一种脱脂花生粉预水解液和预处理固体基质半同步酶解发酵
产乙醇的方法
技术领域
背景技术
[0002] 为减少化石基能源急剧消耗及其使用对社会经济稳定和环境的危害，世界各国逐步寻求可持续利用的替代能源。除
生物汽油和
生物柴油外，
燃料乙醇可与化石基汽油混合(E10和E85混合燃料等)后作为运输燃料，受到全球的广泛关注。
[0003] 木质
生物质具有可持续利用、分布广、产量大及富含
碳水化物的优点，其已被全球研究者作为制备
燃料乙醇的理想原料。然而，木质生物质结构致密，在酶解和发酵前，需对其进行预处理，打破木质生物质中三大组分间复杂的物理化学连接结构；预处理后的固体物质称为“预处理固体基质”，其是后续酶解和发酵的起始原料。然而，在预处理过程中，生物质中部分木质素经化学断键后进一步缩合，进而反沉积于预处理固体基质表面。为降低后续乙醇蒸馏的能耗，通常采用高浓酶解和发酵来提高发酵液中乙醇的浓度。然而，在高浓酶解和发酵过程中，除传质和
传热的影响外，沉积的木质素可与酶解过程中所添加的酶分子(如
纤维素酶和纤维
二糖酶)产生严重的不可逆
吸附，导致用于水解预处理固体基质中
纤维素的酶浓度显著降低，酶解效率也显著降低；因而，通过酶解所产生的可发酵糖浓度也较低，最终发酵产生的乙醇浓度也被降低，蒸馏获得高浓度乙醇的能耗随之显著增加，最终木质纤维素燃料乙醇的生产成本较高。
[0004] 目前，为克服预处理过程中反沉积木质素的不利影响，通常采用增加酶用量(何珣,缪
冶炼,陈介余,等.纤维素酶用量和底物浓度对玉米秸秆酶解的影响[J].食品科技,2010,35(2):47-51.)、添加外源添加剂(如
牛血清蛋白、吐温80和聚乙烯醇等)(孙付保,娄秀平,洪嘉鹏,等.非离子
表面活性剂对木质纤维素酶解的促进作用[J].化工进展,2011,30(12):2719-2723；周妍,赵
雪冰,刘德华.非离子型表面活性剂对木质纤维素酶催化水解的影响及机理[J].化学进展,2015,27(11):1555-1565.)可缓解反沉积木质素对酶解效率的影响。然而，一方面，纤维素酶和纤维二糖酶较为昂贵，增加用量无疑增加了生物质基燃料乙醇的生产成本；另一方面，外源添加剂不仅涉及成本较高，而且不具有生物兼容性，对后续发酵
微生物的活性及产物的分离纯化产生负面影响。为克服传质和传热的影响，已公开的中国发明
专利(一种通过分批补料半同
糖化浓醪发酵纤维素乙醇的方法，
申请号：
201610265845.2)开发了分批补料半同步糖化和发酵的方法生产木质纤维素燃料乙醇。然而，尽管分批补料可部分克服传质和传热的不利影响，但该专利仍然涉及木质素的不利影响。为克服木质素对纤维素酶的无效吸附，在
蒸汽爆破预处理后，该专利进一步采用
碱性过
氧化氢后处理来进一步脱除预处理固体基质中木质素，虽然取得一定效果，但增加了预处理的步骤，且产生新的废液。此外，碱性过氧化氢后处理也无法完全脱除预处理固体基质中的木质素，为提高后续酶解和发酵的效率，该专利所添加的酶用量较高，当乙醇浓度达到
65g/L以上时，其纤维素酶用量达到30FPU/g葡聚糖以上，这将显著增加木质纤维素燃料乙醇的整体生产成本。
[0005] 简言之，在半同步糖化发酵产木质纤维素燃料乙醇过程中，降低酶解过程所需酶用量、提高发酵产乙醇浓度以及开发具有生物兼容性的添加剂将成为促进生物质基燃料乙醇商业化推广
进程中所需要解决的关键技术
瓶颈问题。
发明内容
[0006] 为了解决上述
现有技术存在的不足，本发明的首要目的在于提供一种脱脂花生粉的预水解方法。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种脱脂花生粉预水解液和预处理固体基质半同步酶解发酵产乙醇的方法。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 一种脱脂花生粉的预水解方法，包括以下步骤：
[0010] (1)球磨处理：
[0011] 将脱脂花生粉和液氮加入球磨罐进行球磨，所加入脱脂花生粉的
质量与球磨罐体体积的比为0.5～2％，液氮体积约占球磨罐体体积的20～30％；球磨罐体转动速度600-1000rpm，球磨时间2～4h；
[0012] (2)酶水解：
[0013] 将磨后的脱脂花生粉加入到含有半纤维素酶的
醋酸-醋酸钠缓冲液中进行酶水解，醋酸-醋酸钠缓冲液的浓度为45～50mmol/L，pH值范围为4.8～5.2，半纤维素酶用量为5～10mg蛋白/g脱脂花生粉，以绝干质量计的脱脂花生粉质量与醋酸-醋酸钠缓冲液体积比的范围为1:5～1:8；酶水解
温度、时间和转速分别为45～55℃、12～24h和200～250rpm；
[0014] (3)分离：
[0015] 酶水解后，离心后取上清液，即得到脱脂花生粉的预水解液，离心转速和时间分别为8000～12000rpm和10～15min；
[0016] 所述脱脂花生粉为干法热
压榨或
冷压榨
花生油后的剩余物，经磨粉后过20～40目筛网。
[0017] 一种脱脂花生粉预水解液和预处理固体基质半同步酶解发酵产乙醇的方法，包括以下步骤：
[0018] (1)根据
权利要求1所述脱脂花生粉的预水解方法制备得到脱脂花生粉预水解液，将脱脂花生粉预水解液装入三
角瓶内，向三角瓶内加入预处理固体基质，搅拌后，在45～55℃下进行超声处理；
[0019] (2)往三角瓶中加入纤维素酶和纤维二糖酶，基于文献(Luo X.L.,et al.Evaluation of mountain beetle-infested lodgepole pine for cellulosic ethanol production by sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose.Industrial&Engineering Chemistry Research,2010,49.17:8258-8266.)的方法测定预处理固体基质中葡聚糖的绝干质量，纤维素酶和纤维二糖酶的加入量分别为5～20FPU/g葡聚糖和10～40CBU/g葡聚糖，密封后，进行酶水解，酶水解温度和时间分别为45～55℃、6～12h；
[0020] (3)待酶水解温度冷却至30～35℃后，往上述酶解液中加入
酵母细胞，酵母细胞加入质量与脱脂花生粉预水解液的体积比为0.5:100～1:100，在此温度进行酶水解和发酵，持续时间为6～12h；
[0021] (4)第二次批式补加预处理固体基质；
[0022] 首先，向容器中添加预处理固体基质，添加的预处理固体基质绝干质量与容器中脱脂花生粉预水解液体积比为5:100～8:100，经搅拌后进行超声处理；
[0023] 然后，向容器中添加纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞，在30～35℃条件下继续酶解和发酵12～24h。预处理固体基质、纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞的加入量与第一次半同步糖化发酵的加入量相同；
[0024] (5)第三次批式和后续批次补料及补料后的酶解和发酵条件与第二次相同；
[0025] 所述预处理固体基质为经预处理后的木质生物质，所述木质生物质包括木粉和竹粉；所述预处理包括热水预处理、稀
硫酸预处理、苯磺酸预处理或稀NaOH预处理。
[0026] 优选地，步骤(1)所述预处理固体基质绝干质量与脱脂花生粉预水解液体积的比为5:100～8:100。
[0027] 优选地，步骤(1)所述超声处理的超声功率和处理时间分别为150～300W和30～60min。
[0028] 优选地，步骤(1)所述对三角瓶内固液混合物进行超声处理，三角瓶放置于带磁
力搅拌的恒温水槽中，超声过程中控制温度为30～35℃、磁力搅拌速度为100～150rpm。
[0029] 优选地，步骤(2)摇床的温度、转速和时间分别为至45～55℃、200～250rpm和6～12h；步骤(3)～(5)摇床的温度、转速和时间分别为至30～35℃、90～105rpm和12～24h。
[0030] 优选地，所述酵母细胞经过活化，所述活化包括以下步骤：
[0031] (1)将
葡萄糖、蛋白胨和酵母抽出物溶于蒸馏水中，葡萄糖、蛋白胨和酵母抽出物浓度分别为15g/L、20g/L和10g/L，完全溶解后，将此液体培养基进行灭菌处理；
[0032] (2)在无菌环境中将商品酵母细胞加入到此灭菌后的液体培养基中，商品酵母
细胞质量与培养基体积比(g:ml)为1.5～2.5:100；
[0033] (3)将含有酵母细胞的液体培养基于30～37℃和80～100rpm的条件下活化40～50h；
[0034] 每次活化培养结束后，立即将此液体培养基在6000～8000rpm下离心8～12min，倾倒上清液，将离心出的酵母细胞用于后续的半同步糖化发酵。
[0035] 优选地，所述木质生物质为过40～60目筛的木粉或竹粉；所述脱脂花生粉为过20～40目筛的脱脂花生粉。
[0036] 优选地，所述预处理的条件范围如下：
[0037] 其中，对于热水预处理，预处理温度和时间分别为190～210℃及15～45min，以绝干质量计的木粉或竹粉质量与去离子
水体积比的范围为1:5～1:10；
[0038] 其中，对于稀硫酸预处理，预处理温度和时间分别为170～190℃及15～25min，预处理液为去离子水中加入硫酸的酸性水溶液，硫酸在预处理液中的体积含量为0.1～0.6％，以绝干质量计的木粉或竹粉质量与预处理液体积比的范围为1:5～1:8；
[0039] 其中，对于苯磺酸预处理，预处理温度和时间分别为80～95℃及20～35min，预处理液为去离子水中溶解苯磺酸的酸性水溶液，预处理液中苯磺酸的质量百分比为65～80％，以绝干质量计的木粉或竹粉质量与预处理液质量比范围为1:15～1:20；
[0040] 其中，对于稀NaOH预处理，预处理温度和时间分别为160～180℃及40～90min，预处理液为去离子水中溶解NaOH的碱性水溶液，所溶解NaOH质量为绝干为木粉或竹粉质量的8～15％，以绝干质量计的木粉或竹粉质量与预处理液体积比的范围为1:5～1:8。
[0041] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0042] 本发明采用从廉价的脱脂花生粉中提取花生蛋白、单糖或低聚寡糖，脱脂花生粉预水解液具有生物兼容性，其可直接与预处理固体基质进行半同步酶解和发酵，提升发酵液中燃料乙醇的浓度，乙醇浓度显著增加了300％。
[0043] 一方面，预水解液中花生蛋白可有效屏蔽预处理固体基质表面沉积的木质素，实现低酶用量条件下的高效酶解，且预水解液中无任何外源添加剂，具有较好的生物兼容性；
[0044] 另一方面，预水解液中部分单糖(如葡萄糖和甘露糖)可直接发酵为乙醇，低聚寡糖经后续酶解可增加半同步酶解和发酵液中可发酵糖浓度，进而提升燃料乙醇浓度，降低蒸馏所需能耗。
[0045] 基于预处理固体基质的加入次数，采用分步补加酶和酵母细胞的方式进行半同步糖化发酵，以减少酶在第二次及后续投料过程中的无效吸附以及酵母繁殖对可发酵糖的消耗。
[0046] 总体而言，本发明可有效降低燃料乙醇的生产成本，促进生物质基燃料乙醇的商业化推广。
具体实施方式
[0047] 下面给出
实施例以对本发明进行具体的描述，以下实施例及对比例所用的原材料均为市购。
[0048] 所述脱脂花生粉为干法
热压榨或干法冷压榨花生油后的剩余物，经磨粉后过20～40目筛网。
[0049] 实施例1
[0050] (1)竹材预处理固体基质的制备：
[0051] 首先，将过40目筛的10g竹粉加入到含有聚四氟乙烯
内衬的
微波反应罐中，加入150g苯磺酸的水溶液，预处理液中苯磺酸的质量百分比为80％，密封微波反应罐后在95℃处理30min，预处理完成后，取出微波反应罐并置于冷水中冷却至室温，然后在垫有
滤纸的布氏漏斗中进行固液分离；然后，用去离子水清洗预处理固体基质至滤液pH值为6.8～7.0的范围，将清洗后的预处理固体基质用于后续半同步酶解和发酵。
[0052] (2)脱脂花生粉的预水解：
[0053] 首先，将20g且过40目筛的脱脂花生粉装入1L的球磨罐，加入300ml左右的液氮，迅速密封，在球磨罐体转动速度为600rpm的条件下球磨2h；
[0054] 然后，取磨后的脱脂花生粉20g装入含有100ml醋酸-醋酸钠缓冲液(50mmol/L、pH5.0)的三角瓶中，即以绝干质量计的脱脂花生粉质量与醋酸-醋酸钠缓冲液体积比(g:ml)的范围为1:5；
[0055] 加入半纤维素酶(5mg蛋白/g脱脂花生粉)，使半纤维素酶在缓冲液中的蛋白浓度为100mg/100mL，用橡皮塞密封密封此三角瓶，将密封后的三角瓶置于摇床中进行预水解，预水解温度、时间和转速分别为50℃、12h和200rpm。酶水解后，离心取上清液用于后续的半同步酶解和发酵，离心转速和时间分别为10000rpm和10min。
[0056] (3)酵母细胞的活化：
[0057] 在分批补加活化酵母细胞前，将2g商品酵母细胞加入到100ml液体培养基(葡萄糖、蛋白胨和酵母抽出物在蒸馏水中浓度分别为15g/L、20g/L和10g/L)中，在35℃和90rpm的条件下活化48h。每次活化培养结束后，立即将此液体培养基在8000rpm下离心10min，倾倒上清液，将离心出的酵母细胞用于后续的半同步酶解和发酵。
[0058] (4)脱脂花生粉预水解液和预处理固体基质的半同步酶解发酵：
[0059] 对于第一次加入预处理固体基质，首先，取步骤(2)中离心分离所得脱脂花生粉预水解上清液100ml倒入三角瓶中，向此三角瓶中加入步骤(1)所得的预处理固体基质5g(以绝干质量计算)，即预处理固体基质绝干质量与预水解上清液体积比(g:ml)为5:100；经玻璃棒简单搅拌后将三角瓶置于恒温水槽中进行超声处理，超声功率和处理时间分别为200W和45min，恒温水槽控制温度和磁力搅拌转速分别为35℃和100rpm；
[0060] 其次，采用文献(Luo X.L.,et al.Evaluation of mountain beetle-infested lodgepole pine for cellulosic ethanol production by sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose.Industrial&Engineering Chemistry Research,2010,49.17:8258-8266.)的方法测定预处理固体基质中葡聚糖的质量百分比，基于已加入预处理固体基质中葡聚糖的绝干质量，按照5FPU/g葡聚糖和10CBU/g葡聚糖的用量向此三角瓶中加入纤维素酶和纤维二糖酶，经橡皮塞密封后，将三角瓶置于摇床中进行酶水解，酶水解温度、时间和转速分别为50℃、12h和200rpm。
[0061] 然后，将摇床温度和转速分别调整至35℃和90rpm，待酶解液温度冷却至35℃后，往上述酶解液中加入步骤(3)中离心出酵母细胞，酵母细胞加入质量与脱脂花生粉预水解液的体积比(g:ml)为0.5:100，在此温度和转速下进行酶解和发酵，持续时间为12h。
[0062] (5)对于第二次批式补加预处理固体基质，首先，将摇床中三角瓶置于温度和磁力搅拌转速分别为35℃和100rpm的恒温水槽中，向此三角瓶中添加预处理固体基质，经玻璃棒简单搅拌后将此三角瓶进行超声处理(200W和45min)；然后，将三角瓶放入摇床中，向此三角瓶中添加纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞，在35℃和90rpm条件下继续酶解和发酵24h。预处理固体基质、纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞的加入量与第一次半同步酶解和发酵的加入量相同。
[0063] 第三次补料及补料后的酶解和发酵条件与第二次相同。
[0064] 对比例1
[0065] (1)竹材预处理固体基质的制备：制备方法与实施例1中的步骤(1)相同。
[0066] (2)含半纤维素酶缓冲液的配置：将一定质量半纤维素酶溶于浓度和pH值分别为50mmol/L和5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，使半纤维素酶蛋白浓度为100mg/100mL。
[0067] (3)酵母细胞的活化：活化方法与实施例1中的步骤(3)相同。
[0068] (4)预处理固体基质的半同步酶解和发酵：取步骤(2)所制备含有半纤维素酶的醋酸-醋酸钠缓冲液100ml和步骤(1)所得预处理固体基质5g(以绝干质量计算)加入到三角瓶中，经玻璃棒简单搅拌后将三角瓶置于温度和磁力搅拌转速分别为35℃和100rpm恒温水槽中进行超声处理，超声功率和处理时间分别为200W和45min；
[0069] 其次，采用文献(Luo X.L.,et al.Evaluation of mountain beetle-infested lodgepole pine forcellulosic ethanol production by sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose.Industrial&Engineering Chemistry Research,2010,49.17:8258-8266.)的方法测定预处理固体基质中葡聚糖的质量百分比，基于预处理固体基质中葡聚糖的绝干质量，按照5FPU/g葡聚糖和10CBU/g葡聚糖的用量加入纤维素酶和纤维二糖酶，经橡皮塞密封后，将三角瓶置于摇床中进行酶水解，酶水解温度、时间和转速分别为50℃、12h和200rpm。
[0070] 然后，将摇床温度和转速分别调整至35℃和90rpm，待酶解液温度冷却至35℃后，往上述酶解液中加入步骤(3)中离心出酵母细胞，酵母细胞加入质量与酶解液的体积比(g:ml)为0.5:100，在此温度和转速下进行酶解和发酵，持续时间为12h。
[0071] 当第一次半同步酶解和发酵结束后，将摇床中三角瓶置于温度和磁力搅拌转速分别为35℃和100rpm的恒温水槽中，向此三角瓶中添加预处理固体基质，经玻璃棒简单搅拌后将此三角瓶进行超声处理(200W和45min)；然后，将三角瓶放入摇床中，向此三角瓶中添加纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞，在35℃和90rpm条件下继续酶解和发酵24h。预处理固体基质、纤维素酶、纤维二糖酶及酵母细胞的加入量与第一次半同步酶解和发酵的加入量相同。
[0072] 第三次补料后的半同步糖化发酵的条件与第二次相同。本对比例分批补加预处理固体基质、酶及酵母细胞的总次数为3次。
[0073] 实施例2～6与对比例2～4
[0074] 实施例2～6与对比例2～4的具体方案和乙醇发酵的结果分别如表1和表2所示：
[0075] 木质生物质原料均为过40目的竹粉或者桉木粉；HC、CL、CB、G和YC分别为半纤维素酶、纤维素酶、纤维二糖酶、葡聚糖和酵母细胞的简称；R为预处理固液比的简称；AASA为醋酸-醋酸钠的简称；DPF为脱脂花生粉的简称；PS为预处理固体基质的简称。
[0076] 针对苯磺酸、热水、稀硫酸或稀NaOH预处理，预处理完成后，采用垫有滤纸的布氏漏斗中进行固液分离，用去离子水清洗预处理固体基质至滤液pH值为6.8～7.0的范围，将清洗后的预处理固体基质用于后续半同步糖化发酵。
[0077] 针对稀硫酸预处理，硫酸用量以硫酸在预处理中体积百分含量计；针对稀NaOH预处理，NaOH用量以预处理液中所溶解NaOH质量与绝干木粉或竹粉的质量百分比计。
[0078] 表1实施例方案表
[0079]
[0080]
[0081] 表2对比例方案表
[0082]
[0083]
[0084] 从实施例1和对比例1可知，本发明采用从廉价的脱脂花生粉中提取花生蛋白、单糖或低聚寡糖，脱脂花生粉预水解液具有生物兼容性，其可直接与预处理固体基质进行半同步酶解和发酵，提升发酵液中燃料乙醇的浓度。预水解液中花生蛋白可有效屏蔽预处理固体基质表面沉积的木质素，实现低酶用量条件下的高效酶解，且预水解液中无任何外源添加剂，具有较好的生物兼容性。在相同酶用量条件下，添加脱脂花生粉预水解液使得乙醇发酵量大幅度提高，乙醇浓度增加了3倍左右。
[0085] 从实施例1和对比例2可知，通过本发明开发高效的球磨工艺，加入液氮的球磨处理对脱脂花生粉进行前处理，提高脱脂花生粉中
蛋白质和糖的提取效率，在酶用量降低50％的情况下，也使得乙醇浓度增加了2倍左右。从实施例1和实施例6可知，通过增加补料的次数也可增加乙醇的浓度，补料次数可达到4次，此时发酵产乙醇浓度可达到71.6g/L。
[0086] 从实施例1和对比例4可知，将3次分批添加的料一次性加入并进行发酵，发酵后乙醇浓度显著下降，下降比例高达31％。
