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一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法

阅读：421发布：2024-01-08

专利汇可以提供一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及经济褐藻海带品种混杂领域，具体的说是一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法。将接种雌配子体克隆的苗绳分别置于培养基或海带育苗制冷水循环系统内培养，置于培养基内获得孤雌生殖孢子体，海带育苗制冷水循环系统内培养获得后代孢子体，检测制冷水循环系统内苗绳上的后代孢子体形态特征以及基因型，与孤雌生殖孢子体进行比较，确定育苗过程中品种是否混杂。本检测方法的建立首次证实了在海带夏苗生产工艺中，共用的低温循环水使用的确会造成品种混杂。，下面是一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将接种雌配子体克隆的苗绳分别置于培养基或海带育苗制冷水循环系统内培养，置于培养基内获得孤雌生殖孢子体，海带育苗制冷水循环系统内培养获得后代孢子体，检测制冷水循环系统内苗绳上的后代孢子体形态特征以及基因型，与孤雌生殖孢子体进行比较，确定育苗过程中品种是否混杂。
2.按权利要求1所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：所述后代孢子体是将接种雌配子体克隆的苗绳置于海带育苗制冷水循环系统内培养，使单克隆雌配子体苗绳经历育苗系统内海带夏苗培育过程中卵子和精子排放以及后续的受精过程的配子体发育阶段，形成后代孢子体。
3.按权利要求1所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将单克隆雌配子体和育苗绳在低光条件下共同充气培养，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克隆雌配子体苗绳的接种；将接种有雌配子的苗绳培养直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌配子体苗绳的发育培养；而后将一部分苗绳置于育苗系统制冷水循环系统内，使单克隆雌配子体苗绳经过海带夏苗培育过程中卵子和精子排放以及后续的受精过程的配子体发育阶段，形成后代孢子体，另一部分苗绳置于烧杯中培养，使单克隆雌配子体苗绳完成孤雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体；待两种苗绳上的孢子体长至3-5cm，检测制冷水系统内苗绳上的后代孢子体的形态特征与基因型，与孤雌生殖孢子体的形态特征与基因型进行比较，确定海带育苗制冷水系统内培育的海带品种是否混杂。
4.按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：营养生长的海带单克隆雌配子体，采用高速打碎机破碎至3-10个细胞，将打碎的雌配子与育苗绳共同充气培养，置于PES培养基中，于10-12℃，光强10-20μmol photons m-2s-1，光周期L:D为12:12的条件下，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克隆雌配子体苗绳的接种；将上述接种有雌配子的苗绳置于PES培养基中，于10-12℃，光强50-60μmol photons m-2s-1，光周期L:D为
12:12的条件下，直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌配子体苗绳的发育培养。
5.按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将一部分形成卵囊的单克隆雌配子苗绳，在海带夏苗培育过程中配子体发育阶段，转移到生产育苗的制冷水循环系统的入水槽和育苗池内，使单克隆雌配子体苗绳度过海带苗帘由配子体向孢子体大规模转化阶段，形成后代孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。
6.按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：将另一部分形成卵囊的单克隆雌配子体苗绳，继续培养在烧杯中，置于PES培养基中，于10-12℃，光强50-60μmol photons m-2s-1，光周期L:D为12:12的条件下，直到卵囊排卵，完成单克隆雌配子体的孤雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。
7.按权利要求5所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：所述入水槽地势高于育苗池，使制冷水依据地势特点，从高处流向低处。
8.按权利要求3所述检测海带育苗中品种混杂的方法，其特征在于：所述育苗系统内自然海水经过沙滤后，输入到降温池，降温后输入到冷水储存池，之后泵入到入水槽，顺势流进育苗池，海水流经育苗池中的海带苗帘，汇集后经第二套过滤池再次输入到降温池降温，之后进入育苗循环水系统中，再次使用。

说明书全文

一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及经济褐藻海带品种混杂领域，具体的说是一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法。

背景技术

[0002] 海带为典型的冷水性海藻，在我国海域中，由于夏季海水温度偏高，其无法在自然海域中完成生活史过程。自20世纪50年代，我国海带夏苗培育技术的突破，促进了海带养殖规模的迅速扩大。夏苗技术是将夏季高温海水进行人工降温处理，将海水温度维持在适合海带生存的5-12℃，从而在室内完成海带幼苗培育的过程。为节约制冷成本，海带育苗企业在生产中将制冷水循环使用。因此，如果共用的循环水系统中同时培育两个以上的品种时，就可能造成品种混杂的问题。在实际海带育苗生产中，品种混杂现象是否存在一直没有建立行之可效的技术方法进行检测。

发明内容

[0003] 本发明目的在于提供一种检测海带夏苗制冷水工艺中品种混杂的方法。

[0004] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

[0005] 一种检测海带育苗中品种混杂的方法，将接种雌配子体克隆的苗绳分别置于培养基或海带育苗制冷水循环系统内培养，置于培养基内获得孤雌生殖孢子体，海带育苗制冷水循环系统内培养获得后代孢子体，检测制冷水循环系统内苗绳上的后代孢子体形态特征以及基因型，与孤雌生殖孢子体进行比较，确定育苗过程中品种是否混杂。

[0006] 其中，苗绳上的后代孢子体形态特征比较，孤雌生殖的孢子体畸形率较高，而正常受精形成的孢子体形态正常。孤雌生殖的孢子体在SSR位点仅能获得单一性的等位基因片段，而受精形成的后代孢子体在SSR位点上能够表现出多态性特征。

[0007] 所述后代孢子体是将接种雌配子体克隆的苗绳置于海带育苗制冷水循环系统内培养，使单克隆雌配子体苗绳经历育苗系统内海带夏苗培育过程中的配子体发育阶段(卵子和精子排放以及后续的受精过程)，形成后代孢子体。

[0008] 进一步的说，将单克隆雌配子体和苗绳在低光条件下共同充气培养，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克隆雌配子体苗绳的接种；将接种有雌配子的苗绳培养直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌配子体苗绳的发育培养；而后将一部分苗绳置于育苗系统制冷水循环系统内，使单克隆雌配子体苗绳经历海带夏苗培育过程中的配子体发育阶段(卵子和精子排放以及后续的受精过程)，形成后代孢子体，另一部分苗绳置于烧杯中培养，使单克隆雌配子体苗绳完成孤雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体；待两种苗绳上的孢子体长至3-5cm，检测制冷水系统内苗绳上的后代孢子体的形态特征与基因型，与孤雌生殖孢子体的形态特征与基因型进行比较，确定海带育苗制冷水系统内培育的海带品种是否混杂。

[0009] 所述营养生长的海带单克隆雌配子体，采用高速打碎机破碎至3-10个细胞，将打碎的雌配子与育苗绳共同充气培养，置于PES培养基中，于10-12℃，光强10-20μmol photons m-2 s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下，直到雌配子体牢固附着于苗绳上，完成单克隆雌配子体苗绳的接种；将上述接种有雌配子的苗绳置于PES培养基中，于10-12℃，光强50-60μmol photons m-2 s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下，直到配子体形成卵囊，完成单克隆雌配子体苗绳的发育培养。

[0010] 所述将一部分形成卵囊的单克隆雌配子苗绳，在海带夏苗培育过程中配子体发育阶段，转移到生产育苗的制冷水循环系统的入水槽和育苗池内，使单克隆雌配子体苗绳度过海带苗帘由配子体向孢子体大规模转化阶段，形成后代孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。

[0011] 所述将另一部分形成卵囊的单克隆雌配子体苗绳，继续培养在烧杯中，置于PES培养基中，于10-12℃，光强50-60μmol photons m-2 s-1，光周期为12:12(L:D)的条件下，直到卵囊排卵，完成单克隆雌配子体的孤雌生殖生活史，形成孤雌生殖孢子体，直至孢子体长度为3-5cm。

[0012] 所述入水槽地势高于育苗池，使制冷水依据地势特点，从高处流向低处，优先流过入水槽。

[0013] 所述育苗系统内自然海水经过沙滤后，输入到降温池，降温后输入到冷水储存池，之后泵入到入水槽，顺势流进育苗池，海水流经育苗池中的海带苗帘，汇集后经第二套过滤池再次输入到降温池降温，之后进入育苗循环水系统中，再次使用。

[0014] 本发明所具有的优点：

[0015] 1.本发明充分考虑制冷水循环的路径特点，利用入水槽与育苗池为阶梯势流水系统，且地势高于育苗池，通过检测入水槽处放置的雌配子体苗绳能否获得外源孢子体，可以反映育苗池海带苗帘上的品种混杂问题。

[0016] 2.本发明采用孤雌生殖孢子体形态畸形而受精孢子体形态正常的特点，确定在地势高的入水槽处放置的单克隆雌配子体苗绳产生了形态正常的受精孢子体。

[0017] 3.本发明依据单克隆雌配子与孤雌生殖孢子体微卫星位点等位基因片段单一，而受精孢子体的微卫星位点等位基因具有多态性，进一步证实了入水槽处放置的单克隆雌配子体苗绳形成了受精孢子体。

[0018] 附图说明书

[0019] 图1为本发明实施例提供的海带夏苗工艺中的低温水循环系统示意图。

具体实施方式

[0020] 实施例1

[0021] 将长期保存的营养生长的丝状海带单克隆雌配子体(雌配子体的获取以及生长情况请参考Li Jing,Pang Shaojun,Shan Tifeng,Liu Feng,Gao Suqin.Zoospore-derived monoecious gametophytes in Undaria pinnatifida(Phaeophyceae).Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2014.32(2):365-371.文献中的记载)，置于高速打碎机中，以2000r/min的速率将丝状雌配子体破碎至3-10个细胞。随后，将打碎的雌配子与50cm的苗绳共同充气培养在1L的烧杯中，置于PES培养基中，于温度12℃，光强10-20μmol photons m-2 s-1，光周期为12:12(L:D)的光照培养箱中培养。

[0022] 待到雌配子体牢固附着于苗绳上时，将培养光线提高至50-60μmol photons m-2 s-1，以使雌配子体发育形成卵囊。随后，在海带夏苗培育过程中的配子体发育阶段(卵子和精子排放以及后续的受精过程)，将已经完成发育并形成卵囊的一部分苗绳转移到生产育苗的水循环系统内，分别放置在育苗池中和育苗池的入水槽处(请参考图1所示)。另一部分苗绳继续在培养箱中培养，使其完成孤雌生殖生活史过程。每组设置三个重复。

[0023] 待到海带育苗池中的苗帘完成由配子体到孢子体的转化后，将放置于育苗池和入水槽处的苗绳取回，重新放回光照培养箱中，用煮沸灭菌的消毒海水充入空气培养，培养条件为温度12℃，光强10-20μmol photons m-2s-1，光周期为12:12(L:D)。当孢子体培养至3-5cm大小时，观察比较不同处理组苗绳上孢子体的形态特征。

[0024] 将育苗系统育苗池和入水槽处放置的苗绳以及烧杯中培养的苗绳上收集的海带孢子体，每组30颗,采用CTAB的方法进行基因组的提取(提取方法参考Wang D,Wang X L,Li D P,et al.The geneticanalysis and germplasm identification of the gametophytes of Undariapinnatifida(Phaeophyceae)with RAPD method[J].J.Appl.Phycol.,2006,18:801-9.文献记载)。参考报道的海带SSR引物并依据引物扩增情况选择多态性高，扩增条带清晰的4对引物进行扩增。引物的具体信息见表1。20μL PCR反应体系，包含1μL的DNA模板，8μL ddH2O,10μL 2×mix缓冲液，0.5μL普通引物(10μM)以及0.5μL荧光引物(10μM)。PCR扩增程序为，94℃预处理4分钟，94℃变性1分钟，,Ta 退火1分钟(表
1)，72℃延伸1分钟，经历30个循环，72℃延伸10分钟，最终4℃保存。将PCR扩增产物先用1％的琼脂糖进行检测，确定扩增成功后，采用ABI3730XL自动测序仪进行毛细管电泳，利用软件Genemarker V2.2.0读取等位基因进行分析，内标参照LIZ-500。

[0025] 表1：4对海带属SSR引物信息

[0026]

[0027] 实施例2

[0028] 2014年8月在我国山东省荣成市海带育苗企业开展了制冷水循环系统中品种混杂的检测，将接种雌配子体克隆的苗绳放置在低温循环水系统的育苗池和入水槽处，后期收集苗绳上的后代孢子体，以孤雌生殖孢子体作为对照，进行了形态特征的比较。同时，采用微卫星分析方法，采用4对SSR引物扩增，以亲本雌配子体作为参照，进行了后代孢子体的基因型分析。表明，育苗池和入水槽处收集到的后代孢子体形态正常，这一孢子体群体中除了具有亲本雌配子体的基因片段外，还检测到了外源基因片段，证实为外源的受精孢子体。此项研究证实了在海带夏苗生产工艺中，共用的低温循环水使用的确会造成品种混杂。为防止品种混杂、退化现象的加剧，建议育苗企业建立独立的亲本维护系统，以维持品种的优良性状。

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