本发明涉及从纤维素中生产乙醇燃料的方法。本发明尤其涉及 为乙醇生产而对纤维素原料进行的预处理。对经选择的其阿拉伯聚 糖加木聚糖与非淀粉多糖的比率(AX/NSP)大于0.39的原料进行预 处理，可以产生比其它原料更优良的酶促水解的底物。这些预处理 的原料只适于乙醇生产。在如此预处理法中可供选择的原料的实例 包括一些燕麦壳及玉米棒，及高AX/NSP的经选育的原料。

由于大量原料的可用性，避免燃烧或将其堆积在土壤中的需求 及乙醇燃料的清洁性，从纤维素中生产乙醇的可能性已得到更多的 关注。如此方法对社会的贡献已有阐述，如见ATLANTIC MONTHLY，(April，1996)封面题材的报道。

如此方法中的天然纤维素原料特指为“生物量”。许多类型的生 物量，包括木材、农业残余物、草木作物及城市固体垃圾等，已被 认为可作为生产乙醇的原料。这些物质主要由纤维素、半纤维素、 及木质素组成。本发明涉及的是将纤维素转化为乙醇。熟知的将玉 米淀粉转化为乙醇的方法不在本发明范围内，该方法中是使用硫酸 及淀粉酶将淀粉转化成乙醇。

纤维素是一种经β-1，4键连接的单糖葡萄糖聚合物。纤维素 可明显抗酸、酶或微生物的降解或解聚。一旦纤维素被转化成葡萄 糖，所得糖经使用酵母易于发酵成为乙醇。该方法的难点所在是将 纤维素转化成葡萄糖。

最古老的将纤维素转化成葡萄糖的方法研究基于酸水解(参见 Grethlein，纤维素材料的化学降解，应用化学及生物技术28：296- 308(1978))。该方法可包括使用浓酸或稀酸。浓酸方法是使用72％ (重)的硫酸或42％(重)的盐酸在室温下溶解纤维素，随后将酸 稀释至1％并加热至100℃～120℃3小时以上以将纤维素寡聚体转化 成葡萄糖单体。该方法可产生高产量的葡萄糖，但酸的回收，构建 特殊材料的需求及需使系统中水量降至最低则是该方法的明显不 足。当浓缩的有机溶剂用于纤维素转化时，也会遇到相似的难题。

稀酸方法是使用0.5％～2％(重)的硫酸在180℃～240℃下进 行几分钟至几小时。BRINK(美国专利5,221,537及5,536,325)描 述了一种木质纤维素经酸水解成葡萄糖的二步法。第一步是将半纤 维素解聚成木糖及其它糖。第二步将纤维素解聚成葡萄糖。低水平 的酸可免于化学回收。但最大的葡萄糖产量只大约是纤维素的55％， 且解聚产物的高度产生可抑制经酵母发酵为乙醇的作用。这些难题 阻止了稀酸水解方法达到商品化。

为克服酸水解法中的难题，已研究发展了纤维素转化方法，其 利用两步：(1)预处理，(2)包括酶促水解的处理。预处理的目的 是不将纤维素完全水解成葡萄糖，而是相反地破坏纤维结构的完整， 从而使纤维素更易于在处理阶段被纤维素酶作用。在经该类型特异 性预处理后，底物具有一种泥样质地。预处理物看上去类似纸浆， 但具有较短纤维和对原料的更明显的物理破坏。

众多预处理方法的目的是提供一机械和化学作用的充分联合， 以破坏纤维结构并增强原料对纤维素酶的接受能力。机械作用典型 地包括使用压力、研磨、碾磨、切碎、搅拌、压缩/膨胀、或其它类 型的机械作用。化学作用典型地包括使用加热(通常为蒸汽)、酸及 溶剂。下面将阐述一些已知预处理装置，具体参照挤出机、压力容 器及批式反应器。

一种经酶促水解的典型处理是将底物与水混合以得到含5％～12 ％(重)的纤维素的浆液，然后加入纤维素酶。典型地，水解在50 ℃，pH5下进行24～150小时。在水解作用的末期，水溶性葡萄糖 在液体内，而未转化的纤维素，木质素及其它底物未溶部分残留于 悬浮液中。通过过滤水解浆液收集葡萄糖浆；将纤维固体进行冲洗 以提高葡萄糖的产量。然后用酵母将葡萄糖浆发酵成乙醇，并用蒸 馏或其它方法回收乙醇。乙醇的发酵及回收可使用醇工业中共识的 方法进行。

预处理加上酶水解的二步法克服了许多与用单一强酸水解相关 的难题。酶的特异作用降低了降解产物量而提高了葡萄糖产量。另 外，对纤维破坏的预处理比对纤维素水解的预处理较温和的事实， 意味着可使用较少的化学载荷，降低化学回收的需求及产生较少的 降解产物，提高产量并降低对酵母发酵成乙醇的作用的抑制。

遗憾地，到目前为止预处理及酶水解的处理方法还不能在足够 低费用下生产葡萄糖，以使发酵为乙醇的工艺具有商业吸引力。甚 至目前众多已知的预处理方法中，使纤维素转化为葡萄糖所需的纤 维素酶的量太大，以至于使乙醇生产费用太高。

已有许多方法尝试去降低所需纤维素酶量。

简单地在系统中加入较少量纤维素酶的方法使葡萄糖的生产降 低到难以接受的程度。

通过延长酶作用于原料的时间来降低所需酶量的方法，导致生 产力的浪费，及水解槽的高费用。

通过使纤维素水解与葡萄糖的酵母发酵同时进行以降低所需纤 维素酶量的方法也是不足的。如此称作同步糖化及发酵(SSF)方法 也不适于商业化，这是由于酵母起作用的最适温度28℃远远低于纤 维素酶所要求的50℃的条件。在平均37℃温度下运行SSF系统同样 无效，且引起微生物的污染。

对低耗费的乙醇生产方法的需求促进了大量研究工作以发展有 效的预处理系统。如此的预处理系将吸收目前预处理的所有优点， 包括降解产物的低产出及化学回收的低需求，但具有纤维素酶的低 需求以便使工艺经济。

预处理系统的性能特征在于将一定量的纤维素水解成葡萄糖所 需的酶量。如果预处理A比B需较少酶去生产定量的葡萄糖，则预 处理A比B的性能好。

预处理的早期工作集中在作用装置的构建及最佳性能所需条件 的确定上。

预处理的一主导方法是通过蒸汽爆炸(steam explosion)，使用 FOODY(美国专利4,461,648)所述的工艺条件，该文在本文并入参 考。在FOODY工艺中，将生物量装入已知作为蒸汽枪的容器中。将 大于1％的酸任选地加入在蒸汽枪或预浸液中的生物量中。然后用蒸 汽将蒸汽枪迅速装满，并在高压下保持一定长时间，已知为蒸煮 (cooking)时间。一旦蒸煮时间过去，将容器快速减压以排出预处 理的生物量，由此有了这些术语“蒸汽爆炸”和“蒸汽枪”。

在FOODY工艺中，预处理的性能依赖于蒸煮时间，蒸煮温度、 所用酸的浓度及原料的粒径。FOODY工艺中建议的预处理条件对所 有试验的纤维素原料(硬木，麦秆及蔗渣)都相似，条件是它们需 分成细小颗粒。进一步地，蒸煮温度的确定是通过装入蒸汽枪中的 饱和蒸汽的压力来进行的。因而影响预处理性能的实际操作变量是 气压，蒸煮时间及酸浓度。FOODY工艺描述了最适性能的变量组合； 正如可以预料的，延长时间能降低所用温度，反之亦然。FOODY所 教导的气压范围在250～1000psig，相应温度为208℃～285℃。

关于蒸汽爆炸预处理参量的另一公开的研究是FOODY等人，蒸 汽爆炸预处理优化的最终报告，美国能源部报告ET230501(April 1980)。该研究报道了预处理变量，温度(蒸汽压)、粒径、含水量、 预调节作用、模头构型及木质素含量的作用。报道了对三类麦秆， 五种硬木及四种庄稼残余物而言的最佳蒸汽爆炸条件。

由FOODY公布的最佳预处理条件随后被其它人通过使用其它 原料及不同设备而确认。例如，GRETHLEIN(美国专利4,237,226) 描述了栎木、新闻纸、杨木及禾茎经连续活塞式流动反应器的预处 理，该装置同挤出机相似。转动螺杆输送原料浆通过一小孔，在那 里机械及化学作用使纤维被破坏。

GRETHLEIN列出了所需的孔径、系统压力、温度(180℃～300 ℃)。存留时间(最长5分钟)，酸浓度(最多1％硫酸)及粒径(优 选60目)。GRETHLEIN对他所鉴定的所有特异性底物都获得了相似 结果(见栏3，行30)。尽管GRETHLEIN的装置非常异于FOODY 的蒸汽枪，但最适性能的时间、温度及酸浓度等是相似的。

最近更多的工作集中在通过预处理所用装置能增进所供底物的 酶促水解这一理解上。BRINK(美国专利5,628,830)描述了通过使 用蒸汽法破坏半纤维素，随后应用纤维素酶进行纤维素的水解来预 处理木质纤维素。

预处理的代表性优点首要说明的是预处理应估价木质素去除的 量，脱木质化作用度越高，则完成的越好。参见Fan，Gharpuray，and Lee， 农业残留物的酶促转化的预处理，第三届能量产生和转化中的生物 技术研讨会资料(Gatlinburg，TENNESSEE，May 12-15，1981)。对作为 预处理特征的脱木质化的见解也见于Cunricingahm等的报道。第七 届燃料和化学品的生物技术研讨会资料(Gatlinburg，Tennessee， May 14-17，1985).

Grethlein及Converse，用于预处理木才的酸预水解和蒸汽爆炸的 通用方面，生物能源技术36(2)：77-82(1991)，提出了如下见解即 脱木质化程度只对已干燥的底物是重要的，因而对大多数使用非干 燥原料的预处理方法没有大的相关性。

Knappert等在作为酶促水解的预处理的纤维素材料的部分酸水 解”，生物技术和生物工程，23：1449-1463(1980)中报道了在预处理后 提高的对酶水解的易感性的产生是通过半纤维素的去除所形成的微 孔，底物结晶度的变化及纤维素分子的聚合度的严重降低所致的。

Grohmann等在“生物量的稀酸预处理的优化”，第七届燃料和 化学品生物技术研讨会(Gatlinburg，Tennessee May 14-17，1985)中特别 支持Knappert等的一个假设，他证明预处理中半纤维素的去除导致 原料酶水解的增进(见第59-801页)。Grohmann等用麦秆和杨木 在95℃～160℃及蒸煮时间最多21小时条件下工作。在最初预处理 后，这两种原料的大约80％的纤维素被纤维素酶消化，其中80-90 ％的木聚糖从初始物中去除。

Grohmann和Converse也报道了纤维素的结晶度指数没有被预处 理明显改变。他们还进一步报道预处理可导致广泛范围的聚合度， 但产生对酶促水解的相似易感性。

由预处理改良酶水解作用的另一解释是增加了底物表面积。 Grethlein和Converse改进了该解释，相关表面积是与纤维素酶相接 触的表面积，其具有大约51埃的大小。由小分子如氮的接触性测定 的总表面积与底物的酶水解率不相关，原因是不能使酶透过的微孔 不影响水解率。

尽管对预处理的设备和优化条件有良好的了解并且进行了大量 预处理方法的机制研究，还不存在一种商业可行的适当的预处理方 法使纤维素物质转化为乙醇。如此预处理方法应使纤维素转化为乙 醇的方法具有巨大商业应用价值。

图1是根据实施例3，某些原料在121℃预处理反应后，作为原始 材料的AX/NSP的函数的纤维素转化曲线。

图2是根据实施例4，某些原料在230℃预处理反应后，作为原 始材料的AX/NSP的函数的纤维素转化曲线。

本发明揭示了原料的关键性能决定了在预处理反应后，使纤维 素转化为葡萄糖所需的相应纤维素酶。该性能是阿拉伯聚糖加木聚 糖与总非淀粉多糖的比率，在后文我们指作“AX/NSP”。本发明人 发现AX/NSP越高，则预处理反应后需求的纤维素酶越少，且产生 更经济的乙醇产物。原料的AX/NSP大于约0.39尤适用于纤维素转 化为乙醇工艺。如此原料的一些实例可以是某些燕麦壳及玉米棒。

基于这些发现，本发明人开发了一种改良的在使木质纤维素原 料转化为乙醇的酶处理前的预处理方法。一种如此方法由以下步骤 组成：

1、选择阿拉伯聚糖加木聚糖与总非淀粉多糖的比率(AX/NSP) 大于0.39的木质纤维素原料。

2、在破坏纤维结构，并水解部分纤维素和半纤维素的条件下使 选择的原料反应，以改良预处理后的原料在随后纤维素酶处理中的 可消化性。

另一种如此方法由以下步骤组成：

1、选择一种木质纤维素原料，其被选育以具有相对增加的阿拉 伯聚糖加木聚糖与总非淀粉多糖的比率(AX/NSP)。

2、在破坏纤维结构并使纤维素和半纤维素部分水解的条件下使 选择的原料反应，以改良预处理的原料在随后纤维素酶处理中的可 消化性。

一旦基于高AX/NSP选择了原料，预处理反应可以在与前述报 告一致装置中进行。这可包括在蒸汽枪、挤出机或其它以前使用的 设备中的单步或二步反应。

基于AX/NSP选择原料，预处理反应后纤维素酶所需比除外情 况下所需要低得多。这可明显节约从木质纤维素物质中生产乙醇的 费用。

还没有在特殊选择的原料预处理后优异性能的前期报道，这是 由于没有AX/NSP的特定水平，更不必说AX/NSP的重量比是大于 0.39。

鉴于FOODY等，文献同上的U.S.D.O.E研究，其观察到在蒸 汽爆炸及纤维素酶水解后，原料的木聚糖含量与葡萄糖产量之间没有 关联，本发明是令人惊奇的。

FOODY等研究了13种原料。纤维素转化为葡萄糖的转化率在 预处理原料之间变化很大，栎木和向日葵茎为46～50％，大麦秆和 槭木为86～87％。FOODY等的两种最佳原料大麦秆和槭木，木聚糖 的含量分别为31％和19％，其在所报道的最高与最低值之间。栎木 和杨木都含21％的木聚糖，而它们在纤维素酶水解后却得到分别为 46％和72％的非常不同的葡萄糖产量。

鉴于GRETHLEIN，文献同上的专利，本发明也是令人惊奇的。 GRETHLEIN描述了使用稀硫酸对原料预处理的装置。GRETHLEIN 所有的4种原料(栎木，新闻纸，杨木和玉米棒)性能相似(栏3， 第25～32行)。这一报道结果与本发明的教导完全相反，本发明发 现并鉴定了一种新原料性质，AX/NSP，其可用于预期处理后原料的 特性。

鉴于Knappert等，文献同上，发表的文章，本发明也是令人惊 奇的。Knappert研究了4种原料：Solka絮凝物、新闻纸、栎木及玉 米棒。Knappert等获得了在预处理反应后从纤维素中生产葡萄糖的 最佳产量。从新闻纸，玉米棒和栎木中获得100％产量，从Solka絮 凝物中获得81％产量(表I、II、第1453～1457页)。由于具有纤 维素和木聚糖报道含量的原料是新闻纸和Solko絮凝物，该研究没有 提到原料的AX/NSP与预处理反应后纤维素酶对物质的消化能力之 间的关系。

本发明实际上提示Knappert等的教导是不正确的。至少Knappert 等的教导与本发明的教导是不一致的。Knappert等教导物质的低半 纤维素含量预示着在预处理期间纤维素消化能力的极少改良。在本 发明的实施例5显示在半纤维素经适度反应被去除后，预处理反应 消化燕麦壳的能力大大改良。

后文所述的本发明及优选实施方案的描述中使用了下述一些术 语。

木质纤维素原料：意为一些原材料，其可被看作是纤维素转化 为乙醇工艺的原材料。如此材料至少有大约25％的纤维素，且纤维 素在工艺中基本上被转化成葡萄糖，然后转化为乙醇。典型的木质 纤维素原料是木材、谷类及农业废物。本发明没有关于木质素、淀 粉、蛋白质或灰分含量的特殊规定。已被认为用于乙醇生产工艺的 木质纤维素原料的实例为木材、草、麦秆及作物垃圾。通常木质纤 维素原料源于一种纤维。但本发明中木质纤维素原料可以是源于许 多不同种类的混合物。

燃料乙醇的转化指大约至少40％的纤维素转化为葡萄糖，然后 葡萄糖发酵为乙醇。本发明没有关于产自木质素或半纤维素的转化 产物的特殊规定。在一优选实施方案中，至少60％的纤维素被转化 为葡萄糖且发酵成乙醇。

木聚糖及木聚糖含量：是用于表达现存于原料中脱水木糖含量 的术语。许多脱水木糖的存在形式是木糖的线性β-1，4连接的多 糖。但木聚糖的定义不受限于这种结构的脱水木糖。

阿拉伯聚糖及阿拉伯聚糖含量：是用于表达原料中脱水阿拉伯 糖含量的术语。许多脱水阿拉伯糖是阿拉伯糖的支化α-1，3键连 的多糖。但阿拉伯聚糖的定义不受限于这种结构的脱水阿拉伯糖。

阿拉伯聚糖加木聚糖：指原料的阿拉伯聚糖及木聚糖含量的总 和。它区别于术语“阿拉伯糖基木聚糖”，其是指阿拉伯糖和木糖的 一种α-1，3键连的聚合物。阿拉伯糖基木聚糖是阿拉伯聚糖和木 聚糖一种具体实例，但未包括阿拉伯聚糖和木聚糖的所有可能的形 式。

半纤维素是一通用术语，包括除纤维素及淀粉外所有天然多糖。 该术语包括木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖等的聚合物及其混合 物。在本发明中半纤维素的基本组分是阿拉伯糖和木糖。

AX/NSP是阿拉伯聚糖加木聚糖与非淀粉多糖的比率，且可基于 本文所述分析程序测定任何原料的AX/NSP。

AX/NSP可由公式(1)计算：

AX/NSP＝(木聚糖+阿拉伯聚糖)/(木聚糖+阿拉伯聚糖+纤 维素)(1)

其中原料的木聚糖、阿拉伯聚糖及纤维素的含量可依据实施例1 中的程序测定，且AX/NSP的计算也见于实施例1。

AX/NSP在本文用以代表预处理方法的性能。AX/NSP越高，在 预处理后将纤维素水解为葡萄糖所需的纤维素酶则越少。预处理性 能对于AX/NSP高于约0.39的原料特别好。该点见实施例3及4的 论述。

应测定每批使用的原料的AX/NSP，毫无疑问其将受原料的季 节、时期、地理位置及品种而变化。因而没有AX/NSP的绝对值总 能正确地适应所供品种。但燕麦壳和玉米棒在收集到的数据中呈最 高的AX/NSP，同样也是预处理性能最好的。源自大量样品中的燕麦 壳和玉米棒因而是生产乙醇工艺中的优选原料。

AX/NSP的理论最高限为0.75，这存在于有25％纤维素及75％ 阿拉伯聚糖加木聚糖的物质中。本发明人了解没有物质具有这种组 分。发明人观测到的AX/NSP最高值为0.422。

各种物质的半纤维素、纤维素、阿拉伯聚糖及木聚糖的含量已 经广泛发表。但使用的分析方法可明显影响表观组成，且这些发表 的文章通常是基于许多变化方法的。因而这些可供依据的公开文献 只能提供一种这些物质的近似组分的普通观点。为实施本发明，对 每种候选原料都要进行相同的分析方法，实施例1的那些方法对于 所要求的绝对值是优选的。

在本发明中，可通过两种一般方法对高AX/NSP值的原料加以 鉴定：(1)筛选天然纤维和谷物；(2)筛选各种选育的具有较高 AX/NSP水平的品种。

反应或预处理反应：是指一种用于改变木质纤维素原料，使其 更易于经纤维素酶水解的化学方法。不进行预处理，所需生产葡萄 糖的纤维素酶的数量太大而不切实际。

通过由纤维素酶经破坏纤维结构及实现一部分半纤维素及纤维 素水解而改良可消化性。该术语指的是由预处理反应所引起的原料 的物理及化学上的改变。至少，预处理提高了由纤维素酶从原料中 水解出的葡萄糖的量，破坏了纤维，并水解了纤维素及半纤维素的 某些部分。

本发明的预处理方法优选是将木质纤维素原料转化为乙醇的完 整方法的一部分。该方法包括；预处理后纤维素经酶促水解为葡萄 糖，葡萄糖发酵成乙醇及乙醇的回收。

纤维素水解指的是使用酶将预处理的纤维素转化成葡萄糖。在 本发明中，在预处理期间少量纤维素被水解，而大部分未水解而由 纤维素酶水解。酶水解进行的方式本发明未做限制，但优选的方式 如下：在含5％～12％纤维素的水浆中，保持pH值为4.5～5.0，在 50℃下进行水解。所用的纤维素酶可以是任何可商购的纤维素酶， 其可由IOGEN CORPORATION，NOVO NORDISK，GENENCOR INTERNATIONAL，PRIMALCO，或其它公司生产。纤维素酶可补 加β-葡糖苷酶使纤维二糖完全地转化为葡萄糖。一种商购的β- 葡糖苷酶是由NOVO NORDISK所售的NOVOZYM188。

熟练的从业者明白水解中使用的纤维素酶的数量可通过酶的成 本，所需水解时间，葡萄糖产量及葡萄糖浓度来检测，所有这些都 受方法经济性的影响，并将随每种估价的相关技术而变化。代表性 的酶用量范围是12～128小时，每克纤维素需1-50滤纸单位(FPU) 纤维素酶。在一优选的实施方案中，纤维素酶的范围是每克纤维素 需1～10FPU纤维素酶。实施例2和3较详细地描述了纤维素的水解。

在一优选的实施方案中，纤维素水解和乙醇发酵同时进行，使 用的是前文所述的在SSF方法中通用的那些技术。

乙醇发酵及回收：其是通过已熟知的常规方法，如酵母发酵及 蒸馏进行。本发明不受这些方法限制。

在本发明中，可应用任何类型的原料，包括但不限于天然生成 的及选择性繁殖的原料。由以上所强调的，本发明新颖性在于使用 到目前为止未认识到的高AX/NSP率作为选择葡萄糖及乙醇生产的 最佳原料的关键标准；原料的由来是次要方面。

在一实施方案中，原料是天然生成的。在这种情况下，原料 AX/NSP的测定通过实施例1的方法进行。AX/NSP大约高于0.39的 原料优选用于纤维素→乙醇工艺。

由于AX/NSP毫无疑问随季节及原料的年龄、地理位置及栽培 而变化，因而应测定所用的每批原料的AX/NSP值。随着对原料积 累的经验，可减少测试AX/NSP的频率。

在另外一个优选的实施方案中，原料是经选育的。在这种情况 下，选育的原料的AX/NSP的测定可用实施例1的方法，并与天然 原料的AX/NSP比较。如果因选育而AX/NSP提高，则选育的原料 比天然的或起始原料更适于纤维素转化。

原则上，如此的选育可通过各种在植物繁殖时用于筛选所需性 状的一般方法进行。这些方法见H.B.Tukey，《美国植物杂志》44(3)： 279～289(1957)中“园艺是覆盖地球的大绿毯”，及Ann M.Thayer， 《化学及工程新闻》1997年4月28日p15～19中“转基因农场的赌 注”的综述。这些方法包括：

1、科学繁殖：筛选高AX/NSP值的品种并重复栽培那些显示该 性状的品种。

2、嵌合体：将两种或更多品种嫁接，并筛选所得品种的AX/NSP 水平。

3、授粉繁殖：通过杂交授粉组合两个或多个品种，并筛选其 AX/NSP水平。

4、化学稀释，将作物暴露于化学毒素，如此只有最适合的可存 活。要求毒素是阿拉伯聚糖或木聚糖抗性的。

5、诱导：将品种暴露于可致较高AX/NSP的条件下。

6、环境遇险(distress)：将品种暴露于可致死亡除非由高水平 的AX/NSP保护的条件下。

7、营养及施肥：开发营养方案以提高AX/NSP。

8、基因工程：遗传修饰品种以提高其AX/NSP水平。

在一优选的实施方案中，选育的木质纤维素原料的AX/NSP高 于0.39，然后将该选育原料反应以提高其由纤维素酶的可消化性并 通过用纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖，发酵葡萄糖，及回收乙醇 来转化成乙醇。

在另一优选实施方案中，选择性繁殖的木质纤维素原料比初始 原料具有增高的AX/NSP值，但仍低于0.39。然后将该原料反应以 提高其由纤维素酶的可消化性并转化为乙醇。将原料的AX/NSP含 量提高是有利的，即使低于0.39水平，原因是在某些地理区域气候 只适合小范围原料的生长。例如玉米就不能生长在每年超过40F的 天数少于240天的气候里。在这些较寒冷区域，原料的选择要受限 制，且也许没有哪些原料的AX/NSP接近0.39。在这些气候中，通 过选择性繁殖以使原料的AX/NSP比初始原料有所提高而对原料加 以改良，从而即使AX/NSP仍＜0.39也可有效地改良纤维素转化为乙 醇作物的功效。在这些情况下，本发明将提供一种新的对比标准， 通过该标准可测定和比较这种选育的原料。

所需预处理程度可由一些适当方法而获得，包括但不限于那些 在本文优选实施方案及实施例中讨论的方法。可引起化学改变的机 械与化学处理的任何组合均包括在本发明范围内。这包括任何反应 器，化学添加物，温度、时间、粒径、湿度及其它可改变原料的参 数。

在第一个优选实施方案中，在GRETHLEIN所述的酸预处理的 条件下进行预处理反应，这是将经选择的原料在180℃～270℃下进行 5秒～60分钟处理。本领域技术人员已知原料温度是它自身的，其 可不同于在反应器外所测的温度。本领域技术人员也已知一段时间 内指定的温度范围是那个时期的平均温度，考虑到温度对反应速率 的影响。例如，反应器需从环境条件升至180℃的短期加热。基于反 应动力学的知识(如在给定物质的限定温度范围内，温度每提高10 ℃，反应速率几乎双倍增长)，温度增高对总反应的影响可被计算出 且从而可确定平均温度。

预处理反应典型地用存在于水解浆料中的0.1～2％硫酸进行。 但本领域的技术人员能意识到，一些原料中存在的碱或酸可改变酸 需求量使其在典型范围之外。酸度最好用pH范围表达，不管使用的 是何种酸或浓度如何，其应在0.5～2.5之间。实施例8详述了在此 条件范围内的预处理反应。

第二个优选的实施方案使用了由FOODY发表的作为蒸汽爆炸预 处理优化的较窄的条件。该条件见于实施例4所述，预处理由蒸煮 步骤组成，是在220～270℃，pH为0.5～2.5的条件下处理5秒～120 秒。用于进行该预处理的设备优选包括密封批式反应器及连续挤出 机。这些预处理条件的大规模实例见实施例6、7所述。

第三个优选实施方案使用二步预处理，其中第一步改良纤维素 水解同时主要增溶半纤维素而不是纤维素。第二步完成整个预处理。 在该实施方案中，第一步反应在低于180℃下进行而第二步反应在高 于180℃下进行。二步预处理的优点是，如后文实施例5所示，促进 了半纤维素的分离回收用于下游加工。

在第三个优选实施方案中，第一步反应是在大约60℃～140℃， 在pH为0.5～2.5条件下进行24小时。更优选地，预处理的第一步 是在100℃～130℃，pH为0.5～2.5下进行3小时。

在第4个实施方案中，第二步反应是在180℃～270℃，pH为0.5～ 2.5条件下进行5秒～120秒。原料可以是干燥的(脱水的)或水浆 性的。

在一优选实施方案中，选育的原料是木质纤维。木材是寒冷气 候下最普遍的木质纤维素物质。

成功实施本发明的另一方面是将预处理工艺与用纤维素酶水解 预处理的原料以生产葡萄糖的工艺结合起来。在一优选实施方案中， 预处理原料中至少40％纤维素由纤维素酶水解成葡萄糖。生产出的 葡萄糖可经提纯、结晶并以固体糖包装。或者，其可溶解成液浆以 进一步处理或使用。

实施例1原料中AX/NSP的测定

所供原料的阿拉伯聚糖加木聚糖与总非淀粉多糖的比率的测定 基于对原料的组分分析。该分析如下进行：

受检的原料是大麦秆、小麦秆、小麦壳、燕麦壳、禾本植物、 玉米茎、槭木、松木及三种玉米棒。除了燕麦壳来自 Peterborough，Ontario的Quaker Oats，其余的都得自Ottawa，Ontario。 在Waring搅拌器内粗磨原料，然后用Wiley研磨机经一#20筛研 磨。将原料在环境温度下贮存于密封口袋中直至使用。小样品的水 含量为5％～10％，通过在100℃下干燥而检测到。

将大约0.3g的样品置入试管，每个试管都含有5ml70％的硫酸。 将试管涡旋混合，盖盖并置于50℃水浴中一小时，每10分钟剧烈 涡旋一次。经1小时保温后，将试管内容物转入含195ml去离子水 的预秤重的250ml的烧瓶中，其使酸含量降至1.75％。将内容物混 合，然后将10g等份转入试管中。涡旋混合试管然后将其转至一蒸 汽高压灭菌器中，在121℃下保持1小时。高压灭菌后，用少量碳 酸钡将溶液内容物中和，然后在玻璃微纤维滤纸上真空抽滤。

用Dionex Pulse-Amperametric HPLC测定滤过物中葡萄糖，木 糖及阿拉伯糖的浓度，然后将这些测量值与原料初始样品的重量相 关并分别以原料中葡聚糖、木聚糖及阿拉伯聚糖含量表示，根据(1) 使聚合物产生单体的水合作用的水，(2)由浓酸破坏的物质的量进 行微调，其可通过采用纯纤维素、木糖及阿拉伯糖对照来测定。检 测可用三份进行并报告其平均值。

纤维素含量是通过在总葡聚糖中减去淀粉含量而测定的。淀粉 含量的测定是通过向含20ml去离子水，0.2ml的91.7g/L CaCl2·2H2O贮存液及50微升的1∶100的Sigmaα-淀粉酶#A3403的去离子 水溶液的250ml烧瓶中加入1g Wiley-研磨的原料而进行的。将每个 烧瓶用稀氢氧化钠将pH调至6.4-6.6，然后在一沸水浴中将其温育 1小时。在另加入50ml淀粉酶后将烧瓶在蒸汽高压灭菌器中在121 ℃下温育30分钟。最终，在烧瓶中再加入50ml淀粉酶，再在沸水 浴中温育60分钟。然后将烧瓶冷却至室温，并用稀盐酸将pH值调 至4.2-4.4。加入0.5ml Novo Spritamylase贮存液，贮存液由100ml 去离子水及3g酶组成。以150RPM在50℃将烧瓶振荡20小时。将 后将烧瓶冷却，并将其内容物经玻璃微纤维滤纸过滤。然后用Yellow Springs Instrument(YSI)葡糖分析仪测葡萄糖浓度，并考虑水解淀粉 所需水用于检测原料中淀粉含量。

原料中蛋白质及灰分含量的测定可通过凯氏定氮法及灰分烘箱 法进行。

样品中木质素含量的测定是通过测定在对原料进行硫酸处理后 仍保留的不溶固体量，然后减去灰分量而得。

这些结果示于表1。回收物在842～1019mg/g初始固体物之间。 其相当于84.2％(重)～101.9％(重)的初始物，是这些系统中典 型的物料衡算。

                               表1：原料的组成                    测定的组分(mg/g)     原料   葡聚糖     淀粉  木聚糖   阿拉伯   聚糖   木质素   灰分  蛋白质 总重     大麦秆     426     19.6     161     28     168   82     64  929     小麦秆     464     8.6     165     25     204   83     64  1005     小麦壳     405     14.4     200     36     160   121     33  955   禾本植物     403     3.4     184     38     183   48     54  910     玉米茎     411     3.2     128     35     127   60     81  842     槭木     504     4.0     150     5     276   6     6  947     松木     649     1.0     33     14     320   0     2  1018 玉米棒(红)     436     34     253     38    ND(2)   ND    ND  ND 玉米棒(白)     439     28     250     38     ND   ND    ND  ND 玉米棒(印地     安)     438     8.5     240     36     ND   ND    ND  ND     燕麦壳     481     89     247     39     170   44    38  1019

(1)总重＝葡聚糖+木聚糖+阿拉伯聚糖+木质素+灰分+蛋 白质

(2)ND＝未测

原料的AX/NSP示于表2。在11种分析的原料中，有4种其 AX/NSP大于0.39。这些原料包括燕麦壳及玉米。其余的7种原料的 AX/NSP小于约0.39。

表2：原料的AX/NSP组成     原料   纤维素   (mg/g)     (1) AX(mg/g)(2)     NSP   (mg/g)(3)    AX/NSP     大麦秆     407     189     596     0.317     小麦秆     455     190     645     0.295     小麦壳     391     236     627     0.376     禾本植物     399     222     621     0.357     玉米茎     408     163     571     0.285     槭木     500     155     655     0.237     松木     648     47     695     0.068   玉米棒(红)     402     291     693     0.420   玉米棒(白)     411     288     699     0.412 玉米棒(印地安)     429     276     705     0.391     燕麦壳     392     286     678     0.422 (1)纤维素＝葡聚糖-淀粉 (2)AX＝木聚糖+阿拉伯聚糖 (3)NSP＝木聚糖+阿拉伯聚糖+纤维素 实施例2一种酶的纤维素酶活性测定

一种酶的纤维素酶活性的测定是使用如下Ghose，PURE AND APPL.CHEM.59：257-268(1987)所述步骤。将一片50mg的Whatman #1滤纸置于每个含有1ml 50mM柠檬酸钠缓冲液pH4.8的试管上。 将滤纸卷起并将试管涡旋使滤纸混入液体中。制备在50mM柠檬酸 钠缓冲液，pH4.8中起始浓度的1∶200～1∶1600浓度范围之间的一 系列稀释酶。将稀释酶贮液及底物分别预热至50℃，然后将每种稀 释酶贮液的0.5ml等份与底物置入试管中。在50℃下将试管温育60 分钟。经在每试管中加入3ml二硝基水杨酸(DNS)试剂并煮沸10 分钟而使反应终止。在每个试管中加入Rochelle盐及去离子水以显 色还原糖和DNS试剂之间的反应。测定由每种酶的样品产生的糖的 量，计入酶及滤纸的背景，并将每试管中糖的量与经反应产生的已 知糖标准相对比。

滤纸活性单位定义为每分钟产生的糖的微摩尔数。用产生2mg 糖所需的酶量计算活性。发现Iogen纤维素酶样品每ml具有140滤 纸单位，如表3所示：

表3-Iogen纤维素酶的滤纸活性

产生2mg糖所需酶量(ml)    酶活性(FPU/ml)：

0.00264                      140.0

实施例3原料的适度预处理反应：

该实施例介绍了在对原料进行适度预处理即主要分解半纤维素 之后，原料的对照性能。这种其自身的预处理反应不是最优化的， 但是其可以是两步预处理反应的第一步。这个适度反应说明了利用 AX/NSP表示原料在乙醇生产中的合适性。优化的预处理反应见稍 后实施例所述。

将4g实施例1中的经Wiley研磨过的样品置于在250ml烧瓶内 的96g 1％硫酸(pH0.6～0.9)中。将烧瓶内容物充分混合，然后将 烧瓶置于121℃蒸汽高压灭菌器中1小时。后将烧瓶冷却，并经玻璃 微纤维滤纸真空抽滤。用碳酸钡中和并用Dionex Pulsed-Amperometric HPLC分析以检测选定的滤液中的葡萄糖、木糖及阿拉伯糖的浓度。 用自来水冲洗滤纸上的结块物，并在空气中干燥。用实施例1所述 的方法。将该固体物等份溶于70％硫酸中，用以检测其中纤维素， 木聚糖和阿拉伯聚糖的浓度。

反应对所选的原料中纤维素及半纤维素水平的影响如表4所示。 在所有情况下，少量(小于8％)的纤维素被水解，而超过70％的 半纤维素被水解。

表4：在121℃的预处理反应对不同原料的影响     原料  纤维素  半纤维素     大麦秆   3.2     85     小麦秆   3.6     72     小麦壳   ＜2     75   禾本植物   5.7     80     玉米茎   4.3     82     槭木   ＜2     80     燕麦壳   7.9     85

随后将所有11种原料用纤维素酶水解。将相应于0.2g纤维素的 预处理的固体样品加入含19.8g 0.05M柠檬酸钠缓冲液，pH5.0的 250ml烧瓶中，将Iogen纤维素酶(标化至140FPU/ml)和Novozym188 β-葡糖苷酶(1440BGU/ml)以相应于9FPU/g纤维素及125BGU/g 纤维素的量加入至烧瓶中。少量与β-葡糖苷酶一起加入至烧瓶中 的葡萄糖计算在内。

将每个烧瓶在50℃置于New Brunswick旋转摇床上并以250RPM 摇动20小时。在这个阶段末期，将烧瓶内容物经玻璃微纤维滤纸过 滤，并用YSI葡糖分析仪测定滤液中葡萄糖浓度。将葡萄糖浓度与 预处理原料的纤维素浓度相关联以确定纤维素的转化。

图1是依据实施例3，作为AX/NSP函数的某些原料在平均温度 121℃的纤维素转化图解。

如图1所示，令人惊奇的是，经这种特定的预处理反应纤维素 转化随初始原料的AX/NSP呈线性提高。具有最高AX/NSP的四种 原料(燕麦壳及三种玉米棒)具有最高的转化为葡萄糖的能力。

这些结果表明，原料的AX/NSP越高，经预处理后原料越适于 乙醇的生产。

实施例4原料的高效预处理反应

该实施例介绍了在预处理反应后原料的对照性能。该预处理反 应是在随后纤维素水解中呈最佳性能的条件下进行的。

来自实施例1的0.28g Wiley研磨的样品被置于密闭的不锈钢“弹 式反应器”中的7g 1％硫酸(pH0.6-0.9)中。高压反应器的容积为9ml。 对于任一个试验，准备5个等含量的弹式反应器，且将反应产物合 并以产生足够量。将弹式反应器置入一预热的290℃的油浴中50秒 钟，然后取出并置入自来水中冷却。温差电偶测定结果显示在加热 阶段末期弹式反应器的内部温度达到260℃。平均等效温度为235℃。

经用自来水漂洗取出弹式反应器内容物，然后经玻璃微纤维滤 纸真空抽滤。用自来水冲洗过滤结块物并在空气中干燥。如实施例1 所述将结块物溶于70％硫酸中检测其纤维素浓度。

随后将反应过的原料用纤维素酶水解。将相应于0.05g纤维素的 反应固体样品加入含4.9g 0.05M柠檬酸钠缓冲液，pH4.8的250ml烧 瓶中。在烧瓶中加入相应于9FPU/g纤维素和125BGU/g纤维素量的 Iogen纤维素酶(140FPU/ml)和Novozym 188β-葡糖苷酶 (1440GBU/ml)，要计入与β-葡糖苷酶一起带至烧瓶中的少量葡萄 糖。

将每个烧瓶放在50℃ Orbit旋转摇床上并以250RPM摇动20小 时。在该阶段末期，将烧瓶内容物经玻璃微原纤维滤纸过滤，滤液 中葡萄糖浓度经Dionex Pulsed-Amperomctric HPLC测定。将葡萄糖 浓度与预处理原料中纤维素浓度相关以确定纤维素的转化。

图2是依据实施例4，作为AX/NSP函数的某些原料在平均温度 235℃的纤维素转化图解。

如在121℃的反应，图2呈现纤维素的转化随初始原料的AX/NSP 呈线性提高。具有最高AX/NSP的四种原料(燕麦壳及三种玉米棒)， 观测到它们的纤维素转化水平最高，大约有超过65％的纤维素水解 为葡萄糖。

这些结果表明原料的AX/NSP越高，则在高效预处理之后原料 越适于乙醇的生产。

表5示出达到80％转化为葡萄糖所需纤维素酶量。所需酶量是 确定乙醇生产工艺可行性的关键因素，表5的数据来自图2所示结 果加上其它描述作为纤维素酶剂量的函数的纤维素转化数据。

最高的四种原料，包括燕麦壳及玉米棒，比次佳原料小麦壳在 将纤维素转化为葡萄糖时，所需的纤维素酶要少23％～68％。最高 的四种原料具有比其它试验原料好得多的性能。

最高四种原料的AX/NSP大于0.39，而其它原料的AX/NSP低 于该值。这数据表明AX/NSP大于0.39的原料所需纤维素酶较少， 酶的低需求量是乙酸生产工艺的显著优势。

表5纤维素酶需求量     原料   在20小时80％转化所需纤维素酶量            (FPU/g)    AX/NSP   玉米棒(红)     6.6     0.420   玉米棒(白)     8.7     0.412 玉米棒(印第安)     15.6     0.391   燕麦壳     16.3     0.422   小麦壳     21.0     0.376   禾本植物     27.1     0.357   大麦秆     28.3     0.317   小麦秆     44.5     0.295   槭木     45.5     0.237   玉米茎     63.4     0.285 实施例5燕麦壳的二步预处理反应 该实施例介绍燕麦壳二步预处理反应的使用，第一步温和处理 后接第二步较剧烈处理。

在第一步，将4g来自实施例1的经Wiley研磨的原料样品置于 250ml烧瓶内的96g 1％硫酸(pH0.6～0.9)中。将烧瓶内容物充分混 合，然后将烧瓶置于蒸汽高压灭菌器中在121℃处理40分钟。然后 将烧瓶冷却并经玻璃微原纤维滤纸真空抽滤。用碳酸钡中和并用 Dionex Pulsed-Amperometric HPLC分析样品以检测滤液中葡萄糖， 木糖及阿拉伯糖浓度。用自来水冲洗滤物块并在空气中干燥。如实 施例1所述将固体物等份溶于70％硫酸中检测其中纤维素，木聚糖 及阿拉伯聚糖浓度。温和反应对原料中纤维素及半纤维素(阿拉伯 聚糖+木聚糖)水平的影响见表6所示。几乎所有的半纤维素都溶 解了，这提高了纤维素的浓度。

表6：温和预处理反应后燕麦壳的组成

原料：燕麦壳  纤维素(％)  半纤维素(％)

预处理前         27.9         22.0

预处理后         39.5         3.0

在温和处理条件下将0.28g反应的原料样品置入如实施例4所述 不锈钢弹式反应器中的7g 1％硫酸(pH0.6～0.9)中。准备5个等含 量弹式反应器并将反应产物合并以得到足够量。将弹式反应器置入 预热至290℃的油浴中50秒钟，然后取出并置于自来水中冷却。

用自来水漂洗除下容器内容物，然后经玻璃微原纤维滤纸真空 抽滤。用自来水冲洗滤物块并在空气中干燥。如实施例1所述将滤 物块等份溶于70％硫酸中以检测其中纤维素浓度。

在一级或二级预处理反应后，如下用纤维素酶将各种原料水解。 将相应于0.05g纤维素的预处理固体样品加入含4.9g0.05M柠檬酸钠 缓冲液pH4.8的25ml烧瓶中。以相应于10FPU/g纤维素及125BGU/g 纤维素量的Iogen纤维素酶(140FPU/ml)和Novozym 188β-葡糖 苷酶(1440BGU/ml)加入到烧瓶中。要计入随β-葡糖苷酶带至烧 瓶中的少量葡萄糖。

将每个烧瓶在50℃置于Orbit摇床上以250RPM摇动20分钟。 在该阶段末期将烧瓶内容物经玻璃微原纤维滤纸过滤，用Dionex Pulsed-Amperometric HPLC测定滤物中葡萄糖浓度。将葡萄糖含量与 预处理的原料中纤维素浓度相关以确定葡萄糖产量。

结果见表7。

在第一步反应后，在燕麦壳中残留少量半纤维素。在纤维素被 纤维素酶水解后葡萄糖产量仅为340mg/g。

在第二步预处理反应后，葡萄糖产量比第一步高85％，因而第 二步预处理反应提供了水解性能的明显增强。二步预处理使葡萄糖 产量在如实施例4所述燕麦壳的单步反应后的产量少6％之内。

这些结果明显与Knappert等的教导相反，他们断定低半纤维素 含量的物质在预处理之后不具备改善的由纤维素酶的可消化性。在 本实施例，经第一步反应之后燕麦壳中只有极少量半纤维素残留， 但第二步反应明显地提高了其可消化性。Knappert等教导，如此低 半纤维素的物质对预处理没有较良好反应。本发明的教导正相反。

表7：燕麦壳的二步预处理反应 预处理反应 在此步前半纤维素含量(％) 葡萄糖产量(mg/g纤维素) 二步 3.0 645 一步 22.0 340 单步 22.0 685

实施例6燕麦壳的大规模预处理

使用Werner-Pflederer双螺杆挤出机(Ramsey，NJ)进行燕麦壳大 规模预处理。在Wiley研磨机内研磨之后，将燕麦壳用1％硫酸 (pH0.7～1.2)浆化为30％固体的浓度。以每小时10磅的速度及压 力为500psig将浆液填入挤出机。向挤出机内注入新蒸汽而使之保持 在230℃。在平均速度下，物质在30秒内经过挤出机。收集挤出的 燕麦壳并用水冲洗以除去溶解物，然后经玻璃微原纤维滤纸过滤。

用实施例1的方法测定挤出的燕麦壳的纤维素含量。

随后用纤维素酶将挤出的燕麦壳水解。将相应于0.05g纤维素的 挤出的燕麦壳样品加入含4.9g 0.05M pH4.8的柠檬酸钠缓冲液的25ml 烧瓶中。以相应于9FPU/g纤维素和125BGU/g纤维素的量的Iogen 纤维素酶(140FPU/ml)和Novozym188β-葡糖苷酶(1140BGU/ml) 加入烧瓶中。随葡糖苷酶带至烧瓶中的少量葡萄糖要计入。

将每个烧瓶置于50℃Oribit旋转摇床上，并以250RPM摇动20 小时。在该阶段末期，将烧瓶内容物经玻璃微原纤维滤纸过滤，并 用Dionex Pulse-Amperometric HPLC测定滤液中葡萄糖浓度。将葡萄 糖浓度与挤出的燕麦壳的纤维素浓度相关以确定葡萄糖产量。

结果见表8。大规模燕麦壳的预处理反应的葡萄糖产量比实施例 4的实验室规模预处理的产量略少(8％)。这表明可以进行大规模燕 麦壳预处理反应，这是由于挤出机运转的优化毫无疑问可以克服实 验室预处理反应的8％的优势。

表8：产生自预处理燕麦壳的葡萄糖产量

预处理            葡萄糖(mg/g纤维素)

挤出机                  630

弹式反应器(实施例4)     685

实施例7硬木的大规模预处理

用蒸汽爆炸方法及FOODY，US专利4,461,648所述技术预处理 杨木样品。用水冲洗所得预处理物并命名为“蒸汽分解的硬木”。用 实施例1的方法测定蒸汽分解的硬木的纤维素含量。

随后用纤维素酶将蒸汽分解的硬木水解。将相应于0.05g纤维素 的蒸汽分解硬木样品加入含4.9g 0.05M pH4.8的柠檬酸钠缓冲液的 25ml烧瓶中。将相应于9FPU/g纤维素和125BGU/g纤维素的量的 Iogen纤维素酶(140FPU/ml)和Novozym188β-葡糖苷酶 (1440BGU/ml)加入烧瓶中。要计入随β-葡糖苷酶带至烧瓶中的 少量葡萄糖。

将每个烧瓶置于50℃Orbit旋转摇床上，并以250RPM摇动20 小时。在该阶段末期将烧瓶内容物用玻璃微原纤维滤纸过滤，并用 Dionex Pulsed-Amperometric HPLC测定滤物中葡萄糖浓度。将葡萄 糖浓度与蒸汽分解硬木的纤维素浓度相关以确定葡萄糖产量。

结果见表9。用大规模方法反应的硬木的产量与实验室规模的产 量相差2％(重)。在此情况下蒸汽爆炸的大规模应用大大地优化且 能胜过实验室结果。

表9：硬木的预处理反应：

方法                葡萄糖产量(mg/g纤维素)

蒸汽爆炸               415

实验室(实施例4)        425

实施例8温度对燕麦壳单步及二步预处理反应的影响

实施例介绍在燕麦壳的单步及二步预处理反应中温度范围的使 用。

在单步预处理反应，将0.28g燕麦壳样品置于实施例4所述密闭 不锈钢弹式反应器中的7g 1％硫酸(pH0.6)中。准备5个等含量弹 式反应器并将反应产物合并以得到足够量。将弹式反应器置入预热 的油浴中，然后取出并置入自来水中冷却。

在油浴中的温度及时间如下：

(1)235℃，50秒；(2)180℃，6分钟；(3)170℃，8分钟。

用自来水漂洗以除下容器内容物，然后经玻璃微原纤维滤纸真 空抽滤。用自来水洗滤物块并在空气中干燥。如实施例1所述将滤 物块等份溶于70％硫酸中以检测其中纤维素浓度。

对于二步预处理反应，第一步是将4g Wiley研磨的燕麦壳样品 置入含96g 1％硫酸(pH0.6)的250ml烧瓶。将烧瓶内容物轻轻混 合，然后将烧瓶置于蒸汽高压处理器中在121℃处理40分钟。将烧 瓶冷却并用玻璃微原纤维滤纸真空抽滤。用自来水冲洗滤物块并在 空气中干燥。如实施例1所述将滤物块等分溶于70％硫酸中以检测 其纤维素、木聚糖及阿拉伯聚糖浓度。

第二步反应的进行是将0.28g来自第一步反应的物质置入如实施 例4所述密封不锈钢“弹式反应器”中的7g 1％硫酸(pH0.6)中。 准备5个等含量弹式反应器并将反应产物合并以获得足够量。将弹 式反应器置于预热的油浴中，然后取出并将其置入自来水中冷却。

在油浴中的温度及时间与单步反应类似：

(1)235℃，50秒；(2)180℃，6分钟；(3)170℃，8分钟。

经用自来水漂洗除下容器内容物，然后将其经玻璃微原纤维滤 纸真空抽滤。用自来水洗下滤物块并在空气中干燥。如实施例所述 将滤物块等分溶于70％硫酸中，以检测其中纤维素浓度。

将一步或二步反应后的原料用纤维素酶水解。将相应于0.05g纤 维素的反应后固体样品置于含4.9g 0.05M柠檬酸钠缓冲液pH4.8的 25ml烧瓶中。向烧瓶内加入相应于9FPU/g纤维素及125BGU/g纤维 素的量的IOGEN纤维素酶(140FPU/ml)及NOVOZYM 188β-葡 糖苷酶(1440BGU/ml)。要计入随葡糖苷酶带至烧瓶中的少量葡萄糖。

将每个烧瓶在50℃置于Orbit旋转摇床上并以250RPM摇动20 小时。在该阶段末期，用玻璃微原纤维滤纸过滤烧瓶内容物，并用 Dionex Pulsed-Amperometric HPLC测定滤物中葡萄糖浓度。将葡萄 糖浓度与预处理原料中纤维素浓度相关以确定葡萄糖产量。

结果见表10。

使用单步反应，葡萄糖产量在180℃几乎与在最适温度相同。 随着温度由180℃降至170℃，葡萄糖产量下降。

二步反应与单步预处理反应具有相同温度曲线，在180℃和最适 温度有相似性能，且低于180℃时性能下降。葡萄糖产量在二步反应 比在单步反应低15％。

表10：温度对燕麦壳的葡萄糖产量的影响 预处理  反应温度  反应时间(秒) 葡萄糖产量(mg/g纤维素) 相对葡萄糖     产量   单步   235     50     685     100   单步   180     360     660     96   单步   170     480     555     81   二步   235*     50     575     84   二步   180*     360     560     82   二步   170*     480     485     71

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