技术领域
[0001] 本
发明属于分子
生物学技术领域，涉及一种预测他汀类药物疗效和安全性相关基因突变检测芯片。
背景技术
[0002] 他汀类药物是一种羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶
抑制剂，广泛用于心
血管疾病的降脂
治疗。具有调脂作用强、耐受性好等优点。但是，他汀类药物无论是在控制血脂
水平还是不良反应方面，不同个体之间存在着显著差异。当他汀类药物与贝特类降脂药合用时可造成个别患者的横纹肌溶解而导致死亡。目前，临床上对他汀类药效和安全性的评估主要还是依靠经验，即在患者服药后再进行评估。因此，找出这些差异以及改变目前传统的用药方案，不但可以安全有效的用药，而且具有极大的经济学价值。
[0003] 生物芯片是通过缩微技术，根据分子间特异性相互作用的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于
硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、
蛋白质、基因及其它生物组分的准确、快速、大信息量的检测。
[0004] 目前用于突变检测的大多是序列特异性探针杂交法(SSOP)
基因芯片技术，该种技术利用寡核苷酸基因芯片的高通量和高度并行性的特点，对发生突变的众多基因设计序列特异性的寡核苷酸探针，将这些探针固定于同一张基片上，将待测的包含突变位点的基因
片段进行体外扩增后与芯片杂交，根据杂交的
信号判断突变位点的基因型。这种方法的基本原理是与基因特定序列互补的一段序列特异性寡核苷酸探针对基因序列的特异性识别。当探针的序列与基因序列完全匹配时所形成的杂交体热
稳定性高于含有错配
碱基的杂交体，据此通过控制杂交
温度和其他杂交条件可以使完全匹配的杂交体与含有错配碱基的杂交体区分开来，从而达到基因分型的目的。
发明内容
[0005] 本发明旨在为服用他汀类药物的患者中进行疗效和安全性个体化差异的预测。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
[0007] 一种预测他汀类药物疗效和安全性相关的基因突变检测芯片，包括固相基片和点载在固相基片上的基因探针阵列；所述基因探针是与他汀类药物疗效和安全性相关的寡核苷酸序列；所述药物疗效和安全相关的基因突变位点是CYP3A4*1G(rs2242480)、CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3AP1*3(rs2177180)和SLCO1B1*5(rs4149056)。所述CYP3A4、CYP3A5、CYP3AP1和SLCO1B1的序列如SEQ ID NO.1-4所示。
[0008] 其中，所述基因探针包括野生型基因探针和突变型基因探针，基因探针长度为18-22bp，所述基因探针包括：
[0009] CYP3A4*1Grs2242480野生型探针5′-tggtacatggagaaggagg-3′[0010] (SEQ ID NO.5)
[0011] CYP3A4*1Grs2242480突变型探针5′-cctccttctccatgtatcatcc-3′[0012] (SEQ ID NO.6)
[0013] CYP3A5*3Crs776746野生型探针5′-agtatctcttccctgtttg-3′
[0014] (SEQ ID NO.7)
[0015] CYP3A5*3Crs776746突变型探针5′-ccaaacagggaagagatattga-3′[0016] (SEQ ID NO.8)
[0017] CYP3AP1*3rs2177180野生型探针5′-cagccccgcctccttctc-3′
[0018] (SEQID NO.9)
[0019] CYP3AP1*3rs2177180突变型探针5′-ctggagaaggaggtggggctgc-3′[0020] (SEQ ID NO.10)
[0021] SLCO1B1*5rs4149056野生型探针5′-gcatattacccatgaacac-3′[0022] (SEQ ID NO.11)
[0023] SLCO1B1*5rs4149056突变型探针5′-gcgttcatgggtaatatgc-3′[0024] (SEQ ID NO.12)
[0025] 所述基因探针还包括：
[0026] 阳性参照探针：5′-atatgcttcgtggaatagggga-3′(SEQ ID NO.13)[0027] 阴性参照探针：5′-gagcatgcctttattgtaaccc-3′(SEQ ID NO.14)[0028] 所述固相基片可采用
硅片、玻璃片、塑料片、尼龙膜等固相介质中的一种或他们的任意组合。
[0029] 为提高探针与基片结合的效率和检测灵敏度，所述探针和基片可作进一步修饰和包被。如其基片
表面处理方式可为多聚赖
氨酸包被、琼脂糖包被、氨基或
醛基化修饰。
[0030] 本发明的芯片包括承载基片和在基片上呈阵列式分布的多种基因探针，基因探针含有预测他汀类药物疗效和安全性相关基因突变位点的互补寡核苷酸序列。目前的研究结果显示这些突变位点在人群中的发生
频率较高，且对他汀类药物反应有明显影响。此外，出于芯片
质量控制的要求，芯片上基因探针可设置阳性和阴性参照探针。每个位点设计野生型和突变型两种探针，其长度为18-22bp。
[0031] 本发明的芯片制造方法是：根据所需检测的基因位点附近的碱基序列，每个突变位点设计野生型和突变型两种探针，并设置阳性和阴性参照探针，设计长度范围18-22bp，使用DNA序列合成仪合成探针，用点样装置将探针按一定的间距点在基片上，点样面积可根据探针数量、探针间距、点的大小等因素进行调整，点样后将芯片按探针与基片结合方式的不同，采取适当的方法进行
固化。然后立即使用或贮存于4℃备用。
[0032] 本发明芯片的使用方法
[0035] (2)样本处理
[0036] 使用基因组DNA抽提
试剂盒提取DNA；
[0037] 以下涉及到
荧光标记引物及其产物的操作步骤均在避光条件下(有红灯的暗室内)进行；
[0038] (3)PCR反应扩增
[0039] 使用基因突变位点特异性引物通过PCR反应对DNA标本扩增，使用荧光物质或同位素对引物进行标记；
[0040] (4)杂交
[0041] 取PCR产物
混合液，加阳性参照溶液及预热的杂交液，混匀，变性3min后置
冰上，全部转移到芯片的点样区域(对照点样矩阵
定位芯片)，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进恒温箱或水浴保温1h；
[0042] (5)洗片
[0043] 打开杂交舱，取出芯片，用洗脱液冲掉盖玻片，然后把芯片放入洗脱液中，室温(25℃±10℃)放置5min，用灭菌双蒸水冲洗二遍，室温下干燥；
[0044] (6)读片
[0045] 推荐使用ScanArray4000
扫描仪在60-85扫描强度下扫描；
[0046] (7)结果分析
[0047] 采用人工判读或使用配套
软件分析。根据基因型分析结果判断他汀类药物的疗效和安全性。
[0048] 利用本发明的芯片，只需病人1ml血液，便能够再3-4h内迅速得到结果，并配合专用软件，向临床医生提供明确的建议。采用这一新的检测芯片，医生可以在患者服药前对用药方案进行调整，大大减少了病人不必要的痛苦与经济负担。并且，采用基因芯片技术，可以同时检测多个变异位点，一次判断患者用药的疗效和安全性，检测结果可以终生指导其治疗。
[0049] 本发明采用生物芯片技术检测与他汀类药物疗效和安全性相关的基因突变位点，提前预测药物的疗效和毒性，辅助临床医师制定个体化用药方案，使患者治疗利益最大化。
附图说明
[0050] 图1为本发明所述芯片整体结构示意图；
[0051] 图2为本发明所述基因探针阵列示意图。
[0052] 图注如下：1.承载基片 2点样区 3基因探针阵列 4贴标签处具体实施方式
[0053] 以下对本发明制造的基因突变芯片做进一步的详细描述。
[0054] 通过临床观察以及文献挖掘，选出和他汀类药物疗效和安全性密切相关的4个基因突变位点制作基因突变检测芯片。这4个位点是CYP3A4*1G(rs2242480)、CYP3A5*3C(rs776746)、CYP3AP1*3(rs2177180)和SLCO1B1*5(rs4149056)。
[0055] 基片处理：基片采用玻璃介质，其表面处理方式采用氨基化修饰。具体步骤如下：
[0056] (1)在2mol/lNaOH-70％
乙醇溶液中清洗玻片2h后，用蒸馏水冲洗5遍，110℃烤干并冷却至室温；
[0057] (2)将玻片置于1％的3-氨丙基三甲基硅烷-95％丙
酮溶液中浸泡2min；
[0058] (3)取出后用丙酮冲洗10次，每次5min；
[0059] (4)110℃干燥45min；
[0060] (5)在1g/L的1，4-苯二异硫氰酸盐溶液中处理2h；
[0061] (6)用甲醇清洗5min，丙酮冲洗5min，室温干燥。
[0062] 探针制备：
[0063] (1)在DNA合成仪上合成所需序列的寡核苷酸(包括5′端的10-15个碱基的polyT)；
[0064] (2)在DNA序列合成仪上，将寡核苷酸poly(T)分子臂引入活泼的脂族氨基臂。
[0065] (3)以HPLC纯化5′端氨基修饰的寡核苷酸，离心干燥后，溶于100mmol/l的Na2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，浓度为2mmol/L。
[0066] 基因芯片的制作：在一
块玻璃介质的基片上划分1个基因探针点样区域，其面积为10mm×8mm。点样区域内基因探针阵列中第1行的前5列探针都为阳性参照探针，第1行的后5列为阴性参照探针；第2行前5列为CYP3A4野生型探针，第2行后5列为突变型探针；第3行前5列为CYP3A5野生型探针，第3行后5列为突变型探针；第4行前5列为CYP3AP1野生型探针，第4行后5列为突变型探针；第5行前5列为SLCO1B1野生型探针，第5行后5列为突变型探针。全部基因探针在芯片的分布参见表1。
[0067] 表1基因探针在芯片的分布
[0068]
[0069]
[0070] 打印与打印后处理：
[0071] (1)探针溶液各取2μl，用点样仪按上述格式打印到处理过的基片上；
[0072] (2)37℃封闭处理1h；
[0073] (3)用1％的
氨水溶液洗涤5min，再用双蒸水洗涤3次；
[0074] (4)室温干燥后立即使用或贮存于4℃备用。
[0075] 应用方法：
[0076] (1)先将芯片及其他检测试剂配成试剂盒，试剂盒中成分组成如表2所示：
[0077] 表2试剂盒组分
[0078]
[0079]
[0080] 表2中所列试剂成分说明如下：
[0081] 引物：用于扩增CYP3A4*1G，CYP3A5*3C，CYP3AP1*3和SLCO1B1*5基因突变位点的荧
光标记引物序列；
[0082] 阳性参照溶液：即阳性参照溶液，为合成的阳性参照探针互补序列，经荧光标记；
[0083] 上述引物或互补序列如表3所示：
[0084] 表3引物或互补序列
[0085]
[0086]
[0087] 杂交液：0.2％SDS；
[0088] 50X洗脱液：10％SDS。
[0089] (2)实验操作步骤
[0090] ①采样：从病人身上采血1ml；
[0091] ②样本处理
[0092] 使用基因组DNA抽提试剂盒提取DNA；
[0093] 以下涉及引物及其产物的操作步骤必须在避光条件下(有红灯的暗室内)进行。
[0094] ③PCR反应
[0095] (A)CYP3A4*1G50μl的反应体系，正反引物各0.5μl，模板50-100ng，10XPCR缓冲液2.5μl，MgCl22.0μl，dNTPs1.5μl及0.3μlTaq酶。
[0096] PCR扩增参数：94℃预变性7min，然后94℃变性30s，62℃复性60s，72℃延伸60s，如此35个循环；再72℃延伸5min。
[0097] (B)CYP3A5*3C50μl的反应体系，正反引物各0.5μl，模板50-100ng，1XPCR缓冲液5μl，MgCl22.0μl，dNTPs1.5μl及0.5μlTaq酶。
[0098] PCR扩增参数：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，50℃复性60s，72℃延伸30s，如此35个循环；再72℃延伸5min。
[0099] (C)CYP3AP1*325μl的反应体系，正反引物各0.5μl，模板50-100ng，1XPCR缓冲液5μl，MgCl21.5μl，dNTPs1.0μl及1.0μlTaq酶。
[0100] PCR扩增参数：95℃预变性3min，然后95℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸40s，如此35个循环；再72℃延伸5min。
[0101] (D)SLC01B1*525μl的反应体系，正反引物各0.5μl，模板50-100ng，1XPCR缓冲液5μl，MgCl21.5μl，dNTPs1.0μl及1.0μlTaq酶。
[0102] PCR扩增参数：95℃预变性2.3min，然后94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸30s，如此35个循环；再72℃延伸5min。
[0103] 注意：上述成分充分混匀，最后加入Taq酶混匀，放置PCR管于PCR仪上，用
铝箔纸包裹PCR仪上PCR反应区域。
[0104] ④杂交
[0105] 将(A)、(B)、(C)和(D)PCR产物混合，混匀，取7μlPCR产物混合液，加阳性参照溶液1μl及经48℃预热的杂交液6μl，混匀，94℃变性3min后置冰上，全部转移到芯片的点样区域(对照点样矩阵定位芯片)，加盖玻片(注意不要有气泡)；杂交舱里加几滴水，以保持湿度；将芯片放入杂交舱，密封杂交舱，然后放进94℃(±1℃)恒温箱或水浴保温1h。
[0106] ⑤洗片
[0107] 打开杂交舱，取出芯片，用1X洗脱液冲掉盖玻片，然后把芯片放入盛有洗脱液的
染色缸，室温(25℃±10℃)放置5min，用灭菌双蒸水冲洗二遍，室温下干燥；
[0108] ⑥读片
[0109] 使用ScanArray4000扫描仪在60-85扫描强度下扫描；
[0110] ⑦结果分析
[0111] 采用人工判读或使用配套软件分析。根据芯片基因型分析结果和相关资料给出他汀类药物疗效和安全性的预测建议(见表4)：
[0112] 表4他汀类药物疗效和安全性的预测建议
[0113]
[0114]
[0115] 本发明芯片相关检测指标：
[0116] 检出率(已检出的标本数/标本总数)＞95％；
[0117] 准确性(正确检出的标本数/标本的标本总数)＞99％；
[0118] 重复性(同一标本正确检出的次数/总检测次数)＞99％。
