섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모를 이용한 재생종이로부터 연료용 에탄올 제조방법{Method of manufacturing ethanol for fuel from recycled paper using recombinant-yeast being able to hydrolyse cellulose}

본 발명은 유전공학적 기법을 이용하여 개발한 재조합 효모를 이용하여 전처리된 재생종이로부터 대체에너지로서의 연료용 에탄올 (Ethanol)을 제조하는 방법에 관한 것이다.

미래의 연료용 대체에너지원 중에서 에탄올은 그 원료인 섬유소(Cellulose) 자원이 식물의 광합성을 통해 무한 재생된다는 점과 연소 후 유리되는 이산화탄소의 재순환, 배기가스에 질소산화물이나 황산화물 등의 대기오염 유발 물질이 포함되어 있지 않는 환경 친화성 등의 장점을 이유로 다양한 제조방법들이 보고되어왔다.

먼저 에탄올 제조에 사용되는 원료물질의 관점에서 보면, 농업용 부산물, 목질계 자원, 도시폐기물, 재생종이 등 다양한 섬유소 자원을 이용한 연구가 진행되어 왔다 (LR Lynd, et al., Science, Volume 251, pp. 1318-1323, 1991). 이중에서 미국을 중심으로 원료의 양과 장기적인 수급을 이유로 농업부산물과 재생종이 등이 가장 타당성 있는 섬유소 원료로 간주되고 있다.

그러나 종래의 연구개발은 주로 섬유소 함량이 높은 고급 사무실용 폐지를 대상으로 하였기에 그 원료의 장기적 수급이나 상대적인 양에서 실용화에는 많은 의문이 제기되어왔다.(M. Wayman, et al., Process Biochem., Volume 27, pp. 239-245, 1992; CD Scott, et al., Appl. Biochem. Biotechnol., Volume 45/46, pp. 641-653, 1994; TA Brooks and LO Ingram, Biotechnol. Prog., Volume 11, pp. 619-625, 1995).

둘째로 에탄올 제조에 사용되는 미생물 균주의 제작과 관련하여서는, 그 동안 섬유소 가수분해 유전자를 외래에서 클로닝하여 발현시킨 예는 몇 가지가 보고되어왔다.(V. Arsdell, et al., Bio/Technol., Volume 5, pp. 60-64, 1987; ME Pentilla, et al., Yeast, Volume 3, pp. 175-185, 1987; C. Cummings, Curr. Genet., Volume 29, pp. 227-233, 1996; J. Benitez, Yeast, Volume 5, pp. 299-306, 1989; D. Mochizuki, et al., J. Ferment. Bioeng., Volume 77, Number 5, pp. 468-473, 1994). 하지만 섬유소 가수분해에 필수적인 엔도글루카나제, 엑소글루카나제 및 베타글루코시다제 등 전체 효소를 동시에 클로닝하여 발현시킨 예는 아직 보고된 바 없다. 이러한 외래 섬유소 가수분해 효소의 유전공학적 기법을 이용한 도입은 상용 효소의 사용량을 상당량 절감함으로써 전체 공정의 경제성을 높일 수 있는 것이다.

마지막으로 에탄올 제조에 관한 공정에 관하여서는, 일반적으로 당화공정과 발효공정이 분리된 공정과 이 두가지 공정이 결합된 공정으로 나뉘어 많은 연구가 진행되어 왔다. 그 중에서 상용효소에 의한 섬유소 원료의 당화 공정과 균주에 의한 에탄올 제조 공정을 결합시킨 동시당화발효공정(M. Takagi, S. Abe, S. Suzuki, GH Emert, N. Yata, Bioconversion symposium proceedings., IIT, Delhi, pp. 551-557 (1977))이 가장 경제성 있는 공정으로 알려져 있다. 이러한 동시당화발효 공정은 기존의 당화와 발효가 분리된 공정에 비해 반응기 수를 줄일 수 있을 뿐만 아니라 생성된 당에 의한 생산물 저해 현상 등을 방지할 수 있다. 하지만 이러한 종래의 동시당화발효공정도 상용 섬유소 가수분해효소와 에탄올 제조온도와 균주의 최적온도와의 차이에 의한 효율저하와 고가의 상용효소 비용 등 경제성 있는 공정을 위해서는 여전히 많은 기술적 장애 요인을 가지고 있다.

지금까지 살펴본 바와 같이 상기 방법에 의한 종이를 원료로 한 에탄올 제조방법들에서는 수량이 한정되어 있는 고급지인 사무실 종이류를 주로 이용하였고, 균주도 섬유소 가수분해능을 갖지 못하므로 상대적으로 많은 양의 상용효소를 사용하여왔다.

본 발명은 이와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출되는 것으로, 섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모를 유전공학적인 기법으로 개발하고, 이에 적합한 동시당화발효공정을 제안하여 실용적 관점에서 회수율 및 장기적인 수급이 용이한 혼합 재생종이를 기질로 하며, 기존의 공정보다 상용효소의 사용량을 상당량 절감할 수 있는 새로운 동시당화발효에 의한 연료용 에탄올 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.

도 1 은 본 발명의 재조합 효모를 이용한 재생종이로부터 연료용 에탄올 제조공정도

도 2 는 섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모와 새로운 동시당화발효공정을 이용한 전처리된 재생종이로부터 에탄올 생산추이도

본 발명은 섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모를 이용하여 전처리된 재생종이를 원료로 하여 연료용 에탄올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 현재 도시폐기물 중에서 가장 회수율이 높고 장기적인 수급이 용이한 섬유소 자원중의 하나인 재생종이를 원료로 하고, 유전공학적 기법을 이용하여 개발한 재조합 효모를 이용하여 고효율, 저비용의 연료용 에탄올 제조방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다.

본 발명의 실시예에서는 기질로 신문지와 미국산 잡지류를 재생한 재생종이를 사용하였다. 사용된 재생종이의 조성은 셀룰로오스 62.5%, 헤미셀룰로오스 13.5%, 리그닌 15.5%, 기타 8.5% 였다. 이러한 재생종이 원료의 효소 당화 특성을 향상시키기 위해서 1%의 약한 황산 용액을 사용하여 증기를 이용한 121℃, 15 psig상태에서 30분간 전처리를 하였다. 전처리된 재생종이를 증류수를 이용하여 최종 수소이온 농도가 4-5가 되도록 4-5회 반복해서 씻어준 후, 다량의 수분을 먼저 필터를 이용하여 제거하고, 60 ℃ 건조대에서 완전히 건조시켰다. 이렇게 전처리한 결과, 재생종이의 점도를 상당히 감소시켜서 동시당화발효공정시 훨씬 많은 재생종이를 첨가할 수 있었고 따라서 최종 에탄올 농도의 향상을 통한 전체 공정의 효율을 크게 증진시킬 수 있었다.

도 1 은 본 발명의 재조합 효모를 이용한 재생종이로부터 연료용 에탄올 제조공정도로서, 전처리한 재생종이를 이용하여 에탄올을 생산하기 위해서 개발하여 사용한 새로운 에탄올 제조공정도를 보이고 있다.

도 2 는 섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모와 새로운 동시당화 발효공정을 이용한 전처리된 재생종이로부터 에탄올 생산추이도로서, 발효시간에 따른 에탄올의 생산량과 글루코즈의 감소과 셀의 생성량을 도시하고 있다.

즉, 유전공학적 기법으로 개발된 재조합 효모를 이용하여 전체 에탄올 생산비용 중 상당량을 차지하는 상용효소의 사용량을 절감하고, 전체 조업시간을 단축시키기 위해서 재조합 효소의 축적을 회분식 배양과 최적화된 유가식 배양을 결합한 새로운 공정으로 반응기 부피 내에서 최대의 효소축적을 가능하게 하였다.

먼저 포도당이 2% 포함된 1.4 리터의 반복합 최소배지 (Yeast extract 0.3%, bacto-peptone 0.5%, ammonium sulfate 0.2%, potassium phosphate 0.1%, magnesium sulfate 0.1%, sodium chloride 0.01%, calcium chloride 0.01%)에서 하루정도 전배양한 100 ml의 재조합 효모를 접종하여 회분식 배양을 수행하였다. 이러한 회분식 배양에서 유가식 배양으로의 전환은 실시간 확인하는 배출가스 정보를 이용하였으며 이산화탄소 발생량이 최고에 달하는 점에서 유가식 배양으로 전환하는 방법을 사용하였다. 유가식 배양에 사용한 공급액으로는 20% 포도당과 회분식 배양에 사용한 반복합 최소배지 성분의 2배를 첨가하여 사용하였다. 유가식 배양시 포도당 공급방법도 배양시 재조합 효모에 의한 포도당의 소모속도를 계산하고 또한 포도당 분석기를 이용한 실제 분석을 통해 얻은 포도당 농도를 이용하여 본 발명에 사용된 재조합 균주의 발현시스템에서 ADH1 프로모터의 최적발현을 위한 포도당 농도의 유지를 위한 새로운 배양방법을 개발하여 사용하였다.

유가식 배양이 종료된 후 최종 축적된 효소활성을 확인한 결과 셀룰라제의 경우 640 FPU/L, 베타글루코시다제의 경우 290 IU/L였다. 이것은 본 발명에서 사용한 조업 조건에서의 동시당화발효공정에 필요한 섬유소 가수분해 효소들의 양과 비교해서 각각 42.7%, 29.0%에 해당한다. 따라서 부족한 양은 NOVO사의 상용효소인 Celluclast 1.5L과 Novozyme 188을 공급해 주고 동시에 전처리하여 준비한 재생종이를 공급하여 최종농도가 100 g/L가 되도록 공급하여 동시당화발효 공정으로 전환하였다. 이렇게 하여 최종적으로 29.4 g/L의 에탄올을 생산할 수 있었다. 이것은 섬유소 함량을 기준으로 할 때 최대 이론수율의 약 82.81%에 해당하는 것으로 기존의 다른 공정에서와 비교할 때 매우 우수한 것이다.

이상과 같이 본 발명은 동시당화발효공정에 앞서 섬유소 가수분해능을 갖는 재조합 효모를 유가식 배양을 통해 배양하여 재조합 효소를 축적함으로써 상용효소의 사용량을 절감할 수 있을 뿐만 아니라 고농도의 세포를 이용함으로써 동시당화발효공정에서 기존의 공정에 비해 빠른 시간 내에 에탄올을 제조할 수 있다. 따라서 에탄올 생산성에 있어 상당한 장점을 갖는다.

또한 본 발명에서는 효모의 생리적 최적온도인 30℃에서 조업함으로써 일반적인 동시당화발효공정이 37-38℃에서 수행되는 것과 비교해서 많은 에너지 비용을 절감할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 더 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

재생종이를 증류수로 현탁시키고 1%의 약한 황산용액을 첨가한다. 이것을 121℃에서 30분간 15 psig의 증기압 하에서 처리하였다. 이렇게 전처리된 재생종이를 증류수를 이용하여 최종 수소이온 농도가 4-5가 될 때까지 씻어준 후, 다량의 수분을 먼저 필터를 이용하여 제거한 후 60℃에서 완전히 건조시켜 에탄올 제조의 원료로 준비하였다. 이렇게 전처리한 결과 재생종이 현탁액의 점도를 아래 [표 1]에서 보는 바와 같이 약 1/4로 감소시켜 동시당화발효공정에서 초기 재생종이 첨가량을 상당량 증가시킬 수 있었다.

[표 1] 약산을 이용한 전처리에 따른 점도의 변화

재조합 효소의 축적을 위해서 먼저 포도당 농도 20 g/L와 기타 영양소를 포함한 배지를 이용하여 3 L 반응기에서 1.5 L 부피로 회분식 배양을 시작하였다. 실시간 배출가스 분석기에서 이산화탄소 배출속도가 가장 높은 시점에서 200 g/L의 포도당과 두 배로 농축한 기타 영양소를 포함한 공급액을 공급하여 유가식 배양으로 전환하고 포도당 소모속도를 포도당 분석기를 사용하여 예측하고 이를 보정하는 방식의 새로운 공급방법을 개발하여 사용하였다. 최종 부피가 2 L에 도달하였을 때 유가식 배양을 중지하였다. 이렇게 하여 약 20 시간 후에 최종적으로 셀룰라제 640 FPU/L, 베타글루코시다제 290IU/L의 효소활성을 축적할 수 있었다.

효율적인 동시당화발효공정에 필요한 섬유소 가수분해 효소의 양을 결정하기 위해서 500 ml 플라스크에서 결정성 섬유소를 기질로 하고 상용 효소의 양을 변화시켜 가면서 30℃에서 동시당화발효 실험을 실시하여 최적의 효소량을 결정하였다. 이때 접종하여 준 재조합 효모의 양은 최종농도 기준으로 약 10 g/L 였다. 아래의 [표 2] 에서와 같이 최종 에탄올 수율이 70% 이하인 경우를 제외하고 효소 사용량에 대한 에탄올 생산량을 기준으로 하여 최적 셀룰라제의 양은 30 FPU/g-cellulose였고 베타글루코시다제의 양은 20 IU/g-cellulose였다.

[표 2] 동시당화발효공정에 필요한 최적 섬유소 가수분해 효소량 결정

앞서 결정한 최적의 섬유소 가수분해 효소량에서 재조합 효모의 유가식 배양을 통해 축적한 최종효소의 양을 제외한 부족분 효소를 상용효소로 보충하고자 셀룰라제 17.2 FPU/g-cellulose와 베타글루코시다제 710 IU/L를 첨가한 후, 동시당화발효공정의 기질인 재생종이를 최종농도가 100 g/L가 되도록 공급하여 동시당화발효공정을 수행하였다. 초기 6시간정도는 거의 원활한 혼합이 불가능하여 반응이 지체되었다. 하지만 지속적인 효소반응으로 혼합이 원활해지면서 에탄올 제조가 급격히 증가하였다. 따라서 고농도의 재생종이를 이용한 동시당화발효공정에서는 혼합문제 또한 기질의 점도 못지 않게 중요한 요인임을 확인할 수 있었다. 이렇게 하여 도 2 에서 보는 바와 같이 최종적으로 29.4 g/L의 에탄올을 생산할 수 있었다. 이는 기질의 섬유소 함량을 고려하였을 때 이론수율의 82.81%로 매우 우수한 결과이다.

상업용 효소와 일반효모(섬유소 분해효소를 분비하지 않는 효모)를 사용하는 일반적인 동시당화발효에서는 효소의 최적 작용온도가 50℃ 내외이고 효모의 최적 증식온도는 30℃ 내외로 효소의 작용을 촉진하기 위하여 일반효모가 견딜 수 있는 상한인 37℃∼38℃ 정도에서 조업(배양)을 하게 된다.

본 발명의 효모는 효소를 동시에 분비하므로 효모의 최적 성장(활동)온도인 30℃에서 조업하여 효소의 축적 및 분비를 높여 당화(가수분해)를 촉진하므로 동 30℃에서 조업하였고 이렇게 하여도 충분한 당화로 당화공정이 율속단계가 되는 일이 없이 에탄올이 생성되므로 장점이 있는 것이다.

다시 말하면 일반 동시당화발효공정에서도 30℃ 조업이 가능하지만 비효율적이고 본 발명의 재조합 효모를 사용한 동시당화발효공정은 30℃에서의 효율적인 조업이 가능하다는 특징이 있다.

상기와 같은 구성 및 작용에 의해 기대할 수 있는 본 발명의 효과는 다음과 같다.

유전공학적 기법을 이용하여 제작한 재조합 효모를 이용하여 섬유소 가수분해에 필요한 상업용 효소의 사용량을 절감할 수 있으며, 고농도의 세포를 이용함으로써 동시당화발효공정에서 에탄올 제조시간을 줄일 수 있고, 기질로 혼합 재생종이를 사용하여 기질의 안정적인 수급과 낮은 비용 등으로 인한 전체 공정의 경제성을 크게 향상시킬 수 있으며, 새로운 동시당화발효공정의 개발로 전체 공정의 비용을 상당부분 절감시킬 수 있는 매우 유용한 발명이다.