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骨移 植物成骨潜能的增强

阅读：432发布：2020-05-12

专利汇可以提供骨移植物成骨潜能的增强专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及通过用Wnt多肽如脂质体Wnt多肽的活体外处理增强骨移植物的细胞存活和成骨潜能。特别地，本发明涉及骨移植物用人Wnt3a蛋白，优选脂质体人Wnt3a(LWnt3a)进行的活体外处理。，下面是骨移植物成骨潜能的增强专利的具体信息内容。

权利要求

1.有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理，其中所述细胞在含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理后具有生物标志物的提高的表达水平，该生物标志物包括Axin2，其中所述生物标志物的提高的表达水平是相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞。
2.根据权利要求1所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述生物标志物还包括Lef1。
3.根据权利要求1所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述生物标志物还包括Tcf4。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述细胞还具有包括Runx2、Osterix、骨钙蛋白或碱性磷酸酶的一种或多种生物标志物的提高的表达水平。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中Axin2或Lef1的所述提高的表达水平是提高的Axin2或Lef1基因表达的水平。
6.根据权利要求4所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中Runx2的所述提高的表达水平是提高的Runx2蛋白质表达的水平。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述Wnt蛋白是Wnt3a蛋白。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述细胞包括骨髓干细胞或骨髓祖细胞。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述细胞包括间充质干细胞或骨细胞。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述分离的骨移植物材料包含在含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理后具有降低的细胞凋亡的细胞，其中所述降低的细胞凋亡是相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞。
11.根据权利要求10所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述细胞中的降低的细胞凋亡相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞作为降低的半胱天冬酶活性来测量。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述分离的骨移植物材料包含在含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理后具有提高的细胞增殖的细胞，其中所述提高的细胞增殖是相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞。
13.根据权利要求12所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述细胞中的提高的细胞增殖相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞作为提高的有丝分裂活性来测量。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述分离的骨移植物材料是分离的人骨移植物材料。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的有效剂量的包含细胞的分离的骨移植物材料，其中所述分离的骨移植物材料从至少50岁的人受试者获得。
16.含有Wnt蛋白的脂质体在制备用于在受试者中增强骨移植物的细胞存活的药物中的用途，包括：
将包含经历所述含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的含有细胞的分离的骨移植物材料的样品活体外孵育以产生具有生物标志物的提高的表达水平的细胞，所述生物标志物包括Axin2。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述生物标志物还包括Lef1。
18.根据权利要求16所述的用途，其中所述生物标志物还包括Tcf4。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述细胞还具有包括Runx2、Osterix、骨钙蛋白或碱性磷酸酶的一种或多种生物标志物的提高的表达水平。
20.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述孵育的温度不超过37℃。
21.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述孵育的时间为1小时至36小时。
22.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述分离的骨移植物材料还包含与未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的骨移植物材料相比增强的成骨能力。
23.根据权利要求22所述的用途，其中所述增强的成骨能力包括与未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的骨髓细胞的骨生长体积相比1.5倍、2倍、3倍或更多的提高的骨生长体积。
24.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述细胞的提高的表达水平是相对于来自未经历含有Wnt蛋白的脂质体的活体外处理的分离的骨移植物材料的等同细胞。
25.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中Axin2或Lef1的所述提高的表达水平是提高的Axin2或Lef1基因表达的水平。
26.根据权利要求19所述的用途，其中Runx2的所述提高的表达水平是提高的Runx2蛋白质表达的水平。
27.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述细胞包括骨髓干细胞或骨髓祖细胞。
28.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述细胞包括间充质干细胞或骨细胞。
29.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述分离的骨移植物材料是分离的人骨移植物材料。
30.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述分离的骨移植物材料从至少50岁的人受试者获得。
31.含有Wnt蛋白的脂质体在制备用于在受试者中增强骨移植物的细胞存活的药物中的用途，包括：
分离包含来自人受试者的细胞的骨移植物样品；和
将所述骨移植物样品与含有Wnt3a蛋白的脂质体活体外孵育足够的时间以产生相对于来自未与含有Wnt3a蛋白的脂质体孵育的骨移植物材料的等同细胞具有生物标志物的提高的表达水平的增强的细胞，所述生物标志物包括Axin2。
32.根据权利要求31所述的用途，其中所述生物标志物还包括Lef1。
33.根据权利要求31所述的用途，其中所述生物标志物还包括Tcf4。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的用途，其中所述增强的细胞还具有包括Runx2、Osterix、骨钙蛋白或碱性磷酸酶的一种或多种生物标志物的提高的表达水平。

说明书全文

骨移植物成骨潜能的增强

技术领域

[0001] 本发明涉及通过用Wnt多肽如脂质体Wnt多肽进行的活体外处理增强骨移植物的成骨潜能。特别地，本发明涉及用Wnt3a蛋白，优选脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)对骨移植物的活体外处理。

背景技术

[0002] 矫形和牙科植入物用于多种关节和牙齿置换及促进人体和动物中的骨修复，特别是髋和膝关节及牙齿的置换。虽然许多个体经历简单的愈合和功能恢复，但也存在高的并发症率，对于全关节置换估计为10-20％。植入物-骨骼界面处的故障造成这些失败中的大部分并使得随后的矫正手术成为必要。另外，用作正畸牙移动的锚固装置的植入物据估计具有40％的失败率且由于植入物-骨骼界面处的故障使得随后布置另外的植入物成为必要。

[0003] 矫形和牙科植入物由相对惰性的材料(“异种成形(alloplastic)”材料)(通常金属和陶瓷或塑料的组合)制成。之前用于改善矫形植入物手术的结果的途径主要集中于植入物表面的物理改变，其设计为用于增加骨形成。这些途径包括使用具有多孔金属表面的植入物以促进骨内生和用羟磷灰石乳浆(hydroxyapatite plasma)喷射植入物。使用牙科植入物的途径也包括使用形态增强的钛表面，其中表面粗糙度通过如喷砂、酸蚀刻或氧化的方法赋予。

[0004] 也试图促进骨整合，其中植入物表面发生大的改变。例如，包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的短肽连接于植入物的表面，因为细胞利用RGD序列以粘附于细胞外基质。研究者尝试再建这种细胞与改性的植入物表面的粘附，但这一策略仅导致植入物骨整合和机械固定的轻度增加。或者，在尝试刺激植入物周围的血管内生时，它们的表面用包含血管生成生长因子VEGF的涂层涂覆。浸入盐水溶液中的植入物已作为增加植入物骨整合的手段上市，但具有很少或没有数据证实所声称的效果。

[0005] 用于刺激骨整合的另一策略是使植入物表面纳米织构化(nano-texture)。这一策略的基本原理是织构化增加表面积并因此防止植入物相对于在植入物周围环境中的细胞“滑动”。但是在临床试验中，纳米织构化未产生可测量的益处。

[0006] 用于刺激植入物骨整合的基于蛋白质的方式的使用也已经进行了广泛研究。重组骨形态发生蛋白(BMP)在骨折中诱导稳健的骨形成且它们也已经用于试图刺激植入物周围的直接骨形成。尽管体外结果是令人鼓舞的，但体内数据仍然不能令人信服。重组BMP抑制骨髓腔中细胞的成骨分化并因此禁用于植入物骨整合。参见Sykaras等(2004)Clin Oral Investig 8(4):196-205和Minear等(2010)Journal of Bone and Mineral Research 25(6):1196-207。BMP的使用与异位骨化发生率的提高和不受控的炎症相关，且较新的元数据分析也表明增加的癌症风险。

[0007] Wnt蛋白形成高度保守的分泌信号传导分子的家族，其结合由Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)编码的细胞表面受体。WNT基因家族由编码分泌的信号传导蛋白质的结构相关的基因组成。这些蛋白质牵涉到肿瘤发生及几种发育过程，包括细胞命运的调控和胚胎发生过程中的模式形成。一旦结合，配体启动细胞内事件的级联，其最终通过β-连环蛋白和DNA结合蛋白TCF的核活性导致靶基因的转录(Clevers H,2004 Wnt signaling:lg-norrin the dogma.Curr Biol 14:R436-R437；Nelson WJ,Nusse R 2004 Convergence of Wnt,beta-catenin,and cadherin pathways.Science 303:1483-1487；Gordon MD,Nusse 2006 Wnt signaling:Multiple pathways,multiple receptors,and multiple transcription factors.J Bioi Chem 281:22429-22433)。

[0008] Wnt也涉及到与骨发生的程序相关的广泛的细胞决策。例如，Wnt调节sox9和runx2的表达水平，其影响间充质祖细胞定型为软骨生成或骨生成细胞的命运。Wnt影响骨原细胞的分化率。在成年动物中，有大量证据证明Wnt信号传导调节骨量。例如，人Wnt共受体LRP5中的功能获得性突变与几种高骨量综合征相关，包括I型骨质石化病和骨内膜骨质增生或常染色体显性骨硬化病。Wnt功能丧失性突变引起低骨量疾病，包括骨质疏松症-假神经胶质瘤。Wnt抑制剂Dkkl的产生增加与多发性骨髓瘤(具有增加的骨吸收作为其区别特征之一的一种疾病)相关。对于进一步的详细信息，参见S.Minear等,Wnt proteins promote bone regeneration.Sci.Transl.Med.2,29ra30(2010)；Zhao等,Controlling the in vivo activity of Wnt liposomes,Methods Enzymol 465:331-47(2009)；Popelut等,The acceleration of implant osseointegration by liposomal Wnt3a,Biomaterials 31 9173e9181(2010)和Morrell NT,Leucht P,Zhao L,Kim J-B,ten Berge D等(2008)Liposomal Packaging Generates Wnt Protein with In Vivo Biological Activity.PLoS ONE 3(8):e2930。

[0009] 已证明将Wnt蛋白与脂质囊泡(脂质体)组合产生具有生物活性的Wnt制剂(Morrell等,2008,同上；和Zhao等,2009,同上)(Minear等,2010,同上；和Popelut等,2010,同上)。可溶性无翅蛋白(wingless protein)的生物活性描述于van Leeuwen等(1994)Nature 24:368(6469):3424中。使用可溶性生物活性脊椎动物Wnt蛋白对Wnt-Frizzled相互作用的生物化学表征由Hsieh等(1999)Proc Natl Acad Sci US A 96(7):3546-51描述。Bradley等(1995)Mol Cell Bioi 15(8):4616-22描述了具有促有丝分裂活性的Wnt蛋白的可溶性形式。使用脂质体Wnt蛋白增强骨整合描述于美国专利公开No.20120115788中。

发明内容

[0010] 在一个方面，本发明涉及一种增强骨移植物中的细胞存活的方法，包括使骨移植物经历Wnt多肽的活体外处理。在另一个方面，本发明涉及一种增强骨移植物的成骨潜能的方法，包括使骨移植物经历有效剂量的Wnt多肽(包括，但不限于Wnt3A)的活体外处理。在进一步的方面，本发明涉及一种复活(revitalizing)来自具有降低的治愈潜能的受试者的骨移植物的方法，包括使骨移植物经历Wnt多肽的活体外处理。在所有方面中，骨移植物可以是自体移植物或同种异体移植物。在所有方面中，骨移植物可以包含干细胞群体，例如，举例来说，骨髓来源的干细胞群体，例如骨髓来源的间充质干细胞。

[0011] 骨移植物优选来自人类受试者。在一个实施方式中，人类受试者是老年患者。在某些实施方式中，人类受试者至少50岁，至少55岁，至少60岁或至少65岁或至少70岁或至少75岁或至少80岁或至少85岁。在另一实施方式中，人类受试者具有降低的治愈潜能，例如，是吸烟者、糖尿病患者或特征在于营养缺陷的人。

[0012] 在所有方面和实施方式中，Wnt多肽优选为Wnt3a，更优选人Wnt3a，最优选脂质体人Wnt3a(L-Wnt3a)。在进一步的方面，本发明的方法进一步包括将骨移植物引入接受者如人类患者中的步骤。在各种实施方式中，骨移植物可以用于支持牙种植体、修复骨折。在另一实施方式中，骨移植物用于修复或重建病变的骨骼。在再另一实施方式中，骨移植物用于接受者的髋部、膝部或脊柱中。附图说明

[0013] 图1A-1J.骨移植物具有成骨潜能。图1-A.从转基因β肌动蛋白-增强绿色荧光蛋白(β-肌动蛋白-eGFP)雄性小鼠收获的全骨髓的代表性等份样品中总DNA的定量；各等份样品构成骨移植物。图1-B.骨移植物移植到2-mm直径的临界尺寸(critical-size)颅盖缺陷(用圆圈界定)中，其在分隔顶骨的矢状缝中形成(用垂直白色虚线描绘轮廓)。黑色虚线表示组织切片的平面。图1-C.移植后第1天来自损伤位点的代表性组织切片；GFP免疫染色鉴别来自eGFP供体(n＝5)的移植细胞；下部空间代表矢状窦。图1-D.移植后第5天的代表性组织切片；溴脱氧尿苷(BrdU)的免疫染色鉴别S期的细胞。图1-E.移植后第7天，GFP免疫染色鉴别骨移植物(黄色点线)；图1-E中方框区域的更高放大倍数图象(图1-F)显示损伤位点的大部分细胞源自GFP-阳性移植物。图1-G.移植后第14天，微-CT重建确认2-mm颅盖损伤构成临界尺寸的非愈合缺陷(n＝6)40。图1-H.用骨移植物处理的相同尺寸颅盖损伤愈合(n＝6)。图1-I和1-J.移植后第7天，苯胺蓝染色用于鉴别新的骨样基质；没有骨样基质在未处理的损伤位点中形成(黄色点线)。图1-J显示用骨移植物处理的代表性样品中移植后第7天的可见骨样基质。缩写：IHC＝免疫组织化学。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺：2mm(图1-B)；200μm(图1-C和1-D)；100μm(图1-E)；40μm(图1-F)；2mm(图1-G)和200μm(图1-I和1-J)。

[0014] 图2A-2I.来自老年动物的骨移植物中成骨潜能降低。在移植后第7天(d7)，苯胺蓝染色表明通过来自年轻供体(图2-A)与老年供体(图2-B)的骨移植物产生的骨样基质。图2-C.由年轻和老年骨移植物形成的新骨量的组织形态测定分析。图2-D.在移植后第7天(d7)，绿色荧光蛋白(GFP)免疫染色鉴别在供体年轻时源自骨移植物的细胞，与老年供体(图2-E)相比。图2-F.当移植物从年轻供体(蓝色条，n＝13)收获时与老年供体(白色条，n＝13)相比损伤位点中的GFP-阳性(GFP+ve)细胞数。在移植后第5天(d5)，溴脱氧尿苷(BrdU)染色鉴别来自年轻供体(图2-G)和老年供体(图2-H)的骨移植物中的增殖细胞。图2-I.来自年轻和老年动物的骨移植物中增殖细胞核抗原(PCNA)的定量反转录聚合酶链式反应(qRTPCR)是等同的。单一星号表示p<0.05。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺：200μm(图2-A。[图2-A中的标尺也应用于图2-B]、2-D[图2-D中的标尺也应用于图2-E]和2-G[图2-G中的标尺也应用于图2-H])。

[0015] 图3. Wnt信号传导在老年骨移植物中减少。图3-A.评估从年轻供体(蓝色条，n＝3)和老年供体(白色条，n＝3)收获的骨髓(BM)中Wnt配体和Wnt靶基因(图3-B)相对表达水平的定量RT-PCR。基因表达水平相对于甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)归一化。星号表示p<
0.05。

[0016] 图4.脂质体Wnt3a恢复老年骨移植物的成骨能力。图4-A.L-PBS处理的老年骨移植物(n＝5)的苯胺蓝染色。图4-B.L-Wnt3a处理的骨移植物(n＝8)中新的苯胺蓝阳性骨样基质。图4-C.在移植后第7和12天新骨基质的组织形态测定定量。图4-D.L-PBS和L-Wnt3a(图4-E)处理的骨移植物中移植后第12天(d12)的苯胺蓝染色。图4-F.相对于如在来自收获的骨髓的细胞群体(未粘附的浮动细胞和粘附的细胞)中测量的总DNA归一化的β半乳糖苷酶(β-gal)活性。白色条(n＝4)代表L-PBS处理后的Wnt反应性；蓝色条(n＝4)代表L-Wnt3a处理(有效浓度0.15μg/mL Wnt3a)后的Wnt反应性。图4-G.源自骨髓的粘附细胞中干细胞标志物CD45、CD73、CD105和Stro1的免疫染色。图4-H.相对于L-PBS处理后(白色条,n＝4)或L-Wnt3a处理后(n＝4；有效浓度0.15μg/mL Wnt3a)粘附细胞群体中的总DNA归一化的β半乳糖LacZ/+
苷酶(β-gal)活性。图4-I.代表性组织切片上的Xgal染色鉴别来自老年Axin2 小鼠的L-PBS处理的骨移植物中的Wnt反应性细胞，与L-Wnt3a处理(图4-J)相比较。图4-K.代表性组织切片上的Xgal染色鉴别来自年轻Axin2LacZ/+小鼠的L-PBS处理骨移植物中的Wnt反应性细胞。单一星号代表p<0.05；四星号代表p<0.0001。缩写：L-PBS＝脂质体PBS；L-Wnt3a＝脂质体Wnt3a；BM＝骨髓；和DAPI＝4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，二氢氯化物。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺：100mm(图4-A[图4-A中的标尺也应用于图4-B])；200mm(图4-D[图4-D中的标尺也应用于图4-E])；100mm(图4-G)和40mm(图4-I,[图4-I中的标尺也应用于图4-J和4-K])。

[0017] 图5. L-Wnt3a处理恢复来自老年动物的骨移植物的成骨潜能。来自老年兔供体的骨髓，测定与细胞凋亡相关的DNA断裂。图5-A.末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色(n＝4)证明L-PBS(10mL)处理的老年骨髓中的凋亡程度，与L-Wnt3a处理(图5-B)(有效浓度＝0.15μg/mL Wnt3a)相比。图5-C.L-PBS处理(白色条)或L-Wnt3a处理(蓝色条)的老年骨移植物样品中半胱天冬酶活性的测量。图5-D至5-G.骨髓从老年兔收获，用L-PBS或L-Wnt3a孵育最多1h，然后移植到尺骨中形成的临界尺寸缺陷中。图5-D.骨移植后四周时的放射影像学评估。将L-PBS处理与L-Wnt3a处理(图5-E)相比较。图5-F.骨移植后八周时的微-CT等值面重建(iso-surface reconstruction)。将L-PBS处理与L-Wnt3a处理(图5-G)相比交。图5-H.骨体积(BV)和骨体积/总体积(BV/TV)使用GE MicroView 软件中的骨分析工具计算。单一星号表示p<0.05。缩写：L-PBS＝脂质体PBS和L-Wnt3a＝脂质体Wnt3a。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺：40mm(图5-A和5-B)及5mm(图5-F和5-G)。

[0018] 图6.源自L-Wnt3a处理老年骨移植物的再生骨的组织学外观。用在L-PBS(图6-A)或L-Wnt3a(图6-B)中孵育的老年骨髓处理的损伤位点(加框区域)的苯胺蓝染色。图6-C.老年主体脂肪骨髓腔及接受L-PBS处理的老年骨移植物的邻近损伤区域(图6-D)的Gomori三色染色；纤维组织染色成翠蓝色(turquoise blue)。图6-E.老年主体脂肪骨髓腔及接受L-Wnt3a处理的老年骨移植物的邻近损伤区域(图6-F)的Gomori三色染色；成熟骨样基质染色成深蓝绿色(dark turquoise)和骨细胞核染色成红色。图6-G.在偏振光下，天狼猩红染色鉴别由用L-PBS处理的老年骨移植物形成的纤维组织。与用L-Wnt3a处理的老年骨移植物所形成的骨样基质(图6-H)相比较。缩写：L-PBS＝脂质体PBS和L-Wnt3a＝脂质体Wnt3a。箭头标明完整骨骼的边缘。标尺：500μm(图6-A和6-B)；100μm(图6-C至6-F)和200μm(图6-G和6-H)。

[0019] 图7.骨移植物材料包含干细胞和祖细胞群体。从大鼠股骨(A)、(B)髂嵴和(C)胫骨收获的BGM的Gomori染色。(D)从所示来源新收获的大鼠BGM中内源成骨基因表达的定量RTPCR分析。(E)实验设计的示意图，其中自体BGM移植到大鼠SRC中。(F)移植后第7天髂嵴BGM的代表性组织切片，经染色以检测BrdU掺入。点线指示BGM中包括的松质骨片。(G)Runx2、(H)Sox9和(I)PPARγ表达。(J)BGM的代表性组织切片用苯胺蓝染色以检测骨样基质；星号指示与老骨碎片(黄色点线)相反的新骨基质。肾表面在该图中和在G中用白色点线指示。(K)番红O/快绿组织学以检测富含蛋白聚糖的软骨(红色)，和(L)Gomori三色染色以检测脂肪细胞。缩写：BrdU,溴脱氧尿苷；PPARγ,过氧物酶体增殖物活化蛋白γ。标尺：50μm，星号：p<0.05。

[0020] 图8.骨移植物材料是Axin2CreERT2；R26mTmG小鼠中的Wnt反应性GFP+ve细胞，骨膜(A)和骨内膜(B)通过免疫染色可视化。(C)指定的显微镜视野内GFP+ve细胞/总细胞的定量。+ve 年轻老年
(D)BGM中的GFP 细胞通过荧光可视化。(E)BGM (绿色条)和BGM (灰色条)中内源Axin2、Lef1和GAPDH表达的定量绝对RT-PCR结果。(F)BGM年轻(绿色条)和BGM老年(灰色条)中Wnt3a、总β连环蛋白、Axin2和β肌动蛋白的蛋白质印迹分析。标尺＝50μm。星号：p<0.05。

[0021] 图9. BGM的成骨分化潜能随年龄下降。(A)BGM年轻(绿色条)和BGM老年(灰色条)中碱性磷酸酶、Osterix和骨钙蛋白表达的定量RT-PCR分析。从ACTB-eGFP小鼠收获的BGM，移植到SRC中并在亮视野(B)和(C)荧光下可视化以检测BGM中的GFP信号。来自(D)BGM年轻(N＝5)和(E)BGM老年(N＝5)的用苯胺蓝(插图)染色的代表性组织切片。点线指示表面。(F)在移植后第7天BGM占据的总区域内苯胺蓝+ve 像素的组织形态测定分析。来自(G)BGM年轻(N＝5)和(H)老年BGM (N＝5)的经染色以检测ALP活性的代表性组织切片。(I)在移植后第7天BGM占据的总区域内ALP+ve像素的定量。来自(J)BGM年轻(N＝5)和(K)BGM老年(N＝5)的对于GFP免疫染色的代表性组织切片。(L)在移植后第7天BGM占据的总区域内GFP+ve像素的定量。缩写：ALP,碱性磷酸酶；Oc,骨钙蛋白。标尺：100μm。星号:p<0.05；双星号：p<0.01。

[0022] 图10. BGM的成骨分化需要内源Wnt信号。用(A)鼠IgG2αFc片段(Ad-Fc)或(B)表达可溶性Wnt拮抗剂Dkk1的腺病毒(Ad-Dkk1)处理的BGM中对于ALP活性进行染色的代表性组织切片。用(C)Ad-Fc或(D)Ad-Dkk1处理的BGM中对于PPARγ免疫染色的代表性组织切片。用(E)Ad-Fc或(F)Ad-Dkk1处理的BGM中对于Dlk1免疫染色的代表性组织切片。检测接受用(G)Ad-Fc或(H)Ad-Dkk1处理的BGM的缺陷位点中骨形成的微-CT重建。原始缺陷用点状红色圆圈指示。(I)从微-CT数据±SEM计算的新骨体积(N＝5)。来自接受用(J)Ad-Fc或(K)Ad-Dkk1处理的BGM的缺陷位点的代表性组织切片的苯胺蓝染色。(L)使用组织形态测定分析的新骨体积定量(参见方法)。用(I)Ad-Fc或(J)Ad-Dkk1处理的BM移植物中的PPAR-γ表达。单一星号：p<0.05。标尺：A-B,200μm,CF,J-K,50μm,G-H,2mm。

[0023] 图11. Wnt3a激活BGM老年并恢复其成骨分化潜能。(A)来自老年ACTB-eGFP小鼠的BGM，用L-PBS或L-WNT3A(0.15μg/ml)处理1h，然后通过qRT-PCR测定24h后靶基因表达或立即移植到SRC中7天。(B)用L-PBS(灰色条)或L-WNT3A(蓝色条)处理的BGM老年中Axin2和Lef1表达的倍数变化。(C)用L-PBS(灰色条)或L-WNT3A(蓝色条)处理的BGM老年中总β连环蛋白、老年Axin2和β肌动蛋白的蛋白质印迹分析。在移植后第4天从SRC收获BGM 后，来自(D)L-PBS(N＝5)和(E)L-WNT3A的代表性组织切片对于BrdU掺入进行染色(N＝5)。(F)中心定位于骨移植物中间的显微镜视野内BrdU+ve像素的定量。来自(G)L-PBS(N＝5)和(H)L-WNT3A(N＝5)处理的样品的代表性组织切片，在移植后第7天对于BrdU掺入进行染色。(I)如上BrdU+ve像素的定量。来自(J)L-PBS(N＝5)和(K)L-WNT3A(N＝5)处理的样品的代表性组织切片，在移植后第7天对于Dlk1表达进行免疫染色。(L)在移植后第7天BGM占据的总区域内Dlk1+ve像素的定量。来自(M)L-PBS(N＝5)和(K)L-WNT3A(N＝5)处理的样品的代表性组织切片，在移植后第7天对于Oc表达进行免疫染色。(O)如对于Dlk1描述的Oc+ve像素的定量。(P)L-PBS(N＝
5)和(Q)L-WNT3A(N＝5)处理的样品中用苯胺蓝染色以检测骨样基质的代表性组织切片。
(R)新骨基质的组织形态测定定量；详细信息参见方法。缩写如之前图例中。标尺:100μm。星号：p<0.05；双星号：p<0.01。

[0024] 图12. L-WNT3A刺激BGM干细胞并改善脊柱融合。(A)人MSC培养物在37℃下用L-PBS或L-WNT3A处理所示的时间点，且Axin2表达的qRTPCR用于测定Wnt-反应。(B)鼠SSC在37℃下用L-PBS或LWNT3A处理12h，且Wnt反应用Axin2表达的qRT-PCR进行分析。(C)响应于室温下L-PBS(虚线)或L-WNT3A(0.15μg/mL；蓝色线)1h孵育的Axin2和Lef1表达的定量绝对RT-PCR分析。数据表示为24h时间段内RNA拷贝/总RNA含量的比率。(D)大鼠棘突通过最小切口暴露，且来自髂嵴的标准化体积的自体BGM用L-PBS或L-WNT3A处理1hr，然后(E)移植在L4和L5脊椎骨的横突之间。在POD2时，对于用(F)L-PBS和(G)L-WNT3A处理的图形(粉红色)进行微-CT探测(acquisition)。在POD49时，再次进行微-CT探测以评估用(H)L-PBS(灰色)和(I)L-WNT3A(蓝色)处理的移植物的骨生长。(I)移植物生长作为倍数体积对于各处理组作图，将POD2时的各移植物尺寸与其POD49时的尺寸(如上所述通过颜色指示)相比较。缩写：L4,腰椎#4,L5,腰椎#5,AP,顶突,SP,棘突,TP,横突,POD,手术后天。

具体实施方式

[0025] 定义

[0026] 在描述本方法之前，要理解本发明不限于所描述的特定方法，因此其当然可以是变化的。也应理解本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，且不意图是限制的，因为本发明的范围仅由所附的权利要求限定。在提供值的范围的情况中，应理解在该范围的上限和下限之间的中间值(到下限值的十分之一单位，除非上下文明确指定另外的情况)及在该指定范围中的任何其它指定的或中间的值包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在本发明涵盖的较小范围内，但服从于指定范围中任何特别地排除的限制。除非另外限定，本文中使用的技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)为本领域技术人员提供了本申请中使用的许多术语的一般指导。

[0027] 本文中提及的所有出版物通过引用明确并入本文以公开和描述与引用该出版物相关的方法和/或材料。

[0028] Wnt蛋白。Wnt蛋白形成高度保守的分泌信号分子的家族，其在胚胎发生过程中调节细胞-细胞相互作用。术语“Wnt”或“Wnt基因产物”或“Wnt蛋白”或“Wnt多肽”可互换使用并包括原始序列Wnt多肽、Wnt多肽变体、Wnt多肽片段和嵌合Wnt多肽。在本发明的一些实施方式中，Wnt蛋白包含与半胱氨酸残基共价结合的棕榈酸酯。“原始序列”多肽是具有与天然来源的Wnt多肽相同的氨基酸序列的多肽，无论用于其产生的方法。这样的原始序列多肽可以从产生内源Wnt蛋白的细胞分离或可以通过重组或合成方式产生。因此原始序列多肽可以具有例如天然存在的人多肽、鼠多肽或者来自任何其它哺乳动物物种或来自非哺乳动物物种(例如果蝇、秀丽隐杆线虫等)的多肽的氨基酸序列。

[0029] 术语“原始序列Wnt多肽”包括，但不限于，人和鼠Wnt多肽。人Wnt蛋白包括以下：Wnt1,Genbank参考号NP005421.1；Wnt2,Genbank参考号NP003382.1,其在脑中在丘脑中、在胎儿和成人的肺中和在胎盘中表达；Wnt2B的两种异形体,Genbank参考号NP004176.2和NP078613.1。异形体1在成人心脏、脑、胎盘、肺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠和结肠中表达。在成人脑中，它主要在尾状核、丘脑底核和丘脑中发现。也在胎儿脑、肺和肾中检测到。异形体
2在胎儿脑、胎儿肺、胎儿肾、尾状核、睾丸和癌细胞系中表达。Wnt 3和Wnt3A在发育神经管的形态发生过程中发挥明显的细胞-细胞信号传导作用，并分别具有Genbank参考号NP11
0380.1和X56842(Swiss-Prot P56704)。

[0030] 原始人Wnt3A氨基酸和核苷酸序列分别特别地公开为SEQ ID NO:1和2。Wnt3A在骨髓中表达。Wnt 4具有Genbank参考号NP110388.2。Wnt 5A和Wnt 5B具有Genbank参考号NP003383.1和AK013218。Wnt 6具有Genbank参考号NP006513.1；Wnt 7A在胎盘、肾、睾丸、子宫、胎儿肺及胎儿和成人脑中表达，Genbank参考号NP004616.2。Wnt 7B在胎儿脑中中度表达，在胎儿肺和肾中弱表达，且在成人脑、肺和前列腺中微弱表达，Genbank参考号NP478679.1。Wnt 8A具有两个选择性转录本(alternative transcript)，Genbank参考号NP114139.1和NP490645.1。Wnt 8B在前脑中表达，并具有Genbank参考号NP003384.1。Wnt 10A具有Genbank参考号NP079492.2。Wnt 10B在大多数成人组织中检测到，在心脏和骨骼肌中具有最高水平。它具有Genbank参考号NP003385.2。Wnt 11在胎儿肺、肾、成人心脏、肝脏、骨骼肌和胰腺中表达，并具有Genbank参考号NP004617.2。Wnt 14具有Genbank参考号NP003386.1。Wnt 15在胎儿肾和成人肾中中度表达，且也在脑中发现。它具有Genbank参考号NP003387.1。Wnt 16具有两个异形体，Wnt-16a和Wnt-16b，其通过可变剪接产生。异形体Wnt-16B在外周淋巴器官如脾、阑尾(appendix)和淋巴结中、在肾中表达，但不在骨髓中表达。异形体Wnt-16a仅在胰腺中以显著水平表达。Genbank参考号是NP057171.2和NP476509.1。所列举的全部GenBank、SwissProt和其它数据库序列在此明确通过引用并入。

[0031] 术语“原始序列Wnt蛋白”或“原始序列Wnt多肽”包括具有或不具有起始N-末端甲硫氨酸(Met)和具有或不具有原始信号序列的原始蛋白质。该术语特别地包括352氨基酸长的原始人Wnt3a多肽，具有或不具有其N-末端甲硫氨酸(Met)和具有或不具有原始信号序列。

[0032] “变体”多肽是指与原始序列多肽具有低于100％的序列同一性的，如下定义的生物活性多肽。这样的变体包括其中一个或多个氨基酸残基添加到原始序列的N-或C-末端或者原始序列内；大约一至四十个氨基酸残基被删除和任选地被一个或多个氨基酸残基置换的多肽，及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基被共价修饰以使得所得产物具有非天然发生的氨基酸。通常，生物活性Wnt变体的氨基酸序列与原始序列Wnt多肽具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％，更优选至少约99％。

[0033] “嵌合”Wnt多肽是包含与异源多肽融合或结合的Wnt多肽或其部分(例如，一个或多个结构域)的多肽。嵌合Wnt多肽一般与原始序列Wnt多肽共有至少一种共同的生物学性质。嵌合多肽的实例包括免疫粘附素，将Wnt多肽的一部分与免疫球蛋白序列结合，和附加表位的多肽，其包含与“标签多肽”融合的Wnt多肽或其部分。标签多肽具有足够的残基以提供可以针对其产生抗体的表位，且还足够短以使得其不干扰Wnt多肽的生物活性。合适的标签多肽一般具有至少六个氨基酸残基且通常约6-60个氨基酸残基。

[0034] 原始序列Wnt多肽的“功能性衍生物”是具有与原始序列Wnt多肽共同的定性生物学性质的化合物。“功能性衍生物”包括，但不限于，原始序列的片段和原始序列Wnt多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与对应的原始序列Wnt多肽共同的生物学性质。术语“衍生物”涵盖Wnt多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰。

[0035] 生物活性Wnt。本发明的方法提供在体内施用于动物(例如，哺乳动物，如人)时为活性的Wnt组合物。可以通过在功能性分析(例如，体外分析)中或在测试模型(例如，加速骨再生、干细胞增殖的上调等)中体内施用后测定活性水平、在非功能性分析(例如，免疫染色、ELISA、考马斯或银染凝胶上的定量等)中定量存在的Wnt蛋白量和测定体内生物活性Wnt与总Wnt的比率来测定Wnt蛋白的比活性。

[0036] 脂质结构。如本发明的方法中使用的，发现脂质结构在体内施用后维持Wnt蛋白的活性方面是重要的。Wnt蛋白未包封在这些结构的水相中，而是相反整合到脂质膜中，且可以插入膜的外层中。这样的结构不是从例如脂质体中常规的配制蛋白质的方法预测到的。具有这种脂质结构的Wnt多肽在本文中称为L-Wnt，如L-Wnt3a。用于系留Wnt蛋白到脂质体或胶束的外表面的方法可以利用序列以便强调蛋白质的脂质体外展示，其中首先预制粗脂质体；Wnt蛋白然后添加到粗混合物中，其有利于添加脂质体外Wnt，接着进行各种配制步骤，其可以包括尺寸过滤(size filtering)、透析等等。合适的脂质包括脂肪酸、中性脂肪如三酰基甘油、脂肪酸酯和皂、长链(脂肪)醇和蜡、鞘氨醇(sphingoids)和其它长链碱、糖脂、鞘脂、胡萝卜素类、聚戊烯醇、甾醇等等，以及萜类和类异戊二烯。例如，可以使用如二乙炔磷脂的分子。包括的是具有疏水性和亲水性部分、净正电荷的阳离子分子，包括脂质、合成脂质和脂质类似物，且其自身可以自发地在水中形成双层囊泡或胶束。用中性电荷(例如DMPC)制备的脂质体是优选的。该术语还包括可以与磷脂组合稳定地并入脂质胶束或双层中的任何两性分子，使得其疏水性部分与胶束或双层膜的内部疏水性区域接触和其极性头基部分朝向膜的外部极性表面定向。

[0037] 术语“阳离子两性分子”意图涵盖在生理pH下带正电的分子，且更特别地结构性地带正电的分子，包括例如季铵盐部分。阳离子两性分子通常由亲水性极性头基和亲脂性脂肪链组成。类似地，具有阳离子极性头基的胆固醇衍生物也可以是有用的。参见，例如Farhood等(1992)Biochim.Biophys.Acta 1111:239-246；Vigneron等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)93:9682-9686。目标阳离子两性分子包括，例如咪唑啉盐衍生物(WO 95/14380)、胍衍生物(WO 95/14381)、磷脂酰胆碱衍生物(WO 95/35301)和哌嗪衍生物(WO 95/14651)。可以用于本发明中的阳离子脂质的实例包括DOTIM(也称为BODAI)(Saladin等,(1995)Biochem.34:13537-13544)、DDAB(Rose等,(1991)BioTechniques 10(4):520-525)、DOTMA(美国专利No.5,550,289)、DOTAP(Eibl和Wooley(1979)Biophys.Chern.10:261-271)、DMRIE(Feigner等,(1994)J.Bioi.Chern.269(4):2550-
2561)、EDMPC(购自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Ala.)、DCC hoi(Gau和Huang(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179:280-285)、DOGS(Behr等,(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6982-6986)、MBOP(也称为MeBOP)(WO 95/14651)和WO 97/
00241中描述的那些。

[0038] 尽管不是活性所必需的，但在一些实施方式中，脂质结构可以包括靶向部分，例如与亲水性头基共价或非共价结合的靶向部分。可用于结合靶向部分的头基包括，例如生物素、胺类、氰基、羧酸、异硫氰酸酯、硫醇、二硫化物、α-卤素羰基(ahalocarbonyl)化合物、a,p-不饱和羰基化合物、烷基肼等。可用于将靶向部分连接于两性分子的化学基团也包括氨基甲酸酯、酰胺(胺+羧酸)、酯(醇+羧酸)、硫醚(卤代烷+巯基；马来酰亚胺+巯基)、席夫碱(胺+醛)、脲(胺+异氰酸酯)、硫脲(胺+异硫氰酸酯)、磺酰胺(胺+磺酰氯)、二硫化物、腙(hyrodrazone)、脂质等等，如本领域中已知的。例如，靶向分子可以通过将商购的脂质如DAGPE、PEG-PDA胺、DOTAP等转化成异氰酸酯，接着用三乙二醇二胺间隔子处理以产生胺封端的硫代氨基甲酸酯脂质(其通过用靶向部分的对-异硫氰酸基苯基糖苷处理产生所需的靶向糖脂)而形成。这种合成提供间隔在整合到纳米颗粒中的两性分子与结合于细胞表面受体的配体之间的水溶性柔性接头分子，从而允许配体可容易地达到细胞表面上的蛋白质受体。关于脂质体Wnt组合物及其用途的进一步信息在美国专利申请公开20120115788中发现。

[0039] 术语“骨移植物”在本文中以最宽泛的含义使用，且特别地包括分别从患者的自身骨骼或从接受移植的个体以外的个体(包括尸体)收获的自体移植物和同种异体移植物。术语“骨移植物”也包括自体或同种异体多能干细胞群体，例如从骨髓收获的干细胞，例如骨髓来源的间充质干细胞。骨移植物可以通过各种方式从供体获得，包括但不限于扩髓(reamer)、灌注、抽吸方法。

具体实施方式

[0040] 成骨效能通过用有效剂量的Wnt蛋白，例如L-Wnt3A，孵育用于骨移植物的细胞足以增强成骨潜能的时间段来增强。

[0041] 如本文中使用的，骨移植物材料指从供体获得的细胞组合物，该供体可以是活体或尸体。骨移植物材料通常包含复杂的细胞群体，并包括干细胞如间充质干细胞，且也可以包含骨细胞及其祖细胞。供体相对于接受者可以是同种异体的或自体的。用于骨移植物的细胞的质量可能随供体、接受者、移植目的等等而变化。骨移植物可以包含最多约103、最多约104、最多约105、最多约106、最多约107、最多约108、最多约109、最多约1010或更多的细胞。

[0042] 骨移植物材料从供体获得，例如从髂嵴、从下颌联合(下巴区域)、从股骨和/或胫骨、腓骨、肋骨、前下颌升支的扩髓、灌注和冲洗、脊椎骨的部分(例如，在手术过程中移除的那些)、尸体骨骼等。移植物材料可以是骨髓，例如从合适骨骼的骨内膜表面刮取的，或可以是包含骨髓和小的骨块的块状移植物。同种异体移植物骨可以从尸体、骨库等获取，例如从髋关节置换手术获取(sing)股骨头。骨移植物材料可以新鲜地使用，或可以如本领域中已知的冷冻保存直到需要时。

[0043] 骨移植物的细胞在有效剂量的脂质体Wnt蛋白(例如，L-Wnt3A)存在下悬浮于合适的培养基中。可以使用任何合适的培养基，例如，DMEM、RPMI、PBS等。细胞通常以在孵育过程中维持存活力的浓度重悬浮，例如，最高约104/ml、最高约105/ml、最高约106/ml、最高约7
10/ml。孵育温度通常不超过约37℃，且可以更低，例如最高约32℃、最高约25℃、最高约15℃，最高10℃、最高约4℃，但通常高于冻结温度，除非特别地准备用于冷冻保存。

[0044] Wnt蛋白的有效剂量可以根据来源、纯度、制备方法等变化。在Wnt蛋白是L-Wnt3A的情况下，有效剂量通常是至少约0.1μg/ml、至少约0.5μg/ml、至少约1μg/ml、至少约2.5μg/ml、至少约5μg/ml、至少约7.5μg/ml、至少约10μg/ml、至少约15μg/ml，且可以是至少约25μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml。

[0045] 骨移植物材料用Wnt蛋白孵育足以增强成骨能力的时间段。增强可以通过各种方式测量，例如通过增加的Axin2表达，通过骨移植物材料中提高的有丝分裂活性(在移植物约第2天到约第6天测量)，通过移植后增加的骨形成，通过增加的Runx2或骨钙蛋白表达，通过移植后降低的细胞凋亡，或通过移植后产生的骨体积。增加的骨体积可以是相对于在不存在wnt处理的情况下获得的体积的约1.5-倍、约2-倍、约3-倍或更多。

[0046] 骨移植物材料通常与Wnt蛋白接触至少约1小时、至少约2小时和最高约36小时、最高约24小时、最高约18小时、最高约15小时、最高约12小时、最高约8小时、最高约6小时、最高约4小时。

[0047] 在孵育后，骨移植物材料可以按照常规方案移植到接受者中，例如用于修复脊椎骨、骨折、牙支撑等等。

[0048] 特别地通过用Wnt蛋白孵育恢复老年骨移植物的成骨能力。最初，脂质体Wnt3a处理降低老年骨移植物中的细胞死亡。随后在移植后，用脂质体Wnt3a处理的骨移植物产生显著更多的骨(p<0.05)。如从实施例中明显看出的，脂质体Wnt3a处理增强移植物中的细胞存活并重建来自老年动物的移植物的骨形成能力。

[0049] 因此，本发明提供了用于复活来自老年患者或来自具有降低的治愈潜能的其它患者(如吸烟者、糖尿病患者或具有营养缺陷的患者)的骨移植物的安全、有效和临床适用的基于再生医药的策略。

[0050] 本说明书中引用的所有科学和专利公开出版物、专利和专利申请在此通过引用并入，如同各单个出版物特别地和单独地表明通过引用并入一样。本发明的进一步详情在以下非限制性实施例中提供。

[0051] 实施例I

[0052] Wnt3a重建来自老年动物的骨移植物的成骨能力

[0053] 骨髓的年龄相关性脂肪变性在老年人中造成延迟的骨折愈合和骨质疏松相关骨折。构成这一脂肪变化的基础的机制可能与老年骨髓腔内的Wnt信号传导水平相关。在年轻人中，长骨充满富含血红素的骨髓；随着年龄增长，这被脂肪骨髓(fatty marrow)替代。骨髓的年龄相关性脂肪变性与老年人中延迟的骨骼愈合和骨质疏松相关骨折高度相关，这构成了越来越大的生物医学负担。因此，已经进行了相当大的努力来了解骨髓到主要脂肪组织的转化。骨髓的这种脂肪变性与成骨潜能的损失平行地发生，这在骨髓临床上用于骨移植目的时被揭示。

[0054] 患者自身的骨骼和骨髓被认为是“金标准”，但在患者是老年人时，这些自体移植物有时是不够的。存在驻留于骨髓腔中的至少多种不同的干细胞/祖细胞群体，包括间充质干细胞(MSC)。虽然MSC在体外培养时可以产生软骨、骨、脂肪和肌细胞，但驻留于骨髓腔本身中的MSC仅分化成成骨或成脂谱系，并且越来越多的证据表明这种成脂-成骨命运决策通过β连环蛋白依赖性Wnt信号传导来调节。例如，通过Wnt LRP5受体中的激活突变增强Wnt信号传导在人体中导致高骨量表型。在体外，这一相同的激活突变抑制人间充质干细胞的脂肪细胞分化。另一方面，降低的Wnt信号传导，例如在溶骨性疾病多发性骨髓瘤中，与过度骨损失和在损害生血作用的情况下伴随的骨髓脂肪生成的增加相关。这些观察一起支持Wnt信号传导具有刺激骨生成和抑制脂肪生成的积极作用的假设。

[0055] 转基因小鼠与同系骨移植物模型结合用于追踪参与移植物移入(engraftment)的细胞的命运。免疫组织化学以及定量分析用于评价来自年轻和老年小鼠的骨移植物中的Wnt信号传导及成脂和成骨基因的表达。脂质体Wnt3a蛋白(L-Wnt3a)在小鼠和兔中形成的临界尺寸缺陷模型中测试其恢复老年骨移植物的成骨潜能的能力。放射影像学、微-CT重建、组织学和组织形态测定测量用于定量由L-Wnt3a或对照L-PBS处理导致的骨愈合。骨移植物的基因表达谱证明，老化与偏离成骨谱和朝向成脂谱的偏移相关。这一年龄相关性成脂偏移伴随来自老年动物的骨移植物中显著降低的Wnt表达和Wnt活性(p<0.05)。

[0056] 转基因小鼠与同系骨移植物模型结合用于追踪参与移植物移入的细胞的命运。免疫组织化学以及定量分析用于评价来自年轻和老年小鼠的骨移植物中的Wnt信号传导及成脂和成骨基因的表达。脂质体Wnt3a蛋白(L-Wnt3a)在小鼠和兔中形成的临界尺寸缺陷模型中测试其恢复老年骨移植物的成骨潜能的能力。放射影像学、微定量计算机断层扫描(微-CT)重建、组织学和组织形态测定测量用于定量由L-Wnt3a或对照物质(脂质体磷酸盐缓冲盐水溶液[L-PBS])导致的骨愈合。

[0057] 骨移植物中细胞的表达谱证明随年龄的偏离成骨基因谱和朝向成脂基因谱的偏移。这一年龄相关性成脂偏移伴随Wnt信号传导的显著降低(p<0.05)和成骨潜能的损失。在大和小动物模型中，通过用干细胞因子Wnt3a短暂孵育恢复老年骨移植物的成骨效能。另外，脂质体Wnt3a显著降低骨移植物中的细胞死亡，导致与对照相比显著更多的骨再生。

[0058] 脂质体Wnt3a以用于复活来自老年患者的骨移植物的有效的、可临床应用的、基于再生医药的策略增强来自老年动物的骨移植物的细胞存活并重建成骨能力。

[0059] 材料和方法

[0060] 动物。所有程序由Stanford动物研究委员会批准。描述了Axin2LacZ/+小鼠。选择Β-肌动蛋白增强的绿色荧光蛋白(ACTB-eGFP)转基因小鼠(The Jackson Laboratory,Sacramento,California)，因为其在骨、骨髓和其它相关细胞群体中稳定的GFP表达水平。ACTB-eGFP转基因小鼠与Axin2LacZ/+小鼠杂交以获得Axin2LacZ/+、Axin2LacZ/+/ACTB-eGFP、ACTB-eGFP和野生型(WT)小鼠；12-16周龄的小鼠被认为是年轻的，大于四十周龄的小鼠被认为是老年的。使用老年的(八个月)新西兰白兔。一个兔子用作骨移植物供体，和九个兔子用作试验动物。

[0061] 小鼠中的骨移植。宿主小鼠(仅雄性)通过腹膜内注射氯胺酮(80mg/kg)和甲苯噻嗪(16mg/kg)麻醉。形成3-mm切口以暴露顶骨；使用微解剖环锯产生2-mm直径的圆形全厚度缺陷；不干扰硬脑膜。骨移植物从股骨和胫骨收获，合并，并分成等份样品。各20-μL的等份样品在包含脂质体磷酸盐缓冲盐水溶液(L-PBS)或脂质体Wnt3a蛋白(L-Wnt3a)(有效浓度＝0.15μg/mL)的10μL的具有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco改良Eagle Medium(DMEM)中在37℃下孵育，同时准备颅盖缺陷。骨移植物移植到颅盖缺陷，并封闭皮肤。

[0062] 兔中的骨移植。宿主兔用皮下注射格隆铵(0.02mg/kg)和丁丙诺啡(0.05mg/kg)、肌肉内注射氯胺酮(35mg/kg)和甲苯噻嗪(5mg/kg)和静脉内注射头孢唑啉(20mg/kg)麻醉，并保持在1％-3％异氟烷中。形成2.5-cm切口，显现尺骨边界，并用摆动锯(Stryker System 5,Kalamazoo,Michigan)形成1.5-cm片段缺陷。片段连同其骨膜组织移除。骨移植物从骨盆和股骨收获，合并，并分成等份样品。各大约400-mg等份样品与L-PBS(500μL)或L-Wnt3a(有效浓度＝0.5μg/mL)混合并保持在后台(back table)上的冰上，同时在宿主兔中产生尺骨缺陷。骨移植物移植到尺骨缺陷中，且封闭肌肉和皮肤。手术双侧进行(即，两侧都接受L-PBS或L-Wnt3a)。这一方式消除了骨移植物具有未预料到的系统缺陷的可能性，尽管微少(remote)。

[0063] 兔骨髓的体外Wnt刺激。来自老年兔的骨髓在37℃下用L-PBS或L-Wnt3a(有效浓度＝0.15μg/mL)孵育12小时。总DNA使用PicoGreen dsDNA 试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,California)测定以确保移植物具有等同的细胞容量。半胱天冬酶活性使用标准试剂盒(Roche Diagnostics,Indianapolis,Indiana)测定。

[0064] 组织制备。紧接在处死后(各试验中指定的时间点)，收获整个骨骼成分(包括肌肉、结缔组织和/或硬脑膜)，除去其表皮，并在4℃下4％多聚甲醛中固定12小时。样品在19％EDTA(乙二胺四乙酸)中脱钙，然后包埋在石蜡中或在最佳切割温度(OCT)化合物中。切片为10-μm厚。

[0065] 组织学、免疫组织化学和组织形态测定分析。免疫组织化学如之前所述进行。使用的抗体包括兔多克隆抗-绿色荧光蛋白(抗-GFP)(Cell Signaling Technology,Danvers,Massachusetts)、兔多克隆抗-DLK1(EMD Millipore,Billerica,Massachusetts)、抗-过氧物酶体增殖物激活受体-γ(抗-PPAR-γ)(Millipore)和抗-Ki67(ThermoFisher Scientific,Waltham,Massachusetts)。按照制造商的说明进行溴脱氧尿苷(BrdU)(Invitrogen,Camarillo,California)和末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)(Roche Diagnostics)分析。

[0066] 如之前所述进行Movat五色(pentachrome)、苯胺蓝、Xgal和碱性磷酸酶(ALP)染色。组织切片使用Leica DM5000B数字成像系统(Leica Microsystems,Wetzlar,Germany)拍照。最少每个样品五个组织切片用于组织形态测定分析。

[0067] 微定量计算机断层扫描(微-CT)分析。小鼠用2％异氟烷麻醉并用多模正电子发射断层扫描-计算机断层扫描数据采集系统(Inveon PET-CT；Siemens,Erlangen,Germany)以40-mm分辨率进行扫描。数据用MicroView软件(GE Healthcare,Chicago,Illinois)分析。
三维目标区域工具用于对各样品的结构和骨体积赋值。

[0068] 再生骨体积分数(通过用总骨体积去除再生骨体积计算的百分比[BV/TV,％])的评估使用高分辨率微-CT(vivaCT 40；Scanco Medical,Br¨uttisellen,Switzerland)和采用70kVp,55μA,200-ms积分时间和10.5-μm各向同性体素尺寸进行。目标区域为2cm长并在缺陷边缘近端250μm开始和向远端延伸超出缺陷的相对边缘250μm(1.5cm总直径)。骨使用275mg/cm3羟磷灰石的阈值与软组织分割。扫描和分析遵循公布的指南进行。

[0069] 定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。组织样品在TRIzol溶液(Life Technologies)中匀浆。如之前描述的分离RNA(RNeasy；Qiagen,Germantown,Maryland)并进行反转录(SuperScript III Platinum Two-Step qRT-PCR Kit,Life Technologies)。

[0070] 统计分析。结果作为平均值+标准差显示，“n”表示分析的样品的数目。数据集之间的显著差异使用双侧Student t检验和非参数Wilcoxon检验确定。显著性以p<0.05达到，且所有统计分析用GraphPad Prism软件(GraphPad Software,San Diego,California)进行。

[0071] 结果

[0072] 骨髓移植物具有成骨潜能。为追踪骨移植物材料的命运，我们从ACTB-eGFP转基因小鼠收获全骨髓，将其细分成等同大小的等份样品(图1-A)，然后移植到在同系宿主小鼠的颅盖中形成的未愈合的临界尺寸骨骼缺陷中(图1-B)。存活的移植细胞及其后代可通过其GFP标记在损伤位点内鉴别(图1-C)。当供体和宿主遗传上不相同时，大多数的移植细胞死亡；出于这一原因，仅使用同系的免疫相容的供体-宿主组合。

[0073] 在移植后第1天，GFP-阳性细胞以及来自GFP-阳性供体的基质组织占据损伤位点(图1-C)。在第5天，BrdU染色确认缺陷位点中稳定的细胞增殖(图1-D)。在第7天，GFP免疫染色确认移植的细胞或其后代保留在缺陷位点(图1-E和1-F)。移植的细胞和/或其后代最终分化成成骨细胞并使缺陷愈合(图1-H和1-J)；在不存在骨移植物的情况下，缺陷不愈合(图1-G和1-I)。

[0074] 老年骨移植物表现出脂肪变性。随着老化，人骨髓发生脂肪变性和成骨潜能的损失。相当的年龄相关性变化在小鼠中观察到，其中鼠骨髓的总体外观从年轻动物中的富含血红素的无脂肪组织变化为老年动物中的脂肪骨髓。构成骨移植物的异质细胞群体的定量RT-PCR分析表明，相对于来自年轻动物的样品，来自老年动物的样品显示显著更高的生脂基因脂肪酸结合蛋白4(Fabp4)的表达(p<0.01)和过氧物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达(p<0.01)。与这种成脂偏移同时，来自老年小鼠的骨移植物也显示出显著降低的成骨基因ALP(p<0.05)、骨钙蛋白(p<0.01)和osterix(p<0.05)的表达水平。因此，在人中观察到的骨髓的脂肪变性在小鼠中在总体形态学水平和在可量化的分子水平上重演。

[0075] 脂肪变性与骨移植物中降低的成骨潜能相关。与来自年轻动物的移植物的成骨能力相比，来自老年动物的移植物生成显著更少的新骨(图2-A和2-B；在2-C中量化；p<0.05)。成骨潜能的这种年龄相关性降低不可直接归因于移植物移入效率的差异。使用GFP免疫染色鉴别移植的细胞，GFP-阳性细胞的分布和数目在来自年轻和老年小鼠的骨移植物之间几乎是等同的(图2-D和2-E；在图2-F中量化)。成骨潜能的年龄相关性改变也不可归因于移植物扩增的差异：使用BrdU掺入(图2-G和2-H)和增殖细胞核抗原(PCNA)的qRT-PCR(图2-I)，我们发现来自年轻和老年动物的骨移植物几乎等同的细胞增殖水平。

[0076] 当我们评估骨髓细胞中19种哺乳动物Wnt基因的表达水平时，我们获得了对于老年骨移植物的脂肪变性和成骨潜能损失的基础的深入认识。Wnt基因的子集在来自老年动物的骨髓中与年轻动物相比弱表达(p<0.05；图3-A)。Wnt基因表达的这种降低与Wnt反应性的降低平行，如通过显著降低的Wnt直接靶基因Tcf4、Lef1和Axin2的表达(p<0.05；图3-B)测量的。这些结果证明Wnt信号传导在老年骨髓中降低。

[0077] L-Wnt3a恢复来自老年小鼠的骨移植物的成骨能力。待纯化的第一种Wnt蛋白是Wnt3a。Wnt3a通过“标准”或β-连环蛋白依赖性途径发挥作用并且是公知的成骨刺激。考虑到老年骨髓中降低的Wnt信号传导，我们想知道外源Wnt蛋白的添加是否足以重建源自老年动物的骨移植物的成骨潜能。

[0078] 所有脊椎动物Wnt蛋白是疏水性的；在没有载体的情况下，疏水性Wnt3a快速变性并变成非活性的。我们通过将疏水性Wnt3a包裹在脂质颗粒中解决了这一体内递送问题。人Wnt3a蛋白的这种制剂，脂质体Wnt3a(L-Wnt3a)，在体内是稳定的并在改良的骨折模型中促进稳定的骨再生。虽然外源施加的Wnt3a作为治疗性蛋白质具有大的潜能，但安全性仍然是首要的考虑因素。将高浓度的高效生长因子递送到骨骼损伤位点随之对于患者带来潜在的肿瘤学风险。为回避与延长的或非受控的生长因子暴露相关的问题，我们在活体外递送L-Wnt3a。这通过在收获后立即用L-Wnt3a(n＝30)孵育老年骨移植物来完成，同时准备接受位点。对照骨移植物暴露于L-PBS(n＝30)相同的持续时间。

[0079] 与用L-PBS处理的老年移植物(图4-A)相比，用L-Wnt3a处理的老年移植物显示出新骨形成的急剧增加(图4-B)。在7天内，接受L-Wnt3a处理的移植物的缺陷位点与接受L-PBS处理的移植物的位点相比具有两倍多的新骨(图4-C)。到第12天，L-Wnt3a-处理的移植物与L-PBS处理的移植物相比具有1.5-倍多的新骨(图4-D和4-E；在4-C中量化)。

[0080] 骨髓来源的干细胞是Wnt反应性的。为获得骨移植物中的哪些细胞群体对Wnt刺激有反应的深入了解，我们分析骨髓不同部分的Wnt反应性。在全骨髓中，Wnt反应性低于可检测水平。我们将全骨髓分离成非粘附群体；Wnt反应性再一次低于检测限(图4-F)。但是在包含结缔组织祖细胞53,54的粘附群体中，检测Wnt反应性(图4-F)。我们然后使用建立的方案进一步富集来自粘附群体的骨髓干细胞和/或基质细胞。使用CD45(–)、CD73(+)、CD105(+)和Stro1(+)的免疫染色，我们确认这一群体是骨髓干细胞富集的(图4-G)。相对于PBS处理的CD45(–)、CD73(+)、CD105(+)和Stro1(+)细胞，Wnt3a-处理的群体显示出Wnt反应性10倍的提高(图4-H)。

[0081] 我们还使用来自Axin2LacZ/+小鼠的骨髓的Xgal染色来监测骨移植物中的Wnt反应性。非常少的Xgal+ve细胞在老年骨移植物中发现(图4-I)，但Xgal+ve细胞在年轻骨移植物中是丰富的(图4-K)。老年骨移植物能够对L-Wnt3a刺激作出反应，如通过暴露后Xgal+ve细胞的增加所显示的(图4-J)。因为鼠骨髓腔中干细胞的存在率是非常低的，很可能Wnt反应性群体包括CD45(–)、CD73(+)、CD105(+)和Stro1(+)群体以外的更多细胞。

[0082] L-Wnt3a防止骨移植物中的细胞凋亡。L-Wnt3a的稳定骨诱导能力提示我们将我们的研究扩展到大动物的长骨模型中。如在人中，老年兔发生其骨髓的脂肪变性。我们利用临界尺寸尺骨缺陷模型并将用L-PBS或L-Wnt3a孵育的老年骨移植物移植到缺陷中。我们首先注意到，在收获骨移植物时，在整个聚集体(aggregate)中存在广泛的程序性细胞死亡(图5-A)。加入L-Wnt3a显著减少这种移植物细胞凋亡(p<0.05)(图5-B)。我们使用半胱天冬酶活性作为细胞凋亡的量度验证了L-Wnt3a的这种促存活效应。L-Wnt3a显著降低骨移植物的细胞中的半胱天冬酶活性(p<0.05；图5-C)。

[0083] L-Wnt3a赋予老年骨移植物成骨能力。L-Wnt3a和L-PBS处理的兔骨移植物引入临界尺寸缺陷中并在多个时间点评估再生。在四周时的放射影像学评估揭示了接受L-Wnt3a处理的移植物的位点中桥接愈伤组织(bridging callus)的存在(图5-E)；比较而言，接受L-PBS处理的骨移植物的位点显示最小的愈伤组织形成(图5-D)。

[0084] 在八周时，微-CT分析显示了用L-PBS骨移植物处理的位点中的持续间隙(图5-F)，而用L-Wnt3a骨移植物处理的位点显示稳定的骨形成(图5-G)。组织形态测定分析确认两个组之间在骨体积和骨体积除以总体积(图5-H)两个方面中的显著差异。

[0085] 我们评估了骨再生的质量。与对照(图6-A)相比，L-Wnt3a处理的损伤位点充满新骨(图6-B)。宿主兔的骨髓已发生脂肪变性(图6-C)，且在L-PBS处理的再生中注意到类似的外观(图6-D)。在L-Wnt3a处理的样品中(图6-E)，宿主骨髓显示出如在对照动物中看到的相似的脂肪变性水平，但L-Wnt3a骨移植物的再生是编织骨(图6-F)且可与预先存在的板层骨通过其在片段缺陷位点中的位置和其编织外观区分开来。在偏振光下，天狼猩红染色区分L-Wnt3a处理的骨移植物中发现的成熟的类骨组织(图6-H)与L-PBS处理的骨移植物的纤维性组织(图6-G)。

[0086] 骨移植物中的干细胞和/或祖细胞群体。哺乳动物骨髓腔是支持多种干细胞和/或祖细胞群体的功能性小生镜。骨髓来源的骨移植物(其性质上是异质的)包含多种群体，包括一些干细胞和/或祖细胞。但是，这些干细胞和/或祖细胞对于骨再生的贡献仍然是未知的。多种骨髓来源的干细胞群体是Wnt-反应性的，且我们使用已建立的方案确认骨髓中的至少CD45(–)、CD73(+)、CD105(+)和Stro1(+)干细胞和/或基质细胞群体是Wnt-反应性的(图4)。

[0087] Wnt信号传导和骨髓的年龄相关性脂肪变性。在体外，Wnt信号传导的消除引起间充质干细胞分化成脂肪细胞，而Wnt信号传导的强化引起间充质干细胞分化成成骨细胞。这具有直接的临床相关性：随着年龄增长，人骨髓发生脂肪变性并丧失其成骨潜能。我们的数据显示，老年骨移植物的成骨潜能的这种损失部分地依赖于降低的Wnt信号传导水平：与来自年轻小鼠的骨移植物相比，老年骨移植物显示Wnt基因表达和Wnt反应性的急剧降低(图3)。添加L-Wnt3a到老年骨髓重建其骨形成能力(图4、5和6)。

[0088] 与降低的移动性(如长期卧床和骨质疏松症)相关的状况也与骨髓的脂肪变性相关。一些数据表明脂肪变性是可逆的，至少在试验上是如此。显然地，了解这种变性的基础-及骨骼中的年龄相关性改变可以降低的程度-在设计老年患者中骨损伤的新治疗方面是相当重要的。

[0089] 生长因子加强的骨再生：安全性第一。安全性的关注当前在围绕使用生长因子加强骨骼愈合方面增加。生长因子刺激主要认为诱导驻留于损伤位点中的细胞的增殖；因为不受控的增殖是致癌转化的特征，这种增殖爆发必须在空间和时间上受到控制。出于这一原因，我们设计了限制L-Wnt3a的整个身体暴露的方式。被靶向的细胞是骨移植物本身(其在活体外用L-Wnt3a孵育)中的那些细胞。然后激活的细胞—而非生长因子本身—重新引入到缺陷位点中。这一活体外途径从空间上(限制到移植物本身，而非宿主组织)和从时间上(对Wnt刺激的暴露仅在孵育期间发生)限制L-Wnt3a刺激。这种活体外方式针对临床应用进行调整且不需要二次手术。因此，将Wnt蛋白包裹到脂质颗粒中构成了用于治疗骨骼损伤的可行策略，特别是在具有降低的治愈潜能的个体中的那些骨骼损伤。

[0090] 实施例2

[0091] 用干细胞激活剂WNT3A重建自体骨移植物

[0092] 自体骨移植物是治疗骨缺陷的最常使用的程序，但被认为在老年患者中是不可靠的。自体移植物的功效可以追溯到存在于材料内的多能干细胞。老化减弱这些干细胞的存活力和功能，导致骨性愈合(bonu union)的不一致率。我们证明自体移植物功效的年龄相关性改变伴随材料中内源Wnt信号传导的损失。我们通过过表达Wnt抑制剂Dkk1模拟这种内源Wnt信号传导的损失并发现Wnt信号传导是自体移植物的成骨分化所必须的。我们开发了活体外药物递送系统，其中自体移植物在WNT3A蛋白的稳定制剂中孵育，且然后体内引入。生物工程化的自体移植物显示在接受位点中显著提高的存活。有丝分裂活性和成骨分化在WNT-激活的自体移植物中与单独自体移植物相比显著增强。在脊柱融合模型中，用L-WNT3A处理的老年自体移植物与单独自体移植物相比显示优越的骨形成能力。因此，L-WNT3A中的简短孵育可靠地提高自体骨移植功效，这在老年人中具有显著改善患者保健的潜力。

[0093] 对于骨不连接、延迟的连接和颈后脊柱融合的最常见治疗是自体骨移植或自体移植。自体移植物在绝大多数病例中是成功的，但其骨形成(成骨)能力的基础不是完全清楚的。自体移植物是骨髓血液产物、结缔组织基质、骨质细胞外基质及多种造血、血管和成骨干细胞群体的异质集合，且它们多样性地描述为骨诱导性的、骨传导性的和成骨的。但是，这些术语仅描述细胞过程；它们不提供对于自体移植物成骨潜能的深入认识。

[0094] 自体移植物在老年患者中变成为不可靠的，且对于这种退化状态可能存在多种贡献因子。一些数据表明自体移植物的成骨能力依赖于骨移植物材料内包含的干细胞或祖细胞的存在，且干细胞数目被认为随年龄下降，这部分地是因为最终导致细胞周期停滞和细胞凋亡的累积的DNA损伤。其它数据论证了，并非干细胞数目的下降，而是它们的功能随年龄退化。老年干细胞也可能在其环境中对生长因子刺激具有较低反应性；类似地，这些生长因子刺激的局部或系统水平可能在老年人中下降。老化也影响干细胞的有丝分裂能力：干细胞衰老随年龄增加，部分地是因为端粒酶活性的降低和随后的端粒缩短。干细胞功能的这些降低制约了如肠和肌肉的组织的通常稳定的再生性反应。老化也影响干细胞的有丝分裂能力。类似的机制可能造成自体移植物成骨能力的损失。

[0095] 此处，我们测试了以下假设：自体移植物的成骨潜能可归因于移植物材料中的成骨干细胞，老化影响这些干细胞/祖细胞群体的Wnt反应性状态，及WNT-介导的干细胞激活可恢复来自老年动物的自体移植物的骨形成潜能。

[0096] 方法

[0097] 动物护理。所有程序按照Stanford动物研究委员会批准的方案。使用β-肌动蛋白增强的绿色荧光蛋白(ACTB-eGFP；The Jackson Laboratory,Sacramento,California)和CD1野生型同系小鼠。<3个月龄的小鼠被认为是年轻的；>10个月的小鼠被认为是老年的。Axin2CreERT/+；R26RmTmG/+小鼠购自Jackson Labs。老年的野生型Lewis大鼠(来自Charles Rivers,MA的“退出育种动物(retired breeders)”)用于按照AAUC和IUPAC指南(方案
13146)的脊柱融合手术。

[0098] 用于啮齿动物模型的骨移植物材料(BGM)的收集和处理。大鼠和小鼠用于这一研究中。小鼠模型的使用允许广谱的分子分析，但是因为自体移植物对于这些小动物是高度侵入性的，我们在进行自体移植时使用大鼠(例如，图7和12)，和在采用先进分子技术时使用同系小鼠(图8-11)。在所有情况中，骨移植物材料(BGM)通过纵向切开骨骼从股骨、胫骨和髂嵴，用尖锐器具轻缓地刮取骨内膜表面和冲洗骨髓内容物到收集盘中而收获。这一方法模拟用于人中的RIA技术。

[0099] 为诱导Axin2CreERT/+；R26RmTmG/+小鼠中的重组(图8)，动物连续5天通过IP注射或管饲给予160μg/g体重的它莫昔芬。组织在首次处理后7天收获并通过GFP免疫染色或荧光进行分析。

[0100] 为确保用于移植到SRC中的BGM等份样品在细胞容量方面是等同的，来自3只小鼠(同窝)的BGM合并和然后正如在移植分析中一样分成20μL等份样品。DNA内容物用DNeasy Tissue Kit(QIAGEN)提取且相对DNA浓度使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit(Invitrogen)和微平板荧光阅读仪(BERTHOLD,Bad Wildbad,Germany)测量。DNA含量的百分变化是<20％。为获得BGMACT，新收获的BGM置于包含磷酸盐缓冲盐水的脂质体制剂(L-PBS)或WNT3A的脂质体制剂(L-WNT3A，有效L-WNT3A浓度＝0.15μg/mL)的20μL培养基中并保持在23℃下1小时。

[0101] 定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)。组织样品在TRIzol溶液(Invitrogen)中匀浆。如之前描述的分离RNA(RNeasy；Mini Kit；QIAGEN,MD,USA)并进行反转录(SuperScript III First-Strand Synthesis Supermix for qRT-PCR,Invitrogen)。定量实时PCR使用Prism 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)和Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行。基因表达的水平通过CT方法测定并针对其GAPDH值归一化。所有反应一式三份进行，计算平均值和标准差。引物序列(5’-3’)如下：Axin2,[for-TCATTTTCCGAGAACCCACCGC],[rev-GCTCCAGTTTCAGTTTCTCCAGCC]；Lef1,[for-AGGAGCCCAAAAGACCTCAT],[rev-CGTGCACTCAGCTATGACAT]；GAPDH,[for-ACCCAGAAGACTGTGGATGG],[rev-
GGATGCAGGGATGATGTTCT]；ALP[for-ACCTTGACTGTGGTTACTGC],[rev-
CATATAGGATGGCCGTGAAGG]；Osterix,[for-GGAGACCTTGCTCGTAGATTTC],[rev-
GGGATCTTAGTGACTGCCTAAC]；骨钙蛋白,[for-TGTGACGAGCTATCAAACCAG],[rev-GAGGATCAAGTTCTGGAGAGC]。

[0102] 蛋白质印迹分析。BGM从年轻(N＝5)和老年(N＝5)小鼠收获且然后置于包含10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL 链霉素的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)中，并在37℃下在5％CO2中孵育。24小时后，除去非粘附细胞，更换培养基，并传代粘附细胞它们达到汇合。培养基每3天更换。在一些试验中，第3代后的细胞用L-PBS或L-WNT3A(有效浓度＝0.03μg/mL)处理。在这些试验中，细胞在24小时后收集并使用RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)裂解。提取总蛋白质用于蛋白质印迹分析。泛-肌动蛋白用作内部对照并用于确保蛋白质完整性。使用抗WNT3A(R&D,Minneapolis,MN,USA)、非磷酸化β-连环蛋白(Cell Signaling,Danvers,MA,USA)和Axin2(Abcam,Cambridge,MA,USA)的抗体。积分强度通过ImageJ(National institute of Health,USA version 1.47v)进行分析以定量蛋白质印迹结果。

[0103] 肾包膜下(Sub-renal capsule)移植手术。在一些情况中，肾包膜下分析(SRCA)用于测定其分化潜能。在同系宿主小鼠吸入麻醉后，在紧接肋架尾侧的左侧腹形成皮肤切口。打开腹腔以暴露肾。在肾包膜中形成小切口且BGM使用软塑料管小心地置于包膜下。然后将肾返回到腹腔，且腹膜和皮肤用缝线封闭。丁丙诺啡(0.05mg/kg)用于镇痛。在其中BGM从Axin2CreERT2；R26mTmG供体收获的情况中，随后在第0天开始通过管饲对宿主提供它莫昔芬(100μL的10mg/mL)共5天。SRC移植物在所示的时间点收获。2.6腺病毒-介导的Wnt信号传导抑制DKK1和阴性对照Fc腺病毒构建体之前已描述。腺病毒构建体转染到293T细胞中。2天后，收集细胞、裂解和通过离心沉淀。纯化的腺病毒等分并储存在-80℃下。Wnt抑制通过用Ad-Dkk1和对照Ad-Fc体外孵育BGM 2小时实现，且BGM等份样品然后移植到颅盖缺陷中。

[0104] 颅盖临界尺寸缺陷手术。小鼠被麻醉，且形成3-mm切口以暴露顶骨。2-mm直径的圆形全厚度缺陷使用微解剖环锯形成，不干扰硬脑膜。BGM等份样品用Ad-Dkk1和对照Ad-Fc孵育2小时。BGM等份样品然后移植到颅盖缺陷中且皮肤用缝线封闭。在从手术恢复后，小鼠接受丁丙诺啡用于镇痛。微-计算机断层扫描(微-CT)分析如之前所述进行。

[0105] 脊柱融合手术。Lewis大鼠使用氯胺酮70-100mg/kg和甲苯噻嗪5-10mg/kg的混合物进行麻醉。大鼠的腰部剃毛，然后用碘伏(Betadine)浸泡的纱布消毒。在皮肤切开前，大鼠注射镇痛剂丁丙诺啡0.02mg/kg SC/IP。首先，骨移植物材料(BGM)从髂嵴收获；简言之，触摸左髂骨棘(iliac spine)并形成垂直皮肤切口；髂骨棘的背侧嵴可达并通过钝器解剖暴露。附着的肌肉和骨膜被提升且0.3g的BGM用骨钳收获和颗粒化(morselized)。BGM然后用100μL L-PBS或100μL的[0.15μg/mL]L-WNT3A孵育，同时暴露横突。为暴露横突，完成后外侧钝器解剖，且反映的脊椎旁肌肉通过牵开器保持定位。L4-L5的横突被清除骨膜，并用高速圆头锉(high-speed burr)去壳。BGM展开在L4-L5横突上及其之间。脊椎旁肌肉用可吸收的缝线(4-0Vicryl)封闭，且皮肤用中断的不可吸收的缝线(4-0Nylon)封闭。手术部位用抗生素软膏处理。10mg/kg Baytril皮下递送。丁丙诺啡(0.02mg/kg)在手术后施用3天，且后续剂量按照需要给予以控制疼痛。

[0106] 样品制备、组织加工、组织学。组织在4℃下在4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。样品在19％EDTA中脱钙1天。样本在石蜡包埋之前通过升高的乙醇系列脱水。切割8微米厚的纵向切片并收集在Superfrost-plus载玻片上用于组织学分析。番红O、苯胺蓝和Gomori染色如之前所述进行。组织切片使用Leica DM5000B数字成像系统(Leica Micro-systems,Wetzlar,Germany)拍照。

[0107] ALP、TRAP和TUNEL染色。碱性磷酸酶(ALP)活性通过在氯化氮蓝四唑(NBT；Roche,Indianapolis,IN,USA)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP；Roche)和NTM缓冲液(100mM NaCl,100mM Tris pH 9.5,5mM MgCl)中孵育进行检测。耐酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)活性使用白细胞酸性磷酸酶染色试剂盒(Sigma,St.Louis,MO,USA)按照制造商的说明来观察。在显色后，载玻片在系列乙醇中脱水，在Citrisolv(Fisher Scientific)中清洁，并用Permount封片介质(Fisher Scientific)盖片。对于TUNEL染色，切片使用0.1％Triton X-
100(Sigma)和0.1％柠檬酸钠(sigma)渗透，并用TUNEL反应混合物(In Situ Cell Death Detection Kit,Roche)孵育。切片用DAPI封片介质(Vector Labs,Burlingame,CA,USA)封片，并在落射荧光显微镜下目测检验。对于溴脱氧尿苷(BrdU)分析，小鼠腹膜内注射给予BrdU标记试剂(Invitrogen,CA,USA)并在注射后4小时处死。BrdU检测使用BrdU染色试剂盒(Invitrogen,CA,USA)按照制造商的说明进行。

[0108] 免疫组织化学。组织切片脱蜡和在PBS中复水。内源过氧化物酶活性通过3％过氧化氢淬灭5min，和然后在PBS中洗涤。载玻片在室温下用5％山羊血清(Vector laboratories)封闭1小时。添加适宜的一级抗体并在4℃下孵育过夜。样品然后用适宜的生物素化二级抗体(Vector Laboratories)和抗生物素蛋白/生物素化酶复合物(Vector Laboratories)孵育并通过DAB底物试剂盒(Vector Laboratories)显色。使用的抗体包括GFP(Cell Signaling)和DLK1(Millipore)、Runx2(Santa Cruz)、Sox9(Abcam)和PPAR-γ(Cell Signaling)。

[0109] 微-CT分析和移植物生长的定量。扫描和分析遵循公布的指南。小鼠用2％异氟烷麻醉并用多模正电子发射断层扫描-计算机断层扫描数据采集系统(Inveon PET-CT；Siemens,Erlangen,Germany)以40-mm分辨率进行扫描。为定义各样品中发生的移植物生长，POD2和POD49时间点扫描数据输出到Osirix软件版本5.8(Pixmeo,Bernex,Switzerland)中并登记用于沿相同的定向分段。形成的新骨与移植的初始BGM体积进行比较。数据集之间的差异通过使用XLStat软件版本(Addinsoft,Paris,France)中的Mann-Whitney检验确定。p-值<0.05被认为是统计学显著的。

[0110] 定量和统计分析。GFP、BrdU、TUNEL、DLK1、骨钙蛋白和苯胺蓝染色进行定量。Photoshop CS5(Adobe,版本10.0.1)用于确定损伤位点处目标区域(ROI)中的像素数目。魔术棒工具用于指定ROI内的阳性像素区域。阳性信号的像素与ROI的像素的比率表示为百分比。跨损伤位点的至少5均匀间隔的个切片进行定量以确定各样品的平均值。五个样品包括在各组中(n＝5)。结果表示为平均值±SD。Student’s t-检验用于定量该文献中描述的差异。P≤0.05被认为是显著的。

[0111] 结果

[0112] 骨移植物材料包含多种干细胞/祖细胞群体。用于收获自体移植物的最佳解剖位点取决于多种因素，包括供体位点发病率和骨原料的可得性。我们使用改良的扩髓-灌注-抽吸(RIA)技术从三个解剖位点收获BGM并注意到股骨、髂嵴和胫骨产生具有明显不同组织学外观的BGM。除了造血细胞外，股骨BGM包含脂肪细胞，即使在从年轻动物收获时(图7A)。髂嵴BGM主要由紧密粘附细胞中覆盖的松质骨片段组成(图7B)。来自胫骨的BGM包含相当量的纤维基质和小的无核细胞(图7C)。我们使用定量RT-PCR来评估内源成骨基因表达，并发现在三种来源中，髂嵴BGM以显著更高的水平表达碱性磷酸酶和骨钙蛋白(图7D)。一般地，广泛相信的是自体移植物的生骨性能可归因于骨移植物材料(BGM)内的干细胞/祖细胞群体和成骨细胞。我们通过移植BGM到肾包膜下(SRC)分析中直接测试这一假设。SRC向移植的组织提供血管供应并支持细胞分化成多种组织，包括骨、皮肤、肌肉、牙齿、器官和肿瘤。BGM从髂嵴收获，然后移植到动物的肾包膜下方(图7A)并允许在那里发育7天。BrdU掺入证明自体BGM中细胞的高有丝分裂活性(图7B)。Runx2(图7C)、Sox9(图7D)和PPARγ(图7E)的免疫染色证明BGM中的细胞亚集表达与成骨、软骨形成和成脂定型相关的基因标志物。在第7天，BGM-来源的细胞的亚群分化成骨(图7F)、软骨(图7G)和脂肪(图7H)。总的说来，这些数据证明BGM包含能够分化成所有三种谱系的干细胞/祖细胞。

[0113] 骨移植物材料中的Wnt信号传导随年龄降低。Wnt是受到最多研究的诱导成骨分化的分子信号之一。使用Axin2CreERT2；R26mTmG报告小鼠，我们诱导重组(参见方法)，然后鉴别骨膜(图8A)和骨内膜(图8B)中的GFP+ve前成骨细胞。骨内膜中GFP+ve细胞的频率是～0.1％(图8C)。GFP+ve细胞也在新收获的BGM中鉴别(图8D)。因此，异质BGM中的细胞亚集是Wnt反应性的。我们比较了来自年轻(<3月龄)和老年(>10月龄)小鼠的BGM的Wnt反应性状态。定量绝对RT-PCR证明Wnt靶基因Axin2和Lef1的表达在从老年小鼠中收获的BGM(BGM老年)中相对于年轻小鼠(BGM年轻；图8F)几乎低两倍。蛋白质印迹分析确认，Wnt3a、磷酸化β连环蛋白和Axin2表达在BGM老年中与BGM年轻相比全都显著较低(图8G)。因此，BGM的内源Wnt反应性状态随年龄退化。

[0114] 成骨分化能力也随年龄下降。在人中，骨愈合率随年龄下降。我们发现BGM成骨能力相似的年龄相关性下降。新收获的BGM老年显示与新收获的BGM年轻相比显著更低的成骨基因碱性磷酸酶、Osterix和骨钙蛋白的表达水平(图9A)。为测试成骨基因表达的降低是否影响BGM的成骨能力，我们回到SRC分析。但是，在小鼠中进行自体移植造成过度外伤。为模拟自体移植物，我们使用同系供体和宿主。因为同系动物如此紧密相关，它们的组织是免疫相容的且组织的移植不引起免疫反应。ACTB-eGFP小鼠用作供体且BGM可容易地在SRC中通过其GFP荧光鉴别(图9B、C)。

[0115] 移植后七天，收获BGM并分析骨形成的证据。苯胺蓝染色的骨样基质在BGM年轻(图9D)中是明显的，但在BGM老年(图9E；在F中量化)中不存在。BGM年轻中的骨样基质如通过ALP染老年
色显示的正发生矿化(图9G)，而BGM 未显示ALP染色(图9H；在I中量化)。我们想知道是否BGM老年和BGM年轻之间的移植物移入效率可以造成成骨分化的差异，但GFP免疫染色证明在BGM年轻(图9J)和BGM老年(图9K)两者中，存在相似数目的存活供体细胞(在图9L中量化)。总的来说，这些数据表明BGM的成骨基因表达和成骨能力随年龄下降。

[0116] Wnt信号传导是BGM的成骨能力必须的。内源Wnt反应性及BGM的成骨能力随年龄减小。为测试是否降低的Wnt信号传导造成成骨潜能的这种年龄相关性下降，我们阻断BGM中的内源Wnt信号传导。其他人和我们已经使用Wnt抑制剂Dkk1的过表达以在体内瞬时消除Wnt信号传导。我们递送Ad-Dkk1或Ad-Fc(对照)到年轻小鼠的骨髓腔，然后在24h后收获BGM年轻并移植等份样品到临界尺寸(未愈合)骨骼缺陷中。七天后，当对照BGM年轻对于ALP活性为强阳性时(图10A)，Ad-Dkk1处理的BGM年轻显示最低活性(图10B)。相反，Ad-Dkk1处理的BGM年轻显示成脂蛋白PPAR-γ(图10C、D)和Dlk1(图10E、F)的普遍表达。骨形成受到Ad-Dkk1处理的抑制，如通过BGM的微-CT(图10G、H；在I中量化)和组织形态测定分析(图10J、K；在L中量化)显示的。因此，BGM的成骨能力依赖于内源Wnt信号。

[0117] 增强BGM老年中的内源Wnt信号恢复其成骨能力。内源Wnt信号传导是BGM显示其成骨老年能力所必须的(图10J-L)。我们接着测试是否Wnt刺激足以增强BGM功效。收获BGM ，用L-WNT3A或脂质体PBS(L-PBS)处理，然后在37℃下孵育(图11A)。绝对qRT-PCR分析揭示Axin2表达的小的但显著的提升(图11B)。Lef1响应于L-WNT3A适度地提升(图11B)。蛋白质印迹分析表明β连环蛋白和Axin2蛋白两者响应于L-WNT3A而升高(图11C)。BGM中的有丝分裂活性老年
通过L-WNT3A处理提高。在移植后第4天，细胞增殖在L-WNT3A处理的BGM 中与LPBS-处理的BGM老年相比显著提高(图11D、E；在F中量化)。对于细胞周期的作用是瞬时的：到移植后第7天，BrdU掺入在L-PBS和L-WNT3A样品之间是等同的(图11G、H；在I中量化)。BGM老年中的细胞分化提高。在脂蛋白Dlk1的表达较低(图11J、K；在L中量化)且成骨蛋白骨钙蛋白的表达在L-WNT3A处理的BGM老年中较高(图11M、N；在O中量化)。新骨形成仅在L-WNT3A处理的BGM老年中发现(图11P、Q；在R中量化)。LWNT3A的处理不影响移植物移入效率，但程序性细胞死亡的分析证明L-WNT3A处理的BGM老年具有比L-PBS处理的样品显著更少的TUNEL+ve细胞。降低的细胞凋亡也在移植后第7天观察到。新骨形成用作破骨细胞介导的骨重建的刺激物，且我们仅在L-WNT3A处理的BGM老年样品中观察到新形成的骨样基质周围的TRAP活性。因此，我们得出结论，L-WNT3A足以增强BGM的成骨能力。

[0118] L-WNT3A激活BGM老年中的干细胞并在脊柱融合模型中改善骨生成。我们试图鉴别BGM中负责L-WNT3A介导的成骨能力增强的细胞群体。我们使用标准程序从BGM分离三种干细胞群体，然后使用LPBS(作为对照)或L-WNT3A评估它们的Wnt反应性。在之前的试验中，我们确定了可靠地激活干细胞群体中的Axin2表达的L-WNT3A剂量。时程分析揭示干细胞对L-WNT3A处理的反应：在L-WNT3A暴露的15h内，观察到Axin2的4-倍激活，且最大Axin2激活在36h获得(图12A)。该效应是瞬时的，如通过60h时间点时干细胞中减少的Axin2表达显示的(图12A)。

[0119] 我们使用从BGM分离的第二干细胞群体来验证干细胞对L-WNT3A的反应(图12B)。BGM的激活状态通过qRT-PCR显示。收获BGM老年，用L-WNT3A或L-PBS处理，然后使用Axin2和Lef1表达分析其Wnt反应性状态(图12C)。在12h内，Lef1的显著提高是可检测的；在24h内，Axin2和Lef1两者显著升高(图12C)。这些分析确认BGM的WNT-介导的激活状态；下面我们将ACT ACT
这一材料称为BGM 。我们的下一试验测试BGM 在大鼠脊柱融合模型中的治疗潜能。第四和第五腰椎(例如，L4-5)脊椎骨的横突被脱壳(图12D)，并在这一过程中，收获来自髂嵴的自体BGM老年和用L-WNT3A(或L-PBS)处理1h。所得的材料BGMACT(或BGM老年)然后移植到L4-5突起上和其之间(图12E)。在手术后第2天，BGM的体积通过微-CT评估；这些分析证实BGM老年(图
12F)和BGMACT(图12)在最初包含相当量的矿化组织。新骨形成的体积在手术后第49天再次评估。微-CT数据的三维重建证明在用BGM老年处理的位点中差的骨再生(灰色；图12G)，这与来自经历脊柱融合的老年患者的相似数据一致。相反，用BGMACT处理的位点显示出稳定的骨形成和横突的融合的证据(蓝色；图12H)。横突之间新骨的体积被量化；与BGM老年相比，BGMACT产生显著更多的矿化基质(图12I)。因此，L-WNT3A处理改善来自老年动物的自体移植物的成骨能力。

[0120] 在美国每年进行几乎五十万骨移植手术，使得自体移植物为第二最常见的移植组织(AATB Annual Survey)。自体移植物具有优于同种异体移植物和合成骨替代品的显著优势。但它们在老年人中和在具有基础骨或代谢疾病的患者中是禁忌的。此处，我们致力于理解对于自体移植物功效重要的因素和毒力于验证改善自体移植物功效的方法。四种主要的因素影响自体移植物的成骨能力：首先，自体移植物从其收获的位点；第二，自体移植物在收获后如何操作；第三，自体移植物的生长因子选项(constituency)；和第四，自体移植物中干细胞的激活状态。此处，我们提供了WNT信号可影响这四种关键变量中的三种的证据。

[0121] 优化自体移植物收获和操作。成骨能力及因此自体移植物的功效受到收获位点和方法的影响。大多数非血管化的自体移植物从髂嵴收获，但采用扩髓/灌注/抽吸(RIA)方式，股骨和胫骨髓质腔也可以利用。通过RIA和常规收获方法收集的自体移植物的成骨能力是等同的。使用模拟的RIA方式，我们在从髂嵴、股骨和胫骨收获的BGM的细胞选项中观察到明显的不同。此外，髂嵴BGM与来自股骨或胫骨的BGM相比具有显著更高的合成代谢成骨基因表达水平(图7)。但是，所有这些BGM等份样品在肾包膜下(SRC)分析中表现出骨形成潜能(图7)。自体移植物的功效也可以在移植回到患者中之前受到对该材料的不适当操作的损害。例如，甚至在新收获的BGM保持在室温下时，存在显著的细胞凋亡。用L-WNT3A处理BGM显著提高细胞存活：例如，与单独BGM相比，BGMACT表现低～50％的TUNEL-阳性细胞。有丝分裂活性在BGMACT中相对于用L-PBS处理的BGM显著更高(图11D-F)。总的来说，这种细胞增殖的提高和伴随的细胞死亡的降低转化成提高的BGM生存力并因此提高自体移植物功效。

[0122] 优化自体移植物中的生长因子活性。自体移植物功效也表现为依赖于材料中生长因子的存在。在新收获的自体移植物中，已经鉴定了多种多样的生长因子，包括转化生长因子β、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子和血小板源生长因子。但是，在脱矿的(demineralized)冷冻干燥同种异体移植物中，这些因子缺乏或以最小可测量量存在。据我们所知，还没有报告自体移植物或同种异体移植物中的内源WNT信号传导水平的研究。但是，有多项研究清楚地证明Wnt抑制剂的血清水平在老年人中升高，这据推测降低Wnt信号传导活性。这些临床发现与显示BGM中的Wnt活性随年龄下降的我们的数据一致(图8)。因此，升高WNT反应性的方法恢复自体移植物的成骨能力。我们证明L-WNT3A的处理激活BGM中的Wnt信号传导，其与SRC中(图11)和脊柱融合模型中(图12)的稳定骨发生相关联。

[0123] 用L-WNT3A激活自体移植物干细胞。自体移植物的至少部分功效可以追溯到材料内的干细胞/基质细胞。在骨髓腔中，成骨/骨骼干细胞粘附于骨内膜表面或嵌于骨内膜表面上。结果，依赖于单独抽吸的收获方法通常不能收集这些粘附的干细胞群体。事实上，当前的估计将骨髓抽吸物中干细胞的数目置于低至1/50,000有核细胞；在老年患者中，该数目下降至仅1/1,000,000有核细胞。RIA收获有意地除去骨内膜表面并因此更可能包含成骨干细胞群体。我们使用除去其中Wnt反应性细胞驻留的骨内膜表面的改进RIA方法(图8)，然后证明以这种方式收集的BGM包含干细胞/祖细胞群体且是稳定成骨的(图7)，特别是因为内源Wnt信号(图10)。

[0124] 自体移植物继续代表骨重建的经典样本；但是，对于改善自体移植物功效仍存在相当的空间。此处显示的数据证明活体外暴露于L-WNT3A提高细胞存活力并激活新收获的自体移植物中的干细胞群体，这使得提高的成骨活性达到顶点。这些数据具有直接的临床应用，特别是对于来自其固有骨形成能力由于病态、疾病或老化而降低的风险患者群体的自体移植物。

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