技术领域
[0001] 本
发明涉及生物
发酵技术领域，尤其涉及一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 诺卡氏菌病是以鱼类形成全身肉芽肿和体表溃烂为主要症状的慢性
疾病，近些年在养殖的
海水鱼和部分
淡水鲈形目鱼类中发病率很高，若处理不当会造成巨大经济损失。
[0003] 诺卡氏菌病与池塘水质环境有密切关系，养殖
密度大，
氨氮、亚
硝酸盐高，溶解
氧不足则容易发生此病。现阶段强
力霉素和氟苯尼考对诺卡氏菌的抑杀作用相对较好，但由于诺卡氏菌损伤免疫器官和药物难以渗透肉芽肿组织触杀病原菌等原因，
治疗仅在感染初期有良好的效果。如何做到
预防以避免诺卡氏菌的爆发，要比出现病症后使用药物来的更为重要。目前为止，通过改善
水体环境、增强水产动物体制是切实可行的方案。通过利用微生物制剂，使池塘底泥易腐烂的物质快速的降解，减少腐生菌扩增几率。通过
吸附作用降低氨氮，亚硝酸盐，使水质清爽，确保溶氧充足，从而改变诺卡氏菌的生长环境，降低爆发几率。
发明内容
[0004] 本发明的目的是针对
现有技术中的不足，提供一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂及其制备方法。
[0005] 本发明的第一个目的是，提供一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂，按重量百分比计，由以下组分构成：
[0006]
[0007]
[0008] 本发明的第二个目的是，提供一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂的制备方法，步骤包括：
[0009] 步骤S1、制备酪酸梭菌培养物；
[0010] 步骤S2、制备粪肠球菌及
植物乳杆菌复合发酵物；
[0011] 步骤S3、将所述步骤S1制备的所述酪酸梭菌培养物、所述步骤S2制备的所述粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物、枯草芽孢杆菌菌粉、
硅藻土和沸石粉按比例混合后，
挤压制粒，获得所述微生物制剂。
[0012] 优选地，在所述步骤S1中，包括以下步骤：
[0013] 步骤S11、按一定比例称取酪酸梭菌放入第一培养基进行第一培养，在第一培养条件下培养，待所述第一培养基浑浊后，得到第一
种子液；
[0014] 步骤S12、按一定比例称取所述步骤S11制备得到的所述第一种子液放入第二培养基中进行第二培养，在第二培养条件下培养，得到所述酪酸梭菌培养物。
[0015] 优选地，在所述步骤S11中，所述第一培养基为改良
牛肉膏蛋白胨液体培养基；
[0016] 所述第一培养条件包括：培养
温度为30-40℃，培养时间为24-40h。
[0017] 优选地，在所述步骤S12中，所述第二培养基为
磷酸缓冲液培养液；
[0018] 所述第二培养条件包括：培养温度30-40℃，培养时间为36-52h，每2h以40-60rpm的转速进行搅拌1-5min。
[0019] 优选地，在所述步骤S2中，包括以下步骤：
[0020] 步骤S21、按一定比例称取粪肠球菌放入第三培养基进行第三培养，在第三培养条件下培养，待所述第三培养基浑浊后，得到第二种子液，以及，按一定比例称取植物乳杆菌放入第四培养基进行第四培养，在第四培养条件下培养，待所述第四培养基浑浊后，得到第三种子液；
[0021] 步骤S22、按一定比例称取所述步骤S21制备的所述第二种子液和所述第三种子液，得到复合种子液；
[0022] 步骤S23、按一定比例称取所述步骤S22制备的所述复合种子液放入第五培养基中，并进行第五培养，在第五培养条件下培养，得到复合菌种；
[0023] 步骤S24、按一定比例称取所述步骤S23制备的所述复合菌种放入第六培养基中，并进行第六培养，在第六培养条件下培养，得到所述粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物。
[0024] 优选地，在所述步骤S21中，所述第三培养基为MRS液体培养基；
[0025] 所述第三培养条件包括：培养温度20-40℃，培养时间为64-80h；
[0026] 所述第四培养基为MRS液体培养基；
[0027] 所述第四培养条件包括：培养温度20-40℃，培养时间为64-80h。
[0028] 优选地，在所述步骤S22中，按重量百分比计，所述复合种子液由35-50％的所述第二种子液与50-65％的所述第三种子液构成。
[0029] 优选地，在所述步骤S23中，所述复合种子液与所述第五培养基的
质量比为1：(80-120)；
[0030] 按重量百分比计，所述第五培养基由以下原料构成：
[0031] 红糖 10-20％
[0033] 蒸馏水或超纯水 70-80％；
[0034] 所述第五培养条件包括：培养温度为28-32℃，培养时间为10-15天。
[0035] 优选地，在所述步骤S24中，所述复合菌种与所述第六培养基的质量比为1：(15-20)；
[0036] 按重量百分比计，所述第六培养基由以下原料构成：
[0037]
[0038] 所述第六培养条件包括：培养温度为28-32℃，培养时间为10-15天。
[0039] 本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0040] 本发明的一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂及其制备方法，通过酪酸梭菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌发酵并复配得到的微生物制剂，其含有较高含量枯草菌素、乳酸菌素、
有机酸等多种代谢产物，其中的微生物可以快速降解淤泥中易腐烂的残饵、动物尸体，回复
碳氮平衡；制剂中自带的枯草菌素及乳酸菌素可以抑制革兰氏阴性有害菌的繁殖；微生物制剂在代谢过程中会产生有机酸，其可以降低底部淤泥pH，远离诺卡氏菌的最适生长pH范围；修复养殖塘底生态链，从而抑制诺卡氏菌的爆发。
具体实施方式
[0041] 下面将结合本发明
实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0042] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
[0043] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
[0044] 实施例1
[0045] 本发明的一个示意性实施例，一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0046] 步骤S1、制备酪酸梭菌培养物；
[0047] 步骤S2、制备粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物；
[0048] 步骤S3、将步骤S1制备的酪酸梭菌培养物、步骤S2制备的粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物、枯草芽孢杆菌菌粉、
硅藻土和沸石粉按比例混合后，挤压制粒，获得微生物制剂；
[0049] 其中，按重量百分比计，微生物制剂中的各组分如下：
[0050]
[0051] 进一步地，在步骤S1中，包括：
[0052] 步骤S11、按一定比例称取酪酸梭菌放入第一培养基进行第一培养，在第一培养条件下培养，待第一培养基浑浊后，得到第一种子液；
[0053] 步骤S12、按一定比例称取步骤S11制备得到的第一种子液放入第二培养基中进行第二培养，在第二培养条件下培养，得到酪酸梭菌培养物。
[0054] 进一步地，第一培养基为改良牛肉膏蛋白胨液体培养基，第一培养条件包括：培养温度为30-40℃，培养时间为24-40h。
[0055] 进一步地，第二培养基为磷酸缓冲液培养液，第二培养条件包括：培养温度30-40℃，培养时间为36-52h，每2h以40-60rpm的转速进行搅拌1-5min。
[0056] 进一步地，在步骤S2中，包括以下步骤：
[0057] 步骤S21、按一定比例称取粪肠球菌放入第三培养基进行第三培养，在第三培养条件下培养，待第三培养基浑浊后，得到第二种子液，以及，按一定比例称取植物乳杆菌放入第四培养基进行第四培养，在第四培养条件下培养，待第四培养基浑浊后，得到第三种子液；
[0058] 步骤S22、按一定比例称取步骤S21制备的第二种子液和第三种子液，得到复合种子液；
[0059] 步骤S23、按一定比例称取步骤S22制备的复合种子液放入第五培养基中，并进行第五培养，在第五培养条件下培养，得到复合菌种；
[0060] 步骤S24、按一定比例称取步骤S23制备的复合菌种放入第六培养基中，并进行第六培养，在第六培养条件下培养，得到粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物。
[0061] 进一步地，在步骤S21中，第三培养基为MRS液体培养基，第三培养条件包括：培养温度20-40℃，培养时间为64-80h；
[0062] 第四培养基为MRS液体培养基，第四培养条件包括：培养温度20-40℃，培养时间为64-80h。
[0063] 进一步地，在步骤S22中，按重量百分比计，复合种子液由35-50％的第二种子液与50-65％的第三种子液构成。
[0064] 进一步地，在步骤S23中，复合种子液与第五培养基的质量比为1：(80-120)；
[0065] 按重量百分比计，第五培养基由以下原料构成：
[0066] 红糖 10-20％
[0067] 乳清粉 5-10％
[0068] 蒸馏水或超纯水 70-80％；
[0069] 第五培养条件包括：培养温度为28-32℃，培养时间为10-15天。
[0070] 进一步地，在步骤S24中，复合菌种与第六培养基的质量比为1：(15-20)；
[0071] 按重量百分比计，第六培养基由以下原料构成：
[0072]
[0073] 第六培养条件包括：培养温度为28-32℃，培养时间为10-15天。
[0074] 进一步地，在步骤S3中，枯草芽孢杆菌菌粉的制备方法为使用常规发酵方法对枯草芽孢杆菌进行发酵，然后依次进行离心、
喷雾干燥，即可获得枯草芽孢杆菌菌粉。
[0075] 本发明的优点在于，通过酪酸梭菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌发酵并复配得到的微生物制剂，其含有较高含量枯草菌素、乳酸菌素、有机酸等多种代谢产物，其中的微生物可以快速降解淤泥中易腐烂的残饵、动物尸体，回复碳氮平衡；制剂中自带的枯草菌素及乳酸菌素可以抑制革兰氏阴性有害菌的繁殖；微生物制剂在代谢过程中会产生有机酸，其可以降低底部淤泥pH，远离诺卡氏菌的最适生长pH范围；修复养殖塘底生态链，从而抑制诺卡氏菌的爆发。
[0076] 实施例2
[0077] 本实施例为本发明的一个具体实施例。
[0078] 一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂的制备方法，步骤包括：
[0079] 步骤S1、制备酪酸梭菌培养物
[0080] 步骤S11、按一定比例称取酪酸梭菌(Clostridium butyricum，CGMCC1.0209)放入改良牛肉膏蛋白胨液体培养基进行第一培养，培养温度34℃，静置培养32h，待改良牛肉膏蛋白胨液体培养基浑浊后，得到第一种子液；
[0081] 步骤S12、将第一种子液以5％的重量比放入装有磷酸缓冲液培养基的厌氧液体
发酵罐(发酵罐充满CO2气体)，培养温度34℃，厌氧培养44h，每2h以50rpm的转速对发酵罐内的培养液进行搅拌1min，待发酵液中形成梭状芽孢后，终止发酵，离心，获得半固体状的酪酸梭菌培养物。
[0082] 步骤S2、制备粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物
[0083] 步骤S21、按一定比例称取粪肠球菌(Enterococcus faecalis，ACCC10180)放入MRS液体培养基进行第三培养，培养温度30℃，培养时间72h，待MRS液体培养基浑浊后，得到第二种子液；
[0084] 按一定比例称取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC11118)放入MRS液体培养基进行第四培养，培养温度30℃，培养时间72h，，待MRS液体培养基浑浊后，得到第三种子液；
[0085] 步骤S22、以重量百分比计，称取步骤S21制备的35％第二种子液和65％第三种子液，得到复合种子液；
[0086] 步骤S23、按复合种子液与第五培养基的质量比为1：100称取步骤S22制备的复合种子液，并放入由10％红糖、10％乳清粉和80％蒸馏水构成的第五培养基中，并进行第五培养，培养温度30℃，密闭培养15天，得到复合菌种；
[0087] 步骤S24、按复合菌种与第六培养基的质量比为1：20称取步骤S23制备的复合菌种，并放入由米糠40％、
豆粕2％、
酒糟渣15％、麸皮3％、糖蜜5％、蒸馏水35％构成的第六培养基中，培养温度32℃，密闭培养15天，得到粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物。
[0088] 步骤S3、称取5％步骤S1制备的酪酸梭菌培养物、称取15％步骤S2制备的粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物、称取20％枯草芽孢杆菌菌粉(Bacillus subtilis，ACCC10619)、称取50％硅藻土和称取10％沸石粉进行混合后，挤压制粒，获得微生物制剂，微生物制剂以软颗粒的形式存在。
[0089] 实施例3
[0090] 本实施例为本发明的一个具体实施例。
[0091] 一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂的制备方法，步骤包括：
[0092] 步骤S1、制备酪酸梭菌培养物
[0093] 步骤S11、按一定比例称取酪酸梭菌(Clostridium butyricum，CGMCC1.0209)放入改良牛肉膏蛋白胨液体培养基进行第一培养，培养温度30℃，静置培养40h，待改良牛肉膏蛋白胨液体培养基浑浊后，得到第一种子液；
[0094] 步骤S12、将第一种子液以5％的重量比放入装有磷酸缓冲液培养基的厌氧液体发酵罐(发酵罐充满CO2气体)，培养温度30℃，厌氧培养52h，每2h以40rpm的转速对发酵罐内的培养液进行搅拌5min，待发酵液中形成梭状芽孢后，终止发酵，离心，获得半固体状的酪酸梭菌培养物。
[0095] 步骤S2、制备粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物
[0096] 步骤S21、按一定比例称取粪肠球菌(Enterococcus faecalis，ACCC10180)放入MRS液体培养基进行第三培养，培养温度28℃，培养时间80h，待MRS液体培养基浑浊后，得到第二种子液；
[0097] 按一定比例称取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC11118)放入MRS液体培养基进行第四培养，培养温度28℃，培养时间80h，待MRS液体培养基浑浊后，得到第三种子液；
[0098] 步骤S22、以重量百分比计，称取步骤S21制备的50％第二种子液和50％第三种子液，得到复合种子液；
[0099] 步骤S23、按复合种子液与第五培养基的质量比为1：120称取步骤S22制备的复合种子液，并放入由20％红糖、5％乳清粉和75％蒸馏水构成的第五培养基中，并进行第五培养，培养温度28℃，密闭培养15天，得到复合菌种；
[0100] 步骤S24、按复合菌种与第六培养基的质量比为1：20称取步骤S23制备的复合菌种，并放入由米糠30％、豆粕1％、酒糟渣10％、麸皮1％、糖蜜2％、蒸馏水56％构成的第六培养基中，培养温度28℃，密闭培养15天，得到粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物。
[0101] 步骤S3、称取5％步骤S1制备的酪酸梭菌培养物、称取5％步骤S2制备的粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物、称取10％枯草芽孢杆菌菌粉(Bacillus subtilis，ACCC10619)、称取50％硅藻土和称取30％沸石粉进行混合后，挤压制粒，获得微生物制剂，微生物制剂以软颗粒的形式存在。
[0102] 实施例4
[0103] 本实施例为本发明的一个具体实施例。
[0104] 一种用于改良养殖塘底环境的微生物制剂的制备方法，步骤包括：
[0105] 步骤S1、制备酪酸梭菌培养物
[0106] 步骤S11、按一定比例称取酪酸梭菌(Clostridium butyricum，CGMCC1.0209)放入改良牛肉膏蛋白胨液体培养基进行第一培养，培养温度40℃，静置培养24h，待改良牛肉膏蛋白胨液体培养基浑浊后，得到第一种子液；
[0107] 步骤S12、将第一种子液以5％的重量比放入装有磷酸缓冲液培养基的厌氧液体发酵罐(发酵罐充满CO2气体)，培养温度40℃，厌氧培养36h，每2h以60rpm的转速对发酵罐内的培养液进行搅拌1min，待发酵液中形成梭状芽孢后，终止发酵，离心，获得半固体状的酪酸梭菌培养物。
[0108] 步骤S2、制备粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物
[0109] 步骤S21、按一定比例称取粪肠球菌(Enterococcus faecalis，ACCC10180)放入MRS液体培养基进行第三培养，培养温度32℃，培养时间64h，待MRS液体培养基浑浊后，得到第二种子液；
[0110] 按一定比例称取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC11118)放入MRS液体培养基进行第四培养，培养温度32℃，培养时间64h，，待MRS液体培养基浑浊后，得到第三种子液；
[0111] 步骤S22、以重量百分比计，称取步骤S21制备的42％第二种子液和58％第三种子液，得到复合种子液；
[0112] 步骤S23、按复合种子液与第五培养基的质量比为1：80称取步骤S22制备的复合种子液，并放入由15％红糖、7％乳清粉和78％蒸馏水构成的第五培养基中，并进行第五培养，培养温度32℃，密闭培养10天，得到复合菌种；
[0113] 步骤S24、按复合菌种与第六培养基的质量比为1：15称取步骤S23制备的复合菌种，并放入由米糠49％、豆粕5％、酒糟渣20％、麸皮5％、糖蜜6％、蒸馏水15％构成的第六培养基中，培养温度32℃，密闭培养10天，得到粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物。
[0114] 步骤S3、称取20％步骤S1制备的酪酸梭菌培养物、称取20％步骤S2制备的粪肠球菌及植物乳杆菌复合发酵物、称取40％枯草芽孢杆菌菌粉(Bacillus subtilis，ACCC10619)和称取20％硅藻土进行混合后，挤压制粒，获得微生物制剂，微生物制剂以软颗粒的形式存在。
[0115] 以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明
说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
