技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物医药技术领域，特别涉及亚香棒虫草在抗癌领域的作用。
背景技术
[0002] 随着经济的增长，人们的生活条件越来越好，但人们也逐渐发现每年因
恶性肿瘤而死亡的人数也在逐渐增加，而这也推动了科研人员对于肿瘤药物的开发以及对其机制的深入研究。虫草主要由两部分构成：千尸毛“虫”和头部长出来的
真菌“草”，它的各种活性成分物质具有降压及舒张血管、调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗菌、抗
氧化等多种功效。冬虫夏草被称为我国的“中药之王”，位列三大补品之首，研究发现，在中国境内有100多种虫草，只有一种叫做冬虫夏草，足见其稀缺珍贵。
[0003] 而随着天然产物分离纯化技术、细胞
生物学、药效学和药理学的发展，天然产物抗肿瘤的研究正成为一个越来越热
门的研究领域，因为它相比于化疗来
治疗癌症的
副作用小，比较被人们接受，一旦研究人员能够发明出一种天然活性产物制剂来治疗癌症，那对于世界的贡献不亚于工业革命或者计算机信息技术革命。虫草多糖又作为抗肿瘤活性的重要成分之一，也是引起越来越多的研究学者关注的原因之一。虫草多糖也是国际医学上公认的人体免疫增强剂，它可以调节
机体的免疫功能，增强体液免疫和细胞免疫，从而提高机体的免疫
力。
[0004] 同时，人们也逐渐发现，有些虫草的化学成分及药理作用与冬虫夏草相似，例如：古尼虫草、蛹虫草、凉山虫草、巴西虫草、亚香棒虫草等，他们都可替代冬虫夏草入药，并对人体产生相同的功效。
[0005] 亚香棒虫草(Cordyceps hawkesii Gray.)又称霍克斯虫草，虫体外面灰黄色，“草部”呈淡灰色至灰黑色，亚香棒虫草比较脆而且容易折断，气微香，味淡，其主要靠寄生鳞翅目蝙蝠蛾科棒蝠蛾属(Napialus)幼虫来生长。在成分和功能作用上与冬虫夏草十分接近，因此有些地方直接用亚香棒虫草代替冬虫夏草食用，具有止咳、化痰、定喘、安神、益精气及益肾壮阳等功效。
[0006] 虫草多糖是亚香棒虫草中含量最高的活性物质，它是一类高分子化合物，构造复杂，且拥有广泛的药理作用，引发越来越多的研究学者关注。虫草多糖是国际医学上公认的人体免疫增强剂，作用效果良好，可以调节机体的免疫功能，增强体液免疫和细胞免疫，从而提高机体的免疫力。多糖是组成生物体的四大主要物质之一，普遍存在于各类生物中，多糖由单糖分子以糖苷键结合而成的，在生物体内扮演着重要
角色，具有多方面的生物活性。
发明内容
[0007] 本公开的目的在于提供了亚香棒虫草胞外多糖(BW)的制备方法。
[0008] 亚香棒虫草胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)菌种活化：制备
马铃薯平板培养基并接种亚香棒菌丝体菌25℃培养三天；
[0010] 2)扩大培养：制备马铃薯液体培养基，从活化培养所得的亚香棒菌丝体菌中选取生长良好的菌丝进行接种，振荡培养十天；
[0011] 3)
发酵培养：制备发酵培养基，从扩大培养基中挑取生长良好的菌种进行接种，振荡培养十天；
[0012] 4)胞外粗多糖的提取：将发酵培养所得的亚香棒菌丝体菌进行抽滤，以
乙醇洗涤发酵培养的器皿再次抽滤，合并两次滤液进行浓缩，得到浓缩液；
[0013] 5)胞外粗多糖的提纯：向浓缩液加入3-4倍上清液体积的85％的乙醇，沉淀后过滤，再用乙醚清洗固体，过滤，得到胞外多糖。
[0014] 其中，所述马铃薯平板培养基由以下步骤制得：将马铃薯洗干净，去皮后称取200g，并将其切碎，加入1000ml
水，煮30min，用四层纱布过滤得马铃薯液；加入蛋白胨1％，
磷酸氢二
钾0.05％，
葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.05％，
硫酸镁0.1％，琼脂1.8％，边搅拌边煮沸，直到蛋白胨和葡萄糖完全溶解，再加入200μg/ml抗生素，待冷却45℃左右，倒平板。
[0015] 所述马铃薯液体培养基由以下步骤制得：将马铃薯洗干净，去皮后称取200g，并将其切碎，加入1000ml水，煮30min，用四层纱布过滤得马铃薯液；加入蛋白胨1％，
磷酸氢二钾0.05％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.05％，
硫酸镁0.1％，200μg/ml抗生素，杀菌锅灭菌。
[0016] 所述发酵培养基由以下步骤制得：按葡萄糖10g/L，
蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，蛋白胨4g/L,
硝酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸亚
铁1.4g/L，维生素B10.03g/L,甘
氨酸0.8g/L，玉米粉10g/L,
酵母粉4g/L和
豆粕4g/L加入水中，杀菌锅杀菌。
[0017] 亚香棒虫草胞外多糖在抑制
乳腺癌细胞(MCF-7)、神经母癌细胞(SH-SY5Y)或
肺腺癌细胞(A549)中的应用。通过MTT法测试亚香棒虫草胞外多糖对乳腺癌细胞、神经母癌细胞、肺腺癌
细胞增殖抑制作用的检测，证明亚香棒虫草胞外多糖对上述三种癌细胞都有显著抑制作用。
[0018] 本公开所述的亚香棒虫草胞外多糖的制备方法及其应用。该制备方法能够高效提取亚香棒虫草胞外多糖，有助于为后续研究用虫草多糖与治疗癌症提供充足的
支撑。同时，还经过试验证明所述亚香棒虫草胞外多糖可以有效抑制乳腺癌细胞、神经母癌细胞、肺腺癌细胞，为相关科研提供科学的依据。
附图说明
[0019] 图1为
实施例2中亚香棒虫草胞外多糖对肺腺癌细胞的抑制效果图；
[0020] 图2为实施例3中亚香棒虫草胞外多糖对乳腺癌细胞的抑制效果图；
[0021] 图3为实施例4中亚香棒虫草胞外多糖对神经母癌细胞的抑制效果图。
具体实施方式
[0022] 实施例1：亚香棒虫草胞外多糖的制备
[0023] 包括以下步骤：
[0024] 1)菌种活化：将马铃薯洗干净，去皮后称取200g，并将其切碎，加入1000ml水，煮30min，用四层纱布过滤得马铃薯液；加入蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.05％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.1％，琼脂1.8％，边搅拌边煮沸，直到蛋白胨和葡萄糖完全溶解，再加入200μg/ml抗生素，待冷却45℃左右，倒平板，然后接种亚香棒菌丝体菌25℃培养三天；
[0025] 2)扩大培养：将马铃薯洗干净，去皮后称取200g，并将其切碎，加入1000ml水，煮30min，用四层纱布过滤得马铃薯液；加入蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.05％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.05％，硫酸镁0.1％，200μg/ml抗生素，杀菌锅灭菌，从活化培养所得的亚香棒菌丝体菌中选取生长良好的菌丝进行接种，振荡培养十天；
[0026] 3)发酵培养：按葡萄糖10g/L，蔗糖25g/L，麦芽糖5g/L，蛋白胨4g/L,硝酸铵3g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸氢二钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硫酸亚铁1.4g/L，维生素B10.03g/L,甘氨酸0.8g/L，玉米粉10g/L,酵母粉4g/L和豆粕4g/L加入水中，杀菌锅杀菌，从扩大培养基中挑取生长良好的菌种进行接种，振荡培养十天；
[0027] 4)胞外粗多糖的提取：将发酵培养所得的亚香棒菌丝体菌进行抽滤，再用2-5ml乙醇洗涤发酵培养的器皿再次抽滤，合并两次滤液浓缩到10ml左右，得到浓缩液；
[0028] 5)胞外粗多糖的提纯：向浓缩液加入3-4倍上清液体积的85％的乙醇，沉淀后过滤，再用乙醚清洗固体，过滤，得到胞外多糖。
[0029] 将亚香棒虫草胞外多糖分别配制成BW-L(0.024mg/ml)、BW-M(0.0483mg/ml)、BW-H(0.0966mg/ml)三个浓度梯度。
[0030] 实施例2：亚香棒虫草胞外多糖对肺腺癌细胞增值抑制作用
[0031] 取传代2-3天的肺腺癌细胞，用1ml 0.2％胰蛋白酶消化细胞，消化时间为1-3min，加入2ml的PBS缓冲液进行稀释，用移液枪轻轻对其进行反复吹打，混合均匀，制成单细胞悬液；在1000rpm、3min的条件下放入离心机中进行离心，待离心完毕后，吸去上清液，加3-4ml的细胞培养基，再用移液枪轻轻对其进行吹打，混合均匀。
[0032] 取少量细胞液，用胎盘蓝对其进行
染色，染色后进行计数，并计算浓度，计算结果为5万/ml，稀释10倍；然后进行种板，以每孔5000个细胞种于96孔板中，放入CO2
培养箱中培养一天。
[0033] 培养一天后，设置实验组(BW-H、BW-M、BW-L)，阴性对照组，空白对照组等五组实验，每个实验组设置三个复孔，再取其平均值，实验组加入亚香棒虫草胞外多糖：BW-L(0.024mg/ml)、BW-M(0.0483mg/ml)、BW-H(0.0966mg/ml)三种浓度；空白组只加入培养液，对照组则只加癌细胞和培养液。加完之后，放入CO2培养箱中分别培养24h，48h和72h。
[0034] 培育完后，每孔中加入10μL 5mg/ml的MTT，继续培养4h，培养结束后，吸掉洗液，加150μL DMSO(二甲基亚砜)，振荡3-5min，在490nm
波长的条件下，用酶标仪测其OD值，按公式计算其抑制率。计算公式：
[0035] 存活率＝[实验组－空白组]/[对照组－空白组]×100％
[0036] 抑制率＝1－存活率
[0037] 用酶标仪测出OD值，根据计算公式算出亚香棒虫草胞外多糖对肺腺癌的存活率，算出抑制率，用
软件SPSS.21分析数据，
整理如表1所示，并进一步根据抑制率作出其折线图，如图1所示。
[0038] 表1肺腺癌A549细胞培养的抑制率
[0039]
[0040] 其中，BW-L和BW-M的胞外多糖对肺腺癌A549细胞没有显著抑制作用(P＞0.1)，BW-H的胞外多糖对肺腺癌细胞有显著抑制作用(P＜0.05)。
[0041] 由图1可知，胞外多糖对肺腺癌A549细胞的增殖有抑制作用，对于BW-L的胞外多糖，其抑制作用较弱，抑制率在20％以内；BW-M的胞外多糖，其抑制效果总体比BW-L的胞外多糖抑制效果要好，随着培养时间的增加，抑制作用增强且培养时间超过48h时，抑制率的增
加速率加快，但抑制作用也较弱；BW-H的胞外多糖对肺腺癌A549细胞具有显著抑制作用；培养时间到72h时，BW-L、BW-M和BW-H的胞外多糖对肺腺癌A549细胞的抑制率分别为
10.2％、17.9％，30.7％，效果较好。
[0042] 实施例3：亚香棒虫草胞外多糖对乳腺癌细胞增值抑制作用
[0043] 试验流程与实施例2相同，以乳腺癌细胞取代肺腺癌细胞进行试验。
[0044] 亚香棒虫草胞外多糖对肺腺癌的存活率，算出抑制率，用软件SPSS.21分析数据，整理如表2所示，并进一步根据抑制率作出其折线图，如图2所示。
[0045] 表2乳腺癌MCF-7细胞培养的抑制率
[0046]
[0047] 其中，BW-L的胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用有显著性趋势(0.05＜P＜0.1)，BW-M和BW-H的胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞有显著性抑制作用(P＜0.01)。
[0048] 胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞体外增殖的影响如图2所示，BW-L和BW-M的胞外多糖对乳腺癌MCF-7的抑制作用较弱，说明这两个浓度的胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞的抑制效果不是很好；BW-H的胞外多糖对乳腺癌MCF-7细胞的抑制作用比较显著，他们培养24h的抑制率也比BW-L的胞外多糖培养72h的大，且随着培养时间的增大，其抑制率基本呈线性的方式增大，当培养时间达到72h时，BW-M，BW-M，BW-H的胞外多糖抑制率为22.5％，32.4％，45.6％，表现出较强的浓度依懒性。
[0049] 实施例4：亚香棒虫草胞外多糖对神经母癌细胞增值抑制作用
[0050] 试验流程与实施例2相同，以神经母癌细胞取代肺腺癌细胞进行试验。
[0051] 亚香棒虫草胞外多糖对肺腺癌的存活率，算出抑制率，用软件SPSS.21分析数据，整理如表3所示，并进一步根据抑制率作出其折线图，如图3所示。
[0052] 表3神经母癌SH-SY5Y细胞培养的抑制率
[0053]
[0054] 其中，BW-L，BW-M和BW-H的胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞有显著抑制作用。
[0055] 胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞体外增殖的影响如图3所示，在培养时间48h以前，BW-L和BW-M的胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞抑制作用非常微弱，甚至可能对神经母癌SH-SY5Y细胞的增殖具有促进作用，48h-72h这段时间内抑制作用显著上升；BW-H的胞外多糖对神经母癌SH-SY5Y细胞具有显著抑制作用，当培养时间到72h时，BW-H，BW-M和BW-L的胞外多糖抑制率分别为79.6％，41.3％，30％。
[0056] 胞外虫草多糖对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞抑制作用与虫草多糖的浓度与作用时间关系密切。
[0057] 浓度方面，BW-H、BW-M和BW-L的胞外多糖对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞具有一定的抑制作用，其中BW-H的胞外多糖对这三种癌细胞的抑制作用较为显著，浓度越高抑制效果越好，而浓度低的胞外多糖抑制效果不那么明显，甚至对癌细胞具有增殖作用，也表明虫草多糖对癌细胞的抑制作用具有浓度依赖性。
[0058] 时间方面，BW-H、BW-M和BW-L的胞外多糖随着培养时间的延长，对肺腺癌A549细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母癌SH-SY5Y细胞的抑制效果增强，也具有较强的时间依懒性。
[0059] 分析上述实施例2～4可知，亚香棒虫草胞外多糖CH-012(菌丝体)在适宜的浓度时呈现出较为显著的抗肿瘤作用。
