技术领域
[0001] 本
发明涉及叶绿素测定技术领域，尤其涉及一种高有机质土壤中痕量叶绿素的测定方法。
背景技术
[0002] 叶绿素是绿色
植物的进行光合作用的主要色素。叶绿素以及它的衍
生物的含量测定已在研究光合作用、监测海洋赤潮及浮游植物、研究瓜果的成熟机理、检测食品中叶绿素衍生物添加剂以及色泽等多个领域得到了广泛的应用。但这些应用都需要一个相对较高的叶绿素及其衍生物含量测定。对痕量叶绿素的测定，除了应用在
水体研究之外，其它领域应用很少。叶绿素有特殊共轭体系的卟啉结构，卟啉在一些研究中可以作为分子识别标记，同理，只要有绿色植物存在过的地方，叶绿素没有被完全降解，就有被检测到的可能性。
泥炭为由大泥炭藓等植物演化而来的残体，其叶绿素的卟啉就可能会被检测到，叶绿素的含量是一个比较稳定，且与腐殖化过程相伴随的指标，其可以在一定程度上反应绿色植物死亡之后有机质的保留情况。反过来，也就可以用于有机质较高的土壤的叶绿素的测定。
发明内容
[0003] 本发明的目的是为了解决
现有技术中存在的缺点，而提出的一种高有机质土壤中痕量叶绿素的测定方法。
[0004] 一种高有机质土壤中痕量叶绿素的测定方法，包括以下步骤：
[0005] S1、取材：选取待测土壤样品和绿色植物样品，进行
冷冻干燥；
[0006] S2、叶绿素的提取：准确称取冷冻干燥后的待测土壤样品和绿色植物样品于容器中，然后分别向容器中加入95％(v/v)
乙醇溶剂，封口密封后于避光下提取叶绿素，制得待测土壤叶绿素提取液和绿色植物叶绿素提取液；
[0007] S3、紫外-可见分光光度法测定叶绿素的含量：利用紫外-可见分光光度法测定绿色植物叶绿素提取液在
波长为663nm和645nm下的光
密度，并采用Lichtenthaler的方法计算绿色植物叶绿素提取液中叶绿素a的含量：
[0008] Chl a(mg/g)＝(12.7*OD663–2.69*OD645)*V/1000W (1)
[0009] 式中：Chl a为叶绿素a的含量(mg/g)；
[0010] OD663和OD645分别为绿色植物叶绿素提取液在波长663nm和645nm下测量的光密度；
[0011] V为绿色植物叶绿素提取液的体积(mL)；
[0013] S4、叶绿素的三维
荧光光谱测定：将步骤S2制备的绿色植物叶绿素提取液用不同体积的95％(v/v)乙醇溶剂进行稀释，配制不同浓度的叶绿素标准液，同时配制95％(v/v)乙醇溶剂作为空白对照体系，然后使用荧光分光光度计进行扫描，得到不同浓度的叶绿素标准液的荧光峰强度FLa标n和95％(v/v)乙醇溶剂的荧光峰强度FLa空，空白扣除，计算得到△FLa标n＝FLa标n-FLa空；
[0014] S5、回归方程的建立：以△FLa标n对叶绿素标准液的浓度作标准曲线，建立回归方程；
[0015] S6、待测土壤中叶绿素的含量的测定：按照步骤S4荧光光谱的实施条件对待测土壤叶绿素提取液进行扫描，得到相同的激发波长/发射波长时的荧光峰强度FLa样，扣除空白，计算ΔFLa样＝FLa样-FLa空，然后利用S5建立的回归方程计算出待测土壤中叶绿素的含量。
[0016] 进一步的，步骤S1中，待测土壤样品以及绿色植物样品要同时取样，所述冷冻干燥处理在
真空冷冻干燥机下进行，所述绿色植物样品为泥炭藓、桂花叶或刚竹竹叶，所述待测土壤样品由相应的泥炭藓、桂花叶或刚竹竹叶在厌
氧的环境中不完全降解所形成。
[0017] 进一步的，步骤S2中，所述绿色植物中叶绿素的提取的步骤，包括：准确称取真空干燥后的绿色植物样品装入容器中，然后向容器中加入95％(v/v)乙醇溶剂，使绿色植物样品完全浸入溶剂中，加盖，于避光20-25℃下浸提6-10h，至绿色植物完全变白，即得到绿色植物叶绿素提取液。
[0018] 进一步的，步骤S4中，所述使用荧光分光光度计进行扫描的步骤，包括：使用荧光分光光度计在激发波长为300-480nm、发射波长为600-720nm的条件下进行扫描，分别得到不同浓度的叶绿素标准液和95％(v/v)乙醇溶剂的三维荧光光谱，然后选择激发波长/发射波长为300-480nm/600-720nm范围内的荧光峰，测定不同浓度的叶绿素标准液的荧光峰强度FLa标n和95％(v/v)乙醇溶剂的荧光峰强度FLa空，空白扣除，计算得到△FLa标n＝FLa标n-FLa空。
[0019] 进一步的，步骤S4中，所述n＝6，将步骤S2制备的绿色植物叶绿素提取液用不同体积的95％(v/v)乙醇溶剂进行稀释，稀释倍数依次为0倍、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍。
[0020] 进一步的，步骤S4和S6中，所述荧光分光光度计的测试条件为：
光电倍增管负高压为700V，激发和发射狭缝宽度均为5nm；光谱仪扫描范围为激发波长/发射波长(Ex/Em)＝300-480nm/600-720nm，步长均为5nm。
[0021] 进一步的，所述光谱仪扫描范围为激发波长/发射波长(Ex/Em)＝400-410nm/660-675nm。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0023] 本发明利用低背景的三维荧光光谱，解决了痕量叶绿素在可见紫外光谱中，其吸收光受泥炭，高有机质土壤等有色背景干扰较大的难题，突破了叶绿素的测定只限于绿色植物的局限性，本发明方法可广泛用于研究绿色植物凋落及腐殖化的
进程；本发明方法创新，拓宽了泥炭及高有机质土壤的研究指标，相关性较好，可应用于天然有机质的演化研究或示踪上。
附图说明
[0024] 图1为本发明中深度为0-10cm泥炭中的叶绿素三维光谱图；
[0025] 图2为本发明中深度为10-20cm泥炭中的叶绿素三维光谱图；
[0026] 图3为本发明中深度为20-25cm泥炭中的叶绿素三维光谱图；
[0027] 图4为本发明中不同深度的泥炭对相应的泥炭中叶绿素的含量的柱状图；
[0028] 图5为本发明中深度为0-10cm桂花叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0029] 图6为本发明中深度为10-20cm桂花叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0030] 图7为本发明中深度为20-30cm桂花叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0031] 图8为本发明中不同深度的桂花叶土壤对相应的桂花叶土壤中的叶绿素的含量的柱状图；
[0032] 图9为本发明中深度为0-5cm刚竹竹叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0033] 图10为本发明中深度为5-10cm刚竹竹叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0034] 图11为本发明中深度为10-15cm刚竹竹叶土壤中的叶绿素三维光谱图；
[0035] 图12为本发明中不同深度的刚竹竹叶土壤对相应的刚竹竹叶土壤中的叶绿素的含量的柱状图。
具体实施方式
[0036] 下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0037] 实施例1
[0038] S1、取材：选取凋落层泥炭藓(深度为0-10cm)、浅层泥炭(深度为10-20cm)和深层泥炭(深度为20-25cm)及泥炭藓样品，真空冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥；
[0039] S2、叶绿素的提取：准确称取0.2g冷冻干燥后的待测泥炭样品，0.025g泥炭藓样品于容器中，然后分别向容器中加入10ml的95％(v/v)乙醇溶剂，封口密封后于避光25℃下提取叶绿素6h，制得待测土壤叶绿素提取液和泥炭藓叶绿素提取液，这里将泥炭藓叶绿素提取液作为叶绿素标准液；
[0040] S3、紫外-可见分光光度法测定叶绿素的含量：利用紫外-可见分光光度法测定泥炭藓叶绿素提取液在波长为663nm和645nm下的光密度，并采用Lichtenthaler的方法计算泥炭藓叶绿素提取液中叶绿素a的含量：
[0041] Chl a(mg/g)＝(12.7*OD663–2.69*OD645)*V/1000W (1)
[0042] 式中：Chl a为叶绿素a的含量(mg/g)；
[0043] OD663和OD645分别为泥炭藓叶绿素提取液在波长663nm和645nm下测量的光密度；
[0044] V为泥炭藓叶绿素提取液的体积(mL)；
[0045] W为泥炭藓的质量(g)；
[0046] S4、叶绿素的三维荧光光谱测定：将步骤S2制备的泥炭藓叶绿素提取液用不同体积的95％(v/v)乙醇溶剂进行稀释，稀释倍数依次为0倍、1倍、5倍、10倍、50倍、100倍，配制得到不同浓度的叶绿素标准液，同时配制95％(v/v)乙醇溶剂作为空白对照体系，然后使用荧光分光光度计在激发波长为300-480nm、发射波长为600-720nm的条件下进行扫描，分别得到不同浓度的叶绿素标准液和95％(v/v)乙醇溶剂的三维荧光光谱，然后选择激发波长/发射波长为300-480nm/600-720nm范围内的荧光峰，测定不同浓度的叶绿素标准液的荧光峰强度FLa泥炭藓n和95％(v/v)乙醇溶剂的荧光峰强度FLa空，空白扣除(用于消除95％乙醇溶剂的
拉曼散射，降低背景噪声)，计算得到△FLa泥炭藓n＝FLa泥炭藓n-FLa空；
[0047] 其中，n＝1、2、3、4、5、6，使用荧光分光光度计的测试条件为：在荧光分光光度计(F-4600型，日本日立公司)上，设置光电倍增管负高压为700V，激发和发射狭缝宽度均为5nm，光谱仪扫描范围为激发波长/发射波长(Ex/Em)＝300-480nmnm(步长5nm)/600-720nm(步长5nm)，无需进行内效应校正；
[0048] S5、回归方程的建立：以△FLa泥炭藓n对叶绿素标准液的浓度作标准曲线，建立回归方程：叶绿素的含量＝FLa/5636；
[0049] S6、泥炭样品中叶绿素的含量的测定：按照步骤S4中的荧光分光光度计的测试条件对待测泥炭样品叶绿素提取液进行扫描，得到相同的激发波长/发射波长(300-480nm/600-720nm)范围内时的荧光峰强度FLa泥炭，扣除空白，计算ΔFLa泥炭＝FLa泥炭-FLa空，然后将ΔFLa泥炭代入步骤S5建立的回归方程中，叶绿素的含量＝(ΔFLa泥炭*0.025/0.2)/5636，从而得到泥炭中痕量叶绿素的含量。
[0050] 如图1-4所示，可以观察到荧光峰的峰值随土壤深度的增加而降低，但即使在深层泥炭也有荧光峰的出现。
[0051] 实施例2
[0052] S1、取材：选取凋落的桂花
叶片((0-10cm)，为刚刚掉落的枯死桂花叶片和稍微腐烂的桂花叶片)、浅层桂花叶土壤(10-20cm)和深层桂花叶土壤(20-25cm)及泥炭藓，真空冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥；
[0053] S2、叶绿素的提取：准确称取0.2g冷冻干燥后的待测桂花叶土壤样品，0.025g泥炭藓样品于容器中，然后分别向容器中加入10ml的95％(v/v)乙醇溶剂，封口密封后于避光20℃下提取叶绿素6h，制得待测桂花叶土壤叶绿素提取液和泥炭藓叶绿素提取液，这里将泥炭藓叶绿素提取液作为叶绿素标准液，(也可以用其他植物作为标准)；
[0054] S3、可见紫外光谱测定叶绿素的含量：同实施例1中的步骤S3；
[0055] S4、叶绿素的三维荧光光谱测定：同实施例1中的步骤S4；
[0056] S5、回归方程的建立：同实施例1中的步骤S5；
[0057] S6、待测桂花叶土壤样品中叶绿素的含量的测定：按照步骤S4中的荧光分光光度计的测试条件对待测桂花叶土壤样品叶绿素提取液进行扫描，得到相同的激发波长/发射波长(300-480nm/600-720nm)范围内时的荧光峰强度FLa桂花叶土壤，扣除空白，计算ΔFLa桂花叶土壤＝FLa桂花叶土壤-FLa空，然后将ΔFLa桂花叶土壤代入步骤S5建立的回归方程中，叶绿素的含量＝(ΔFLa桂花叶土壤*0.025/0.2)/5636，从而得到待测桂花叶土壤中痕量叶绿素的含量。
[0058] 如图5-8所示，可以观察到峰值随桂花叶土壤的深度增加而降低，但即使在深层桂花叶土壤也有荧光峰的出现。
[0059] 实施例3
[0060] S1、取材：选取凋落的竹叶((0-5cm)，为刚刚掉落的枯死刚竹竹叶和稍微腐烂的刚竹竹叶)、浅层刚竹竹叶土壤(5-10cm)和深层刚竹竹叶土壤(10-15cm)及泥炭藓，真空冷冻干燥机中-80℃冷冻干燥；
[0061] S2、叶绿素的提取：准确称取0.2g冷冻干燥后的待测刚竹竹叶土壤样品，0.025g泥炭藓样品于容器中，然后分别向容器中加入10ml的95％(v/v)乙醇溶剂，封口密封后于避光25℃下提取叶绿素6h，制得待测刚竹竹叶土壤叶绿素提取液和泥炭藓叶绿素提取液，这里将泥炭藓叶绿素提取液作为叶绿素标准液；
[0062] S3、可见紫外光谱测定叶绿素的含量：同实施例1中的步骤S3；
[0063] S4、叶绿素的三维荧光光谱测定：同实施例1中的步骤S4；
[0064] S5、回归方程的建立：同实施例1中的步骤S5；
[0065] S6、待测刚竹竹叶土壤样品中叶绿素的含量的测定：按照步骤S4中的荧光分光光度计的测试条件对待测刚竹竹叶土壤样品叶绿素提取液进行扫描，得到相同的激发波长/发射波长(300-480nm/600-720nm)范围内时的荧光峰强度FLa刚竹竹叶土壤，扣除空白，计算ΔFLa刚竹竹叶土壤＝FLa刚竹竹叶土壤-FLa空，然后将ΔFLa刚竹竹叶土壤代入步骤S5建立的回归方程中，叶绿素的含量＝(ΔFLa刚竹竹叶土壤*0.025/0.2)/5636，从而得到待测刚竹竹叶土壤中痕量叶绿素的含量。
[0066] 如图9-12所示，可以观察到峰值随深度增加而降低，但即使在深层刚竹竹叶土壤也有荧光峰的出现。
[0067] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉
本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
