一种PD-1单克隆抗体及其应用
阅读：0发布：2020-09-05
专利汇可以提供一种PD-1单克隆抗体及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种PD‑1单克隆 抗体 及其应用，本发明的单克隆抗体，特异性高，亲和 力 强，能够显著刺激IFN‑γ的分泌，并且能够有效激活CD8+和CD4+T细胞。，下面是一种PD-1单克隆抗体及其应用专利的具体信息内容。
1.一种抗体，其特征在于，所述的抗体为抗PD-1蛋白的抗体，所述抗体具有：
(1)重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:4所示的CDR1，
SEQ ID NO:6所示的CDR2，和
SEQ ID NO:8所示的CDR3；和
(2)轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
SEQ ID NO:14所示的CDR1’，
SEQ ID NO:16所示的CDR2’，和
SEQ ID NO:18所示的CDR3’。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，和所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括：单链抗体、或双链抗体。
4.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体。
5.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述的抗体包括：嵌合抗体、鼠源抗体、或人源化抗体。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的抗体的序列；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，它编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的多核苷酸。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒。
10.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述载体为腺病毒、或逆转录病毒。
11.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
12.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的抗体、或权利要求6所述的重组蛋白；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、或放射性核素。
13.如权利要求12所述的免疫偶联物，其特征在于，所述可检测标记物为酶。
14.一种药物组合物，其特征在于，它含有：
(i)如权利要求1所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求12所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为注射剂型。
16.如权利要求1所述的抗体、如权利要求6所述的重组蛋白、或如权利要求12所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-1蛋白；
所述药剂用于治疗或预防表达PD-1蛋白的肿瘤。
17.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自：胃癌和滤泡性淋巴瘤。
19.如权利要求16所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
20.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求11所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或权利要求
6所述的重组蛋白。
一种PD-1单克隆抗体及其应用
技术领域
背景技术
[0002] T细胞的特异性免疫应答是由T细胞受体与抗原肽MHC复合物结合后形成的第一刺激信号所激发的；同时T细胞介导的免疫应答的强度和幅度则是被免疫检验点蛋白(包括共抑制因子和共刺激分子)所调节。经过20多年的研究，免疫检验点的分子被发现在调节T细胞免疫应答中发挥了关键作用，这些分子包括：细胞毒性淋巴细胞抗原4(Cytotoxic lymphocyte antigen-4,CTLA-4)，程序性死亡蛋白1(Programmed death-1,PD-1)，T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构-3(T cell immunoglobul in and mucin domain 3,TIM-3)，T细胞免疫球蛋白和ITIM结构(T cell Ig and ITIM domain,TIGIT)等。
[0003] 正常生理状况下，免疫检验点的主要功能是维持自身耐受和保护正常组织免受免疫系统损伤。在肿瘤微环境中，由于长时间接触肿瘤抗原，淋巴细胞会异常表达某些共抑制因子，从而造成肿瘤特异性T细胞发生功能紊乱。大量的临床数据显示针对共抑制信号的抗体能够提高肿瘤特异性T细胞的应答。因此，这些免疫检验点蛋白成为了抗肿瘤免疫治疗的潜在靶点。
[0004] 然而，目前的抗体的性能尚难以令人满意。因此本领域需要开发新的、性能优异针对上述靶点的抗体药物，以满足临床上的需求。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种新的PD-1单克隆抗体及其应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
[0007] SEQ ID NO:4所示的CDR1，
[0008] SEQ ID NO:6所示的CDR2，和
[0009] SEQ ID NO:8所示的CDR3。
[0010] 在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
[0011] 本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有本发明第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
[0012] 在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源或鼠源的。
[0013] 本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
[0014] SEQ ID NO:14所示的CDR1’，
[0015] SEQ ID NO:16所示的CDR2’，和
[0016] SEQ ID NO:18所示的CDR3’。
[0017] 在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列。
[0018] 本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有本发明第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
[0019] 在另一优选例中，所述轻链的恒定区为人源或鼠源的。
[0020] 本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
[0021] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区；和/或
[0022] (2)如本发明第三方面所述的轻链可变区。
[0023] 在另一优选例中，所述抗体具有：如本发明第二方面所述的重链；和/或如本发明第四方面所述的轻链。
[0024] 在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗PD-1蛋白的抗体。
[0025] 在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
[0026] 本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
[0027] (i)如本发明第一方面所述的重链可变区的序列、如本发明第二方面所述的重链的序列、如本发明第三方面所述的轻链可变区的序列、如本发明第四方面所述的轻链的序列、或如本发明第五方面所述的抗体的序列；以及
[0028] (ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
[0029] 在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
[0030] 在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗PD-1蛋白。
[0031] 本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，它编码选自下组的多肽：
[0032] (1)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、或如本发明第五方面所述的抗体；或
[0033] (2)如本发明第六方面所述的重组蛋白。
[0034] 在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:3、5、7、9、13、15、17、或19所示的序列。
[0035] 本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明第七方面所述的多核苷酸。
[0037] 本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的多核苷酸。
[0038] 本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
[0039] (a)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、或如本发明第六方面所述的重组蛋白；和
[0040] (b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
[0041] 在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0042] 本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
[0043] (i)如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物；以及[0044] (ii)药学上可接受的载体。
[0045] 在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
[0046] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、肾上腺肿瘤、或膀胱肿瘤。
[0047] 本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的重链可变区、如本发明第二方面所述的重链、如本发明第三方面所述的轻链可变区、如本发明第四方面所述的轻链、如本发明第五方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的重组蛋白、或如本发明第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
[0048] 所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中PD-1蛋白；
[0049] 所述药剂用于治疗或预防表达PD-1蛋白的肿瘤。
[0050] 在另一优选例中，所述肿瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
[0051] 在另一优选例中，所述肿瘤选自：胃癌和滤泡性淋巴瘤。
[0052] 在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
[0053] 本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中PD-1蛋白的方法，所述方法包括步骤：
[0054] (1)将样品与本发明第五方面所述的抗体接触；
[0055] (2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在PD-1蛋白。
[0056] 本发明的第十四方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：
[0057] (a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；
[0058] (b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明第五方面所述的抗体或本发明第六方面所述的重组蛋白。
[0060] 图1显示了PD1-1375对可溶性人PD-1的亲和力分析结果。
[0061] 图2A和2B显示了本发明单克隆抗体PD1-1375的序列结构。
[0062] 图3显示了PD1-1375与PD-1竞争ELISA检测结果。
[0063] 图4显示了PD1-1375与PDL1竞争ELISA检测结果。
[0064] 图5显示了PD1-1375激活PBMC实验结果。
[0065] 图6显示了DSC检测PD1-1375的热稳定性。
[0066] 图7显示了阻断PD-1可以增加PD-1+抗肿瘤T细胞的增殖。
[0067] 图8显示了PD1抗体可以显著增强肿瘤病人TIL的细胞因子(IFN-γ和TNF-α)产生。
[0068] 图9显示了PD1抗体可以显著的抑制FL肿瘤生长。
[0069] 图10A和10B显示了PD1抗体，结合利妥昔单抗药物，可以进一步抑制RL肿瘤生长。
具体实施方式
[0070] 本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地一种抗PD-1单克隆抗体PD1-1375，实验结果表明，该单克隆抗体不仅特异性高，亲和力强，能够显著刺激IFN-γ的分泌，并且能够有效激活CD8+和CD4+T细胞。在此基础上完成了本发明。
[0071] PD-1信号通路
[0072] PD-1免疫检验点受体，在外周组织炎症应答的时候能够限制T细胞的活性，以及限制自身免疫。这是肿瘤微环境中产生免疫抵抗的主要机制。T细胞在活化后诱导PD-1的表达。当与PD-1的一个配体结合后，参与T细胞激活的磷酸化酶SHP2被抑制。同时，因为PD-1结合抑制了TCR停止信号，这条信号通路能够改变T细胞—APC或T细胞—靶细胞之间的连接时间。PD-1高表达于Treg细胞，Treg细胞在PD-1配体存在的情况下会增强自身的增殖。因为许多肿瘤高表达浸润的Treg细胞，可能会进一步抑制效应细胞的免疫应答，所以阻断PD-1信号通路会通过减少并/或抑制瘤内Treg细胞的活性从而增强抗肿瘤免疫应答。
[0073] PD-1有两个配体PD-L1(即B7-H1/CD274)和PD-L2(即B7-DC/CD273)。
[0074] PD-1表达在来源多种肿瘤类型的大部分肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中。高表达PD-1的CD4+TIL，主要集中在肿瘤组织中CD4+Treg细胞。高表达PD-1的CD8+TILs表现出无能或疲惫的状态，通过比较黑色素瘤内PD-1-TILs，PD-1+TILs分泌更少的细胞因子。就像PD-1高表达于许多肿瘤的TILs，PD-1配体也高表达于多种肿瘤的肿瘤细胞表面。在实体瘤细胞表面主要表达PD-1的配体PD-L1，促使小鼠肿瘤细胞高表达PD-L1能够抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。的确，这些发现为阻断PD-1信号通路增强在肿瘤微环境中抗肿瘤效应细胞的功能提供了基础。基于免疫组化(IHC)和流式细胞仪的分析得出多种人类肿瘤在一定水平组成型高表达PD-1配体。PD-1配体的表达模式将主要决定阻断这条通路的免疫治疗策略是否可行，因为PD-1配体在癌症中的主要作用被认为是在肿瘤微环境中发挥免疫抑制，而且PD-1与它的配体，PD-L1和PD-L2，结合后只能抑制淋巴细胞的功能。
[0075] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述PD-1的氨基酸序列为：
[0076] DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO.:1)
[0077] 如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0078] 如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0079] 脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
[0080] 如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
[0081] 本发明还包括具有所述的抗PD-1蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗PD-1蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
[0082] 如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗PD-1蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗PD-1蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
[0083] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链。
[0084] 如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
[0085] 如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region,CDR)”可互换使用。
[0086] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
[0087] CDR1，其氨基酸序列为GWSLTGPG(SEQ ID NO:4)，其编码核苷酸序列为，gggtggtcattaaccggccccggt(SEQ ID NO.:3)；
[0088] CDR2，其氨基酸序列为IYGDGST(SEQ ID NO.:6)，其编码核苷酸序列为，atatatggtgatggaagcaca(SEQ ID NO.:5)；
[0089] CDR3，其氨基酸序列为AYEYAMDW(SEQ ID NO.:8)，其编码核苷酸序列为，gcctatgagtatgctatggactgc(SEQ ID NO.:7)。
[0090] 在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：
[0091] DVQLQESGPGLVAPSQSLSITCTVSGWSLTGPGVNWVRQPPGKGLEWLGMIYGDGSTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKINSLQTDDTARYYCAYEYAMDWWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO.:10)；
[0092] 其编码核苷酸序列为：
[0093] gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacatgcaccgtctcagggtggtcattaaccggccccggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtctggagtggctgggaatgatatatggtgatggaagcacagactataattcagctctcaaatccagactgagcatcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaataaacagtctgcaaactgatgacacagccaggtactactgtgcctatgagtatgctatggactgctggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcaa(SEQ ID NO.:9)。
[0094] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。
[0095] 如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
[0096] 在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
[0097] CDR1’，其氨基酸序列为WSVSTSGKSY(SEQ ID NO:14)，其编码核苷酸序列为，tggagtgtcagtacatctggcaagagttat(SEQ ID NO.:13)；
[0098] CDR2’，其氨基酸序列为LLS(SEQ ID NO:16)，其编码核苷酸序列为，cttctgtcc(SEQ ID NO.:15)
[0099] CDR3’，其氨基酸序列为YHIRDLT(SEQ ID NO:18)，其编码核苷酸序列为，taccacattagggaccttacacg(SEQ ID NO.:17)
[0100] 在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：
[0101] DIVMTQSPASLAVSLGQRATISYRASWSVSTSGKSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLLSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCYHIRDLT(SEQ ID NO.:20)，
[0102] 其编码核苷酸序列为：
[0103] gacattgtgatgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatctcatacagggccagctggagtgtcagtacatctggcaagagttatatgcactggaaccaacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttctgtccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgttaccacattagggaccttacacg(SEQ ID NO.:19)。
[0104] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
[0105] 在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-1蛋白的抗体，例如具有重链可变区(如SEQ ID NO.:10的氨基酸序列)和/或轻链可变区(如SEQ ID NO.:20的氨基酸序列)的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
[0106] 在另一优选例中，所述的抗体为抗PD-1蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
[0107] 本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
[0108] 一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
[0109] 本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
[0110] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
[0111] 如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0112] 本发明抗体指具有PD-1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
[0113] 该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0114] 本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0115] 在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0116] 表1
[0117]
[0118]
[0119] 本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQ ID NO.:3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列有差别的核酸序列。
[0120] 编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
[0121] 术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0122] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:10和/或SEQ ID NO.:20所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
[0123] 本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6Hi s)融合在一起，形成融合蛋白。
[0124] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
[0125] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0126] 本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0127] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
[0128] 用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
[0129] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0130] 在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0131] 本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0132] 用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0133] 可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素(Koppe等，2005，癌转移评论(Cancer metastasis reviews)24，539)；2.生物毒(Chaudhary等，1989，自然(Nature)339，394；Epel等，2002，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565)；3.细胞因子如IL-2等(Gillies等，1992，美国国家科学院院刊(PNAS)89，1428；Card等，2004，癌症免疫学和免疫治疗(Cancer Immunology and Immunotherapy)53，345；Halin等，2003，癌症研究(Cancer Research)63，3202)；4.金纳米颗粒/纳米棒(Lapotko等，2005，癌症通信(Cancer letters)239，36；Huang等，2006，美国化学学会杂志(Journal of the American Chemical Society)128，2115)；5.病毒颗粒(Peng等，2004，基因治疗(Gene therapy)11，1234)；6.脂质体(Mamot等，2005，癌症研究(Cancer research)65，11631)；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0134] 本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0135] 本发明的药物组合物可直接用于结合PD-1蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0136] 本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0137] 使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0138] 杂交瘤细胞株
[0139] 本发明还提供了可生产本发明针对PD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的针对PD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0140] 在获得生产本发明的PD-1蛋白单克隆抗体的杂交瘤之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备本发明的单克隆抗体。
[0141] 单克隆抗体的制备
[0142] 本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
[0143] 代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
[0144] 对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal
Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
[0145] 由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(protein A-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
[0146] 本发明提供了一种针对PD-1蛋白的单克隆抗体，特别是针对PD-1蛋白的单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
[0147] 本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，10天左右可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
[0148] 标记的免疫球蛋白
[0149] 在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
[0150] 胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，PD-1蛋白的单克隆抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的单克隆抗体。
[0151] 本发明的PD-1蛋白单克隆抗体具有很好的特异性，很高的效价。
[0152] 检测板及其材料
[0153] 本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。
[0154] 本发明检测PD-1蛋白的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的PD-1蛋白单克隆抗体或多克隆抗体，优选被胶体金标记的PD-1蛋白单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；
[0155] 在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的PD-1蛋白单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的PD-1蛋白单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为502 2
μl/cm；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm；
μl/cm；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm；
[0156] 检测方法与结果判定
[0157] 平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μl，3～5min内观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
[0158] 阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；
[0159] 阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；
[0160] 无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。
[0161] 方法和样本
[0162] 本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测肿瘤的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-1蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。
[0163] 试剂盒
[0165] 本发明进一步设计用于检测PD-1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0166] 本发明的主要优点在于：
[0168] (2)本发明抗PD-1蛋白的抗体能够有效刺激T细胞IFN-γ的分泌。
[0169] (3)本发明抗PD-1蛋白的抗体能够有效刺激T细胞TNF-α的分泌。
[0170] (4)本发明抗PD-1蛋白的抗体能够激活CD8+和CD4+T细胞，及其他表达PD-1蛋白的细胞。
[0171] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
[0172] 实施例1 单克隆抗体的制备
[0173] 1.1动物免疫
[0174] 取6-8周雌性BALB/C小鼠，免疫原为基因重组表达PD-1蛋白293T细胞，氨基酸序列如下：
[0175] DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPL(SEQ ID NO.:1)，免疫程序见表2。每次免疫前进行小鼠断尾采血，采用基因重组表达PD-1蛋白293T细胞作为检测抗原包被间接ELISA法检测小鼠血清效价。待免疫小鼠血清效价滴度达到最大并不再升高时取脾细胞进行融合。
[0176] 表2 小鼠免疫程序
[0177]免疫时间 免疫剂量(个细胞) 免疫途径
首免(第1天) 1×106/0.1mL 尾静脉注射
二免(第14天) 1×106/0.1mL 尾静脉注射
三免(第28天) 1×106/0.1ml 尾静脉注射
四免(第42天) 1×106/0.1ml 尾静脉注射
首免(第1天) 1×106/0.1mL 尾静脉注射
二免(第14天) 1×106/0.1mL 尾静脉注射
三免(第28天) 1×106/0.1ml 尾静脉注射
四免(第42天) 1×106/0.1ml 尾静脉注射
[0178] 1.2细胞融合与培养
[0179] 按常规方法收集免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，融合比率脾细胞：SP2/0＝5:1，融合细胞分装于96孔培养板，置于37℃，5％CO2恒温培养箱中选择性培养。融合后用HAT培养基全换液3次；待杂交瘤细胞长满一个显微镜视野时，进行ELISA检测。
[0180] 1.3阳性杂交瘤的筛选
[0181] 检测时，采用间接ELISA筛选：抗原选用PD-1-Fc融合蛋白，2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入杂交瘤上清并设置阳性(P)、阴性(N)及空白对照(空白直接加入酶标二抗)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(Sigma A2554)(1:10000)37℃反应45～60min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止。
[0182] ELISA筛选结果以OD值大于0.6的为出阳性孔，并进行复检。经过两次连续检测为阳性后，将该阳性孔细胞进行扩增，及时冻存和亚克隆。
[0183] 1.4杂交瘤细胞系的建立
[0184] 对于2次筛选都为阳性的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，取一块96孔细胞培养板，每孔中加入150μl HAT培养液；对需亚克隆的阳性孔轻轻吹打悬浮，吸取100μl细胞悬液加到96孔细胞板中，从第一孔开始倍比稀释。细胞计数选取孔中约有100个细胞的孔并加入到含有6ml HAT培养液的加样槽中，按100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加前三列；再补加HAT培养基3ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加中三列；再补加HAT培养基5ml，100μl/孔加到铺饲养层的细胞板中，加后六列。计算每块板的阳性率达到100％时，得到稳定细胞株PD1-1375。转移到细胞培养板中，扩大培养并大量冻存。
[0185] 1.5单克隆抗体的大量生产(腹水制备)
[0186] 大量培养杂交瘤细胞(PD1-1375)，8-10周龄的BALB/C雌性小鼠预先用液体石蜡致敏，然后腹腔注射1x106杂交瘤细胞/只，约10天左右待小鼠腹部明显膨大到一定程度后，用9号针头抽取腹水。收获的腹水用PD-1-Fc融合蛋白包被通过ELISA检测腹水效价达到1：10,
000以上。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以Prote in G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260,280测定抗体蛋白浓度为0.7-1.5mg/ml，间接ELISA检测结果表明：纯化的单克隆抗体的效价在1:10000以上。
000以上。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以Prote in G亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260,280测定抗体蛋白浓度为0.7-1.5mg/ml，间接ELISA检测结果表明：纯化的单克隆抗体的效价在1:10000以上。
[0187] 采用常规方法对获得的单克隆抗体进行测序，测序结果如图2所示。
[0188] 实施例2 PD1-1375对可溶性人PD-1的亲和力分析
[0189] 将可溶性抗原蛋白PD1-Fc以5μg/ml的浓度溶解于PBS中进行抗原包被；
[0190] 不同浓度梯度的PD1-1375进行抗体孵育；
[0191] 将羊抗鼠IgG-HRP(ProSci)以1:5000溶解于稀释液(1％BSA+0.05％PBST20)，进行二抗孵育，显色；实验结果如图1所示，得到PD1-1375抗体的EC50＝29.4ng/mL。
[0192] PD1-Fc是由人的PD1分子的胞外结构域加上人IgG1的Fc片段组成，其氨基酸序如下：
[0193] DSPDRPWNPPTFSPALLVVTEGDNATFTCSFSNTSESFVLNWYRMSPSNQTDKLAAFPEDRSQPGQDCRFRVTQLPNGRDFHMSVVRARRNDSGTYLCGAISLAPKAQIKESLRAELRVTERRAEVPTAHPSPSPRPAGQFQTLVVGVVGGLLGSLVLLVWVLAVICSRAARGTIGARRTGQPLKEDPSAVPVFSVDYGELDFQWREKTPEPPVPCVPEQTEYATIVFPSGMGTSSPARRGSADGPRSAQPLRPEDGHCSWPLPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.:2)
[0194] 实施例3 亲和力检测
[0195] 芯片包被：用pH5.5,20mM NaAc缓冲液稀释重组抗原PD-1-Fc至20μg/ml。按照氨基酸偶联试剂盒使用说明进行偶联，先用EDC-NHS活化CM5芯片表面，然后偶联重组PD-1至CM5芯片，偶联水平预设值为2000RU，最终偶联量为2639.3RU。
[0196] KD测试：用HBS-EP缓冲液稀释PD1-1375(anti-PD-1ab)样品，分别稀释样品浓度至500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM。设置进样时间为3min，解离时间30min，再生缓冲液为20mM的pH2.0Gly-HCl，再生时间为30s，重复进样样品浓度为100mM。
[0197] 按照BiaCoreX100control soft的protocol进行上机测试，检测结果表明本发明单克隆抗体的KD＝0.34nM。
[0198] 表3和已知的PD-1抗体的亲和性比较
[0199]
[0200] 通过和已知的PD-1抗体比较，本发明抗体亲和性显著优于现有的PD-1抗体。显示本发明的单克隆抗体具有重大的开发成药潜力。
[0201] 实施例4 PD1-1375与PD-1竞争ELISA
[0202] 包被：PD-L1-Fc以5μg/ml的浓度溶解于PBS中进行抗原包被；每孔100μL加入板孔中，包被过夜。
[0203] 封闭：将已包被的板用洗涤液洗涤2次，每孔加入120μL封闭液，封闭一段时间，取出，甩干备用。
[0204] 竞争反应：在制备好的板中每孔加入50μL系列浓度的PD1-1375溶液和50μL浓度1μg/ml的PD-1-biotin溶液，孵育一段时间。
[0205] 洗板：用洗涤液洗涤5次。
[0206] 显色反应：每孔加入0.05％Streptavidin-HRP(Sigma)100μL，孵育一段时间。
[0207] 终止：每孔各加入终止液，在酶标仪上测定各孔的吸光值。
[0208] 实验结果如图3所示，测得EC50＝2850ng/mL。
[0209] 实施例5 PD1-1375与PDL1竞争ELISA
[0210] (1)包被：PD-1-Fc以5μg/ml的浓度溶解于PBS中进行抗原包被；每孔100μL加入板孔中，包被过夜。
[0211] (2)封闭：将已包被的板用洗涤液洗涤2次，每孔加入120μL封闭液，封闭一段时间，取出，甩干备用。
[0212] (3)竞争反应：在制备好的板中每孔加入50μL系列浓度的PD1-1375溶液和50μL浓度1μg/ml的PD-L1-biotin溶液，孵育一段时间。
[0213] (4)洗板：用洗涤液洗涤5次。
[0214] (5)显色反应：每孔加入0.05％Streptavidin-HRP(Sigma)100μL，孵育一段时间。
[0215] (6)终止：每孔各加入终止液，在酶标仪上测定各孔的吸光值。
[0216] 实验结果如图4所示：EC50＝1020ng/mL
[0217] 实施例6 PD1-1375激活PBMC实验
[0218] CD3抗体(购自eBioc ience公司)以3μg/ml的浓度溶解于PBS中包被96孔板；每孔加入5×105PBMC孵育；每孔加入100μL 20μg/ml的PD1-1375孵育4天；收集上清通过ELISA试剂盒检测IFN-γ分泌。
[0219] 阴性对照：不相关的IgG。
[0220] 阳性对照：PDL1的阻断抗体(MedImmune)。
[0221] 实验结果如图5所示：PD1-1375组分泌的IFN-γ显著高于对照组。
[0222] 实施例7 DSC检测PD1-1375热稳定性
[0223] PD1-1375以2mg/mL的浓度溶解于PBS；从1℃/min的速度从15℃升温至105℃。
[0224] 两个峰应该分别是CH2，Fab，CH3的Tm值。从逢高上看，Fab的Tm值和CH2基本重叠。结果如图6所示，可以看出该抗体具有良好的稳定性。
[0225] 4℃存放PD1-1375两个月后ELISA检测活性，发现变化不超过+/-5％，因此在此条件下，该抗体在2个月内保持稳定。
[0226] 实施例8 阻断PD-1增加PD-1+抗肿瘤T细胞的增殖
[0227] 实验方法：
[0228] (1)复苏冻存滤泡性淋巴瘤病人的单细胞悬液，去除死细胞，使用CD20/19微磁珠(Miltenyi生物公司，德国)，富集CD20/19双阳性的B细胞，即肿瘤细胞
[0229] (2)同时用负选法富集T细胞，将T细胞标记CFSE(Invitrogen/Life Technologies公司)
[0230] (3)将自身肿瘤细胞和自身T细胞混合培养(1:1)五天后，搜集上清，细胞经清洗后，标上抗人的CD4/8/PD1的抗体，使用流式细胞仪观察CFSE在CD4/CD8/PD1+/-T细胞中的稀释情况。
[0231] 实验结果如图7所示，本发明的抗PD1抗体可以显著增加CD4+PD1+及CD8+PD1+双阳性的TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)的增殖。
[0232] 实施例9 TIL的细胞因子激活
[0233] 实验方法：见实施例8的实验方法，使用Bio-Plex Pro Human Th1/Th2细胞因子试剂盒(Bio Rad)，将上述实施例8搜集的上清，和萤光磁珠混合后，使用Bio-Plex array reader读出荧光数据。
[0234] 实验结果如图8所示，本发明的PD1抗体可以显著增强肿瘤病人TIL的细胞因子(IFN-γ和TNF-α)产生，激活T细胞功能。
[0235] 实施例10 淋巴瘤移植模型检测抗体活性
[0236] RL淋巴瘤，一种来源于人的改造过的淋巴瘤细胞系，购自购自ATCC。皮下移植到SCID小鼠。
[0237] Ramos淋巴瘤，一种来源于人的伯基特淋巴瘤细胞系，购自购自ATCC。皮下移植到裸鼠。
[0238] 淋巴瘤移植模型检测PD-1抗体活性：
[0239] (1)1×106处于对数生长期的淋巴瘤细胞经注射到小鼠皮下。
[0240] (2)7天后，从尾静脉注射10μgαPD-1抗体。随后每隔6天注射一次，注射3次。对照使用同样体积的PBS。
[0241] (3)从第8天开始每天计算肿瘤大小，观察小鼠的死亡情况。
[0242] 实验结果如图9所示，RL-SCID模型用实线表示；Ramos-裸鼠模型用点断线表示，注射αPD-1抗体的两组小鼠的肿瘤生长显著低于注射PBS同组小鼠。因此，本发明的PD1抗体可以显著的抑制FL肿瘤生长(P<0.01)，延长动物模型的生存期(P<0.01)。
[0243] 淋巴瘤移植模型检测PD-1抗体+利妥昔单抗联合用药活性：
[0244] 每个肿瘤模型都分成三组：PBS组、利妥昔单抗组(RTX，腹腔注射200μg/mouse)、利妥昔单抗+PD1-1375组(静脉注射10μg/mouse)。Day1接种肿瘤，Day10、27、34、41注射利妥昔单抗(Rituximab)，Day13、20、27、34、41注射PD1-1375。
[0245] 实验结果如图10所示，注射αPD-1+RTX抗体的RL-SCID小鼠的生存率优于单独使用RTX，二者都优于对照组。注射αPD-1抗体的Ramos-裸鼠的生存率优于使用RTX，二者都优于对照组。因此，根据这两个动物实验模型，本发明的PD1抗体，结合利妥昔单抗药物，可以进一步抑制RL肿瘤生长，延长动物模型的生存期。
[0246] 讨论：
[0247] 滤泡性淋巴瘤TIL中，PD1表达显著增加；胃癌TIL中，PD1和Tim3表达均显著增加。本发明研制的PD1抗体，可以显著刺激滤泡性淋巴瘤病人肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)中，PD1阳性的CD4+TIL的增殖；该PD1抗体可以显著增强FL TIL的细胞因子产生，包括INF-γ和TNF-α。其它细胞因子也有表达增加的现象，包括：IL-2、GM-CSF、IL-10、IL-5；还可以显著刺激胃癌TIL中CD4+/CD8+T细胞细胞因子的产生；在淋巴瘤移植瘤模型试验中，PD1抗体可以显著抑制肿瘤的生长、改善小鼠生存期。与Rituximab联合使用，对动物模型生存期的改善更为显著；在体外实验中，联合阻断PD1和Tim3，表现出对胃癌细胞株的显著杀伤能力；上述试验结果说明，该PD1抗体是一株具有优越阻断性能的抗体。
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