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一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动 发酵单胞菌及其应用

阅读：1024发布：2020-05-30

专利汇可以提供一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供了一种耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，该运动发酵单胞菌的保藏编号为CGMCC No.10946。本发明的运动发酵单胞菌可以在含有7.0g/L以上的乙酸和3.0g/L以上的呋喃甲醛的培养液迅速生长，且可快速进行乙醇发酵。这使本发明的运动发酵单胞菌可在较高乙酸浓度和较高呋喃甲醛浓度的条件下直接对纤维素酶解产物发酵，并制备得到燃料乙醇。，下面是一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种运动发酵单胞菌，其特征在于：该运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的保藏编号为CGMCC No.10946。
2.权利要求1所述的运动发酵单胞菌在发酵生产乙醇中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中，发酵生产乙醇所用的原料包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳和花生壳中的至少一种。
4.根据权利要求2或3所述的用途，其中，所述运动发酵单胞菌的发酵条件包括：发酵过程的全部或者部分在不低于7g/L的乙酸浓度下和不低于3g/L的呋喃甲醛浓度下进行。
5.一种发酵生产乙醇的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的原料进行蒸汽爆破、稀酸预处理和酶解，得到酶解液；(2)向所述酶解液中接种发酵菌种，进行发酵，得到发酵液；(3)从所述发酵液中分离乙醇；所述发酵菌种含有如权利要求1所述的运动发酵单胞菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述含有纤维素的原料包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳和花生壳中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，酶解的条件使得所述酶解液含有乙酸和呋喃甲醛。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，酶解的条件使得所述酶解液含有不低于7g/L的乙酸和不低于3g/L的呋喃甲醛。

说明书全文

一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动 发酵单胞菌及其

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一种耐高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌和它的应用。

背景技术

[0002] 利用我国丰富的秸秆资源为原料生产燃料乙醇及其他生物基产品，对促进我国农业可持续发展、拓展农业功能及保障国家能源安全具有重要意义。但在秸秆等木质纤维素生物质资源在发酵生产乙醇及生物基化学品的过程中，由于原料中纤维素、半纤维素和木质素之间致密的结构，不利于后续的纤维素酶解糖化。因此，木质纤维素类生物质在酶解前一般需经过物理及化学等预处理手段以提高纤维素酶对纤维素的糖化效率。但在预处理过程中，一些化学预处理手段，如稀酸等，较容易形成乙酸和呋喃甲醛等一系列对微生物具有毒害左右的抑制物。其中酶解液中乙酸浓度可达1-10g/L，酶解液中呋喃甲醛的浓度可达0.5-11g/L，严重影响了后续的生物发酵过程。

[0003] 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为唯一一种通过ED代谢途径(兼性厌氧)发酵葡萄糖的微生物，具有较高的乙醇发酵效率和乙醇耐受性等优势，已成为构建产乙醇工程菌及其他生物基产品的优选宿主之一(Biotechnology for Biofuel,2014,7:101)。然而在纤维素生物质稀酸预处理工艺中，存在一些具有毒性作用的抑制物质，仍然会对已有的运动发酵单胞菌造成毒害作用，导致乙醇发酵效率降低。在外源添加浓度为4g/l的乙酸的情况下即可对该菌生长具有明显抑制作用，并且其乙醇产量也下降10％左右，而在高浓度乙酸(7.0g/L)存在情况下，已有的运动发酵单胞菌则生长更加缓慢，乙醇产量更低。在外源添加浓度为1g/L的呋喃甲醛的情况下即可对该菌生长具有明显抑制作用，并且其乙醇产量也下降20.54％，而在高浓度呋喃甲醛(2.0g/L)存在情况下，运动发酵单胞菌则不能生长。

[0004] 已有研究工作对耐受高浓度乙酸的运动发酵单胞菌和耐受高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌分别进行了选育，得到了分别对乙酸和呋喃甲醛具有耐受性的运动发酵单胞菌，但是，这些运动发酵单胞菌不能同时耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛，尚不能满足秸秆发酵生产乙醇的要求。

发明内容

[0005] 为了克服现有的运动发酵单胞菌难以同时耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的缺陷，本发明提供了一株能同时耐受高达7g/L乙酸和3g/L的呋喃甲醛的运动发酵单胞菌菌株。

[0006] 本发明提供了一种运动发酵单胞菌，该运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的保藏编号为CGMCC No.10946。

[0007] 本发明还提供了如上所述的运动发酵单胞菌在发酵生产乙醇中的用途。

[0008] 本发明还提供了一种发酵生产乙醇的方法，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的原料进行蒸汽爆破、稀酸预处理和酶解，得到酶解液；(2)向所述酶解液中接种发酵菌种，进行发酵，得到发酵液；(3)从所述发酵液中分离乙醇；所述发酵菌种含有如上所述的运动发酵单胞菌。

[0009] 本发明的运动发酵单胞菌可作为纤维素乙醇发酵及其他生物基产品生产的良好菌株，可节省酶解液脱毒处理步骤，直接在较高乙酸存在条件下进行乙醇及其他生物基产品的发酵。

[0010] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

[0011] 生物材料保藏

[0012] 本文对比例中涉及的一种运动发酵单胞菌由实验室模式运动发酵单胞菌经诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，其保藏编号为CGMCC No.9987，保藏日期为2014年11月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

[0013] 本发明的耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的运动发酵单胞菌由保藏编号为CGMCC No.9987的运动发酵单胞菌经诱变和筛选得到。该菌株分类命名为运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)，其保藏编号为CGMCC No.10946，保藏日期为2015年6月2日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

[0014] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0015] 本发明提供了一株运动发酵单胞菌，其中，该运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的保藏编号为CGMCC No.10946。

[0016] 本发明还提供了如上所述的运动发酵单胞菌在发酵生产乙醇中的用途。

[0017] 其中，发酵生产乙醇所用的原料没有特别的要求，可以为常规的各种含有纤维素的原料；例如可以包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳和花生壳中的至少一种。

[0018] 其中，所述运动发酵单胞菌的发酵条件没有特别的要求，可以为常规的各种用于制备乙醇的发酵条件，由于本发明的运动发酵单胞菌对乙酸具有优异的耐受性，优选地，所述运动发酵单胞菌的发酵条件包括：发酵过程的全部或者部分在不低于7g/L的乙酸浓度下和不低于3g/L的呋喃甲醛浓度下进行。

[0019] 其中，为了避免特别高浓度的乙酸和特别高浓度的呋喃甲醛对发酵的影响，优选地，所述运动发酵单胞菌的发酵条件包括：发酵过程的全部或者部分在不高于11g/L的乙酸浓度下和不高于11g/L的呋喃甲醛浓度下进行。

[0020] 本发明还提供了一种发酵生产乙醇的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的原料进行蒸汽爆破、稀酸预处理和酶解，得到酶解液；(2)向所述酶解液中接种发酵菌种，进行发酵，得到发酵液；(3)从所述发酵液中分离乙醇；所述发酵菌种含有如上所述的运动发酵单胞菌。

[0021] 其中，所述含有纤维素的原料包括农作物秸秆、木屑、竹子、稻壳和花生壳中的至少一种。

[0022] 其中，含有纤维素的原料进行蒸汽爆破、稀酸预处理和酶解的条件可以为常规的稀酸预处理和酶解条件，例如，稀酸预处理的条件可以包括：温度为150-190℃，时间为10-100分钟，硫酸浓度为0.2-3重量％，固液比为1:(5-25)；蒸汽爆破的条件可以包括：温度为
180-200℃，压力为1.4-2.0兆帕，压力的维持时间为3-7分钟。酶解的条件和步骤可以包括：
以每克含纤维素的原料的干重计，纤维素酶的用量为8-20酶活力单位，温度为45-55℃，时间为25-48小时，pH值为3.0-7.0。在酶解的过程中，酶解的条件可以使得所述酶解液含有乙酸和呋喃甲醛。

[0023] 其中，由于本发明的运动发酵单胞菌对乙酸具有优异的耐受性，优选地，酶解的条件使得所述酶解液含有不低于7g/L的乙酸和不低于3g/L的呋喃甲醛。

[0024] 以下通过实施例进一步详细说明本发明：

[0025] 制备实施例1

[0026] 本制备实施例用于说明含有乙酸和呋喃甲醛的RM培养基的制备，以及由含有纤维素的原料(玉米秸秆)制备酶解液的过程。

[0027] 按照20.0g/L葡萄糖、10.0g/L 酵母粉、1.0g/L MgCl2、1.0g/L(NH4)2SO4和1.0g/L KH2PO4的配方配置得到基础RM培养基。在基础RM培养基中添加乙酸和呋喃甲醛，得到3种RM调整培养基，其中，第一RM调整培养基含有6.0g/L的乙酸和2.0g/L的呋喃甲醛，第二RM调整培养基含有7.0g/L的乙酸和3.0g/L的呋喃甲醛，第三RM调整培养基含有7.5g/L的乙酸和3.5g/L的呋喃甲醛。

[0028] 将玉米秸秆切成2厘米左右的小段，然后加水调节含水量为40重量％；输送至保温压力装置中，在195℃、1.6兆帕下进行蒸汽爆破，并收集蒸汽爆破产物，并将所得蒸汽爆破产物与70℃的水按照重量比1:3搅拌混合30分钟，然后加入浓度为72重量％的硫酸溶液使硫酸的浓度稀释到2重量％，30℃下搅拌30分钟，得到稀酸处理产物。对稀酸处理产物进行酶解，以每克含纤维素的原料的干重计，纤维素酶的用量为18酶活力单位，温度为52℃，时间为38小时，pH值为4.0；得到酶解液。用液相色谱法测得酶解液中乙酸的含量为7.2重量％，呋喃甲醛的含量为2.8重量％。

[0029] 测试实施例1

[0030] 将保藏编号为CGMCC No.9987的运动发酵单胞菌和保藏编号为CGMCC No.10946的运动发酵单胞菌分别接种于灭菌后的3种RM调整培养基中，于30℃条件下静止培养72小时，发酵24小时后每隔12小时进行取样。利用紫外分光光度计在600nm处测定其生长情况，结果如表1所示。

[0031] 表1

[0032]

[0033] 从表1的数据可以看出，本发明的保藏编号为CGMCC No.10946的运动发酵单胞菌同时具有对高乙酸浓度和高呋喃甲醛浓度的耐受性。

[0034] 测试实施例2

[0035] 将保藏编号为CGMCC No.9987的运动发酵单胞菌和保藏编号为CGMCC No.10946的运动发酵单胞菌分别接种于灭菌后的制备实施例1得到的酶解液(由玉米秸秆制备得到，乙酸的含量为7.2重量％，呋喃甲醛的含量为2.8重量％)中。接种的浓度为104CFU/mL，于30℃下于发酵罐中搅拌培养40小时。在100℃蒸馏所得发酵产物，所得蒸馏馏分在78.3℃下二次蒸馏可得乙醇，按照下式计算乙醇产率。

[0036] 乙醇产率＝100％×乙醇重量/秸秆干重

[0037] 计算结果显示，在相同的发酵条件下，本发明的保藏编号为CGMCC No.10946的运动发酵单胞菌的运动发酵单胞菌的乙醇产率达到28.5重量％，而保藏编号为CGMCC No.9987的运动发酵单胞菌的乙醇产率仅14.5重量％，由此可以看出，在较高乙酸和较高呋喃甲醛同时存在条件下，本发明的保藏编号为CGMCC No.10946的运动发酵单胞菌可生成更多的乙醇。

[0038] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

[0039] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

[0040] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

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