技术领域
[0001] 本
发明涉及一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法，属于生物基因工程领域。
背景技术
[0002] 甾体药物被广泛用于抗炎、抗癌、抗过敏以及避孕药等，是未来全球药物市场上最具有影响
力的药物种类之一。甾体母核的羟基化反应是赋予甾体特殊生理药理活性的重要方式之一，在甾体工业上常见的反应有C7α,C9α,C11α,C11β,C16α,C17α羟基化等。然而这些羟基化反应的完成对于传统的化学合成工艺是巨大的挑战，因此由细胞色素P450单加
氧酶介导的
微生物转化是甾体工业上生产药物中间体的最重要手段之一。利用微生物转化法合成甾体化合物，专一性强，立体选择性较高，并且副产物少，弥补了化学合成法的不足之处；同时，微生物转化条件温和，步骤简单，避免了大量
有机溶剂和化工原料的使用，因此微生物转化过程是一个环境友好型绿色过程。由于P450催化的甾体羟基化反应需要大量还
原型辅酶提供
电子，即为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及其磷
酸化形式(NADPH)，因此还原辅酶或还原力的供给是甾体中间体生物合成的重要限制性因素。为了促进NAD(P)H的有效再生，大多研究主要基于两种策略，一是引入辅助的酶催化的辅酶再生系统，或改变与NAD(P)H相关的代谢路径，促使更多的电子流再生还原力。例如，Tsuyoshi等人将甘油脱氢酶(GLD)与P450cam在大肠杆菌中共表达，显著提高了产物5-exo-hydroxycampor的产量。除此之外，
乙醇脱氢酶(ADH)、
甲酸脱氢酶(FDH)、
葡萄糖脱氢酶(GDH)、6-
磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)也被相关文献报道，可被引入生物催化剂中进行NADH或NADPH的原位再生过程，以促进相应需要还原辅酶的反应进行。另外，Arnold和其工作者通过改造与NAD(P)H有关的代谢路径，使得宿主内部部分呼吸链失活，调整了体内辅酶的还原型与氧化型之间的比例，从而显著促进了P450PMOR2催化的单加氧反应。
发明内容
[0003] 目前涉及相关P450酶系的催化工程，多采用基因工程改造后微生物的全细胞催化。然而对于需要大量电子供体的细胞色素P450单加氧酶来说，还原力供给不足仍是限制大多数甾体羟基化反应的实际应用的重要因素。为了进一步解决甾体羟化过程中还原力供给不足的问题，本发明向P450酶全细胞催化系统中引入体外电子传递途径(EET途径)驱动NAD(P)H再生，结合了电化学和P450酶全细胞催化系统，实现了
碳源电子供体和
电极电子供体对P450介导的单加氧反应的协同驱动作用，即为细胞色素P450酶生物电催化系统。本发明以CYP7B1(7α羟化酶)的全细胞转化系统为例，DHEA(I)、7α-OH-DHEA(II)分别为该羟化反应的底物和产物(如图2)，为P450介导的单加氧反应在甾体工业上的发展和改良提供了良好的借鉴。
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种生物电催化系统促进P450催化甾体羟基化反应的方法。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供的生物电催化系统促进P450酶单加氧反应的方法，包括下列步骤：
[0006] (一)DNA合成及重组菌构建
[0007] 从NCBI
数据库中获得(NP_031851.3)来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，由北京擎科生物公司密码子优化后合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；
[0008] 利用PTEF1-F/R和TCYC1-F/R引物扩增Saccharomyces cerevisiae By4742
染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的
片段P-cyp7b1-T，并由通过限制性酶切位点Hind III/BamH I连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426-cyp7b1。
[0009] 敲除
酵母染色体基因atf2和ayr1基因。因为酵母染色体基因atf2和ayr1分别编码了作用于底物DHEA的3β-乙酰化酶和17β-羟化载体脱氢酶，生成副产物降低7α羟基化效率，因此先敲除atf2和ayr1基因。首先以S.cerevisiae By4742的染色体基因为模板，用atf2-Up-F/R及atf2-Down-F/R分别扩增得到atf2-UP和atf2-Down。然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用Overlap PCR技术将三段基因拼接成atf2-UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC-L(亮
氨酸营养
缺陷型培养基)筛选培养基上获得基因敲除菌株S.cerevisiaeΔatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426-cyp7b1的转化实验并于SC-U(尿嘧啶营养缺陷型培养基)上选出目标重组菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达。用于PCR的引物见下表：
[0010]
[0011]
[0012] 上述引物为
发明人独立设计完成的，未见在其他期刊杂志等途径公开或报道。
[0013] (二)生物电催化系统
电池装置的预处理
[0014] ①碳布
阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5cm×3cm，然后在1M HCl溶液中浸泡过夜，用双蒸
水反复冲洗干净，最后在纯丙
酮中浸泡过夜，取出烘干后，用适当长度的
导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用。
[0015] ②
质子交换膜(PEM)的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1M HCl溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用。
[0016] ③生物电催化电池的组装：先将
橡胶圈放在电池的
阳极室和
阴极室之间，然后用相配套的
铁夹旋紧。阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室
盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压
蒸汽灭菌锅内121℃的条件下灭菌20min。转移至烘箱中烘干，最后放入超净
工作台内待用。
[0017] ④阳极液的配制(50mM K2HPO4和50mM KH2PO4缓冲液)：称取17.116g K2HPO4·3H2O和10.206g KH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5L，121℃的条件下灭菌20min后备用。
[0018] ⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用
镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间，用夹子将阴极室和阳极室夹紧固定好，用量筒准确量取135mL阳极液倒入阳极室中备用。
[0019] (三)P450酶生物电催化系统的组装
[0020] ①细胞的培养及收集：从SC-U平板上挑取新活化的单菌落接入装有30mL SC-U液体培养基的250mL锥形瓶中，200r/min、30℃振荡培养24h；取1mL转接到装有200mL SC-U体液培养基的2L锥形瓶中，继续振荡培养至对数生长期(约24h)。取35mL的培养液，5000r/min离心2分钟，用50mM磷酸缓冲液冲洗细胞3遍去除残留培养基培养基，重悬于135mL阴极液中至)OD600≈1.5，倒入阴极室中备用。
[0021] ②提前30min～1h将铂电极和Ag/AgCl参比电极电极放在超净工作台内用75％酒精擦拭，并在紫外灯照射下灭菌30min左右。然后将阳极铂电极的穿透阳极室盖子上的直径6mm的孔伸到瓶盖外面，Ag/AgCl参比电极穿过阴极室盖子上的直径6mm的孔伸到阴极室内，拧好阴极室的瓶盖。
[0022] ③将各个装好的生物电催化电池从超净工作台拿出，放在磁力搅拌器上，设置
温度为30℃，转速为150r/min左右。将阴极瓶盖上的通气孔加上气体过滤装置并与装有空气的
钢气瓶的管子相连接。
[0023] ④打开电化学工作站和电脑，将生物电催化电池与电化学工作站相连，绿色线接
工作电极(阴极室碳布电极)的导线，红色线接
对电极(阳极室铂电极)的导线，白线接参比电极(阴极室Ag/AgCl电极)的导线。设置电化学工作站恒电位
电压-0.6V vs.Ag/AgCl、运行时间等参数，运行完成后，拆除电池，将数据保存至电脑中。每组三个平行试验。
[0024] (四)样品的提取、处理及检测方法
[0025] 每隔6h或12h取一次阴极
发酵液500μL，加入1mL乙酸乙酯漩涡震荡2min、12000r/min取上清液于新的EP管中，重复7次，将所有上清液
真空离心浓缩(45℃，1500r/min，1h左右)最后加入适量乙腈溶解，经0.22μm滤
膜过滤后，取滤液进行HPLC检测。
[0026] 色谱条件：C18色谱柱，Waters(4.6×250mm)；检测器，Waters 2998PDA；流动相，水和乙腈；洗脱条件，线性梯度洗脱，乙腈：水＝30～80％,32min，45℃，1mL/min，检测
波长205nm。
[0027] 定量方法：使用相同的色谱条件测定DHEA与7α-OH-DHEA标准品的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对萃取液中的产物进行定量。
[0028] (五)生物量的测定
[0029] 生物量：每隔6h或12h取适量发酵液，13000r/min离心1min沉淀细胞，洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD600值。
[0030] (六)胞内NAD(H/+)、NADP(H/+)比值测定
[0031] 使用Bioquest(USA)AmpliteTM NAD/NADH比色分析
试剂盒(AAT15273)，AmpliteTM NADP/NADPH比色分析试剂盒(AAT15274)测定。
[0032] 具体步骤：取适量200uL发酵液，放入0℃离心机，10000xg，15min尽除上清，加入50uL细胞裂解液，室温下培养15min，再次离心2500rpm,5min，取上清液于新EP管中，并用PBS缓冲液(PH＝7)将其稀释3倍，取25μL用于NAD/NADH或NADP/NADPH比色分析试剂盒测定。
[0033] (七)电催化条件优化
[0034] 将不同量的底物DHEA加入阴极室中配置其终浓度从100mg/L到500mg/L的阴极发酵液，保持促溶剂M-β-CDs的摩尔量为底物DHEA的2倍，生物电催化系统维持在恒电位-0.6V(vs.Ag/AgCl)，NR最终浓度为0.1mM，在以上条件下探究底物投料量对于7α羟基化反应的影响作用，并绘制细胞生长曲线监测较高浓度底物对细胞生长的影响。接下来，以添加促溶剂M-β-CDs的量为变量设置对照实验，优化促溶剂与DHEA的最佳投入摩尔比例。
[0035] 本发明的有益效果：
[0036] 为了进一步解决甾体羟化过程中还原力供给不足的问题，本发明向P450酶全细胞催化系统中引入体外电子传递途径(EET途径)驱动NAD(P)H再生，结合了电化学和P450酶全细胞催化系统，实现了碳源电子供体和电极电子供体对P450介导的单加氧反应的协同驱动作用，即为细胞色素P450酶生物电催化系统。本发明以CYP7B1(7α羟化酶)的全细胞转化系统为例，DHEA(I)、7α-OH-DHEA(II)分别为该羟化反应的底物和产物(如图2)，为P450介导的单加氧反应在甾体工业上的发展和改良提供了良好的借鉴。
[0037] 本发明提供的P450酶生物电催化系统，设计的主要目标是利用体外电子传递途径(EET途径)增强酵母体内的还原型辅酶的再生或者还原力供给。本发明的系统是一个双室H-型的电化学体系，将培养到一定OD600的
酿酒酵母菌体收集起来，放入阴极室，通过一张质子交换膜与阳极室分隔开，如图1。在工作工程中，阳极室持续发生
电解水反应，阴极通过电子传递体被还原，携带电子进入酵母菌体内，协同碳源电子供体加强还原辅酶NAD(P)H的再生过程，最终提高NAD(P)H依赖的P450酶单加氧反应。
附图说明：
[0038] 图1是细胞色素P450生物电催化系统示意图。
[0039] 图2是底物DHEA经7α羟化酶转化为产物7α-OH-DHEA示意图。
[0040] 图3是生产7α-OH-DHEA菌株的设计与构建(A)酵母染色体两个本源基因ayr1和atf2对于底物DHEA的处理作用；(B)利用同源重组技术获得双敲除菌株S.cerevisiae[0041] Δayr1Δatf2；(C)重组质粒pRS426-cyp7b1。
[0042] 图4是生物电催化系统和对照组中阴极室细胞培养物
颜色的差别。
[0043] 图5是生物电催化系统对7α羟基化反应的强化影响(A)7α-OH-DHEA积累量在生物电催化系统和对照组中的差别(B)底物DHEA在生物电催化系统和对照组中剩余量的对比(C)菌体生长曲线(D)酵母胞内NADH/NAD+及NADPH/NADP+比值的增长。具体实施方式：
[0045] 本实施例提供一种生物电催化系统促进P450酶单加氧反应的方法，包括下列步骤：
[0046] (一)DNA合成及重组菌构建
[0047] 从NCBI数据库中获得(NP_031851.3)来自鼠源7α羟化酶的cDNA序列，由北京擎科生物公司密码子优化后合成并置于克隆载体pUC57，随后由cyp7b1-F/R引物PCR扩增得到cyp7b1基因；
[0048] 利用PTEF1-F/R和TCYC1-F/R引物扩增Saccharomyces cerevisiae By4742染色体基因组上的启动子PTEF1和终止子TCYC1，并通过基因拼接获的目的片段P-cyp7b1-T，并由通过限制性酶切位点Hind III/BamH I连接到表达载体pRS426上，获的目的重组质粒pRS426-cyp7b1。
[0049] 敲除酵母染色体基因atf2和ayr1基因。因为酵母染色体基因atf2和ayr1分别编码了作用于底物DHEA的3β-乙酰化酶和17β-羟化载体脱氢酶，生成副产物降低7α羟基化效率，因此先敲除atf2和ayr1基因。首先以S.cerevisiae By4742的染色体基因为模板，用atf2-Up-F/R及atf2-Down-F/R分别扩增得到atf2-UP和atf2-Down。然后以pRS415质粒为模板扩增获得LEU标签，利用Overlap PCR技术将三段基因拼接成atf2-UP+LEU+Down片段，并将此片段进行酵母转化实验，并于SC-L(亮氨酸营养缺陷型培养基)筛选培养基上获得基因敲除菌株S.cerevisiaeΔatf2，利用同样的方法进行基因ayr1敲除实验，使用组氨酸HIS筛选标签获得双基因敲除型菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1，最后进行重组质粒pRS426-cyp7b1的转化实验并于SC-U(尿嘧啶营养缺陷型培养基)上选出目标重组菌株S.cerevisiaeΔatf2Δayr1/cyp7b1实现组成型强启动子PTEF1调控的cyp7b1基因的过表达。用于PCR的引物见发明内容部分。
[0050] 本实施例成功构建了pRS426-cyp7b1重组质粒，转化进入双敲除底盘菌S.cerevisiaeΔayr1Δatf2，经PCR验证表明成功构建基因工程菌株S.cerevisiaeΔayr1Δatf2/cyp7b1(图3)。
[0051] (二)生物电催化系统电池装置的预处理
[0052] ①碳布阴极的预处理：首先将碳布裁剪为所需的尺寸大小，为2.5cm×3cm，然后在1M HCl溶液中浸泡过夜，用双蒸水反复冲洗干净，最后在纯丙酮中浸泡过夜，取出烘干后，用适当长度的导线与预处理后的碳布连接并用胶水粘连固定住，晾干备用。
[0053] ②质子交换膜(PEM)的预处理：首先将质子交换膜裁剪为生物电催化电池所需的尺寸大小，然后在1M HCl溶液中浸泡过夜，用灭菌后的双蒸水反复冲洗干净，最后在无菌水中浸泡备用。
[0054] ③生物电催化电池的组装：先将橡胶圈放在电池的阳极室和阴极室之间，然后用相配套的铁夹旋紧。阴极室内放入磁力搅拌子，碳布电极的导线穿透阴极室盖子上的导线孔伸到瓶盖外面，瓶盖上的通气孔与无菌滤器相连，把组装好的生物电催化电池装置放入高压蒸汽灭菌锅内121℃的条件下灭菌20min。转移至烘箱中烘干，最后放入超净工作台内待用。
[0055] ④阳极液的配制(50mM K2HPO4和50mM KH2PO4缓冲液)：称取17.116g K2HPO4·3H2O和10.206g KH2PO4于适量蒸馏水中彻底溶解，继续加蒸馏水定容至1.5L，121℃的条件下灭菌20min后备用。
[0056] ⑤在超净工作台内，将灭菌并烘干后生物电催化电池阴阳极室之间的铁夹打开，用镊子夹取一张处理好的浸泡在无菌水内的质子交换膜放在阴极室和阳极室中间，用夹子将阴极室和阳极室夹紧固定好，用量筒准确量取135mL阳极液倒入阳极室中备用。
[0057] (三)P450酶生物电催化系统的组装
[0058] ①细胞的培养及收集：从SC-U平板上挑取新活化的单菌落接入装有30mL SC-U液体培养基的250mL锥形瓶中，200r/min、30℃振荡培养24h；取1mL转接到装有200mL SC-U体液培养基的2L锥形瓶中，继续振荡培养至对数生长期(约24h)。取35mL的培养液，5000r/min离心2分钟，用50mM磷酸缓冲液冲洗细胞3遍去除残留培养基培养基，重悬于135mL阴极液中至)OD600≈1.5，倒入阴极室中备用。
[0059] ②提前30min～1h将铂电极和Ag/AgCl参比电极电极放在超净工作台内用75％酒精擦拭，并在紫外灯照射下灭菌30min左右。然后将阳极铂电极的穿透阳极室盖子上的直径6mm的孔伸到瓶盖外面，Ag/AgCl参比电极穿过阴极室盖子上的直径6mm的孔伸到阴极室内，拧好阴极室的瓶盖。
[0060] ③将各个装好的生物电催化电池从超净工作台拿出，放在磁力搅拌器上，设置温度为30℃，转速为150r/min左右。将阴极瓶盖上的通气孔加上气体过滤装置并与装有空气的钢气瓶的管子相连接。
[0061] ④打开电化学工作站和电脑，将生物电催化电池与电化学工作站相连，绿色线接工作电极(阴极室碳布电极)的导线，红色线接对电极(阳极室铂电极)的导线，白线接参比电极(阴极室Ag/AgCl电极)的导线。设置电化学工作站恒电位电压-0.6V vs.Ag/AgCl、运行时间等参数，运行完成后，拆除电池，将数据保存至电脑中。每组三个平行试验。
[0062] (四)样品的提取、处理及检测方法
[0063] 每隔6h或12h取一次阴极发酵液500μL，加入1mL乙酸乙酯漩涡震荡2min、12000r/min取上清液于新的EP管中，重复7次，将所有上清液真空离心浓缩(45℃，1500r/min，1h左右)最后加入适量乙腈溶解，经0.22μm滤膜过滤后，取滤液进行HPLC检测。
[0064] 色谱条件：C18色谱柱，Waters(4.6×250mm)；检测器，Waters 2998PDA；流动相，水和乙腈；洗脱条件，线性梯度洗脱，乙腈：水＝30～80％,32min，45℃，1mL/min，检测波长205nm。
[0065] 定量方法：使用相同的色谱条件测定DHEA与7α-OH-DHEA标准品的标准溶液，绘制浓度-峰面积标准曲线，对萃取液中的产物进行定量。
[0066] (五)生物量的测定
[0067] 生物量：每隔6h或12h取适量发酵液，13000r/min离心1min沉淀细胞，洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的OD600值。
[0068] (六)胞内NAD(H/+)、NADP(H/+)比值测定
[0069] 使用Bioquest(USA)AmpliteTM NAD/NADH比色分析试剂盒(AAT15273)，AmpliteTM NADP/NADPH比色分析试剂盒(AAT15274)测定。
[0070] 具体步骤：取适量200uL发酵液，放入0℃离心机，10000xg，15min尽除上清，加入50uL细胞裂解液，室温下培养15min，再次离心2500rpm,5min，取上清液于新EP管中，并用PBS缓冲液(PH＝7)将其稀释3倍，取25μL用于NAD/NADH或NADP/NADPH比色分析试剂盒测定。
[0071] 本发明选取了NR作为P450酶生物催化体系的电子传递体，负责建立电极电子到微生物细胞体内的运送过程，协助生物催化剂胞内还原力的再生从而促进7α羟基化反应、提升7α-OH-DHEA的产量。首先在整个催化过程中观察到了阴极室中的NR由红变黄的变化，该现象预示着氧化型的NR(NRox，红色)被阴极电子还原成还原型NR(NRred，黄色)。从阴极室中取出适量培养物，离心后如图4，观察到红色菌体和黄色上清液，这表明还原态NR进入细胞后被氧化，因此管底细胞呈现红色(氧化态中性红)。中性红NR是一种广泛使用的电子传递体，起到了将电子从电极运送至酵母细胞内部的电子载体作用。
[0072] 实施例2
[0073] 在实施例1的
基础上，本实施例按照步骤(七)电催化条件优化进行优化，具体为：
[0074] 将不同量的底物DHEA加入阴极室中配置其终浓度从100mg/L到500mg/L的阴极发酵液，保持促溶剂M-β-CDs的摩尔量为底物DHEA的2倍，生物电催化系统维持在恒电位-0.6V(vs.Ag/AgCl)，NR最终浓度为0.1mM，在以上条件下探究底物投料量对于7α羟基化反应的影响作用，并绘制细胞生长曲线监测较高浓度底物对细胞生长的影响。接下来，以添加促溶剂M-β-CDs的量为变量进行对照实验，设置M-β-CDs：DHEA的摩尔比分别为0、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1，优化促溶剂M-β-CDs与DHEA的最佳投入摩尔比例。
[0075] 通过步骤(七)电催化条件优化，得到各个最佳参数条件。在生物电催化系统阴极液中投入适量的酵母菌体，电子传递体NR 0.1mM，阴极电势控制在-0.6V(vs.Ag/AgCl)，酵母细胞内的NAD(H/+)和NADP(H/+)值较对照组分别提高了1.3倍和2.2倍，促使了200mg/L DHEA投料下近乎100％的转化率。经发酵条件优化后，在底物DHEA投料量达400mg/L，促溶剂M-β-CDs的添加量是DHEA摩尔比的3倍时，7α-OH-DHEA的产量最高达到288.6±7.8mg/L，是未介入EET途径的对照实验组产量的2.4倍。
[0076] 实施例3
[0077] P450酶生物电催化系对7α-OH-DHEA产量的提升验证
[0078] 如图5A和5B，当底物DHEA的投料量为200mg/L，生物电催化系统在42h时底物转化率近乎100％，此时达到7α-OH-DHEA的最高产量198.0±6.1mg/L，是对照组(无电子传递体中性红，即无EET途径，其余条件与生物电催化系统一致)产量111.6±1.7mg/L的1.8倍。同时还绘制了细胞生长曲线以监测两种催化系统中细胞的生长状态，如图5C所示，电驱动催化7α羟基化的方式并未对细胞生长产生明显的影响。另外，在生物电催化过程中NADH/NAD+和NADPH/NADP+的最峰值分别是相应对照组峰值的1.3倍和2.2倍(图5D)，因此证明了“NR介导的体外电子传递途径”在P450酶生物催化系统中起到的主导电极电子进入酵母体内并促进体内还原型辅酶NAD(P)H再生的作用，为7α-OH-DHEA积累量的提高提供了支持。
