바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법 및 이에 의해 제조된 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자{manufacturing method of micro-beads for bioassay and micro-beads for bioassay thereby}

본 발명은 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자에 관한 것으로서, 마스크 패터닝 공정과 스팟팅 및 임프린팅 공정을 이용하여 바이오 어세이용 마이크로 입자의 제조가 가능하며, 특히 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않아, 실시간 PCR 적용이 가능한 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법 및 이에 의해 제조된 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자에 관한 것이다.

분자진단 시스템은 전자공학, 물리학, 화학, 생물학, 재료공학, IT, NT 등 과학기술 전반에 걸친 차세대 융합기술로, 질병의 진단과 치료를 위한 혁신적인 기술로 각광받고 있다.

특히, 분자진단 시스템의 대표적인 분야 중 하나인 바이오칩은, 유리, 실리콘, 고분자와 같은 기질 상에 DNA, 단백질 등의 생분자 프로브(probe)를 고밀도로 부착시켜, 상기 프로브와 시료 내 표적(target) 물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출하여, 극미량의 시료를 초고속으로 분석하는데 유용하게 사용되고 있다.

이에 의해 유전자 발현 및 반응 양상, 유전자 결함, 단백질 분포 등의 유전자 정보를 분석해내어, 궁극적으로 인간의 질병의 진단과 치료에 활용될 뿐만 아니라, 신약개발, 시약진단 등에 활용될 수 있도록 하는 것이다.

이러한 바이오칩은 프로브의 종류에 따라 DNA칩이나 단백질칩 등으로 나누고, 프로브의 부착형태에 따라 고체 기질 상에 부착된 마이크로어레이칩과 미세유체채널 상에 부착된 미세유체칩으로 나눌 수 있다.

특히, 상기 바이오칩을 이용하여 DNA, RNA, 단백질 등을 동시에 정량함으로써, 분석시간을 줄이고, 적은 비용으로 다양한 정보를 얻는 것, 즉, 다중(multiplexing) 분석 기술에 대한 연구가 활발하다. 또한, 극미량 시료를 이용한 분석을 통한 비용절감에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다.

일반적으로, 상기 프로브와 시료 내 표적(target) 물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출할 때, 검출 분자에 대한 선택적 혼성화 여부를 검출하기 위하여, 연구자들이 직접 측정 가능한 신호를 얻기 위한 형광 물질, 방사성 물질, 자기입자 등의 표지 물질을 사용하게 된다.

그러나, 이러한 표지 물질은 일반적으로 가격이 비싸기 때문에 극미량 분석을 통한 비용절감에 대한 연구자들의 관심은, 극미량 시료를 이용하면서 동시에 여러가지 정보를 얻을 수 있는 다중 분석 기술에 집중되고 있다.

이러한 다중 분석 기술 중 하나로, 평면 마이크로어레이(positional microarray)에 의한 것으로, X, Y 좌표에 특정한 생체 프로브 또는 코드 영역을 형성하여 유전자 정보를 분석하는 것이 있으며, 이는 초고밀도 분석에 용이한 장점이 있다.

또한, 다중 분석 기술로, 서스펜션어레이(suspension array)에 의한 것으로, 각각 다른 방출색(emission colors)을 발현하는 다양한 염색액( 또는 형광물질)에 의한 칼라 코딩(color coding) 방식에 의한 것으로 많은 양의 샘플을 처리할 수 있는 장점이 있다.

그러나, 상기의 평면 마이크로어레이 기술이나 칼라 코딩 방식은 그 재현성(reproducing)이 떨어지며, 실시간 PCR 분석이 용이하지 않아, 정확한 유전자 정보의 인식과 정량이 어려운 단점이 있다. 또한, 표지 물질에 따른 검출 신호 측정방법이나, 검출기의 방향, 감도 등에 따라서, 검출 정보 간의 간섭과 교란 등에 의해 유전자 정보에 대한 검출 정보가 부정확하여, 극미량의 시료를 이용한 고감도의 검출을 위한 방안으로는 부족한 면이 있다.

또한, 다중 분석 기술로, 입자 기반의 진단에 대한 기술이 나와 있으며, 크기가 작은 입자를 이용할 경우 반응 표면적을 넓힐 수 있어 반응성을 높일 수 있으며, 각 입자들을 각기 다른 타겟의 플랫폼으로 이용하여 적은 시료를 가지고도 다양한 어세이를 진행할 수 있는 장점이 있다.

이러한 입자 기반의 진단 기술로, 대한민국특허청 공개특허공보 공개번호 10-2009-0091117호 "고성능 분석을 위한 다중기능성 인코딩된 입자"는, 마이크로 유동 채널을 따라서 형광 표지된 모노머를 흘려보내고, 인접된 다른 마이크로 유동 채널을 따라서 프로브-리드오프 모노머를 흘려보낸 후, 이들을 중합하여 포토마스크를 통하여 전달된 자외선에 노출시켜 코드 영역과 프로브 영역을 보유하는 입자를 형성하도록 하는 것이다.

그러나, 상기 기술은 프로브 영역과 코드 영역이 분리되어 있어서, 인식과 정량의 구분이 용이하지 않으며, 포토마스크 및 렌즈를 이용하여야 하므로, 해상도가 떨어져, 분해능(resolution)에 한계가 있어 정밀한 코드 영역의 형성이 용이하지 않은 단점이 있다.

또한, 상기의 방법은 마이크로 유체 채널을 따라 단속적으로 포토마스크에 의해 프로브 영역 및 코드 영역을 보유하는 입자를 형성하게 되므로, 마이크로 유체 채널을 따라 포토리소그래피 공정에 의해 생성된 입자 사이에 재료의 손실이 발생하게 되어 비경제적인 문제점이 있다.

또한, 상기의 방법에 의해 제조된 입자는 실시간 PCR 구현이 불가능하여, 유전자 정보에 대한 정확한 정량 및 인식이 불가능한 단점이 있다.

최근에는 본 발명자가 출원한 기술로써, "패턴이 입력된 인코더를 포함하는 바이오 어세이용 마이크로 구조체"에 대한 기술이 있다. 이는 바이오 어세이에서 각 마이크로 구조체를 구분하는데 특정 패턴으로 제공하는 인코더를 포함하는 바이오 어세이용 마이크로 구조체에 관한 것으로서, 종래의 형광으로 인해 발생하는 교란없이 마이크로 구조체의 정보를 용이하게 식별하고 판독할 수 있도록 하였으며, 원하는 패턴을 다양하게 형성하여 동시에 여러 종류의 표적 핵산을 실시간으로 모니터링 또는 검출이 가능하여 극미량의 시료를 이용한 정보의 검출이 가능한 장점이 있다.

상기 종래 기술은 마이크로 구조체의 형상이 입자 형태로 형성된 것으로, 일반적으로 외부에서 인코더의 패턴을 판독할 수 있도록 투명한 재질의 구형 형태로 제조된 것으로서, 마이크로 구조체의 수직방향 위쪽에서 인코더에 입력된 패턴을 인식할 수 있도록 인코더와 매트릭스를 구성하는 물질 간의 밀도차를 이용하여, 인코더의 패턴이 항상 X축 방향으로 평행하게 위치될 수 있도록 한 것이다.

상기 마이크로 구조체의 제조방법은, X축 방향으로의 인코더 패턴의 배열을 위해서 밀도가 다른 인코더 물질을 준비하고, 실리콘 기판 등에 인코더 형성을 위한 패턴 공정을 수행한 후, 마이크로 유체 채널을 별도로 제작하여 플로우-포커싱(flow-focusing) 방법으로 액적(droplet) 형태의 구조체를 형성하여 경화함으로써, 인코더가 포함된 마이크로 구조체를 제조하는 것이다.

그러나, 상기의 제조방법은 인코더 패턴을 형성한 후, 또 다시 이를 포함하는 마이크로 구조체를 제작하는 등 그 제조방법이 복잡하고 까다로우며, 매트릭스 물질과 인코더 물질과의 밀도차를 이용한다 하더라도, 패턴에 따라 인코더 물질의 밀도가 방향에 따라 달라질 수 있어 무게중심이 다르게 형성될 수 있으므로, 인코더 패턴이 항상 X축 방향으로 평행하게 배치되지 않을 수도 있다.

이러한 점은 상술한 바와 같이, 표지 물질에 따른 검출 신호 측정방법이나, 검출기의 방향, 감도 등에 따라서, 검출 정보가 부정확할 가능성이 있어, 실험의 재현성이 떨어지며, 극미량의 시료를 이용한 고감도의 검출을 위한 방안으로는 미흡한 문제가 있다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 마스크 패터닝 공정과 스팟팅 및 임프린팅 공정을 이용하여 바이오 어세이용 마이크로 입자의 제조가 가능하며, 특히 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않아, 실시간 PCR 적용이 가능한 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법 및 이에 의해 제조된 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제공을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 기판 상에 감광수지층을 형성하고, 마스크 패터닝 공정에 의해 감광수지로 이루어진 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드를 제작하는 제1단계와, 상기 제1몰드 상에 임프린트 레진층을 형성하고, 임프린팅 공정에 의해 임프린트 레진으로 이루어져 음각 인코더 패턴이 형성된 마스터 몰드를 제작하는 제2단계와, 상기 마스터 몰드에 형성된 음각 인코더 패턴 영역 상에 바이오 어세이용 용액을 스팟팅(spotting)하여 액적(droplet)을 형성하는 제3단계 및 상기 마스터 몰드 상에 형성된 액적을 경화한 후, 상기 마스터 몰드 상에서 이를 분리하여, 바닥면에 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자를 형성하는 제4단계;를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법 및 이에 의해 제조된 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자를 그 기술적 요지로 한다.

또한, 상기 제2단계 후에, 상기 마스터 몰드에서 음각 인코더 패턴 영역의 표면을 친수성 처리하거나, 상기 마스터 몰드에서 음각 인코더 패턴 영역을 제외한 영역의 표면을 소수성 처리하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제3단계의 액적(droplet)은, 바닥면이 평편한 입체적 형상을 띄는 것이 바람직하며, 상기 제3단계의 액적(droplet)은, 반구형 또는 반타원형으로 형성되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 제4단계의 상기 마이크로 입자 내에 기공을 더 형성하는 것이 바람직하며, 상기 제4단계의 마이크로 입자의 인코더 패턴 상에 불투명한 금속층 또는 감광수지층의 배열을 더 형성하는 것이 바람직하다.

본 발명은 마스크 패터닝 공정과 스팟팅 및 임프린팅 공정을 이용하여, 동일한 기질 내에 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않고 중첩적으로 형성된 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자를 제공하여, 실시간 PCR 적용이 가능하여 유전자 정보 분석에 대한 정확한 정량 및 인식이 가능한 효과가 있다.

또한, 마스크 패터닝 공정에 의해 인코더 패턴의 정밀성(5㎛ 이하)이 보장되고, 10 ⁹ 개 이상의 인코딩이 가능하여 극미세 시료의 다양한 정보 검출이 가능하며, 마스터 몰더에 형성된 음각 인코더 패턴 상에만 스팟팅 공정에 의해 액적이 형성되므로, 프로브 재료의 낭비를 줄일 수 있어 비용이 절감되는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 마이크로 입자는 바닥면이 평편한 형태로 형성되어, 패턴화된 인코더 영역이 바닥면에 대해 항상 수평을 향하도록 형성되어, 일정 방향으로의 인코더의 고정화가 가능하여, 검출 정보의 정확성을 보장할 수 있으며, 극미량의 시료를 이용하더라도 고감도의 검출이 가능하는 등 실험의 재현성을 향상시키는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 표지 물질의 사용여부, 종류에 상관없이 일반 CCD 카메라로도 인코더 패턴에 대한 명암, 농도 변화로부터 표적 물질과의 혼성화 여부를 검출할 수 있어, 실험이 용이하며, 표지 물질 사용에 대한 비용을 절감할 수 있는 효과가 있다.

도 1 - 본 발명에 따른 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법에 대한 모식도.
도 2 - 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드 상에 형성된 액적에 대한 측면 사진을 나타낸 도.
도 3 - 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드에 대한 사진(a), 마이크로 입자에 대한 사진(b),(c),(d)을 나타낸 도.
도 4 - 본 발명의 다양한 실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 사진을 나타낸 도.
도 5 - 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 PCR 이후의 BF 이미지(a), PCR 이전과 이후의 형광(fluorescence) 이미지(b),(c)를 나타낸 도.
도 6 - 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 복합 구조체를 이루는 마이크로 입자에 대한 모식도((a)단면, (b)저면도)를 나타낸 도.

본 발명은 바이오 어세이 특히, DNA, RNA, 단백질 등을 동시에 정량 및 인식함으로써, 분석시간을 줄이고, 적은 비용으로 다양한 정보를 얻을 수 있는 다중(multiplexing) 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자에 관한 것으로, 마스크 패터닝 공정과 스팟팅 및 임프린팅 공정을 이용하여, 동일한 기질 내에 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않고 중첩적으로 형성된 것을 특징으로 하는 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자를 제공하고자 하는 것이다.

이에 의해 본 발명은 종래 기술에 비해 간단하고 경제적인 방법으로 바이오 어세이용 마이크로 입자의 제조가 가능하며, 특히 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않아, 실시간 PCR 적용이 가능하여 유전자 정보 분석에 대한 정확한 정량 및 인식이 가능한 장점이 있다.

이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 대해 상세히 설명하고자 한다. 도 1은 본 발명에 따른 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법에 대한 모식도를 나타낸 것이고, 도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드 상에 형성된 액적에 대한 측면 사진을 나타낸 것이고, 도 3은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드에 대한 사진(a), 액적에 대한 사진(b), 마이크로 입자에 대한 사진(c),(d)을 나타낸 것이고, 도 4는 다양한 실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 사진을 나타낸 것이고, 도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 PCR 이후의 BF 이미지(a), PCR 이전과 이후의 형광(fluorescence) 이미지(b),(c)를 나타낸 것이며, 도 6은 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 복합 구조체를 이루는 마이크로 입자에 대한 모식도((a)단면도, (b)저면도))를 나타낸 것이다.

도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법은 기판 상에 감광수지층을 형성하고, 마스크 패터닝 공정에 의해 감광수지로 이루어진 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드를 제작하는 제1단계와, 상기 제1몰드 상에 임프린트 레진층을 형성하고, 임프린팅 공정에 의해 임프린트 레진으로 이루어져 음각 인코더 패턴이 형성된 마스터 몰드를 제작하는 제2단계와, 상기 마스터 몰드에 형성된 음각 인코더 패턴 상에 바이오 어세이용 용액을 스팟팅(spotting)하여 액적(droplet)을 형성하는 제3단계 및 상기 마스터 몰드 상에 형성된 액적을 경화한 후, 상기 마스터 몰드 상에서 이를 분리하여, 바닥면에 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자를 형성하는 제4단계를 포함하여 이루어진다.

본 발명에서의 마이크로 입자는, 바이오 어세이에서 표적 핵산을 검출하고 분석하기 위한 장치에 사용되는 것으로서, 나노(10 ^-6 ), 마이크로(10 ^-3 ), 밀리(10 ^-2 ) 등의 미소 크기의 입자를 모두 포함하는 개념이며, 표적 핵산 또는 이와 반응하는 고정 프라이머의 양에 대한 정보 즉, 바이오 어세이 정보를 정량 검출하기 위한 프로브 영역과, 종류를 인식하기 위한 인코더 영역으로 이루어진다.

본 발명에 따른 바이오 어세이를 위한 마이크로 입자의 제조방법은, 먼저, 기판 상에 감광수지층을 형성하고, 마스크 패터닝 공정에 의해 감광수지로 이루어진 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드를 제작하는 것이다(제1단계, (가)단계).

상기 기판은 금속, 실리콘, 유리 및 폴리머 등과 같이 평면기판으로 사용할 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 무방하며, 형성될 인코더 패턴의 크기 및 갯수에 따라 적당한 면적의 기판을 준비한다.

그리고, 상기 기판 상에는 인코더 패턴을 형성하기 위해서 감광수지층을 코팅하여 형성하며, 감광수지층의 두께는 인코더 패턴의 오목부의 깊이를 고려하여 형성한다.

상기 감광수지층은 포토리소그래피에 의한 마스크 패터닝 공정에 사용할 수 있는 수지라면 어떠한 수지도 사용할 수 있으며, 방사선 경화형 에폭시 아크릴레이트, 우레탄 아크릴레이트, 폴리에스터 아크릴레이트 및 굴절율을 조절한 치환체 등을 사용할 수 있고, SU-6, SU-7, SU-8 등을 사용할 수 있다.

기판 상에 상기 감광수지층을 형성하고 나서, 인코더 패턴이 미리 그려져 있는 마스크를 이용해 선택적으로 노광 후, 현상 공정을 거쳐 노광 공정에 의해 경화되지 않은 감광수지 부분은 제거하고, 경화된 감광수지만 남아 이루어진 양각 인코더 패턴을 형성한다.

여기에서 양각 인코더 패턴이라 함은 최종 인코더 패턴에 대응되는 패턴을 말하는 것으로서, 후술할 마스터 몰드에 의해 최종 인코더 패턴이 형성되게 되므로, 이와는 반대의 상을 가지는 것을 양각 인코더 패턴이라고 한다.

이와 같이 마스크 패터닝 공정에 의해 감광수지로 이루어진 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드를 완성하게 되며, 인코더 패턴의 정밀성(5㎛ 이하)이 보장되고, 10 ⁹ 개 이상의 인코딩이 가능하며, 후술할 공정에서 마스터 몰더에 형성된 음각 인코더 패턴 상에만 스팟팅 공정에 의해 액적이 형성되므로, 프로브 재료의 낭비를 줄일 수 있어 비용을 절감시킬 수 있다.

그 다음, 상기 제1몰드 상에 임프린트 레진층을 형성하고, 임프린팅 공정에 의해 임프린트 레진으로 이루어져 음각 인코더 패턴이 형성된 마스터 몰드를 제작하게 된다(제2단계, (나)단계).

상기 임프린트 레진층은 임프린트 레진을 상기 제1몰드 상에 부어 롤러 등으로 압착하여 상기 제1몰드의 음각 인코더 패턴이 상기 임프린트 레진층에 임프린트되도록 하는 것이다.

그리고, 임프린팅 후 상기 임프린트 레진층을 광경화시켜 임프린트 레진으로 이루어진 패턴이 고정되도록 하며, 이를 필오프하면 상기 임프린트 레진으로 이루어져 음각 인코더 패턴(상기 제1몰드의 양각 인코더 패턴에 대응되는 패턴)이 형성된 마스터 몰드가 완성된다.

이러한 광경화를 위해서는 광경화형 수지를 임프린트 레진층에 사용하며, 상기 임프린트 레진층에 사용되는 광경화형 수지는 상기 감광수지층에 사용되는 수지와 동일한 것을 사용하거나, 더욱 구체적으로는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 용액과 경화제를 혼합한 프레-폴리머 등을 사용한다.

한편, 상기 마스터 몰드에서 음각 인코더 패턴 영역의 표면을 친수성 처리하거나, 상기 마스터 몰드에서 음각 인코더 패턴 영역을 제외한 영역의 표면을 소수성 처리하는 것이 바람직하다.

이는 음각 인코더 패턴 영역 상에는 친수성 처리를 하거나, 스팟팅되지 않는 음각 인코더 패턴 영역 이외의 영역은 소수성 처리를 수행하여, 후술할 바이오 어세이용 용액이 스팟팅되어 형성되므로, 스팟팅될 영역을 정확하게 설정해주는 역할을 하게 되므로, 스팟팅 장치의 정밀한 제어없이도 용이하게 액적의 형성이 가능하도록 한 것이다.

일반적으로 친수성 처리는 상기 음각 인코더 패턴 영역 상에 마스크를 이용하여, SOG, TEOS, LTO, 실리콘옥사이드, 티타늄옥사이드, 알루미늄옥사이드와 같은 옥사이드 계열 물질 중의 적어도 어느 하나를 포함하여 산화막층을 형성하며, 소수성 처리는 음각 인코더 패턴 영역 이외의 영역에 마스크를 이용하여 소수성물질의 증착, 소수성물질의 코팅, 실라나이징 처리 및 플라즈마 처리 중 어느 하나의 방법에 의해 구현되도록 한다.

그 다음, 상기 마스터 몰드에 형성된 음각 인코더 패턴 상에 바이오 어세이용 용액을 스팟팅(spotting)하여 액적(droplet)을 형성한다(제3단계, (다)단계).

즉, 마스터 몰드에서 음각 인코더 패턴이 형성된 영역 상에만 바이오 어세이용 용액을 스팟팅하여 액적을 형성하게 되므로, 바이오 어세이용 용액(즉, 프로브 재료)의 낭비를 줄일 수 있게 된다.

상기 바이오 어세이용 용액은, 외부에서 인코더 패턴을 판독할 수 있는 투명한 재료로 형성된 것으로서, 폴리에틸렌 글리콜-디아크릴레이트(Polyethylene Glycol-Diacrylate, PEG-DA), 폴리아크릴아마이드(Polyacrylamide, PA) 및 아가로스(agarose) 중 하나 이상의 폴리머로 이루어질 수 있다.

또한, 상기 폴리머 이외에 중합효소 연쇄반응(PCR) 프라이머, 표적 핵산과 상보적으로 결합하여 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 시아닌(cyanine) 계열의 염색약, EtBr, TaqMan ^TM probe, 올리고핵산 프로브(oligo-nucleotide probe; Molecular Beacon probe) 등을 예로 들 수 있는 형광표식인자 등을 더 포함할 수 있다.

이와 같이 바이오 어세이용 용액은 본 발명에 따른 마이크로 입자의 기질(matrix)로 작용하게 되며, 기질 자체의 종류를 달리하거나, 기질에 포함되는 프라이머나 프로브 등을 달리 형성하여, 동시에 여러 종류의 표적 핵산 또는 이와 반응하는 고정된 프라이머의 종류, 크기 또는 양에 대한 정보의 검출이 가능하도록 한다.

또한, 상기 액적의 모양은 마스터 몰드 상에 스팟팅(spotting)되므로, 바닥면이 평편한 입체적 형상을 띄게 되며, 구체적으로는 반구형 또는 반타원형 등으로 형성되게 된다.

여기에서, 상기 스팟팅은 솔레노이드 밸브 등으로 미세 제어가 가능한 스팟팅 장치를 이용하며, 스팟팅 시간과 유량을 제어함으로써, 액적의 크기를 제어할 수 있다.

다음으로, 상기 마스터 몰드 상에 형성된 액적을 경화한 후, 상기 마스터 몰드 상에서 이를 분리(releasing)하여, 바닥면에 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자를 형성하게 된다(제4단계).

상기 마스터 몰드 상에서 경화된 액적의 분리를 위해 그 사이에 희생층을 별도로 형성할 수 있으며, 마스터 몰드에서 필오프 방식으로 경화된 액적을 분리(releasing)하게 되면, 바닥면에 음각 인코더 패턴에 대응되는 최종적인 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자의 형성이 완료되게 된다.

상기 인코더 패턴은 마스크 패터닝 공정에 의해 생성되므로, 인코더 패턴의 정밀성(5㎛ 이하)이 보장되고, 10 ⁹ 개 이상의 인코딩이 가능하여, 극미세 시료에 대한 다양한 정보의 검출이 가능한 장점이 있다.

이와 같은 마이크로 입자는 스팟팅에 의해 액적의 형태로 투하되어 경화되게 되므로, 바닥면이 평편한 형태의 입체적 형상으로 형성되게 되며, 바람직하게는 반구형 또는 반타원형으로 형성되며, 평편한 바닥면에는 마스터 몰드에 의한 인코더 패턴이 임프린팅되어 나타나게 된다.

이러한 형태의 마이크로 입자는 무게 중심이 항상 바닥면이 수평인 상태를 유지하게 되므로, 즉, 인코더 패턴이 형성된 바닥면이 지면에 닿거나, 그 반대로 뒤집어지도록 배열(array)되게 되므로, 인코더 패턴은 항상 지면에 대해서 수평으로 인식되게 된다.

따라서, 마이크로 입자에 대해서 항상 수직한 방향으로 표지 물질에 대한 검출기를 사용하면 되므로, 검출 정보의 정확성을 보장할 수 있으며, 극미량의 시료를 이용하더라도 고감도의 검출이 가능하는 등 실험의 재현성을 향상시키게 된다.

또한, 이러한 형태의 마이크로 입자는 바이오 어세이 정보를 정량 검출하기 위한 프로브 영역과, 상기 바닥면에 형성된 인코더 패턴에 의해 바이오 어세이 정보의 종류를 인식하기 위한 인코더 영역이 기질 내에서 분리되어 있지 않고, 중첩적으로 형성되어, 인코더 패턴의 인식으로 정량과 인식이 동시에 검출 가능한 장점이 있다.

즉, 마스크 패터닝 공정과 스팟팅 및 임프린팅 공정을 이용하여 종래 기술에 비해 간단하고 경제적인 방법으로 바이오 어세이용 마이크로 입자의 제조가 가능하며, 특히 프로브 영역과 인코더 영역이 분리되어 있지 않아, 실시간 PCR 적용이 가능하여 지수기(exponential phase)에서의 반응을 모니터로 실시간으로 확인할 수 있어 표적 핵산의 최초의 양을 정확하게 정량할 수 있게 된다.

한편, 상기 제4단계의 마이크로 입자의 인코더 패턴 상에 불투명한 금속층 또는 감광수지층의 배열을 더 형성하여, 다양한 방식의 바이오 어세이 정보에 대한 검출이 가능하도록 한 것이다. 즉, 형광에 의한 검출 정보를 획득하는 것뿐만 아니라, 일반적인 bright field에 의한 검출 정보의 획득도 용이하게 하기 위함이다.

구체적으로, 상기 감광수지층은 에폭시 베이스의 네거티브 감광수지(epoxy-based negative photoresist)를 포함하며, 그 예로 SU-8를 들 수 있다. 상기 금속층은 전도성 금속 및 전도성 고분자 중 하나 이상을 포함할 수 있으며, 자성물질을 형성할 수도 있다. 상기 자성 물질은 철, 니켈, 코발트, 다이나비드(Dynabeads) 및 박테리얼 마그네틱 파티클(Bacterial magnetic particle) 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한, 상기 제4단계의 마이크로 입자의 인코더 패턴에 거칠기(roughness) 가공을 더 수행하여, 형광 검출 시 빛의 산란이 더욱 잘 일어나도록 하여, 더욱 정확한 정보를 검출할 수 있도록 한다.

또한, 상기 제4단계의 상기 마이크로 입자 내에 기공을 더 형성하여, 마이크로 입자의 표면만이 증폭 및 검출에 사용되는 것이 아니라 내부까지 이용할 수 있어 반응성을 극대화할 수 있도록 한 것이다.

이러한 마이크로 입자 내의 기공 형성방법은, 상기 바이오 어세이용 용액에 기공유도중합체(porogen)를 혼합하여, 액적의 경화 후 이 기공유도중합체의 제거하는 것이다.

상기 기공유도중합체는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol; PEG)을 사용할 수 있으며, 상기 기공에는 증폭되는 핵산의 정량적 정보를 제공하는 형광표식인자 등을 포함할 수 있다.

한편, 상기 마스터 몰더 상에 형성된 액적을 경화한 후, 상기 액적 상에 또 다른 액적을 형성할 수 있는데, 도 6에 도시된 바와 같이, 편의상 내부에 포함된 액적을 제1액적이라 하고, 외부에 형성된 액적을 제2액적이라고 한다.

상기 마스터 몰더 상에 형성된 제1액적을 경화한 후, 상기 (다)단계의 바이오 어세이용과는 다른 바이오 어세이용 용액을 상기 제1액적 상에 스팟팅하여 내부에 제1액적이 포함되도록 제2액적을 형성한다((라)단계).

그리고, 상기 제2액적을 경화한 후, 상기 마스터 몰드 상에서 제1액적 및 제2액적으로 이루어진 복합 구조체를 분리하여, 바닥면에 인코더 패턴이 형성된 복합 마이크로 입자를 형성하게 된다((마)단계).

이러한 방식은 하나의 마이크로 입자에서 두 종류 이상의 표적 핵산 또는 이와 반응하는 고정된 프라이머의 종류, 크기 또는 양에 대한 정보를 동시에 검출하고자 하는 경우 유용하게 사용될 수 있으며, 제1액적 및 제2액적 간의 표지 물질을 달리하거나, 제1액적에만 인코더 패턴이 형성되거나, 제1액적 및 제2액적에 각각 다른 인코더 패턴이 형성될 수도 있다. 또한, 필요에 의해 제3액적의 구현도 가능하다.

상기와 같이 제조된 마이크로 입자의 인코더 패턴의 판독하는, 즉 인코더의 정보를 읽는 방법은 제한되지 않으나, CCD 카메라 등을 이용할 수 있다. 또한, 각 마이크로 입자마다 개별적으로 인코더의 정보를 판독하거나, 어레이에 배열된 복수개의 각 마이크로 입자의 인코더 정보를 동시에 판독할 수도 있다.

또한, 용액에 프라이머, 표적 핵산 등의 바이오실험물질과 본 발명에 따른 마이크로 입자를 넣은 후 바이오 어세이를 진행하고, 이를 어레이(array)에 배열한 후, 각 마이크로 입자에 포함된 인코더 패턴을 판독하여 바이오 어세이 결과를 분석한다.

또는, 어레이에 프라이머, 표적 핵산 등의 바이오실험물질과 본 발명에 따른 마이크로 입자들을 배열한 후, 상기 어레이에 배열된 마이크로 입자를 바이오 어세이하여, 각 마이크로 입자에 포함된 인코더 패턴을 판독하여 바이오 어세이 결과를 분석하도록 한다.

이하에서는 본 발명의 실시예에 대해서 설명하고자 한다.

먼저, 실리콘 기판 상에 감광수지로서 SU-8 수지(SU-8 3025, Microchem 사)를 붓고 10초간 500rpm, 30초간 200rpm의 조건으로 코팅하였다.

그 다음, 95℃의 핫플레이트에서 15분 동안 소프트 베이크를 수행한 후, 인코더 패턴이 미리 그려져 있는 마스크를 이용해 선택적으로 250mJ UV 노광을 진행하였다. 노광 후 65℃의 핫플레이트에서 1분 95℃의 핫플레이트에서 5분간 베이크(bake)를 진행한 다음, SU-8 현상액(developer)(Microchem 사)을 이용해 노광되지 않은 SU-8을 제거해주는 현상작업을 수행하였다. 그 다음, 다시 200℃의 핫플레이트에서 5분간 베이크를 진행하였다.

이에 의해 실리콘 기판 상에 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드를 제작하였다.

그리고, 상기 양각 인코더 패턴이 형성된 제1몰드 상에 임프린트 레진층을 형성하였다. 임프린트 레진으로는 폴리다이메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS) 용액과 경화제(제품명 : SYLGARD® 184, 제조사 : 다우하이텍실리콘)를 10:1로 혼합한 프레-폴리머를 제1몰드 상에 부었다.

진공 챔버에서 60분간 가스를 제거한 다음 80℃의 오븐에 90분간 경화시키고, 제1몰드로부터 분리하여 PDMS로 이루어진 음각 인코더 패턴이 형성된 마스터 몰드를 제작하였다.

그리고, 상기 마스터 몰더에 형성된 음각 인코더 패턴 상에 바이오 어세이용 용액을 스팟팅(spotting)하여 액적(droplet)을 형성하였다.

상기 바이오 어세이용 용액은 용액 총 부피에 대하여 PEG700DA(제조사: Sigma Aldrich) 20 부피%, 폴리에틸렌글리콜 600(PEG 600) 40부피%, 광개시제로 Darocur 1173(제조사: Sigma Aldrich) 5부피%, 0.15부피%의 트윈(tween)-20을 포함하는 3X TE 버퍼 35 부피%로 사용하였다. 그리고, 상기 바이오 어세이용 용액 총 부피에 대해 5부피%의 EtBr(이중가닥 핵산에 결합하여 증폭과 함께 형광을 나타내는 시약(Interchelator))을 더 혼합하였다.

상기 바이오 어세이용 용액을 스팟팅 장치의 오픈타임(open time)을 조절하여 상기 마스터 몰더에 형성된 음각 인코더 패턴 영역 상에만 스팟팅하여, 음각 인코더 패턴 영역을 내부에 포함하는 액적을 형성하였다.

그리고, 상기 액적을 6~8mW/cm ² 로 20분 동안 자외선(UV)을 조사하여 고형화(curing)한 후, 상기 마스터 몰더 상에서 이를 분리(release)하여, 바닥면에 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자를 형성하였다.

도 2는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드 상에 형성된 액적에 대한 측면 사진을 나타낸 것으로, 스팟팅에 의해 액적의 형태가 바닥면이 평편한 반구형을 나타냄을 알 수 있다.

도 3(a)는 본 발명의 일실시예에 따라 제조된 마스터 몰드에 대한 사진을 나타낸 것이고, 도 3(b),(c)는 상기 마스터 몰드 상에 바이오 어세이용 용액을 스팟팅하여 형성한 액적에 대한 사진을 나타낸 것이며, 도 3(d)는 상기 액적을 경화하고, 상기 마스터 몰드로부터 액적을 분리하여 제조된 마이크로 입자에 대한 사진을 나타낸 것으로, 마스크 패터닝 공정 및 임프린팅 공정에 의해 고정밀도의 인코더 패턴이 형성됨을 확인할 수 있었다.

도 4는 본 발명의 다양한 실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 사진을 나타낸 것으로서, 다양한 인코더 패턴이 형성된 마이크로 입자에 대한 것이다. 이러한 마이크로 입자는 바닥면이 평편한 반구형 형태로 형성되어, 마이크로 입자의 수직 상방향에서 모든 마이크로 입자의 인코더 패턴의 판독이 가능함을 알 수 있었다.

도 5(a)는 본 발명의 일실시예에 따른 마이크로 입자에 대한 PCR 이후의 BF(bright field) 이미지(a)로써, CCD 카메라로 촬영한 것으로서, 인코더 패턴의 판독이 가능함을 확인할 수 있었다.

도 5(b),(c)는 PCR 이전과 이후의 형광(fluorescence) 이미지를 나타낸 것으로서, PCR 싸이클이 증가할수록 형광의 색이 밝아짐과 동시에 인코더 패턴이 더욱 뚜렷해짐을 확인할 수 있었다.