同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌、其制备方
法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 大
力发展
可再生能源已经成为全球应对
气候变化、能源安全等全球性重大问题的共识，而
纤维素
乙醇作为一种
可再生能源已经受到重视。然而破除木质
纤维素抗降解屏障是纤维素转化为
燃料乙醇的首要障碍。但在预处理过程中，一些化学预处理手段，如稀酸等，较容易形成乙酸和呋喃甲醛等一系列对微生物具有毒害左右的抑制物；其中酶解液中乙酸浓度可达1-10g/L，酶解液中呋喃甲醛的浓度可达 0.5-11g/L，严重影响了后续的生物发酵过程。
[0003] 利用额外的脱毒工艺会增加生产成本。
[0004] 相比较而言，利用生物手段构建耐受呋喃甲醛和乙酸的优良微生物菌株将是抵御呋喃甲醛和乙酸毒害、降低生产成本的方法之一。
[0005] 运动发酵单胞菌(Zymomonasmobislis)是产乙醇的优良物种，近年来在可再生
燃料乙醇研究和生产中受到广泛关注，杜邦公司已经开发出利用该菌进行燃料乙醇生产的工艺生产线。然而目前在运动发酵单胞菌进行木质纤维素燃料乙醇发酵工艺中，呋喃甲醛和乙酸仍然是一个巨大的挑战。
[0006] 为了解决上述问题，本
申请的
发明人做了很多努力，比如
专利申请号为201510150902.8的中国专利申请，公开了一种通过突变等步骤得到一种耐受3g/L的呋喃甲醛的运动发酵单胞菌ZM4-MF；又比如专利申请号为201711437348.7的中国专利申请，公开了一种通过 ARTP诱变和筛选步骤得到一种耐受8g/L乙酸的运动发酵单胞菌突变株AQ8-1；
[0007] 但是，在发酵产乙醇的环境中，往往高浓度的乙酸和高浓度的呋喃甲醛同时存在，所以，有必要对现有的这些菌株进行进一步改进，使其能实现对高浓度的乙酸和呋喃甲醛的双重耐受。
发明内容
[0008] 本发明的目的之一，就在于提供一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，以解决上述问题。
[0009] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60526。
[0010] 另一种能同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌，所述运动发酵单胞菌的生物保藏号为GDMCC60527。
[0011] 本发明的目的之二在于，提供一种上述的同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的制备方法，采用的技术方案为，包括以下步骤：
[0012] (1)制备原生质体：
[0013] 选取一株耐受乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8-1和一株耐受呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株F3-3，分别制备突变株A8-1和F3-3 的原生质体；
[0014] (2)电融合：
[0015] 取步骤(1)所得的突变株A8-1和F3-3原生质体溶液，混合后离心；然后用缓冲液洗并重悬，取重悬细胞于电融合仪中进行电融合；
[0016] (3)运动发酵单胞菌融合菌株的筛选：
[0017] 首先测试亲本A8-1和F3-3在各梯度乙酸和各梯度呋喃甲醛组合的双抗平板上的抗性，并同时以野生菌株ZM4为对照；
[0018] 通过两轮步骤(2)所述的电融合介导的基因组重组，最终筛选出10株同时耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛的突变株，通过发酵测试，最终选取发酵效果最好的ZM532,ZM533作为5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛筛选菌株，生物保藏号分别为GDMCC60526和GDMCC60527，分类命名为：Zymomonas mobilis；保藏时间均为：2018年12月18日，保藏单位为：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼。
[0019] 作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述突变株A8-1耐受8g/L 乙酸，所述突变株F3-3耐受3g/L呋喃甲醛。
[0020] 作为优选的技术方案：步骤(2)中，所述混合后的A8-1和F3-3 原生质体溶液中，含有106到108个细胞，且A8-1和F3-3细胞个数相同。
[0021] 作为优选的技术方案：步骤(2)中，电融合时，直流
电压为 600-1000V，交流电压为10-60V，脉冲时间为5-40μs，脉冲次数为 1-3次。
[0022] 作为进一步优选的技术方案：步骤(2)中，电融合时，直流电压为800V，交流电压为40V，脉冲时间为25μs，脉冲次数为3次。本发明所采用的耐受8g/L乙酸的运动发酵单胞菌突变株A8-1，可以选自申请号为201711437348.7的中国专利申请所公开的AQ8-1，也可以选自通过对野生运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis ZM4)采用其他方法比如适应性进化等方法得到的耐受8g/L乙酸的其他运动发酵单胞菌突变株；
[0023] 本发明所采用的耐受3g/L呋喃甲醛的运动发酵单胞菌突变株 F3-3，可以选自专利申请号为201510150902.8的中国专利申请所公开的ZM4-MF，也可以选自通过对野生运动发酵单胞菌 (Zymomonasmobilis ZM4)采用其他方法比如适应性进化等方法得到的耐受3g/L呋喃甲醛的其他运动发酵单胞菌突变株；
[0024] 本发明在上述两株突变菌株的
基础上，通过原生质体电融合介导的基因组重组(genome shuffling)育种方法对A8-1和F3-3进行两轮电融合法的基因组重组，最终获得同时具有乙酸和呋喃甲醛抗性的运动发酵单胞菌突变菌株。上述两株突变菌株是耐受呋喃甲醛和乙酸的优良微生物菌株，可应用在纤维素预处理和
水解液等含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境中生产燃料乙醇等生物基产品。
[0025] 本发明的目的之三，在于提供上述的同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的应用，采用的技术方案为：将所述运动发酵单胞菌用于含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境中生产乙醇。
[0026] 作为优选的技术方案：所述含有呋喃甲醛和乙酸的发酵环境为纤维素预处理或水解液。
[0027] 与
现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次将电融合技术应用于运动发酵单胞菌，将现有的单抗性运动发酵单胞菌进行基因组重组，得到具有同时耐受高浓度乙酸和高浓度呋喃甲醛的新型运动发酵单胞菌；一方面对现有的单抗性菌株进行了改良，另一方面也丰富了双重抗性的运动发酵单胞菌库，为进一步提高运动发酵单胞菌的抗性提供了研究基础。
附图说明
[0028] 图1为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的OD600变化图；
[0029] 图2为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的
葡萄糖消耗变化图；
[0030] 图3为不同菌株在5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛环境下的乙醇浓度变化图。
具体实施方式
[0031] 下面将结合附图对本发明作进一步说明。
[0033] 同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的制备方法，包括以下步骤：
[0034] (1)运动发酵单胞菌突变株A8-1和F3-3的原生质体制备方法，参考文献K.J.Lee,C.N.Seong,Strain Development of Zymomonas mobilis for Ethanol Production-Optimal conditions for the spheroplast formation and regeneration,(1984)，其典型的步骤包括：
[0035] 将5mL ZM4过夜培养液转接到装有50mL RMg的150mL锥形瓶中，30℃培养至OD600～0.8(～5h)；
[0036] 3000g、4min离心收集菌体，用0.01M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)洗涤两次后重悬于SMM溶液(～4ml SMM,菌体浓度～6x 109 cells/ml)；
[0037] 每毫升菌液加入0.4mL的溶菌酶(3mg/ml)，37℃温浴5min 后再加入0.05ml的0.1M EDTA，轻柔混匀温浴18min；
[0038] 3000g离心10min收集菌体，重悬于50ml的RMSG,30℃静置培养4h(3h后镜检观察原生质球的形成)；
[0039] 2000g下离心15min收集原生质球并重悬于2ml SMM缓冲液。镜检原生质球并用血球计数板测定浓度；
[0040] 将原生质球放于室温备用。
[0041] (2)运动发酵单胞菌突变株A8-1和F3-3原生质体电融合方法：
[0042] 取突变株A8-1和F3-3原生质体溶液，各50μL混合(一共106到108个细胞，A8-1和F3-3各占一半)，3000g离心5min；菌体用 SMM缓冲液(0.5M山梨醇20mM
马来酸钠,20mM MgCl2,pH 6.5)洗两次并重悬于
电极缓冲液(0.5M山梨醇和0.2mM CaCl2)，取20μL重悬细胞置于正负电极之间，正负两极之间的距离是1mm，电融合仪 CFB16-HB(BEX Co.,Ltd.,Japan)，选取交流电压(AC)为10V,20 V,30V,40V,50V,60V，在
显微镜下观察原生质体的成串率，当
视野中(需上下左右转动)有90％的原生质体结成长串，即选为最适交流电压，最终
选定的最优交流电压为40V；
[0043] 当交流电压确定之后，需确定直流电压、脉冲时间、脉冲次数：直流电压设定3个梯度(600V,800V,1000V),脉冲时间设定3个梯度(5μs,25μs,40μs)，脉冲次数设定3个梯度(1，2，3)，通过
正交设计L9(33)，根据融合率判断各因素的影响大小及最适直流电压，脉冲时间，脉冲次数；
[0044] 最终确定的最佳直流电压为800V、脉冲时间为25μs、脉冲次数为3次。
[0045] (3)运动发酵单胞菌融合菌株的筛选：
[0046] 首先测试亲本A8-1和F3-3在各梯度乙酸和各梯度呋喃甲醛组合的双抗平板上的抗性，以野生菌株ZM4为对照，30℃
培养箱，倒置2 周，每两天计数一次，亲本抗性实验独立重复3次。根据双亲本的双重抗性基础，提高呋喃甲醛和乙酸的浓度设定为筛选平板浓度。
[0047] 通过步骤(2)的两轮电融合介导的基因组重组后重测序的结果见表1；最终筛选出10株同时耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛及10 株同时耐受7g/L乙酸和2g/L呋喃甲醛的双重耐受突变菌株，因呋喃甲醛对菌株的毒害作用更大，能与其它抑制物形成协同作用，且目前菌株对呋喃甲醛单因素抗性的最高水平为3g/L，因此对10株同时耐受5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛的突变株进行发酵测试，最终选取发酵效果最好的ZM532,ZM533作为5g/L乙酸和3g/L呋喃甲醛筛选菌株；其用于专利程序的
生物材料保存编号分别为GDMCC60527，GDMCC60526。
[0048] 表1菌株的结构变异结果表
[0049]菌株 Post1 Post2 类型 Size
272 245068 245542 ITX 251
273 245071 245652 ITX 256
274 245074 245604 ITX 257
532 244367 244691 ITX 266
245058 245690 ITX 262
633 245065 245594 ITX 247
[0050] 表1中，ITX是SV(
染色体结构变异的一个类型)表示染色体内部迁移；
[0051] Post1-前端reads锚定区域的
位置；
[0052] Post2-后端reads锚定区域的位置；
[0053] Size-预估的SV大小，表示在Pos1-Pos2之间，有一个大小约为 Size的SV发生。
[0054] 实施例2
[0055] 同时耐高浓度乙酸和呋喃甲醛的运动发酵单胞菌的功能验证试验：
[0056] 在RM培养基(RM培养基配方为：50.0g/L葡萄糖,10.0g/L
酵母提取物,2.0g/L KH2PO4,2.0g/LMgSO4和1.0g/L(NH4)2SO4)、5g/L乙酸和3 g/L呋喃甲醛的条件下，突变菌株ZM532,ZM533在发酵42小时将葡萄糖全部消耗完，而亲本菌株A8-1和F3-3在发酵42小时时，分别只消耗了40％、41.6％的葡萄糖，野生菌株ZM4只消耗了20.8％的葡萄糖。突变菌株ZM532,ZM533的乙醇转化率分别达到理论转化率的 82.8％和81.4％，产率达到0.51g/g葡萄糖,0.50g/g葡萄糖,野生菌株ZM4只有0.22g/g葡萄糖，其结果如图1-3所示，图1-3中，“532”代表突变菌株ZM532，“533”代表突变菌株ZM532，“A8”代表亲本 A8-1，“F3”代表亲本F3-3，ZM4代表野生菌株ZM4。
[0057] 在RM培养基(RM培养基配方为：50.0g/L葡萄糖,10.0g/L酵母提取物,2.0g/L KH2PO4,2.0g/L MgSO4和1.0g/L(NH4)2SO4)、7g/L乙酸的条件下，突变菌株ZM532,ZM533发酵30小时后可将葡萄糖全部消耗完，菌株乙醇转化率分别达到理论转化率的90.0％和89.2％，而同等条件下亲本菌株A8-1在42小时后将葡萄糖全部消耗完，而野生菌株ZM4 在
60小时后将葡萄糖全部消耗完。
[0058] 在RM培养基(RM培养基配方为：50.0g/L葡萄糖,10.0g/L酵母提取物,2.0g/L KH2PO4,2.0g/L MgSO4和1.0g/L(NH4)2SO4)、3g/L呋喃甲醛的条件下，突变菌株ZM532,ZM533与亲本菌株F3-3同样在发酵36小时后可将葡萄糖全部消耗完，同等条件下野生菌株ZM4在72小时后将葡萄糖全部消耗完；
[0059] 从上述结果可以看出：在呋喃甲醛和乙酸的双重抗性条件下，突变菌株ZM532,ZM533的发酵速率尽管受到一定影响，但仍可正常发酵产乙醇，且在7g/L乙酸的条件下，比亲本A8-1发酵更快，在3g/L 呋喃甲醛的条件下，与亲本F3-3发酵相当；目前对运动发酵单胞菌对呋喃甲醛的抗性最高是3g/L,本申请的菌株对呋喃甲醛的抗性达到了最高的3g/L的同时，还能胁迫5g/L乙酸乙酸，而且ZM532ZM533 的单抗性也是比亲本优异的，所以，本申请取得的技术效果是非常显著的。
[0060] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
