纤维素内切酶基因及其蛋白和应用
阅读：494发布：2020-05-24
专利汇可以提供纤维素内切酶基因及其蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 纤维 素内切酶基因，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所编码的蛋白如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供了一种可以高效表达且纯化该重组蛋白的方法，纯化后的蛋白纯度高达95％，且具有 水 解 纤维素 产生 葡萄糖 的酶活性，这对于 生物 燃料 乙醇 的生产、食品、 饲料 等行业有重要的工业价值。，下面是纤维素内切酶基因及其蛋白和应用专利的具体信息内容。
1.纤维素内切酶基因，其特征在于，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：
1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；
2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因编码得到的纤维素内切酶。
3.根据权利要求2所述的纤维素内切酶，其特征在于：所述纤维素内切酶为如下(1)或(2)的蛋白：
(1)蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；
(2)序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有纤维素内切酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白质。
4.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，由空载体和插入该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。
6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pET28载体。
7.一种权利要求2或3所述的纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求1所述的基因重组到构建到pET28载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；
2)将步骤1)表达株在LB液体培养基中培养，并加入0.1～0.5mM的IPTG诱导，发酵完毕，超声破碎，离心取上清，得可溶性重组的纤维素内切酶。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用DEAE层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含20mM Na2HPO4，20～30mM NaCl，pH7.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mMNaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0缓冲液溶液将蛋白洗脱下来即可。
9.根据权利要求7或8所述制备方法得到的蛋白。
10.权利要求1所述基因、权利要求2、3或9所述蛋白、权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在生物燃料乙醇的生产、食品、饲养和/或印染领域中的应用。
纤维素内切酶基因及其蛋白和应用
技术领域
背景技术
[0002] 纤维素是由葡萄糖以β-1，4糖苷键构成的多糖，是构成植物细胞壁的重要组分，也是目前地球上含量最丰富的可再生性资源。目前，纤维素的利用率还非常低，如何提高纤维素的利用率仍是一个世界级的课题。纤维素的高效利用离不开降解纤维素相关的酶类。纤维素酶属于糖苷水解酶类，是专门催化水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的一类酶的总称，是一种高活性生物催化剂，能够分解纤维素产生葡萄糖。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。纤维素酶复合体是一种超分子结构的多酶蛋白复合体，由多个亚基构成。非复合体纤维素酶由内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡聚糖苷酶组成。非复合体纤维素酶主要由好氧的丝状真菌产生，它们是分解纤维素的最重要的酶源。
[0003] 随着石油和煤炭资源的日渐枯竭，如何更为有效地转化和利用纤维素这一自然界分布最广、最丰富也最廉价的可再生性有机资源和多糖物质，是我国关注的重要研究领域。所以利用纤维素酶降解纤维素，使其转化成燃料、食物和化学制品，如糖，乙醇，饲料蛋白等，对缓解能源危机，食品和饲料资源紧张有重大的经济意义，纤维素酶将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等领域中发挥重要作用。目前虽然发现产纤维素酶的生物群种很多，如细菌、真菌、放线菌及昆虫、软体动物等，但是随着纤维素酶在工、农、畜和医等领域都有广泛的需求，其需求量正日益增大，纤维素酶制剂供不应求，前景十分广阔。而我国的纤维素酶工业制备还处于研究开发阶段，纤维素酶的生产还存在纤维素酶活力较低，生产成本较高，生产周期较长等问题使得纤维素酶的应用受到限制，因此，需要克服纤维素酶大量生产的瓶颈。深入研究纤维素酶的作用机制，加强对纤维素酶的分子生物学研究，特别要充分利用DNA基因重组技术的应用，生产具有高酶活的重组蛋白。纤维素酶系包含内切酶、外切酶和糖苷转移酶3种酶。其中，纤维素内切酶对纤维素的分解起重要作用。目前市售纤维素酶都是各种酶的混合物，很少有利用基因工程手段获得大最高纯度和高活性的纤维素内切酶的相关产品和技术。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种纤维素内切酶基因，以及这种基因所编码的蛋白，本发明还提供一种构建含有SEQ ID NO.1基因序列的重组载体，更提供一种高效表达且纯化该重组蛋白的方法。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 1.纤维素内切酶编码基因，所述基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片段：
[0008] 2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
[0009] 3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
[0010] 进一步，与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交条件为：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；
[0011] 还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；
[0012] 还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；
[0013] 还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；
[0014] 还可以杂交条件为50℃，在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；
[0015] 还可以杂交条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。
[0016] 2.其中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列由651个脱氧核苷酸组成，本序列为纤维素内切酶(EG)的全长cDNA读码框，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白，包含217个氨基酸残基。
[0017] 1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；
[0018] 2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
[0019] 或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有95％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
[0020] 或与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有98％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列；
[0021] 3)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列杂交且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。
[0022] 以上三种任一种基因编码得到的纤维素内切酶属于本发明的保护范围。
[0023] 3.含有SEQ ID NO.1基因序列的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
[0025] 进一步，所述空载体为pET 28载体。
[0026] 4.一种纤维素内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0027] 1)将技术方案1所述的基因重组到构建到pET 28载体中；再转化到大肠杆菌菌株中，得到表达株；
[0029] 进一步，步骤2)中IPTG加入量为0.2mM。
[0030] 进一步，还包括蛋白纯化步骤：用DEAE层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含20mM Na2HPO4，20～30mM NaCl，pH7.0缓冲液预洗柱子，然后用含100mM～200mMNaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0缓冲液溶液将蛋白洗脱下来即可。
[0031] 根据上述的制备蛋白的方法制备得到的纯化后的蛋白也属于本发明的保护范围。
[0033] 本发明的有益效果在于：本发明将提供一种新的经人工改造的纤维素内切酶基因，且该基因构建到pET28载体后再连接大肠杆菌表达菌株，实现了具有纤维素内切酶活性的表达产物的可溶性表达和高效表达；同时还提供了一种简单有效纯化活性重组纤维素内切酶的方法，使纯化后的蛋白纯度高达95％，这为纤维素酶制剂的制备提供了一种简单高效的生产制备方法，为该酶在工、农、畜和医等领域的广泛应用奠定技术基础。
[0035] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0036] 图1为本发明实施例中的pET28/EG载体构建示意图。
[0037] 图2为本发明实施例中的pET28/EG重组载体表达目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。
[0038] 图3为本发明实施例中的重组纤维素内切酶经DEAE层析柱纯化的洗脱曲线。
[0039] 图4为本发明实施例中的纯化后重组纤维素内切酶的SDS-PAGE检测结果图。
[0040] 图5为对比例中表达目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。
[0041] 图6为本发明实施例中酶活检测的HPLC结果图。
具体实施方式
[0042] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。
[0043] 本发明选用大肠杆菌表达菌、载体扩增菌株TOP10和表达载体pET28均购自美国Invritrogen公司。
[0044] 所用培养基配方如下：
[0045] 1)LB液体培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存；
[0046] 2)LB/Kan平板：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，琼脂粉15g，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mL浓度为100mg/ml的卡那霉素(Kan)，充分混均后倒板，4℃避光保存；
[0047] 3)LB/Kan培养基：NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌后，冷却至70℃以下，加入1mLKan(100mg/ml)，充分混均，4℃保存；LB液体培养基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸馏水1L，高压灭菌，室温保存。
[0049] 5)50mg/mL卡那霉素保存液：卡那霉素0.5g，加蒸馏水溶解并定容至10mL，分装后于-20℃保存；
[0050] 6)5×SDS-PAGE上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)1.25mL，SDS 0.5g，BPB 25mg，甘油2.5mL，加去离子水溶解后定容至5mL，分装(约500μL每份)后于室温保存，使用每份加入25μLβ-巯基乙醇混匀；
[0051] 7)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5.0g，加入约800mL去离子水，充分搅拌溶解后定容至1L，室温保存；
[0053] 9)考马斯亮蓝脱色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去离子水300mL，充分混合后，室温保存。
[0054] 实施例1
[0055] 本实施例提供了一种优化的人工化学合成的纤维素内切酶基因(EG)，具体序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示。合成的序列在NCBI数据库中无相似度达30％的序列，它是根据大肠杆菌表达的特点，优化并合成的一种DNA。
[0056] 将上述优化后的基因连接到大肠杆菌表达载体pET28中并获得重组载体，以上经测序验证的重组载体热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子，其中pET28/EG载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的pET28/EG载体构建示意图。
[0057] 利用经优化的天然纤维素内切酶基因序列的pET28重组载体为表达载体，其对应的表达菌转化子经0.1-0.5mM的IPTG在18℃下诱导均检测到目标蛋白的表达，其菌体总蛋白SDS-PAGE结果如图2所示，重组纤维素内切酶分子量为27kDa左右，表达的目标蛋白如箭头所示。
[0058] 实施例2
[0059] 本实施例提供一种制备蛋白的方法，具体包括如下步骤：
[0060] S1：优化基因、构建原核表达载体及转化：人工化学合成经优化的成熟纤维素内切酶基因连接至pUC通用载体得到pUC/EG，利用BamHI和HindIII双酶切pUC/EG，将得到的EG片段再亚克隆至表达载体pET28中，得到重组表达载体pET28/EG，载体构建如图1所示。pET28/EG载体构建的主要步骤如下:
[0061] (1)用BamH I和Hind III双酶切重组载体pUC/EG，获得目的片断EG，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：
[0062]
[0063] (2)用BamH I和Hind III双酶切pET28，获得载体片断，反应体系如下(所用内切酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：
[0064]
[0066] (4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确插入到表达载体读码框内，反应体系如下：
[0067]
[0068] 将重组载体pET28/EG转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET28/EG；用热激法将重组载体pET28/EG转入到宿主细胞大肠杆菌表达菌株中，用含有Kan抗性的LB平板筛选得到包含有重组载体pET28/EG的大肠杆菌表达菌株转化子。
[0069] S2：可溶性重组纤维素内切酶的表达与提取：将包含优化后人工合成基因的pET28/EG载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.4，然后分别加入浓度为0mM、0.1mM、0.2mM和0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，得到重组纤维素内切酶，SDS-PAGE结果如图2所示。
[0070] S3：重组纤维素内切酶的纯化：经扩大培养和在18℃下用0.1mM IPTG诱导20-24小时，收集经IPTG诱导表达后的表达菌的菌体，将菌体重悬于50ml的缓冲液A(含20mM Na2HPO4和1mM蛋白酶抑制剂PMSF，pH 7.0)中，然后用超声破碎仪进行破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次；将破碎后的菌液在4℃下，30000g离心15min；将离心所得到的上清液加入到经缓冲液A预平衡的DEAE层析柱中；用100ml缓冲液B(含20mM Na2HPO4，20～30mMNaCl，pH7.0)漂洗蛋白纯化柱子后，加入NaCl为100～200mM的缓冲液C(含20mM Na2HPO4，pH 7.0)，将蛋白洗脱下来，洗脱曲线如图3所示，收集图中目标箭头峰的蛋白样品，利用SDS-PAGE对样品蛋白进行SDS－PAGE分析具体结果如图4所示，100～200mMNaCl洗脱的蛋白是纯度在95％以上的重组纤维素内切酶。
[0071] S4：重组纤维素内切酶的浓缩：将蛋白质样品在pH4.0的20mM NaH2PO4和柠檬酸缓冲液下透析，透析结束后，利用截留分子量为15kDa的超滤管进行超滤浓缩即可得到纯度在95％以上的高浓度重组纤维素内切酶。利用胶扫描并结合Bradford法对目标蛋白的浓度进行了检测，表1是100ml经IPTG诱导的菌体中可溶性纤维素内切酶重组蛋白经各纯化步骤的得率与纯度结果。
[0072] 表1蛋白纯化结果
[0073]
[0074] 需要说明的是，在步骤S2得到的上清液中加入SDS-PAGE样品缓冲液，对其可溶蛋白进行分析。在18℃温度下IPTG的浓度为0.1、0.2和0.5mM时，都可以得到可溶性重组纤维素内切酶。但从图2分析可知，本发明优选采用诱导温度18℃，0.2mM的IPTG进行诱导表达。
[0075] 对比例
[0076] 茯苓的形成是由茯苓菌丝体在适宜的条件下寄生于已死松木上，不断分解松木中的营养，并将菌化后的多余物质积聚迅速膨大，形成的营养贮藏器官和休眠器官即为菌核，俗称松茯苓。木材的主要成分是纤维素。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的分泌型纤维素酶。发明人利用转录组技术对茯苓的纤维素酶分解酶的表达谱进行分析发现了该高丰度的纤维素分解的酶基因。利用茯苓转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因序列如SEQ ID NO.3所示，将该茯苓重组纤维素内切酶基因用BamH I和Hind III双酶切，并连接到同样经BamH I和Hind III双酶切的pET28表达载体。重组载体经热激转化到大肠杆菌表达菌株的感受态细胞，涂布对应的抗性LB平板，37℃恒温培养箱中培养12小时，筛选转化子。将包含优化前基因的pET28/EG载体的大肠杆菌重组转化子在37℃的液体LB培养基中培养至OD600为0.4，然后分别加入浓度为0、0.1、0.2、0.5mM的IPTG，在18℃诱导24小时，诱导后收集的菌体超声破碎，破碎功率300W，破碎2s，间隙6s，循环90次后，离心取上清液，未得到可溶性重组纤维素内切酶，SDS-PAGE结果如图5所示。该对比例结果说明，只有本发明人工优化后的茯苓重组纤维素内切酶基因才能在大肠杆菌中实现可溶性的表达。
[0077] 实施例3
[0078] 本发明利用高效液相色谱检测羧甲基纤维素钠(CMC-Na)被内切酶水解产生少量葡萄糖的能力来确定酶活。具体方法如下：将纯化的重组纤维素内切酶300μg加到pH4的含1％的CMC-Na溶液中，40℃下反应4小时；反应结束后，将样品用0.22μm微孔滤膜过滤至样品瓶，供液相色谱分析。液相的方法如下：色谱柱：Aglient氨基柱，250×4.6mm，5μm；流动相：
乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。HPLC结果如图6所示，其中上图为CMC-Na在不加该重组纤维素内切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，下图为CMC-Na加入本发明制备的纤维素内切酶反应4小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为5.576分钟，葡萄糖浓度约为21ng/μL，说明该内切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。
乙腈：水＝70：30(体积比)，流速：1.0mL/min，进样量：10uL，柱温：35℃，检测器：示差折光检测器。HPLC结果如图6所示，其中上图为CMC-Na在不加该重组纤维素内切酶的情况下未检测到葡萄糖峰，下图为CMC-Na加入本发明制备的纤维素内切酶反应4小时后，检测到了明显的葡萄糖峰，该峰的保留时间为5.576分钟，葡萄糖浓度约为21ng/μL，说明该内切酶的确具有水解纤维素产生葡萄糖的能力。
[0079] 因此，根据以上结果，根据本发明所提供的如SEQ ID NO.1所示的基因序列构建的重组载体，进一步所表达出的新的纤维素内切酶是一种能分解羧甲基纤维素钠产生葡萄糖的新颖重组纤维素内切酶。
[0080] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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