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重组酿酒 酵母菌株及其制备方法和应用

阅读：110发布：2020-05-22

专利汇可以提供重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及基因工程及代谢工程领域，公开了基因工程及代谢工程领域，具体地，涉及一种重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用。本发明的重组酿酒酵母菌株包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：(1)来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的araA基因，(2)来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araB基因，(3)来自植物乳杆菌的araD基因。本发明的重组酿酒酵母菌株具有外源整入的阿拉伯糖作为碳源的代谢途径，在木质纤维素原料发酵制备生物液体燃料乙醇工艺中，既可利用葡萄糖亦可利用阿拉伯糖，可实现木质纤维素原料93.2％的糖醇转化率，且菌株发酵性能良好，提高吨原料的乙醇产率，提高原料利用率，适合于纤维素乙醇的大规模生产。，下面是重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种重组表达载体，其特征在于，其包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：
(1)来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的araA基因，
(2)来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araB基因，
(3)来自植物乳杆菌的araD基因。
2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其中，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为能够表达(1)～(3)的基因的基因表达盒经Gibson组装而构建得到的表达载体；
优选地，所述重组表达载体还含有博来霉素抗性基因。
4.一种重组酵母菌株，其特征在于，其包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：
(1)来自乳酸片球菌的araA基因，
(2)来自植物乳杆菌的araB基因，
(3)来自植物乳杆菌的araD基因。
5.根据权利要求4所述的重组酵母菌株，其中，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求4所述的重组酵母菌株，其中，所述重组酵母菌株为以保藏号CGMCC No.16830保藏的重组酵母菌株。
7.一种重组酵母菌株的制备方法，其特征在于，该方法包括：将包括下述(1)～(3)的基因的基因表达盒导入酵母菌株：
(1)来自乳酸片球菌的araA基因，
(2)来自植物乳杆菌的araB基因，
(3)来自植物乳杆菌的araD基因。
8.根据权利要求7的制备方法，其中，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；
优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
9.一种乙醇的制备方法，其特征在于，将权利要求4-6中任意一项所述的重组酵母菌株或者权利要求7或8所述方法制备的重组酵母菌株接种于发酵培养基中进行发酵制乙醇，优选地，所述发酵培养基中的碳源包括葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
10.权利要求4-6中任意一项所述的重组酵母菌株或者权利要求7或8所述方法制备的重组酵母菌株在制备乙醇中的应用，优选在以木质纤维素为碳源制备燃料乙醇中的应用。

说明书全文

重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程及代谢工程领域，具体地，涉及一种重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 燃料乙醇是公认的最有发展前景的新型生物能源。由于第一代燃料乙醇的生产存在与人争粮的问题，因而提出以木质纤维素材料为原料的第二代燃料乙醇生产策略，以推进燃料乙醇的规模化应用。自20世纪70年代以来，有关生物质的全糖利用问题已成为木质纤维素原料再生性能源开发的重要课题。开发生产工艺将木质纤维素原料充分转化成单糖组分，并将得到的所有单糖组分转化成乙醇，是木质纤维素发酵生产乙醇的必要条件。构建可以发酵全糖组分的微生物工程菌株是纤维素乙醇规模化生产与应用的前提条件之一。

[0003] 木质纤维素包含纤维素、半纤维素和木质素三部分，其中纤维素、半纤维素包含多种己糖及戊糖组分。虽然不同种类木质纤维素原料中L-阿拉伯糖的含量差别较大，但其含量在木质纤维素糖组分中位于第三位。同时它和木糖一样，是比较容易通过预处理过程从木质纤维素原料中释放出来的糖分，是木质纤维素全糖乙醇发酵的重要底物成分。

[0004] 虽然野生型的酿酒酵母可以通过非特异性的醛糖还原酶转化L-阿拉伯糖生成阿拉伯糖醇，但很难完成后续代谢步骤。通过表达缺乏的L-阿拉伯糖代谢最初几步所需的酶基因，可以赋予其代谢L-阿拉伯糖的能力。酿酒酵母L-阿拉伯糖代谢工程的研究，起步远晚于木糖代谢工程的研究，近几年来取得了阶段性进展，有效地拓展了酿酒酵母的底物利用范围，提高了木质纤维素原料的利用效率，推进了第二代燃料乙醇生产过程的成本节约和经济可行的进程。

[0005] CN103289908A公开了一种发酵阿拉伯糖的真核细胞的代谢工程改造方法。将具有序列编码L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶 (araD)的多核苷酸序列插入到酵母细胞中，从而这些核苷酸序列的表达赋予细胞使用L- 阿拉伯糖和/或将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或转化为期望的发酵产物如乙醇的能力。宿主细胞是已用核酸构建体转化的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码如文中定义的araA、araB或araD酶的核苷酸序列。在一个更优选的实施方案中，用三种核酸构建体共转化宿主细胞，每种核酸构建体包含编码araA、araB或araD的核苷酸序列。包含araA、araB和/或araD编码序列的核酸构建体能够在宿主细胞中表达araA、 araB和/或araD酶。但是该专利申请仅仅公开了使用来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD的方法，且阿拉伯糖利用率仍较低。

[0006] CN102712894B公开了一种导入阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物及使用所述微生物生产木糖醇的方法。该发明涉及在木糖/阿拉伯糖混合培养基中使用产木糖醇微生物有效生产木糖醇的方法，所述产木糖醇微生物中通过导入阿拉伯糖代谢途径抑制了副产物阿拉伯糖醇的生产，并仅使用阿拉伯糖用于细胞代谢。更确切地，为了在热带假丝酵母中有效地表达araA、araB和araD，对密码子进行了优化。然后，将各基因插入含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子和URA3选择标记的基因表达盒中，将该基因表达盒导入假丝酵母微生物中。结果，可抑制妨碍木糖醇纯化和结晶的副产物阿拉伯糖醇，使得木糖醇生产方法更加有效。该发明导入了阿拉伯糖代谢途径的产木糖醇微生物通过抑制阿拉伯糖醇的生成，可有效地用于提高生产率生产木糖醇。但是，该专利仅仅公开了用假丝酵母的偏爱密码子替换地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)L-阿拉伯糖异构酶(araA)、大肠杆菌L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸4-表异构酶(araD)的密码子并导入假丝酵母中的技术方案，且阿拉伯糖利用率仍有待提高。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种重组酿酒酵母菌株及其制备方法和应用，该重组酵母菌株具有同时高效代谢葡萄糖和阿拉伯糖的能力，可以用于以木质纤维素酶解液为原料的发酵中。

[0008] 为了实现上述目的，本发明一方面提供一种重组表达载体，其包括能够表达下述 (1)～(3)的基因的基因表达盒：

[0009] (1)来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的araA基因，

[0010] (2)来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araB基因，

[0011] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0012] 优选地，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0013] 优选地，所述重组表达载体为能够表达(1)～(3)的基因的基因表达盒经Gibson 组装而构建得到的表达载体。

[0014] 优选地，所述重组表达载体还含有博来霉素抗性基因。

[0015] 本发明第二方面提供一种重组酵母菌株，其包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：

[0016] (1)来自乳酸片球菌的araA基因，

[0017] (2)来自植物乳杆菌的araB基因，

[0018] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0019] 优选地，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0020] 优选地，所述重组酵母菌株为以保藏号CGMCC No.16830保藏的重组酵母菌株。

[0021] 本发明第三方面提供一种重组酵母菌株的制备方法，该方法包括：将包括下述(1)～ (3)的基因的基因表达盒导入酵母菌株：

[0022] (1)来自乳酸片球菌的araA基因，

[0023] (2)来自植物乳杆菌的araB基因，

[0024] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0025] 优选地，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0026] 优选地，所述酵母菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

[0027] 本发明第四方面提供一种乙醇的制备方法，将上述本发明的重组酵母菌株或者上述本发明的方法制备的重组酵母菌株接种于发酵培养基中进行发酵制乙醇。

[0028] 优选地，所述发酵培养基中的碳源包括阿拉伯糖。

[0029] 本发明第五方面提供上述本发明重组酵母菌株或者上述本发明的方法制备的重组酵母菌株在制备乙醇中的应用，特别是在利用阿拉伯糖作为碳源制备乙醇中的应用。优选的情况下，上述应用为上述重组酵母菌株在制备燃料乙醇中的应用，特别是在以木质纤维素气爆料酶解液为碳源制备燃料乙醇中的应用。

[0030] 通过上述技术方案，本发明的重组酵母菌株利用分子生物学方法，利用来自乳酸片球菌的araA基因、来自植物乳杆菌的araB基因和araD基因构建了阿拉伯糖代谢途径，从而可以实现高效代谢阿拉伯糖，拓宽了酵母发酵底物范围。重组酵母菌株为重组酿酒酵母菌株的情况下，能够同时高效利用葡萄糖和阿拉伯糖，具有极高的糖醇转化率，且菌株发酵性能良好，从而提高了乙醇的发酵效率和乙醇产率，提高原料利用率，非常适合用于纤维素乙醇的大规模生产。

[0031] 本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

[0032] 生物保藏

[0033] 菌株S.C araABD，分类命名：酿酒酵母菌Saccharomyces cerevisiae，于2018年11 月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.16830。附图说明

[0034] 图1为本发明实施例中使用的载体图谱。

具体实施方式

[0035] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

[0036] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0037] 本发明第一方面提供重组表达载体，其包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：

[0038] (1)来自乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的araA基因，

[0039] (2)来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araB基因，

[0040] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0041] 利用本发明的重组表达载体可以将上述来自乳酸片球菌的araA基因(以下也简称 PA-araA)、来自植物乳杆菌的araB基因(以下也简称LP-araB)和araD基因(以下也简称LP-araD)导入酵母中，从而能够在酵母中表达L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB)和L-核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶(araD)，得到的酵母菌株能够使用阿拉伯糖用于细胞代谢，达到将阿拉伯糖分解为乙醇的目的，能够更加彻底地分解纤维素中的糖类，达到提高酵母生产乙醇的效率。

[0042] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0043] 为了保持上述基因的稳定表达能力，本发明的重组表达载体优选为整合型载体，即上述能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒优选插入酵母的基因组中，从而能够稳定表达三种酶。作为上述重组表达载体的制备方法，可以将上述基因表达盒构建到现有的酵母整合载体中而得到，具体可以根据基因表达盒的片段长度选用现有的任意酵母整合载体。优选的情况下，本发明的整合型载体选取酿酒酵母基因组多拷贝序列rDNA 位点作为整合位点。

[0044] 在三种基因表达盒的构建中，优选选用酵母主要代谢途径中基因的启动子或终止子作为本发明中阿拉伯糖代谢途径的启动子或终止子，例如三种基因表达盒可以为 ENO2p-araD-SLM5t、GPM1p-araB-FBA1t、TEF1p-araA-CYC1t。

[0045] 根据本发明优选的实施方式，所述重组表达载体为PA-araA、LP-araB和LP-araD的基因表达盒依次插入表达载体中得到。为了便于验证所述载体在酵母菌株中的正确插入，优选地，所述重组表达载体还含有抗生素抗性基因，例如博来霉素抗性基因。优选的情况下，重组表达载体依次包括rDNA上游1000bp同源臂、博来霉素Zeocin抗性基因、araA 表达盒、araB表达盒、araD表达盒、rDNA下游1000bp同源臂的序列。

[0046] 根据本发明优选的实施方式，所述重组表达载体为能够表达上述(1)～(3)的基因的基因表达盒经Gibson组装而构建得到的表达载体。

[0047] 作为上述酵母菌种，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，优选的情况下，本发明的酿酒酵母选取酿酒酵母S.C X630，该菌株的保藏编号为CGMCC No.16832，该菌株可同时高效利用葡萄糖和木糖生产乙醇。

[0048] 本发明第二方面提供重组酵母菌株，其包括能够表达下述(1)～(3)的基因的基因表达盒：

[0049] (1)来自乳酸片球菌的araA基因，

[0050] (2)来自植物乳杆菌的araB基因，

[0051] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0052] 在本发明的重组酵母中，能够表达L-阿拉伯糖异构酶(araA)、L-核酮糖激酶(araB) 和L-核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶(araD)，从而能够使用阿拉伯糖用于细胞代谢，因此本发明的重组酵母菌株可以使用更多的碳源进行乙醇发酵，并且在进行纤维素的发酵时，可以分解其中的阿拉伯糖，提高了糖类的利用率，实现了更高效发酵乙醇的效果。

[0053] 根据本发明优选的实施方式，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0054] 根据本发明优选的实施方式，上述(1)～(3)的基因的基因表达盒插入酵母基因组的rDNA区段。

[0055] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述重组酵母菌株为以保藏号CGMCC No. 16830保藏的重组酵母菌株(S.C araABD)。

[0056] 本发明第三方面提供的重组酵母菌株的制备方法，该方法包括：将包括下述(1)～ (3)的基因的基因表达盒导入酵母菌株：

[0057] (1)来自乳酸片球菌的araA基因，

[0058] (2)来自植物乳杆菌的araB基因，

[0059] (3)来自植物乳杆菌的araD基因。

[0060] 根据本发明的一个优选的实施方式，所述来自乳酸片球菌的araA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述来自植物乳杆菌的araB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO： 2所示；所述来自植物乳杆菌的araD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0061] 上述基因的基因表达盒导入酵母菌株的过程可以采用现有的基因工程方法进行，例如可以使用能够用于酵母中的任意的表达载体进行导入，只要导入后上述基因能够在酵母菌株中稳定表达即可。为了保持上述基因的稳定表达能力，使用的表达载体优选为整合型载体。

[0062] 另外，本发明的重组酵母菌株也可以通过使用上述本发明的重组表达载体导入酵母中制备得到，例如可以通过电转化的方法将所述重组表达载体转入酵母中。

[0063] 如前所述，根据本发明优选的实施方式，所述基因表达盒整合至酵母菌株的基因组中。

[0064] 本发明第四方面提供的乙醇的制备方法，将上述本发明的重组酵母菌株或者上述本发明的方法制备的重组酵母菌株接种于发酵培养基中进行发酵制乙醇。由于本发明的重组酵母菌株能够利用阿拉伯糖，优选地，所述发酵培养基中的碳源包括阿拉伯糖。更优选地，所述发酵培养基的碳源为阿拉伯糖。

[0065] 例如，本发明的重组酵母菌株可以用于乙醇的发酵制备过程，作为发酵过程使用的条件，可以包括：温度30-35℃，150-200rpm，培养60-72h，利用本发明的重组酵母菌株进行乙醇发酵，合成培养中阿拉伯糖利用率可以达到60％以上，转化率达到0.459g/g，为理论转化率的89.9％；在应用于秸秆酶解液的C5糖和C6糖共发酵产乙醇时，阿拉伯糖利用率为53.6％，葡萄糖、木糖和阿拉伯糖混合糖转化为乙醇的转化率为93.2％。

[0066] 本发明的重组酵母菌株为重组酿酒酵母菌株时，由于其同时具有高葡萄糖、木糖和阿拉伯糖转化效率，从而能够进一步提高乙醇发酵效率和乙醇产率，特别适用于利用纤维素作为碳源发酵乙醇。

[0067] 本发明第五方面提供上述本发明所述的重组酵母菌株或者上述本发明的方法制备的重组酵母菌株在制备乙醇中的应用，特别是在利用葡萄糖、木糖和阿拉伯糖共同作为碳源制备乙醇中的应用。

[0068] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。其中，基因的表达盒的构建参考《分子生物学(第五版)》(Robert F.Weaver著，2013年3月科学出版社)中的双酶切和DNA 片段连接方法进行。

[0069] 大肠杆菌DH5α的活化与培养：取出-80℃保存的甘油冻存菌液，用接种环蘸取少许菌液划线接种于2YT固体培养基，37℃恒温培养16h后，挑取大肠杆菌单菌落于2YT液体培养基中，置于220rpm摇床中，37℃培养16h。

[0070] 酿酒酵母的活化与培养：取出-80℃保存的甘油冻存菌液，用接种环蘸取少许菌液划线接种于YPD固体培养基，30℃培养48h，挑取平板上的单菌落于液体YPD液体培养基中，置于250rpm摇床中，30℃培养72h。

[0071] 菌落PCR反应条件如下表1所示。

[0072] 表1

[0073]

[0074] 菌落PCR体系为15μL，各组分比例如下表2所示。

[0075] 表2

[0076]dNTP(10mM) 1.0μL
10×rTaq DNA聚合酶buffer 1.5μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
菌落 1μL
rTaq DNA聚合酶(5U/μL) 0.5μL
ddH2O 10.0μL

[0077] 酵母感受态细胞制备：接种酵母单菌落至10mLYPD培养基中，中，250rpm，30℃过夜培养；取1ml菌液转接至新的100mLYPD培养基中，30℃，250rpm，培养4-5h，直到OD600为1.0；菌液转入50mL离心管，4500rpm 4℃离心5min，弃上清；用50mL冰预冷无菌水重悬菌体，
4500rpm 4℃离心5min，弃上清；用25mL冰预冷的无菌水重悬菌体，4500rpm 4℃离心5min，弃上清；用2mL预冷的1M山梨醇重悬菌体，4500rpm 4℃离心5min，弃上清；最后用约300μL1M冰山梨醇重悬，每管80μL分装备用。

[0078] 酵母电击转化及阳性克隆筛选：利用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌中测序验证正确的阳性克隆质粒；按照Bln I酶切体系将5-10μg质粒在37℃水浴锅中酶切线性化过夜；酶切产物的纯化按照DNA纯化回收试剂盒进行操作，回收后的线性化片段与80μLGS115 感受态细胞混合，转入0.2cm预冷电击杯中；调节电转条件为1.5Kv，电容25μF，5ms，电阻200Ω立刻进行电转；电击后立刻加入1mL 1M预冷山梨醇，然后在30℃培养箱静置孵育1-2h；5000rpm离心1min，弃上清液，用100μL 1M的山梨醇重悬，重悬的细胞涂布于含有zeocin抗生素的YPD平板，30℃倒置培养3天，观察菌落生长情况；以平板上挑取的单菌落作为模板，参照上述菌落PCR条件进行阳性克隆鉴定，PCR反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测，筛选得到阳性菌株。

[0079] 实施例中使用的药品与试剂来源如下表3所示。

[0080] 表3

[0081]名称级别来源
博来霉素生物级 Invitrogen公司
Prime STAR DNA聚合酶 2.5U/μL TaKaRa(大连)公司
Q5DNA聚合酶 5U/μL New England Biolabs公司
dNTP 生物级 TaKaRa(大连)公司
AvrII(BlnI) 12U/μL TaKaRa(大连)公司
FD Dpn I 生物级 Thermo Scientific公司
核酸Marker 400ng/5ul 北京盛旭百川生物科技有限公司
蛋白低分子量Marker 0.6ug/ul TaKaRa(大连)公司
DNA回收试剂盒 50次北京百泰克生物技术有限公司
质粒回收试剂盒 50次北京百泰克生物技术有限公司
质粒中提试剂盒 50次北京康为世纪生物科技有限公司
BsmBI 2.5U/μL Thermo公司
BsaI 2.5U/μL Thermo公司

[0082] 培养基：

[0083] (1)YPD培养基用于酿酒酵母和毕赤酵母的活化、培养及菌种保存，含有1重量％酵母提取物，2重量％蛋白胨，2重量％葡萄糖，15重量％琼脂(配制固体培养基)，121℃条件下灭菌20min。

[0084] (2)YEPX培养基用于共发酵酿酒酵母的碳源利用检测，以无葡萄糖的YPD培养基为基准，添加2重量％木糖作为唯一碳源，YEPA培养基用于共发酵酿酒酵母的碳源利用检测，以无葡萄糖的YPD培养基为基准，添加2重量％阿拉伯糖作为唯一碳源，121℃条件下灭菌20min。

[0085] (3)YEPXA培养基：1重量％酵母粉、2重量％蛋白胨、2重量％木糖、1重量％阿拉伯糖、1000mL水，121℃条件下灭菌20min。

[0086] (4)YEPD培养基：4重量％葡萄糖、1重量％酵母粉、2重量％蛋白胨、1000mL 水，121℃条件下灭菌20min。

[0087] (5)YNBA、YNBX培养基用于共发酵酿酒酵母的碳源利用检测，以无碳源的YNB 培养基为基准，添加2重量％木糖作为唯一碳源(YNBX)，添加2重量％阿拉伯糖作为唯一碳源(YNBA)。

[0088] (6)混合糖培养基用于验证重组C5/C6共发酵酿酒酵母菌株的发酵性能：以无葡萄糖的YPD培养基为基准，添加1重量％酵母提取物，2重量％蛋白胨，4重量％葡萄糖， 2重量％木糖，1重量％阿拉伯糖，121℃条件下灭菌20min。

[0089] (7)2YT培养基用于大肠杆菌的活化、培养及菌种保存，含有1重量％酵母提取物，1.6重量％蛋白胨，0.5重量％NaCl，15重量％琼脂(配制固体培养基)，121℃条件下灭菌
20min。

[0090] 检测方法：

[0091] HPLC分析条件：色谱仪：Agilent Technologies 1260Infinity II；检出器：RID；分离柱：Aminex HPX-87H Column 300×7.8mm；流动相：0.05M硫酸；流量：0.5mL/min；进样量：20μL。

[0092] 标品：纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙酸、乳酸钠、糠醛、5-羟甲基糠醛，色谱级，来自Sigma-Aldrich；

[0093] 样品制备：取发酵培养液1.5ml，12000rpm离心15min，用0.45μm和0.22μm无菌滤膜过滤后，过滤液装液相小瓶等待HPLC检查分析。

[0094] 实施例1

[0095] 整合质粒的构建：对乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici，也简称PA)的araA (PA-araA)基因、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，也简称LP)的araB(LP-araB) 和araD(LP-araD)基因进行扩增，分别构建三个基因的表达盒：ENO2p-araD-SLM5t(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)、GPM1p-araB-FBA1t(核苷酸序列如SEQ ID NO：5 所示)、TEF1p-araA-CYC1t(核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示)；再通过Golden Gate 方法串联组装抗性基因表达盒和三个基因表达盒，选取酿酒酵母基因组多拷贝序列rDNA 位点作为整合位点，构建质粒依次包含rDNA上游1000bp同源臂、博来霉素Zeocin抗性基因、araA表达盒、araB表达盒、araD表达盒、rDNA下游1000bp同源臂的序列，通过酶切线性化处理获得基因组整合大片段。

[0096] 本次实验所用引物序列如下表4所示。

[0097] 表4

[0098]

[0099] 上述引物中，Gib-K4-rDNA用于验证构建的正确性；Gib-zeocin用于扩增博来霉素 Zeocin抗性基因；Gib-araA、Gib-araB、Gib-araD分别用于扩增araA基因、araB基因、 araD基因。

[0100] 利用PrimerSTAR HS polymerase分别PCR扩增目的片段，反应体系如下表5所示。

[0101] 表5

[0102]名称体积(μl)
10X buffer 10
dNTPs 4
引物-F 1
引物-R 1
模板 1
HS polymerase 0.5
ddH2O 32

[0103] 使用乳酸片球菌PA的基因组DNA扩增araA基因、使用植物乳杆菌LP的基因组 DNA分别扩增araB和araD基因，并对载体(载体图谱见图1)进行酶切线性化，分别切胶回收目的片段(胶回收试剂盒为OMEGA Gel Extraction Kit)。回收的目的片段分别为：K4-CCDB(线性化载体)、博来霉素Zeocin抗性基因、LP-araB、LP-araD、PA-araA。利用Gibson组装方法构建整合质粒载体，反应体系如下表6所示。

[0104] 表6

[0105]名称体积(μl)
K4-CCDB(282.8ng/μl) 1.2
Zeocin(204ng/μl) 0.5
PA-araA(129ng/μl) 1.0
LP-araB(130ng/μl) 1.2
LP-araD(100ng/μl) 1.1
Gibson Assembly Master Mix 10
ddH2O 5

[0106] 将反应液混匀后置于PCR仪中50℃连接反应1h20min。连接产物取10μl转化Trans2-Blue感受态细胞，涂布相应抗性平板，挑选单菌落进行菌落PCR和测序验证。使用Gib-K4-rDNA引物测序，结果表明质粒构建成功，即成功构建了在rDNA位点依次插入了博来霉素Zeocin抗性基因、araA表达盒、araB表达盒、araD表达盒的重组酿酒酵母菌株，其中araA表达盒包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，araB表达盒包括如 SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，araD表达盒包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

[0107] 整合酿酒酵母及发酵验证

[0108] 选取S.C X630酿酒酵母菌株底盘宿主(保藏编号为CGMCC No.16832)，制备酿酒酵母S.C X630的电转化感受态细胞，将纯化后的1-2μg DNA线性化片段转化感受态细胞， 30℃在添加博来霉素Zeocin的YPD平板上培养3天长出单克隆。挑选单克隆转接YEPX (2重量％木糖作为唯一碳源)和YEPA(2重量％阿拉伯糖作为唯一碳源)平板进行培养，观察生长情况可以看出，YEPX平板上菌株生长速度比YEPA快，YEPA平板上接种的单克隆培养3天左右可看出不同单克隆生长出现区别。

[0109] 挑选在YEPX和YEPA平板上均能生长的菌株5-2(命名为：S.C araABD)，提取基因组进行基因组PCR验证，验证结果证明挑选的菌株S.C araABD已转入目标基因(博来霉素Zeocin抗性基因、PA-araA表达盒、LP-araB表达盒和LP-araD表达盒)。

[0110] 对比例1

[0111] 利用实施例1的方法制备重组酵母菌株，不同的是，使用植物乳杆菌LP的基因组 DNA分别扩增araA、araB和araD基因，得到对照菌株1-1。

[0112] 提取基因组进行基因组PCR验证，验证结果证明该对照菌株1-1已转入目标基因(博来霉素Zeocin抗性基因、LP-araA表达盒、LP-araB表达盒和LP-araD表达盒)。

[0113] 测试例1

[0114] 将上述酵母菌株分别用YNBA、YNBX培养基培养并检测OD变化，结果如表7所示。

[0115] 表7

[0116]

[0117] 使用混合糖培养基对上述菌株进行摇瓶培养，起始OD600＝0.1，在30℃、200rpm条件下培养60h。利用HPLC方法测定培养基中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘油、乙醇的浓度(单位：g/L)，结果如表8所示。

[0118] 表8

[0119] 葡萄糖木糖阿拉伯糖甘油乙醇
S.C araABD0h 33.474 20.052 9.867 0.101 0.064
S.C araABD60h 0.086 0.322 3.729 0.189 29.124
对照菌株1-10h 33.847 20.520 10.085 0.106 0.064
对照菌株1-1 60h 0.075 0.341 5.599 0.105 28.869
S.C X6300h 33.613 20.225 9.951 0.105 0.068
S.C X63060h 0.082 0.374 10.196 0.165 21.837

[0120] 根据上述表的结果可知，本发明的S.C araABD菌株在合成培养基中阿拉伯糖利用率达到62.2％，转化率达到0.459g/g，为理论转化率的89.9％，高于对照菌株1-1，而S.C X630不能利用阿拉伯糖。

[0121] 测试例2

[0122] 在玉米秸秆酶解液中进行重组酿酒酵母的发酵验证

[0123] 本测试例引用CN201410548925.X中所述的方法进行玉米秸秆酶解液制备。利用实施例1和对比例1得到的菌株，接种至含100mL YEPXA培养基的摇瓶中，16h后测定 OD600吸光值，取1mL培养液转接至含200mL YEPD培养基的摇瓶中。

[0124] 发酵：取种子液20mL在8000rpm条件下离心10min，用生理盐水洗一次，用1mL 生理盐水悬浮接种至200ml秸秆酶解液培养基(主要成分为葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖、乙酸)中，初始接种量控制为1g干细胞/L发酵液(等效接种OD为1)，通过保鲜膜包扎在30℃、150rpm下进行厌氧发酵，取发酵72h的样品进行液相色谱进样分析葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和乙醇含量。

[0125] 结果如表9所示。从表9可以看出，在秸秆酶解液培养基中，本发明菌株的阿拉伯糖利用率可以达到53.6％，总糖醇转化率(相应时间的乙醇/(木糖+葡萄糖+阿拉伯糖) /0.511*100)达到93.2％。

[0126] 表9

[0127] 葡萄糖木糖阿拉伯糖乙醇
S.C araABD0h 74.62 32.37 3.86 0.02
S.C araABD60h 0.00 3.92 1.79 52.79
对照菌株1-10h 74.90 32.86 3.79 0.02
对照菌株1-160h 0.00 4.41 1.96 51.66
S.C X6300h 74.18 32.68 3.95 0.02
S.C X630 60h 0.00 5.74 4.19 49.83

[0128] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

[0129] 序列表

[0130] SEQ ID NO：1

[0131] >PAaraA

[0132] NCBI NO.:CP015206.1

[0133] ATGAAAAAAATGCAAGATTATGAATTTTGGTTTATTACAGGTAGTCAATTCCTATATGGT GAAGAAACCCTTCGTTCAGTAGAAAAGGACGCTCGCGAAATCGTTGATAAGTTAAATGAAT CCAAGAACTTACCTTATCCAGTTAAATTCAAGTTGGTAGCAACTACTGCTGAAAACATCACT CAAGTAATGAAGGATGCTAACTATAACGACAAAGTTGCCGGGGTAATTACCTGGATGCACAC CTTCTCACCAGCTAAAAACTGGATCCGCGGTACTAAGTTATTGCAAAAACCATTGCTTCACT TAGCAACCCAATTCTTGAACCACATTCCATATGACACCATTGATTTTGACTACATGAACTTAA ATCAATCTGCCCATGGTGACCGTGAATATGCATTTATTAATGCACGCTTGCGTAAGAACAACA AGATCATCACTGGTTACTGGGGTGATGAAGACATTCAAAAACAAATCGCTAAATGGATGGAC GCAGCCGTTGGCTACAATGAATCATTTGGTATCAAGGTAGTAACCTTTGCTGACAAGATGCG TAACGTAGCGGTTACTGACGGTGACAAGATTGAAGCGCAAATTAAATTTGGCTGGACCGTC GATTACTGGGGAGTTGCGGACTTAGTTGAAGAAGTTAACGCCGTTGCTGAAGACGACATCA ACAATAAGTACGAAGAAATGAAGAAGGAATACAACTTCGTTGAAGGAGAAAATTCTTCAGA AAAATTCGAACACAATACTAAGTACCAAATTCGTGAATACTTTGCATTGAAGAAATTCATGG ACGATCGCGGATACACCGCATTCACAACTAACTTTGAAGACTTAGCTGGTTTGGAACAACTT CCAGGATTGGCTGTTCAAATGTTGATGGCTGAAGGCTATGGCTTCGCTGGTGAAGGGGACT GGAAGACCGCTGCTTTGGATCGCTTAATGAAGATCATTGCGCATAACCAACACACTGCCTTC ATGGAAGATTACACCCTTGACCTTCGTAAGGGACACGAAGCAATCCTTGGCTCACACATGCT AGAAGTTGACCCAACGTTAGCTAGTGACACGCCACGGGTCGAAGTTCACCCGCTTGACATT GGTGGCAAGGATGACCCTGCACGCTTTGTCTTCACTGGTATGGAAGGCGACGCGGTTGACG TTACGATGGCTGACTACGGTGATGAATTCAAGCTCATGTCTTACGATGTTCAAGGCAACAAG CCTGAAAAAGAAACACCACATCTTCCAGTTGCTAAACAACTCTGGACTCCAAAACAAGGTT GGAAGAAGGGTGCTGAAGGCTGGCTCACACTTGGTGGTGGCCATCATACCGTACTTTCCTT CAACGTGGATGCTGAACAATTACAAGACCTCAGCAACATGTTTGGATTGACATACGTTAACA TCAAATAG

[0134] SEQ ID NO：2

[0135] >LParaB

[0136] NCBI NO.:CP017066.1

[0137] ATGAATTTAGTTGAAACAGCCCAAGCGATTAAAACTGGCAAAGTTTCTTTAGGAATTG AGCTTGGCTCAACTCGAATTAAAGCCGTTTTGATCACGGACGATTTTAATACGATTGCTTCG GGAAGTTACGTTTGGGAAAACCAATTTGTTGATGGTACTTGGACTTACGCACTTGAAGATGT CTGGACCGGAATTCAACAAAGTTATACGCAATTAGCAGCAGATGTCCGCAGTAAATATCACA TGAGTTTGAAGCATATCAATGCTATTGGCATTAGTGCCATGATGCACGGATACCTAGCATTTG ATCAACAAGCGAAATTATTAGTTCCGTTTCGGACTTGGCGTAATAACATTACGGGGCAAGCA GCAGATGAATTGACCGAATTATTTGATTTCAACATGCCACAACGGTGGAGTATCGCGCACTT ATACCAGGCAATCTTAAATAATGAAGCGCACGTTAAACAGGTGGACTTCATAACAACGCTGG CTGGCTATGTAACCTGGAAATTGTCGGGTGAGAAAGTTCTAGGAATCGGTGATGCGTCTGGC GTTTTCCCAATTGATGAAACGACTGACACATACAATCAGACGATGTTAACCAAGTTTAGCCA ACTTGACAAAGTTAAACCGTATTCATGGGATATCCGGCATATTTTACCGCGGGTTTTACCAGC GGGAGCCATTGCTGGAAAGTTAACGGCTGCCGGGGCGAGCTTACTTGATCAGAGCGGCACG CTCGACGCTGGCAGTGTTATTGCACCGCCAGAAGGGGATGCTGGAACAGGAATGGTCGGTA CGAACAGCGTCCGTAAACGCACGGGTAACATCTCGGTGGGAACCTCAGCATTTTCGATGAA CGTTCTAGATAAACCATTGTCTAAAGTCTATCGCGATATTGATATTGTTATGACGCCAGATGGG TCACCAGTTGCAATGGTGCATGTTAATAATTGTTCATCAGATATTAATGCGTGGGCAACGATT TTTCGTGAGTTTGCAGCCCGGTTGGGAATGGAATTGAAACCGGATCGATTATATGAAACGTT ATTCTTGGAATCAACTCGCGCTGATGCGGATGCTGGAGGGTTGGCTAATTATAGTTATCAATC CGGTGAGAATATTACTAAGATTCAAGCTGGTCGGCCGCTATTTGTACGGACACCAAACAGTA AATTTAGTTTACCGAACTTTATGTTGACCCAATTATATGCGGCGTTCGCACCCCTCCAACTTG GTATGGATATTCTTGTTAACGAAGAACATGTTCAAACGGACGTTATGATTGCACAGGGTGGA TTGTTCCGAACGCCGGTAATTGGCCAACAAGTATTGGCCAACGCACTGAACATTCCGATTAC TGTAATGAGTACTGCTGGTGAAGGCGGCCCATGGGGGATGGCAGTGTTAGCCAACTTTGCTT GTCGGCAAACTGCAATGAACCTAGAAGATTTCTTAGATCAAGAAGTCTTTAAAGAGCCAGA AAGTATGACGTTGAGTCCAGAACCGGAACGGGTGGCCGGATATCGTGAATTTATTCAACGTT ATCAAGCTGGCTTACCAGTTGAAGCAGCGGCTGGGCAAGCAATCAAATATTAG

[0138] SEQ ID NO：3

[0139] >LParaD

[0140] NCBI NO.:CP017066.1

[0141] ATGCTAGAAGCATTAAAACAAGAAGTTTATGAGGCTAACATGCAGCTTCCGAAGCTGG GCCTGGTTACTTTTACCTGGGGCAATGTCTCGGGCATTGACCGGGAAAAAGGCCTATTCGTG ATCAAGCCATCTGGTGTTGATTATGGTGAATTAAAACCAAGCGATTTAGTCGTTGTTAACTTA CAGGGTGAAGTGGTTGAAGGTAAACTAAATCCGTCTAGTGATACGCCGACTCATACGGTGTT ATATAACGCTTTTCCTAATATTGGCGGAATTGTCCATACTCATTCGCCATGGGCAGTTGCCTAT GCAGCTGCTCAAATGGATGTGCCAGCTATGAACACGACCCATGCTGATACGTTCTATGGTGA CGTGCCGGCCGCGGATGCGCTGACTAAGGAAGAAATTGAAGCAGATTATGAAGGCAACACG GGTAAAACCATTGTGAAGACGTTCCAAGAACGGGGCCTCGATTATGAAGCTGTACCAGCCT CATTAGTCAGCCAGCACGGCCCATTTGCTTGGGGACCAACGCCAGCTAAAGCCGTTTACAAT GCTAAAGTGTTGGAAGTGGTTGCCGAAGAAGATTATCATACTGCGCAATTGACCCGTGCAA GTAGCGAATTACCACAATATTTATTAGATAAGCATTATTTACGTAAGCATGGTGCAAGTGCCTA TTATGGTCAAAATAATGCGCATTCTAAGGATCATGCAGTTCGCAAGTAG

[0142] SEQ ID NO：4

[0143] >TEF1p-PAaraA-CYC1t

[0144] cagcgacatggaggcccagaataccctccttgacagtcttgacgtgcgcagctcaggggcatgatgtgactgtcgcccgtacatttagccca tacatccccatgtataatcatttgcatccatacattttgatggccgcacggcgcgaagcaaaaattacggctcctcgctgcggacctgcgagcagggaa acgctcccctcacagacgcgttgaattgtccccacgccgcgcccctgtagagaaatataaaaggttaggatttgccactgaggttcttctttcatatactt ccttttaaaatcttgctaggatacagttctcacatcacatccgaacataaacaaccgATGAAAAAAATGCAAGATTATGAATTTT GGTTTATTACAGGTAGTCAATTCCTATATGGTGAAGAAACCCTTCGTTCAGTAGAAAAGGAC GCTCGCGAAATCGTTGATAAGTTAAATGAATCCAAGAACTTACCTTATCCAGTTAAATTCAA GTTGGTAGCAACTACTGCTGAAAACATCACTCAAGTAATGAAGGATGCTAACTATAACGACA AAGTTGCCGGGGTAATTACCTGGATGCACACCTTCTCACCAGCTAAAAACTGGATCCGCGGT ACTAAGTTATTGCAAAAACCATTGCTTCACTTAGCAACCCAATTCTTGAACCACATTCCATAT GACACCATTGATTTTGACTACATGAACTTAAATCAATCTGCCCATGGTGACCGTGAATATGCA TTTATTAATGCACGCTTGCGTAAGAACAACAAGATCATCACTGGTTACTGGGGTGATGAAGA CATTCAAAAACAAATCGCTAAATGGATGGACGCAGCCGTTGGCTACAATGAATCATTTGGTA TCAAGGTAGTAACCTTTGCTGACAAGATGCGTAACGTAGCGGTTACTGACGGTGACAAGAT TGAAGCGCAAATTAAATTTGGCTGGACCGTCGATTACTGGGGAGTTGCGGACTTAGTTGAA GAAGTTAACGCCGTTGCTGAAGACGACATCAACAATAAGTACGAAGAAATGAAGAAGGAAT ACAACTTCGTTGAAGGAGAAAATTCTTCAGAAAAATTCGAACACAATACTAAGTACCAAAT TCGTGAATACTTTGCATTGAAGAAATTCATGGACGATCGCGGATACACCGCATTCACAACTA ACTTTGAAGACTTAGCTGGTTTGGAACAACTTCCAGGATTGGCTGTTCAAATGTTGATGGCT GAAGGCTATGGCTTCGCTGGTGAAGGGGACTGGAAGACCGCTGCTTTGGATCGCTTAATGA AGATCATTGCGCATAACCAACACACTGCCTTCATGGAAGATTACACCCTTGACCTTCGTAAG GGACACGAAGCAATCCTTGGCTCACACATGCTAGAAGTTGACCCAACGTTAGCTAGTGACA CGCCACGGGTCGAAGTTCACCCGCTTGACATTGGTGGCAAGGATGACCCTGCACGCTTTGT CTTCACTGGTATGGAAGGCGACGCGGTTGACGTTACGATGGCTGACTACGGTGATGAATTCA AGCTCATGTCTTACGATGTTCAAGGCAACAAGCCTGAAAAAGAAACACCACATCTTCCAGT TGCTAAACAACTCTGGACTCCAAAACAAGGTTGGAAGAAGGGTGCTGAAGGCTGGCTCAC ACTTGGTGGTGGCCATCATACCGTACTTTCCTTCAACGTGGATGCTGAACAATTACAAGACC TCAGCAACATGTTTGGATTGACATACGTTAACATCAAATAGctcatgtaattagttatgtcacgcttacattcacgcc ctccccccacatccgctctaaccgaaaaggaaggagttagacaacctgaagtctaggtccctatttatttttttatagttatgttagtattaagaacgttattt atatttcaaatttttcttttttttctgtacagacgcgtgtacgcatgtaacattatactgaaaaccttgcttgagaaggttttgggacg

[0145] SEQ ID NO：5

[0146] >GPM1p-LParaB-FBA1t

[0147] CACATGCAGTGATGCACGCGCGATGGTGCTAAGTTACATATATATATATATATAGCCATA GTGATGTCTAAGTAACCTTTATGGTATATTTCTTAATGTGGAAAGATACTAGCGCGCGCACCC ACACACAAGCTTCGTCTTTTCTTGAAGAAAAGAGGAAGCTCGCTAAATGGGATTCCACTTT CCGTTCCCTGCCAGCTGATGGAAAAAGGTTAGTGGAACGATGAAGAATAAAAAGAGAGATC CACTGAGGTGAAATTTCAGCTGACAGCGAGTTTCATGATCGTGATGAACAATGGTAACGAG TTGTGGCTGTTGCCAGGGAGGGTGGTTTTCAACTTTTAATGTATGGCCAAATCGCTACTTGG GTTTGTTATATAACAAAGAAGAAATAATGAACTGATTCTCTTCCTCCTTCTTGTCCTTTCTTAA TTCTGTTGTAATTACCTTCCTTTGTAATTTTTTTTGTAATTATTCTTCTTAATAATCCAAACAAA CACACATATTACAATAGATGAATTTAGTTGAAACAGCCCAAGCGATTAAAACTGGCAAAGTT TCTTTAGGAATTGAGCTTGGCTCAACTCGAATTAAAGCCGTTTTGATCACGGACGATTTTAAT ACGATTGCTTCGGGAAGTTACGTTTGGGAAAACCAATTTGTTGATGGTACTTGGACTTACGC ACTTGAAGATGTCTGGACCGGAATTCAACAAAGTTATACGCAATTAGCAGCAGATGTCCGCA GTAAATATCACATGAGTTTGAAGCATATCAATGCTATTGGCATTAGTGCCATGATGCACGGAT ACCTAGCATTTGATCAACAAGCGAAATTATTAGTTCCGTTTCGGACTTGGCGTAATAACATTA CGGGGCAAGCAGCAGATGAATTGACCGAATTATTTGATTTCAACATGCCACAACGGTGGAGT ATCGCGCACTTATACCAGGCAATCTTAAATAATGAAGCGCACGTTAAACAGGTGGACTTCAT AACAACGCTGGCTGGCTATGTAACCTGGAAATTGTCGGGTGAGAAAGTTCTAGGAATCGGT GATGCGTCTGGCGTTTTCCCAATTGATGAAACGACTGACACATACAATCAGACGATGTTAAC CAAGTTTAGCCAACTTGACAAAGTTAAACCGTATTCATGGGATATCCGGCATATTTTACCGCG GGTTTTACCAGCGGGAGCCATTGCTGGAAAGTTAACGGCTGCCGGGGCGAGCTTACTTGAT CAGAGCGGCACGCTCGACGCTGGCAGTGTTATTGCACCGCCAGAAGGGGATGCTGGAACA GGAATGGTCGGTACGAACAGCGTCCGTAAACGCACGGGTAACATCTCGGTGGGAACCTCAG CATTTTCGATGAACGTTCTAGATAAACCATTGTCTAAAGTCTATCGCGATATTGATATTGTTAT GACGCCAGATGGGTCACCAGTTGCAATGGTGCATGTTAATAATTGTTCATCAGATATTAATGC GTGGGCAACGATTTTTCGTGAGTTTGCAGCCCGGTTGGGAATGGAATTGAAACCGGATCGA TTATATGAAACGTTATTCTTGGAATCAACTCGCGCTGATGCGGATGCTGGAGGGTTGGCTAAT TATAGTTATCAATCCGGTGAGAATATTACTAAGATTCAAGCTGGTCGGCCGCTATTTGTACGG ACACCAAACAGTAAATTTAGTTTACCGAACTTTATGTTGACCCAATTATATGCGGCGTTCGCA CCCCTCCAACTTGGTATGGATATTCTTGTTAACGAAGAACATGTTCAAACGGACGTTATGATT GCACAGGGTGGATTGTTCCGAACGCCGGTAATTGGCCAACAAGTATTGGCCAACGCACTGA ACATTCCGATTACTGTAATGAGTACTGCTGGTGAAGGCGGCCCATGGGGGATGGCAGTGTTA GCCAACTTTGCTTGTCGGCAAACTGCAATGAACCTAGAAGATTTCTTAGATCAAGAAGTCTT TAAAGAGCCAGAAAGTATGACGTTGAGTCCAGAACCGGAACGGGTGGCCGGATATCGTGAA TTTATTCAACGTTATCAAGCTGGCTTACCAGTTGAAGCAGCGGCTGGGCAAGCAATCAAATA TTAGCgttaattcaaattaattgatatagttttttaatgagtattgaatctgtttagaaataatggaatattatttttatttatttatttatattattggtcggctcttt tcttctgaaggtcaatgacaaaatgatatgaaggaaataatgatttctaaaattttacaacgtaagatatttttacaaaagcctagctcatcttttgtcatgcac tattttactcacgcttgaaattaacggccagtccactgcggagtcatttcaaagtcatcctaatcgatctatcgtttttgatagc

[0148] SEQ ID NO：6

[0149] >ENO2p-LParaD-SLM5t

[0150] ACGCGGCGTTATGTCACTAACGACGTGCACCATTTTTGCGGAAAGTGGAATCCCGTTC CAAAACTGGCATCCACTAATTGATACATCTACACACCGCACGCCTTTTTTCTGAAGCCCACT TTCGTGGACTTTGCCATATGCAAAATTCATGAAGTGTGATACCAAGTCAGCATACACCTCACT AGGGTAGTTTCTTTGGTTGTATTGATCATTTGGTTCATCGTGGTTCATTAATTTTTTTTCTCCAT TGCTTTCTGGCTTTGATCTTACTATCATTTGGATTTTTGTCGAAGGTTGTAGAATTGTATGTGA CAAGTGGCACCAAGCATATATAAAAAAAAAAAAGCATTATCTTCCTACCAGAGTTAATTGTT AAAAACGTATTTATAGCAAACGCAATTGTAATTAATTCTTATTTTGTATCTTTTCTTCCCTTGT CTCAATCTTTTATTTTTATTTTATTTTTCTTTTCTTAGTTTCTTTCATAACACCAAGCAACTAAT ACTATAACATACAATAATAGATGCTAGAAGCATTAAAACAAGAAGTTTATGAGGCTAACATGC AGCTTCCGAAGCTGGGCCTGGTTACTTTTACCTGGGGCAATGTCTCGGGCATTGACCGGGA AAAAGGCCTATTCGTGATCAAGCCATCTGGTGTTGATTATGGTGAATTAAAACCAAGCGATTT AGTCGTTGTTAACTTACAGGGTGAAGTGGTTGAAGGTAAACTAAATCCGTCTAGTGATACGC CGACTCATACGGTGTTATATAACGCTTTTCCTAATATTGGCGGAATTGTCCATACTCATTCGCC ATGGGCAGTTGCCTATGCAGCTGCTCAAATGGATGTGCCAGCTATGAACACGACCCATGCTG ATACGTTCTATGGTGACGTGCCGGCCGCGGATGCGCTGACTAAGGAAGAAATTGAAGCAGA TTATGAAGGCAACACGGGTAAAACCATTGTGAAGACGTTCCAAGAACGGGGCCTCGATTAT GAAGCTGTACCAGCCTCATTAGTCAGCCAGCACGGCCCATTTGCTTGGGGACCAACGCCAG CTAAAGCCGTTTACAATGCTAAAGTGTTGGAAGTGGTTGCCGAAGAAGATTATCATACTGCG CAATTGACCCGTGCAAGTAGCGAATTACCACAATATTTATTAGATAAGCATTATTTACGTAAG CATGGTGCAAGTGCCTATTATGGTCAAAATAATGCGCATTCTAAGGATCATGCAGTTCGCAAG TAGCTATTCCATTTGTTTCTTATCTCCTTCTATGTATTTACTCACTGTTCACCATTCTTCCCCCC TTAAAAGTAAGCTTTATTTAAGACCATCCTTGTAAATATAATAATGTAGCATTTTTCTTCAATAT GAAGGTACTAAACTCCATTTGGCATTCGGCCTGATCTATGTTAATTGACAAAGAATGACACAT TCCGCTCATTGGAAATCTCGGATACGAAAATGCCAAAACAAAATATAACAAAAAGTATCTAT CATTAGTAAAAAATACTATAATGGTCCTTATCCACAGAGCTTGAATTTAGATCACCTAAAGGA ATGCTAGCCAAGGAACTAGGAAGTGGTAAGCATATAAACACACGAATATAAAAGATATGGCG CGTCAAAAGCTTACTTTCAAA。

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