技术领域
[0001] 本
发明涉及一种促进BG-11培养基中微藻生长和油脂积累的方法，属于利用微藻生产
生物柴油技术领域。
背景技术
[0002] 生物柴油作为化石
能源的替代者，具有诸多的优势。近年来，越来越多的人们开始关注利用微藻制备生物柴油这一领域。然而，在利用微藻制备生物柴油的过程中，由于微藻的培养成本高、生物量产率和油脂产率较低，限制了其工业化的发展
进程。利用废弃物同时联合二
氧化
碳对微藻进行培养，是降低微藻培养成本、提高生物量产率和油脂产率的一种有效的方法。例如，在生活污
水中通入2.5%的二氧化碳，栅藻Scenedsumis sp.的生物量达到1.37 g/L，油脂含量为细胞干重的33.3%，分别是对照组高1.54倍和1.44倍。同时，藻类吸收的二氧化碳经光合作用合成碳水化合物、脂类和
蛋白质等物质，有利于藻类生长。然而单一的利用废弃物进行微藻的培养，生物量较低，且培养周期较长，不利于降低培养成本。
[0003] 核桃具有较高的营养价值，是一种广受欢迎的
植物，在我国很多地区被广泛种植。然而，在核桃产品加工过程中，核桃壳作为一种固体废弃物被大量产生。不可否认的是，核桃壳中含有丰富的
营养元素。对核桃壳传统的处理方式发是用于
活性炭或填充柱的制备，但通常情况下，这种固体废气物被直接燃烧，不仅造成了资源的浪费，同时产生大量的
温室气体，造成环境污染。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种促进BG-11培养基中微藻生长和油脂积累的方法，该方法操作简单易行，可以降低温室气体的产生，提高微藻的生物量产率和油脂产率，具体包括以下步骤：（1）培养基的制备：分别制备核桃壳提取液培养基和BG-11培养基；对核桃壳提取液培养基，用NaOH溶液调节pH值至6.8-7.0之间，对BG-11培养基，用HCl溶液调节pH值至6.8-7.0之间；将两种培养基单独灭菌后混合于反应器中，使混合后的培养基中核桃壳提取物浓度为20 g/L 50g/L；
~
（2）微藻的培养：将产油微藻接入上述配置好的培养基中，通入CO2-空气混合气体，进行光照培养。
[0005] （3）微藻中油脂的提取：将微藻培养至稳定期后期，离心富集，利用
有机溶剂提取微藻中的油脂。
[0006] 优选的，本发明所述微藻为单针藻菌株Monoraphidiumsp. QLZ-3。
[0007] 优选的，本发明所述核桃壳提取液的制备方法：添加核桃壳
质量9.5-10.5倍的水，在93-95℃条件下保温240-260min，用NaOH溶液调节pH值6.8-7.0之间。
[0008] 优选的，本发明步骤（1）中灭菌条件为121℃灭菌20 min。
[0009] 优选的，本发明步骤（2）中微藻的初始接种量为0.4 g/L，光照强度为6500-7000 lux，通入CO2-空气混合气体中CO2的含量为12%，培养
温度为25±1 ℃。
[0010] 优选的，本发明所述步骤（3）中，油脂的提取方法具体为：将培养至稳定期的微藻，3500 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤2次，-80 ℃冻干，混合2倍质量的
石英砂
研磨，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取藻细胞内的油脂，重复提取3次，合并提取液，40℃下烘干称重。
[0011] 本发明的有益效果是：（1）本发明所述方法联合核桃壳提取液和BG-11，同时通入CO2对微藻进行培养，有效利用了资源，提高了微藻的生物量产率和油脂产率，对核桃壳进行了环境友好的利用，有利于降低温室气体的产生，保护环境。
[0012] （2）本发明与单独利用BG-11培养基的相比，到达稳定期后，当混合培养基中核桃壳提取液的浓度为40 g/L时，油脂含量最高，达到细胞干重的55.42%，其生物量产率和油脂产率分别为296.40和534.70 mg/(L·d)。
[0013] （3）本发明所述方法向传统的BG-11培养基中只添加一些核桃壳提取液，促进了微藻生物量和油脂的积累，不但解决了核桃壳直接燃烧引起的环境问题，而且将废弃物进行资源化的利用；微藻在添加核桃壳提取液的混合培养基中生长，增加了生物量和油脂含量，可能存在的作用机制是核桃壳提取液中的多酚促进了微藻对混合气体中CO2的吸收，从而提高了微藻的生物量产率和油脂产率。
附图说明
[0014] 图1为对比实例与
实施例1 4中微藻的生物量情况。~
[0015] 图2为对比实例与实施例1 4中微藻的油脂含量、生物量产率和油脂产率情况。~
具体实施方式
[0016] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
[0017] 本发明实施例中所述微藻为单针藻菌株Monoraphidiumsp.QLZ-3对比实例
以BG-11培养基作为产油微藻培养的
基础培养基，用HCl溶液调节pH值在6.8-7.0之间，
121 ℃灭菌20 min，接入产油微藻，初始接种量为0.4 g/L，培养温度为25±1 ℃，光照强度为6500 lux，进行光照摇瓶培养。
[0018] 结果表明，BG-11培养基中微藻的生物量和油脂含量分别为3.26 g/L和47.66%，生物量产率和油脂产率分别为465.69和222.02 mg/(L·d)。
[0019] 实施例1（1）培养基的制备：先制备BG-11培养基，用HCl溶液调节pH值在6.8-7.0之间，121℃灭菌20 min；添加核桃壳质量9.5倍的水，在95℃条件下保温240min，用NaOH溶液调节pH值
6.8-7.0之间，得到核桃壳提取物浓度为100 g/L的核桃壳提取液，分装、121℃灭菌20 min；
将核桃壳提取液与BG-11混合于反应器中，与BG-11混合后培养基中核桃壳提取物的浓度为
20g/L。
[0020] （2）微藻的培养：将产油微藻接入上述配置好的培养基中，通入CO2-空气混合气体，进行光照培养，初始接种量为0.4 g/L，光照强度为6500 lux，通入CO2-空气混合气体中CO2的含量为12%，培养温度为25±1℃。
[0021] （3）微藻中油脂的提取：将微藻培养至稳定期后期，3500 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤2次，-80 ℃冻干，混合2倍质量的石英砂研磨，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取藻细胞内的油脂，重复提取3次，合并提取液，40℃下烘干称重。
[0022] 结果表明，当BG-11培养基中含有核桃壳提取液的浓度为20 g/L时，微藻的生物量和油脂含量分别为3.51 g/L和54.24 %，生物量产率和油脂产率分别为500.91和272.05 mg/(L·d)。
[0023] 实施例2（1）培养基的制备：先制备BG-11培养基，用HCl调节pH值在6.8-7.0之间，121 ℃灭菌20 min。添加核桃壳质量9.5倍的水，在95℃条件下保温240min，用NaOH溶液调节pH值6.8-7.0之间，得到核桃壳提取物浓度为100 g/L的核桃壳提取液，分装、121℃灭菌20 min。将核桃壳提取液与BG-11混合于反应器中，与BG-11混合后培养基中核桃壳提取物的浓度为30g/L。
[0024] （2）微藻的培养：将产油微藻接入上述配置好的培养基中，通入CO2-空气混合气体，进行光照培养，初始接种量为0.4 g/L，光照强度为6700lux，通入CO2-空气混合气体中CO2的含量为12%，培养温度为25±1℃。
[0025] （3）微藻中油脂的提取：将微藻培养至稳定期后期，3500 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤2次，-80 ℃冻干，混合2倍质量的石英砂研磨，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取藻细胞内的油脂，重复提取3次，合并提取液，40℃下烘干称重。
[0026] 结果表明，当BG-11培养基中含有核桃壳提取液的浓度为30 g/L时，微藻的生物量和油脂含量分别为3.64 g/L和54.07 %，生物量产率和油脂产率分别为519.60和281.20 mg/(L·d)。
[0027] 实施例3（1）培养基的制备：先制备BG-11培养基，用HCl溶液调节pH值在6.8-7.0之间，121 ℃灭菌20 min。添加核桃壳质量9.5倍的水，在95℃条件下保温240min，用NaOH溶液调节pH值
6.8-7.0之间，得到核桃壳提取物浓度为100 g/L的核桃壳提取液，分装、121℃灭菌20 min。
将核桃壳提取液与BG-11混合于反应器中，与BG-11混合后培养基中核桃壳提取物的浓度为
40g/L。
[0028] （2）微藻的培养：将产油微藻接入上述配置好的培养基中，通入CO2-空气混合气体，进行光照培养，初始接种量为0.4 g/L，光照强度为7000 lux，通入CO2-空气混合气体中CO2的含量为12%，培养温度为25±1℃。
[0029] （3）微藻中油脂的提取：将微藻培养至稳定期后期，3500 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤2次，-80 ℃冻干，混合2倍质量的石英砂研磨，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取藻细胞内的油脂，重复提取3次，合并提取液，40℃下烘干称重。
[0030] 结果表明，当BG-11培养基中含有核桃壳提取液的浓度为40 g/L时，微藻的生物量和油脂含量分别为3.74 g/L和55.42 %，生物量产率和油脂产率分别为534.70和296.40 mg/(L·d)。
[0031] 实施例4（1）培养基的制备：先制备BG-11培养基，用HCl溶液调节pH值在6.8-7.0之间，121 ℃灭菌20 min。添加核桃壳质量9.5倍的水，在95℃条件下保温240min，用NaOH溶液调节pH值
6.8-7.0之间，得到核桃壳提取物浓度为100 g/L的核桃壳提取液，分装、121℃灭菌20 min。
将核桃壳提取液与BG-11混合于反应器中，与BG-11混合后培养基中核桃壳提取物的浓度为
50g/L。
[0032] （2）微藻的培养：将产油微藻接入上述配置好的培养基中，通入CO2-空气混合气体，进行光照培养，初始接种量为0.4 g/L，光照强度为6500lux，通入CO2-空气混合气体中CO2的含量为12%，培养温度为25±1℃。
[0033] （3）微藻中油脂的提取：将微藻培养至稳定期后期，3500 r/min离心5 min，用蒸馏水洗涤2次，-80 ℃冻干，混合2倍质量的石英砂研磨，用氯仿/甲醇（2:1，v/v）提取藻细胞内的油脂，重复提取3次，合并提取液，40℃下烘干称重。
[0034] 结果表明，当BG-11培养基中含有核桃壳提取液的浓度为50 g/L时，微藻的生物量和油脂含量分别为3.09 g/L和50.68 %，生物量产率和油脂产率分别为441.25和223.65 mg/(L·d)。
[0035] 对比实例和实施例1-4中微藻的生物量、油脂含量、生物量产率和油脂产率如图1~2所示。
[0036] 结果表明：本发明与BG-11对照组相比，添加核桃壳提取液可提高微藻生物量和油脂含量；核桃壳提取液中的多酚作为一种抗
氧化剂，可以阻碍自由基进入脂质分子，从而减少由于脂质氧化引起的细胞损伤；同时，多酚可能会通过调节藻细胞内抗
氧化酶的活性，促进微藻的生长和油脂的积累；当BG-11培养基中核桃壳提取液浓度为40 g/L时，微藻的油脂含量高达55.42 %，比对照组提高了16.28 %；生物量（3.74 g/L）较对照组（3.26 g/L）提高了14.72 %；生物量产率和油脂产率分别为534.70和296.40 mg/(L·d)，是对照组的1.15和1.34倍。
