养144h，肉眼可见微生物明显增长，取5mL作为种子再分别接种到新配制的选择性无机盐液体培养基中，如此进行五次富集培养。
[0087] (2)菌株分离
[0088] 取1mL上述步骤(1)中得到的富集培养物，然后用无菌水进行10倍梯度稀释，取0.2mL梯度稀释液分别涂在含有200mg/L菲和芘的无机盐培养基琼脂平板上，30℃倒置培养
5-8天，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化。最终，从污染土壤中共筛选出7株细菌，这些细菌能够在仅有菲和芘为碳源时进行生长。
5-8天，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化。最终，从污染土壤中共筛选出7株细菌，这些细菌能够在仅有菲和芘为碳源时进行生长。
[0089] (3)液体种子培养：
[0090] 将(2)中筛选得到的7株细菌分别接种于含15mL液体种子培养基的150mL摇瓶中，温度为30℃、150rpm转速下进行培养，60h备用。
[0091] (4)摇瓶发酵复筛
[0092] 取5mL上述(3)中培养好的不同细菌液体种子分别接种于50mL摇瓶发酵复筛培养基中，温度为30℃、180rpm转速下进行培养，每24h取样一次利用HPLC测定菲和芘的降解情况，按照公式计算最终得到一株对菲和芘降解能力最强的菌株编号为JY-41。
[0093] 采用HPLC法分析多环芳烃的方法如下：
[0094] 样品制备：将10g样品放在三角瓶中，并加入50mL 1∶1体积混合的正己烷和丙酮，利用超声波对其进行过滤和提取，时间为30min，次数共为3次，最后将提取液相互合并，使用10g的无水硫酸钠进行30min的脱水处理，利用旋转薄膜蒸发仪将其浓缩到1mL。加入20mL的正己烷，再进行浓缩处理，最终数量为2mL。将浓缩完毕的样品放置到SPE Florisil小柱(品牌：Merck)，并将流速控制在1.0mL/min，利用丙酮和正己烷对其进行洗脱，对液体进行氮吹处理，并在其中加入1mL的乙腈，充分吹氮2次，最终将其进行过滤处理，放在小瓶上供HPLC检测。
[0095] 色谱条件：色谱柱为Agilent Li Chrospher PAH色谱柱(250mmx4.6 mm,0.45μm)；进样量为10～20μL；柱温为25℃；流速为0.8ml/min；流动相为水和乙腈，采用梯度洗脱程序。以保留时间对各PAHs单体定性，荧光检测器谱图峰面积定量计算不同多环芳烃污染物含量，并以DAD二级管阵列检测器对比跟踪。根据公式②计算多环芳烃的降解率，[0096] [c(终)-c(始)]/c(始)*100％ ②
[0097] 其中，c(终)为经过不同时间培养后检测的各多环芳烃浓度之和，c(始)为初始时各多环芳烃的浓度之和。
[0098] 实施例2：菌株的分子生物学鉴定
[0099] 菌株鉴定采用16S rDNA序列比对法。
[0100] 首先利用天根公司基因组提取试剂盒提取菌株JY-41的总DNA，利用一对细菌通用引物扩增菌株的16S rDNA基因。上游引物为8f(5`-AGTTTGATCCTGGCTCA-3`)，下游引物为1492r(5`-GGTTACCTTGTTACGACTT-3`)。PCR反应体系(50μl)为：模板DNA 2μl，PCR Taqmix
25μl，上下游引物各1.5μl，DMSO 2μl，加ddH2O至反应体系为50μl。
25μl，上下游引物各1.5μl，DMSO 2μl，加ddH2O至反应体系为50μl。
[0101] PCR程序为：95℃预变性4min，94℃变性1min，58℃退火1min，循环30次，72℃延伸7min，PCR反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测后送生工生物工程(上海)有限公司进行测序分析。将测序结果在Genbank中用Blast进行同源性比较，得到与相关菌株的16S rRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明JY-41菌株与珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline)的16S rRNA基因序列的同源性在99％以上，JY-41菌株被鉴定为珊瑚色诺卡氏菌(Nocardia coralline)。
[0102] 实施例3：微生物菌剂制备
[0103] 1.种子制备
[0104] 配制种子培养基(葡萄糖1.5g/100mL、酵母膏1.0g/100mL、玉米浆1g/100mL、水，调pH为7.0)，将珊瑚色诺卡氏菌JY-41接种于上述种子培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养24h，即得适于接种的种子。
[0105] 2.液体发酵培养
[0106] 配制发酵培养基(糖蜜3g/100mL，酵母膏0.5g/100mL，豆粕3.5g/100mL，磷酸氢二钾0.05g/100mL，pH为6.5)，将(1)中获得的珊瑚色诺卡氏菌种子按照发酵培养基体积的5％接种于发酵培养基中，在旋转式摇床180rpm转速下，30℃培养48h后，制得菌体浓度为9.0×107cfu/mL的珊瑚色诺卡氏菌发酵培养基。
[0107] 3.菌体细胞分离
[0108] 用澄清型碟式离心机离心除去(2)中发酵培养基中水分，获得珊瑚色诺卡氏菌菌体细胞。
[0109] 4.微生物菌剂制备
[0110] 1)将上述步骤(3)中获得的菌体细胞，分别按照菌体细胞与糊精质量比1：1.2的比例加入糊精后混合均匀，形成菌-糊精混合物；
[0111] 2)按照菌体细胞：豆粕粉质量比1:25.0的比例加入细度为100目豆粕粉，搅拌混合均匀；
[0112] 3)按照菌体细胞：生物炭质量比1:30.0的比例加活性炭，搅拌混合均匀，即获得多环芳烃降解微生物复合菌剂。
[0113] 上述步骤3)中，生物炭的制备方法为：350～450℃热解玉米秸秆8小时，粉碎过120～150目筛即可。
[0114] 实施例4：微生物菌剂多环芳烃污染土壤修复
[0115] 取清洁土壤经自然风干后，剔除石块、树枝等杂质，过2mm筛。称取150g过筛后的土壤分装于培养瓶中，121℃高温灭菌30min，冷却后每瓶分别定量加入芘和苯并(a)芘的丙酮溶液，使芘和苯并(a)芘的初始浓度分别为10mg/kg，置于通风橱内。待丙酮溶剂挥发后，向培养瓶中加入10g微生物菌剂，混合均匀后，于室温(25℃)放置。定期补加无菌水，保持土壤含水量为25％～30％(质量分数)，分别在0d,15d，30d,45d,60d和75d取样按照实施例1中HPLC检测方法测定，根据公式2计算土壤中芘和苯并(a)芘的降解率。
[0116] 结果表明：在第75d未添加微生物菌剂的PHAs土壤中芘和苯并(a)芘的降解率分别为10.2％和11％，添加微生物菌剂的PHAs土壤中芘和苯并(a)芘的降解率分别达到了为74.5％和73.5％(分别如图1和图2所示)。
[0117] 实施例5：微生物菌剂多环芳烃污染土壤修复
[0118] 污染土样取自上海金山某化工厂，挖取生产车间附近一片空地的表层10cm左右的土样，采回后将土样混拌均匀，土壤样品中PAHs(萘、菲、蒽、芴、荧蒽、芘、 苯并(a)芘)总量为8.683mg.kg-1。称取10kg过筛后的土壤样品加入800g微生物菌剂，以不加微生物菌剂作为对照，混合均匀后，于室温(25℃)放置。定期补加无菌水，保持土壤含水量为25％～30％(质量分数)，分别在30d,60d,90d和120d取样按照实施例1中HPLC检测方法测定，并根据公式2计算土壤中总PAHs降解率。
[0119] 结果表明：在第75d未添加微生物菌剂的污染土壤中PHAs的降解率仅为8.5％，在第75d添加微生物菌剂土壤中PHA的降解率达到了88.4％。
[0120] 本发明提供的珊瑚色诺卡氏菌CCTCC M 2019673，对芘和苯并(a)芘的75天降解率可以达到73％以上，恢复污染环境生态系统具有重要意义。
[0121] 本发明根据微生物菌剂在修复土壤有机污染技术存在微生物菌株环境适性差的问题，在微生物菌剂制备过程中加入环糊精、豆粕和生物炭，可大大提高微生物的菌剂的作用面积，增强微生物的环境适应能力和污染物去除能力，大大提高土壤修复效果。
[0122] 本发明可弥补传统的物理与化学修复技术的不足，能降解复杂污染物、修复面广，具有修复治理效果好、成本低、经济环保、操作简单等优点，有利于大规模推广应用。
[0123] 以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
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