专利汇可以提供一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的 荧光 传感器 ,属于生化分析领域。首先,以含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的Hairpin DNA为底物,在S-腺苷甲硫 氨 酸存在下,于37℃条件下,以Dnmt1催化底物发生甲基化反应;然后加入对甲基化敏感的限制性内切酶BssHII,于60℃下进行剪切反应,被完全甲基化的底物不能被BssHII识别,从而不能被剪切,而未被完全甲基化的底物能被剪切,释放出G-四链体 片段 ;最后,向体系中加入NMM,其与G-四链体结合后,产生强荧光 信号 ,可根据荧 光信号 的强弱判断底物DNA的甲基化 水 平,从而进一步反映甲基化反应中Dnmt1的活性。该方法在均相反应体系中进行,操作简单。,下面是一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器专利的具体信息内容。
1.一种基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:是通过以下方法构建:
(1)将含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的底物DNA溶于TE缓冲液中,配制成100μM的底物DNA,于水浴中加热,之后缓慢冷却至室温,得到100μM的Hairpin DNA底物;
(2)将步骤(1)配成的Hairpin DNA底物,加入Dnmt1缓冲液,再加入S-腺苷甲硫氨酸、Dnmt1,用水稀释,之后将该混合液置于37℃水浴中进行Dnmt1催化Hairpin DNA底物进行甲基化反应;
(3)甲基化反应完毕后,加入CutSmart缓冲液及BssHII,超纯水稀释,于60℃水浴中进行BssHII催化的剪切反应;
(4)剪切反应完毕后,向体系中加入N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM),涡旋1min,测定荧光强度,激发波长399nm。
2.根据权利要求1所述的基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:
具体步骤如下:
(1)将含有G-四链体序列、经半甲基化修饰的底物DNA溶于TE缓冲液中,配制成100μM的底物DNA,于水浴中加热至90℃,保持5min,缓慢冷却至室温,得到100μM的Hairpin DNA底物;
(2)将1μL 100μM的Hairpin DNA底物加到200μL的离心管中,加入2.5μL 10×Dnmt1缓冲液中,加入0.5μL32mM S-腺苷甲硫氨酸,加入1μL Dnmt1,最后以水稀释至总体积为25μL,将该混合液置于37℃水浴中进行Dnmt1催化Hairpin DNA底物进行甲基化反应,反应时间
2h;
(3)甲基化反应完毕后,向反应体系中加入10μL 10×CutSmart缓冲液,加入3μL
1000U/mL BssHII,以超纯水稀释至终体积为100μL,于60℃水浴中进行BssHII催化的剪切反应,反应时间2h;
(4)剪切反应完毕后,向体系中加入1μL 100μM N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM),涡旋1min,测定荧光强度,激发波长399nm。
3.根据权利要求1或2所述的基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:TE缓冲液的成分为10mM Tris-HCl,1mM EDTA,,pH 8.0。
4.根据权利要求1或2所述的基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:1×Dnmt1成分为:15%Glycerol,1mM DTT,1mM EDTA,50mM Tris-HCl,100μg/ml BSA,pH
7.8。
5.根据权利要求1或2所述的基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:1×CutSmart成分为:50mM Potassium Acetate,20mM Tris-acetate,10mM Magnesium Acetate,100μg/ml BSA,pH 7.9。
6.根据权利要求1或2所述的基于G-四链体的检测Dnmt1活性的荧光传感器,其特征在于:所述N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)是溶于DMSO中。
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