一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法专利检索-波长物理专利检索查询-专利查询网

一种快速测定生物 活性炭滤池表面细菌总数的方法

阅读：920发布：2021-04-13

专利汇可以提供一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法，检测步骤为：(1)取1～5g生物活性炭样品，加入10～20mL 磷酸盐缓冲溶液，超声处理10～20min，得到细菌脱附溶液；(2)在4℃下离心步骤(1)所得到的细菌脱附溶液，6000r/min下离心10min，得到沉淀菌体细胞，使用裂解液复溶所述沉淀菌体细胞，涡旋混合均匀，60～80℃ 水浴30～40min后，冷却至室温，在4℃下10000r/min离心10min，将上清液转移至96孔板，立即利用多功能读板机荧光模式进行NADH测定，激发波长为350～400nm，发射波长为400～650nm。采用本发明所述检测方法得到的细菌数值与HPC法、ATP法相比呈现良好的线性关系，可适用于生物活性炭滤池细菌总量的快速检测。，下面是一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取1～5g生物活性炭样品，加入10～20mL 磷酸盐缓冲溶液，超声处理10～20min，得到细菌脱附溶液；
(2)在4℃下离心步骤(1)所得到的细菌脱附溶液，6000r/min下离心10min，得到沉淀菌体细胞，使用裂解液复溶所述沉淀菌体细胞，涡旋混合均匀，60～80℃水浴30～40min后，冷却至室温，在4℃下10000r/min离心10min，将上清液转移至96孔板，立即利用多功能读板机荧光模式进行NADH测定，激发波长为350～400nm，发射波长为400～650nm。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述裂解液为100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100。
3.根据权利要求1-2任一项所述的测定方法，其特征在于，所述步骤(2)中所述水浴温度为80℃，水浴时间为30min。

说明书全文

一种快速测定生物 活性炭滤池表面细菌总数的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及水环境微生物领域，尤其涉及快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的测定方法。

背景技术

[0002] 随着经济快速发展，居民生活品质逐渐提高，安全健康饮水意识逐渐增强，但我国环境污染却愈加严重，尤其是水污染问题。饮用水厂的水质情况直接影响居民饮用水安全，因此饮用水厂水处理工艺面临巨大挑战。传统的净水工艺包括混凝-沉淀-过滤-消毒等步骤，但常规处理仅能去除水中有机污染物等微污染物，不能完全达到新的《生活饮用水标准》的要求，因此饮用水厂一般在常规处理后增加深度处理技术，如活性炭吸附、臭氧-生物活性炭、膜技术等工艺，其中臭氧-生物活性炭技术经济适用，操作简便，是我国应用较多的深度水处理技术。生物活性炭上微生物群落结构和微生物数量及活性是影响生物活性炭滤池处理效果的关键因素，为了更好地优化生物活性炭滤池去除颗粒物和可生物降解有机物的能力，研究人员已经开发出多种测定生物活性炭滤池生物量和生物活性的方法，如：用来测定生物量的方法有异养菌平板计数法(HPC)、磷脂法、细菌总数直接计数法、氯仿熏蒸-提取法；用来测定生物活性的方法有耗氧量法、荧光素二乙酸酯(FDA)水解法和ATP法。其中，HPC法通过选用贫营养培养基以及降低培养温度的方法，模拟滤池贫营养环境，但细菌培养所需时间较长，检测周期延长，需要在专业的实验室进行，不适于现场操作。与之相比，ATP方法所需时间少、操作简单、检测限低；而且，ATP法无需培养，可以测量包括异养和自养生物在内的全部活细胞。因此，近年来在评估生物滤池实际监测和控制的研究中得到广泛的应用，但ATP法中测定所需的荧光素-荧光素酶试剂较为昂贵，限制了该方法的产业应用。

[0003] 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的还原态，产生于糖酵解和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环。NADH广泛存在于各种活的生物体中，是许多生物氧化还原电子传递链中所必须的辅酶。NADH是线粒体中能量产生链中的控制标志物，因此只存在于活菌体中，可作为具有代谢活性细胞指示物。单位菌体胞内NADH含量恒定。因此，细菌菌数也应与NADH含量应呈正相关关系，可以通过测定NADH来反映活菌数量。据报道，目前主要有以下几种方法检测NADH含量：酶循环分析、高效液相色谱法、毛细管电泳法。由于NADH是一种强荧光物质，而NAD无荧光，因此也可以通过荧光法检测NADH含量，与上述检测NADH的方法相比，荧光法易操作，可作为快速检测细菌总数的方法，具有广阔的产业应用和市场前景。目前只有少数报道NADH荧光法快速测定细菌总数。王静雪等人利用NADH荧光法建立了快速检测大肠杆菌方法，该方法利用Tris-HCl作为裂解液，高温提取大肠杆菌胞内NADH并测定其荧光强度，检测便捷但检出限较高，为104CFU/mL。

[0004] 本发明针对目前常用的检测活性炭滤池中细菌总数方法的局限性，优化提取细菌胞内NADH条件，实现对滤池内细菌总数简易、快捷、高效的检测，检出限低，准确。目前尚未有利用NADH荧光法测定生物活性炭滤池中细菌总数的报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是建立快速检测生物活性炭滤池表面细菌总数的新方法。本发明过程包括NADH法与传统的HPC法和ATP法进行比较、细菌胞内NADH提取方法及检测限测定。

[0006] 根据上述目的，本发明旨在提供一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] (1)取1～5g生物活性炭样品，加入10～20mL 磷酸盐缓冲溶液，超声处理10～20min，得到细菌脱附溶液；

[0008] (2)在4℃下离心步骤(1)所得到的细菌脱附溶液，6000r/min下离心10min，得到沉淀菌体细胞，使用裂解液复溶所述沉淀菌体细胞，涡旋混合均匀，60～80℃水浴30～40min后，冷却至室温，在4℃下10000r/min离心10min，将上清液转移至96孔板，立即利用多功能读板机荧光模式进行NADH测定，激发波长为350～400nm，发射波长为400～650nm。

[0009] 其中，所述裂解液为100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100。

[0010] 其中，所述步骤(2)中所述水浴温度为80℃，水浴时间为30min。

[0011] 本发明的技术方案中采用NADH法对活性炭滤池表面的细菌总数检测，并与传统的HPC法(异养菌平板计数法)和ATP法比较。利用磷酸盐缓冲溶液(PBS)对生物活性炭表面细菌进行脱附，取得到的细菌脱附溶液进行异养菌平板计数，具体步骤为取1～5g生物活性炭样品，加入10mL PBS脱附溶液，超声处理15min。此时，可以利用ATP法检测细菌菌液的ATP浓度。同时，可吸取超声后的脱附溶液进行HPC法检测，具体步骤为：将超声后脱附溶液稀释至合适浓度，在22℃恒温箱中用R2A培养基培养7天，7天后得到单位质量炭样的菌落数值。

[0012] 取PBS对生物活性炭表面细菌进行脱附后获得的细菌脱附溶液在4℃下离心，转速为6000r/min，离心10min，得到沉淀菌体细胞。利用裂解液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100)复溶菌体细胞，涡旋混合均匀，60～80℃水浴30～40min后，冷却至室温，在4℃下10000r/min离心10min，转移上清液至96孔板，立即利用多功能读板机荧光模式进行NADH测定，激发波长为350～400nm，发射波长为400～650nm，得到NADH浓度，数据分析发现生物活性炭滤池细菌NADH浓度与其HPC值拟合，呈良好的线性关系，且与脱附细菌ATP浓度也呈现良好的线性关系。

[0013] 其次，本发明对大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa细菌菌液梯度稀释，分别得到不同细菌浓度的菌液。利用不同的提取方法进行对比分析提取NADH效果，经过提取方法对比后，最终选取最佳裂解液B(100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100)提取不同浓度E.coli和P.aeruginosa菌液的NADH，在此基础上得出NADH荧光法检出限值：大肠杆菌E.coli和铜绿假单胞菌P.aeruginosa检出限值为103CFU/mL。

[0014] 本发明的上述检测方法提取检测过程步骤少，只需用荧光检测仪，符合快速检测的需求，可适用于生物活性炭滤池细菌总量的快速检测，并替代传统的测定活性炭滤池细菌总数的方法。附图说明

[0015] 图1：生物活性炭滤池细菌总数NADH浓度与HPC、ATP浓度相关性；

[0016] 图2：NADH提取条件选择；

[0017] 图3：大肠细菌E.coli NADH检出限值；

[0018] 图4：铜绿假单胞菌P.aeruginosa NADH检出限值。

具体实施方式

[0019] 下面结合附图，对实施例作详细说明。

[0020] 实施例1：NADH提取实验条件摸索

[0021] 将大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa细菌过夜培养后，离心多次，PBS缓冲液洗涤，以去除培养基，将获得的细菌悬液在4℃下6000r/min离心10min，弃去上清液，得到菌体细胞。

[0022] 配置不同组分配比的三种裂解液：

[0023] 裂解液A：100mM Tris-HCl和10mM EDTA；

[0024] 裂解液B：100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100；

[0025] 裂解液C：100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.1％Tween-20；

[0026] 设置不同NADH提取条件：

[0027] 条件a：4℃静置30min；

[0028] 条件b：4℃冰浴超声30min；

[0029] 条件c：80℃水浴加热30min；

[0030] 分别采用裂解液A、B、C复溶菌体细胞，涡旋混合均匀后，在不同条件a、b、c下提取NADH，提取完毕后，恢复温度至室温，在4℃下10000r/min离心10min，转移上清液至96孔板，立即利用多功能读板机荧光模式进行NADH测定，测定所使用的激发波长为350nm，发射波长为650nm。实验结果如附图2所示，通过对比发现，采用裂解液B：100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100，在80℃下加热30min所提取获得的NADH量最优。

[0031] 实施例2：大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa检出限值确定

[0032] 大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa细菌过夜培养后，离心多次洗去培养基，PBS缓冲液梯度稀释至合适浓度，吸取1mL菌液至R2A培养基，22℃恒温培养箱下培养7天，分别得到两种细菌的单位体积菌落数值。同时，将每个梯度的大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa细菌菌液在4℃下
6000r/min离心10min，得到不同数量的菌体细胞。利用裂解液B复溶上述获得的菌体细胞，涡旋混合均匀，80℃水浴30min后，冷却至室温，在4℃下10000r/min离心10min，转移上清液至96孔板，立即利用多功能读板机进行荧光法NADH测定。得出细菌的NADH浓度的检出限值，结果如附图3和4所示，大肠杆菌Escherichia coli和铜绿假单胞菌Pseudomonas
3
aeruginosa检出限值为10CFU/mL。

[0033] 实施例3：生物活性炭滤池样品细菌量快速测定

[0034] 取不同运行日期(滤池内的细菌是随时间增加而增加的，最终达到稳定状态)的生物活性炭滤池样品(共计23个，其中细菌是逐渐增加的。)进行细菌量快速测定。取1～5g生物活性炭样品，加入10mL PBS脱附溶液，超声处理15min。对脱附得到后的菌液进行梯度稀释，稀释倍数为10～106倍，取稀释倍数为104～106的菌液1mL,在22℃恒温箱中用R2A培养基培养7天，7天后得到单位质量炭样的菌落数值。同时用裂解液(100mM Tris-HCl、10mM EDTA和0.05％Triton X-100)，80℃水浴30min提取脱附后细菌菌液的NADH，用多功能读板机荧光模式测定NADH浓度，同时测定脱附细菌菌液的ATP值。如附图1所示，脱附细菌菌液的NADH浓度与HPC、ATP浓度拟合后，发现生物活性炭滤池细菌的NADH检测值与HPC法检测结果(R2＝0.8784)和脱附细菌ATP浓度(R2＝0.9375)均呈良好的线性关系。

[0035] 此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

标题	发布/更新时间	阅读量
用于矫正颜色视觉的光学镜片	2020-05-08	170
LED发光装置及照明设备	2020-05-08	235
一种基于多波长光子筛阵列的光纤耦合器	2020-05-11	30
一种激光二极管的发射功率自动调整电路及方法	2020-05-08	550
一种环网柜放电检测装置	2020-05-08	730
一种波长调制情况下的二极管激光器动态波长测量装置及方法	2020-05-11	684
投影装置、后视设备和机动车	2020-05-08	539
一种污水管道COD速检仪及其方法	2020-05-08	787
基于级联双平行马赫曾德尔调制器产生光频梳的装置和方法	2020-05-08	862
一种紫外可见分光光度计	2020-05-08	235

一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法

一种快速测定生物活性炭滤池表面细菌总数的方法

技术领域

背景技术

发明内容

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：