镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用
阅读：269发布：2021-04-13
专利汇可以提供镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种 镊子 状复合 纳米探针 及其制备方法与应用。所述复合纳米探针是由镊子形状的DNA折纸纳米结构为模板，诱导棒状金纳米颗粒自组装而成的复合纳米探针结构。所述复合纳米探针可以识别特定的底物--还 原型 谷胱甘肽。本发明的复合纳米探针在检测还原型谷胱甘肽时具有操作简便，灵敏度高，检测条件温和等优势。理论上，本发明的复合纳米探针可以通过细胞胞吞的方式进入胞质，在不破坏细胞 生物 活性的前提下检测细胞内的还原型谷胱甘肽浓度。本发明在检测细胞 水 平底物浓度上有着广泛的应用前景。，下面是镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.镊子状复合纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、合成金纳米棒，并用带有巯基官能团的特定序列DNA修饰在金纳米棒的表面；
B、合成在预先设计位点带有特定捕获链的DNA折纸；
C、将步骤A修饰的金纳米棒与DNA折纸进行组装，得到镊子状复合纳米探针；
步骤A中所述带有巯基官能团的特定序列DNA如下：5′-TATTATTATTATTATTTTT-SH-3′和
5′-TTTTTTTTTTTTTTTAGCG-SH-3′；
步骤B中所述DNA折纸是由1条M13mp18噬菌体长链DNA和172条短链DNA通过碱基互补配对组装而成，其中172条短链中包含32条捕获链；172条短链DNA和长链DNA的核酸序列分别如SEQ ID NO:1-173所示；
步骤C中所述修饰的金纳米棒通过其表面修饰的带有巯基官能团的特定序列DNA与所述DNA折纸上的捕获链杂交，组装得到镊子状复合纳米探针。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A包括：
A1、合成晶种溶液；
A2、以步骤A1合成的晶种为基底生长金纳米棒；
A3、纯化步骤A2得到的金纳米棒；
A4、将带有巯基官能团的特定序列DNA修饰于金纳米棒的表面。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A1包括：将50ul质量百分数为2％的氯金酸溶液加入至9.5ml的CTAB溶液中，搅拌均匀，然后在搅拌条件下向其中加入6mM硼氢化钠溶液1ml，30℃水浴6～12h，得到晶种溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A2包括：在反应器中加入100ml的CTAB溶液，然后在搅拌下加入780ul的2％氯金酸溶液，在搅拌条件下加入700ul的10mM硝酸银溶液和480ul的100mM抗坏血酸溶液，然后加入160ul步骤A1制备的晶种溶液，搅拌均匀，于30℃水浴12h，得到含有金纳米棒的胶体溶液；
步骤A3包括：将步骤A2得到的胶体溶液以3000rpm离心20min，弃沉淀，得到纯化的金纳米棒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A4包括：
(1)将人工合成的带有巯基官能团的特定序列DNA加水分别配制成100uM的DNA溶液，并加入适量的TCEP至终浓度为20mM；
(2)将800ul 5×TBE缓冲溶液、40ul 1％SDS溶液和400ul 5M NaCl溶液混合，加水稀释至总体积4ml，用盐酸调pH至3.6，即为修饰液；
(3)在震荡条件下，先将步骤(1)的100uM溶液100ul加入至上述修饰液中，再于震荡条件下加入步骤A3纯化的金纳米棒，于30℃水浴6h，得到修饰的金纳米棒；其中，金纳米棒与每种DNA的摩尔比分别为1:2500。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B包括：
B1、人工合成M13mp18噬菌体长链DNA和172条短链DNA，将长链DNA与短链DNA按摩尔比
1:5～1:10混合，在含Mg2+的1×TAE缓冲溶液中进行自组装；
自组装条件为：PCR扩增仪设置以下程序：从95℃降温至65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留5min；从65℃降温至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留10min；
B2、自组装完成后，将自组装产物与含Mg2+的1×TAE缓冲溶液按1:4的体积比混合，加入截留分子量为100KDa的离心柱中，5000rpm离心3min；
B3、向离心柱中加入含Mg2+的1×TAE缓冲溶液，重复离心洗涤3次，即得DNA折纸；
其中，所述含Mg2+的1×TAE缓冲溶液的组成为：0.04M Tris，0.02M乙酸，0.003M EDTA和
0.0125M醋酸镁，pH8.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C包括：
C1、将修饰的金纳米棒与DNA折纸按摩尔比4:1～10:1混合，在含Mg2+的1×TAE缓冲溶液中进行自组装；
自组装条件为：PCR扩增仪设置以下程序：从45℃降温至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留5min；当温度在25℃停留5min后，升温至45℃进行下一个循环，反应6个循环结束；
C2、自组装完成后，将自组装产物进行0.5％～2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：85V，
1h；
C3、切胶回收电泳产物，即为镊子状复合纳米探针。
8.根据权利要求1-7任一项所述方法制备的镊子状复合纳米探针。
9.根据权利要求9所述的复合纳米探针，其特征在于，所述复合纳米探针上金纳米棒的长度为40±4nm，直径为10±1nm；紫外光谱的吸收峰值在760±20nm波长区域；和/或圆二色光谱检测所述复合纳米探针的波长范围为400～900nm。
10.权利要求8或9所述复合纳米探针在检测还原型谷胱甘肽中的应用。
镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于纳米科学领域，具体地说，涉及一种镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用。
背景技术
[0002] 当物质的尺寸由宏观缩小到纳米尺度时，物质的许多物理化学性质会发生明显的变化。例如，许多贵金属颗粒的尺寸在10～100纳米之间时，由于其尺寸小于金属固体中电子的平均自由程；并且金属的能带逐渐分立成密集排布的能级，金属的导电性质，光学性质等将发生变化。其中一项重大变化是：贵金属的纳米颗粒中的电子会聚集在金属颗粒的表面而产生表面等离子体(surface plasmon)。表面等离子体使得金属纳米颗粒的表面带有电荷。当外界光源射入时，表面等离子体会吸收光的特定波长的能量发生集体的振动。当入射光的频率接近于金属粒子表面等离子体的固有振动频率时，光的吸收值达到最大且发生表面等离子共振效应。
[0003] 当表面等离子体产生共振时，金属粒子周围会差生显著的强电磁场。电磁场的强度与分布可以通过麦克斯韦方程组求解。当一个金属粒子与其他金属粒子在空间上发生自组装时，表面等离子体的电磁场可以被显著的增强。因此，寻找一种可以精确组装金属纳米粒子的方法十分必要。
[0004] DNA折纸技术为精确组装金属纳米粒子提供了一种可行的思路。DNA折纸是由一条从M13噬菌体中提取出的长链环状DNA单链，与人工设计合成的多条短链DNA通过严格的碱基互补配对原则组装而成的纳米结构。其优点在于可以人为的设计DNA折纸的形状以及在DNA折纸上精确的位点定位。运用DNA折纸作为金属纳米颗粒组装的模板，可以自由的调控金属纳米颗粒的空间位置以及相互之间的夹角。这为研究金属表面等离子体共振现象提供了有力且关键的技术支持。
[0005] 谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的小分子多肽。分为还原型和氧化型两种。还原型谷胱甘肽是由一分子的谷氨酸，一分子的半胱氨酸和一分子的甘氨酸依靠肽键连接而成的。由于谷胱甘肽中的半胱氨酸残基上含有具有还原性的巯基，谷胱甘肽具有较强的还原性。在生物体细胞内，谷胱甘肽有着参与酶催化反应，维持蛋白质活性，清除过量的氧自由基等重要功能。因此，检测还原型谷胱甘肽对于了解细胞水平的生物效应十分有意义。
[0006] 现存的检测谷胱甘肽的方法往往基于化学反应或紫外分光光度法，存在诸多问题，譬如需要较高的检出限，检测生物样品前需要破坏生物组织，检测方法繁琐等。
发明内容
[0007] 本发明的目的是提供一种镊子状复合纳米探针及其制备方法与应用。
[0008] 为了实现本发明目的，本发明提供的镊子状复合纳米探针，其是由镊子形状的DNA折纸(DNA origami)纳米结构为模板，诱导棒状金纳米颗粒(Au nanorods)自组装而成的复合纳米探针结构。
[0009] 第一方面，本发明提供镊子状复合纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010] A、合成金纳米棒，并用带有巯基官能团的特定序列DNA修饰在金纳米棒的表面；
[0011] B、合成在预先设计位点带有特定捕获链的DNA折纸；
[0012] C、将步骤A修饰的金纳米棒与DNA折纸进行组装，得到镊子状复合纳米探针；
[0013] 步骤A中所述带有巯基官能团的特定序列DNA如下：5′-TATTATTATTATTATTTTT-SH-3′和5′-TTTTTTTTTTTTTTTAGCG-SH-3′(SEQ ID NO:174-175)；
[0014] 步骤B中所述DNA折纸是由1条M13mp18噬菌体长链DNA和172条短链DNA通过碱基互补配对组装而成，其中172条短链中包含32条捕获链；172条短链DNA和长链DNA的核酸序列分别如SEQ ID NO:1-173所示；
[0015] 步骤C中所述修饰的金纳米棒通过其表面修饰的带有巯基官能团的特定序列DNA与所述DNA折纸上的捕获链杂交，组装得到镊子状复合纳米探针。
[0016] 前述的方法，步骤A包括：
[0017] A1、合成晶种溶液；
[0018] A2、以步骤A1合成的晶种为基底生长金纳米棒；
[0019] A3、纯化步骤A2得到的金纳米棒；
[0020] A4、将带有巯基官能团的特定序列DNA修饰于金纳米棒的表面。
[0022] 步骤A2包括：在反应器中加入100ml的CTAB溶液，然后在搅拌下加入780ul的2％氯金酸溶液，在搅拌条件下加入700ul的10mM硝酸银溶液和480ul的100mM抗坏血酸溶液，然后加入160ul步骤A1制备的晶种溶液，搅拌均匀(搅拌2min)，于30℃水浴12h，得到含有金纳米棒的胶体溶液。
[0023] 步骤A3包括：将步骤A2得到的胶体溶液以3000rpm离心20min，弃沉淀，得到纯化的金纳米棒。
[0024] 步骤A4包括：
[0025] (1)将人工合成的带有巯基官能团的特定序列DNA加水分别配制成100uM的DNA溶液，并加入TCEP至终浓度为20mM以确保所有的巯基都处于还原状态；
[0026] (2)将800ul 5×TBE缓冲溶液、40ul 1％SDS溶液和400ul 5M NaCl溶液混合，加水稀释至总体积4ml，用盐酸调pH至3.6，即为修饰液；
[0027] 其中，1×TBE缓冲溶液的组成为：89mM Tris，89mM硼酸和2mM EDTA，pH8.0，以水配制；
[0028] (3)在震荡条件下，先将步骤(1)的100uM溶液100ul加入至上述修饰液中，再于震荡条件下加入步骤A3纯化的金纳米棒，于30℃水浴6h，得到修饰的金纳米棒；其中，金纳米棒与每种DNA的摩尔比分别为1:2500。
[0029] 前述的方法，步骤B包括：
[0030] B1、人工合成M13mp18噬菌体长链DNA和172条短链DNA，将长链DNA与短链DNA按摩尔比1:5～1:10混合，在含Mg2+的1×TAE缓冲溶液中进行自组装；
[0031] 自组装条件为：PCR扩增仪设置以下程序：从95℃降温至65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留5min；从65℃降温至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留10min；整个退火过程约为8h；
[0032] B2、自组装完成后，将自组装产物与含Mg2+的1×TAE缓冲溶液按1:4的体积比混合并加入截留分子量为100KDa的离心柱中，5000rpm离心3min；离心除去过量短链DNA；
[0033] B3、向离心柱中加入含Mg2+的1×TAE缓冲溶液，重复离心洗涤3次，即得DNA折纸。
[0034] 其中，所述含Mg2+的1×TAE缓冲溶液的组成为：0.04M Tris，0.02M乙酸，0.003M EDTA和0.0125M醋酸镁，pH8.0。
[0035] 前述的方法，步骤C包括：
[0036] C1、将修饰的金纳米棒与DNA折纸按摩尔比4:1～10:1(优选8:1)混合(并保持DNA折纸的浓度在3nM)，在含Mg2+的1×TAE缓冲溶液中进行自组装；
[0037] 自组装条件为：PCR扩增仪设置以下程序：从45℃降温至25℃，每1℃为一个梯度，每个梯度停留5min；当温度在25℃停留5min后，升温至45℃进行下一个循环,反应6个循环结束，并保存在4℃；
[0038] C2、自组装完成后，将自组装产物进行0.5％～2％琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为：85V，1h；
[0039] C3、切胶回收电泳产物，即为镊子状复合纳米探针。
[0040] 步骤C2中，用于配制凝胶的溶液为含10mM MgCl2的1×TBE缓冲溶液。电泳使用的溶液与上述配制凝胶所用的溶液相同。
[0041] 第二方面，本发明提供按照所述方法制备的镊子状复合纳米探针。
[0042] 所述复合纳米探针能够识别特定底物--还原型谷胱甘肽。所述的复合纳米探针在识别底物时，其镊子结构的两根悬臂的角度会发生开合变化。
[0044] 光学信号变化与所述复合纳米探针的两臂开合关系为：当复合纳米探针的两臂打开时，其圆二色谱光学信号减弱；当复合纳米探针的两臂合上时，其圆二色谱光学信号增强。
[0045] 当引入还原型谷胱甘肽时，谷胱甘肽切断了位于复合纳米探针之间的双硫键，导致镊子的两臂打开。
[0046] 所述复合纳米探针上金纳米棒的长度为40±4nm，直径为10±1nm；紫外光谱的吸收峰值在760±20nm波长区域。
[0047] 圆二色光谱检测所述复合纳米探针的波长范围为400～900nm。
[0048] 第三方面，本发明提供所述复合纳米探针在检测还原型谷胱甘肽中的应用。
[0049] 在实际检测过程中，将还原型谷胱甘肽溶液加入至复合纳米探针溶液中，室温(25℃～30℃)孵育6-12h后。在圆二色光谱中检测其光谱信号，根据光谱信号的减弱可以计算出还原型谷胱甘肽的浓度。还原型谷胱甘肽的线性检测范围为0.1mM～5mM，检测下限为0.1mM。
[0050] 优选地，还原型谷胱甘肽与复合纳米探针在含10mM MgCl2的1×TBE缓冲溶液中进行反应。
[0051] 优选地，圆二色光谱检测复合纳米探针的波长范围为400～900nm。
[0052] 借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
[0053] (一)本发明提供的复合纳米探针结构是由金纳米棒和DNA折纸结构组装而成的。DNA折纸的结构形态可以人为控制，所有用于组装金纳米棒的捕获链的位点也是精确可控的。可以通过调节捕获链的位点控制金纳米棒组装的形态，从而控制纳米探针的初始圆二色光谱信号的强弱。并且通过控制金纳米棒的长径比来控制复合纳米探针的圆二色光谱的信号范围。
[0054] (二)鉴于还原型谷胱甘肽切断双硫键的反应十分可靠，并且本发明通过复合纳米探针的结构开合引起的圆二色谱光学信号变化放大了双硫键被打开的过程，使得本方法具有较高的响应灵敏度，且检测需要的样品少等优点。同时，相比于化学氧化还原法，本发明提供的复合纳米探针具有反应条件温和可控，反应产物无毒无害等优势。
[0055] (三)本发明提供的复合纳米探针结构是由金纳米棒和DNA折纸结构组装而成的；其中，金纳米棒化学性质稳定，不具有生物毒性，而DNA折纸结构本身就是由DNA链按照碱基互补配对规则组装而成的，具有良好的生物兼容性。本发明提供的复合纳米探针尺寸为纳米级别；理论上可以通过胞吞等途径被细胞摄取，因而具有潜在的检测细胞水平的还原型谷胱甘肽的可能，在生物医学领域有着广泛的应用前景。
[0056] (四)本发明以镊子形状的DNA折纸纳米结构为模板，诱导两根金纳米棒组装出一定的夹角，通过底物与DNA折纸结构的相互作用，改变两根金棒间的夹角。金棒间夹角的变换可以通过圆二色谱信号(circular dichroism signal)的差异所检测。相较传统的检测技术，本发明提供的复合纳米探针具有成本低，检测手段方便快捷，检测限低等优势。附图说明
[0057] 图1为本发明实施例3中制备的复合纳米探针材料在引入还原型谷胱甘肽前后处于打开或闭合状态的三维模型示意图。
[0058] 图2A和图2B为本发明复合纳米探针的设计图。
[0059] 图3为本发明实施例2中组成复合纳米探针的金纳米棒的电子显微镜表征图。
[0060] 图4为本发明实施例3中复合纳米探针结构的用琼脂糖凝胶纯化产生的条带。其中，1-6泳道为自组装产物样品。
[0061] 图5为本发明实施例4中复合纳米探针的闭合状态(A)与打开状态(B)的透射电子显微镜表征图。
[0062] 图6为本发明实施例4中复合纳米探针在检测谷胱甘肽前后的圆二色光谱信号变化。
具体实施方式
[0063] 本发明提供一种基于圆二色光谱检测还原型谷胱甘肽浓度的复合纳米探针。
[0064] 本发明通过谷胱甘肽与复合纳米探针中含有双硫键的区域发生氧化还原反应，导致复合纳米探针的形貌从闭合变为打开状态；复合纳米探针形貌的开合变化会在圆二色光谱中表现出来。未加入还原型谷胱甘肽时，复合纳米探针结构处于闭合状态，圆二色光谱信号较强；加入还原型谷胱甘肽后，结构中的二硫键打开，复合纳米探针处于打开状态，圆二色谱信号减弱。
[0065] 本发明采用以下技术方案：
[0066] 一方面，本发明提供一种由金纳米棒与DNA折纸结构组装而成的镊子状的复合纳米探针。
[0067] 在本发明的复合纳米探针结构中，所述的复合纳米探针是由DNA折纸结构与金纳米棒组装而成的复合纳米结构。
[0068] 本发明提供的复合纳米探针结构的制备方法包括所述的以下步骤：
[0069] (1)用晶种生长法合成金纳米棒，并用带有巯基官能团的特定序列DNA修饰在金纳米棒的表面。
[0070] (2)合成在预先设计位点带有特定捕获链的DNA折纸纳米结构。
[0071] (3)将金纳米棒与DNA折纸纳米结构组装，得到所述的复合纳米探针结构。
[0072] (4)将得到的复合纳米结构用琼脂糖凝胶电泳提纯。
[0073] 优选地，步骤(1)中的金纳米棒合成是由晶种法合成的，所需的晶种为几十个金原子组成的金纳米簇，分散在100mM浓度的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中。
[0074] 优选地，步骤(1)合成的金纳米棒的长度为40±4nm，直径为10±1nm；紫外光谱的吸收峰值在760±20nm波长区域。
[0075] 优选地，步骤(1)合成的金纳米棒分散在100mM浓度的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液中。
[0076] 优选地，步骤(1)中修饰在条金棒上的DNA链序列如下(SEQ ID NO:174-175)：
[0077] S10：TATTATTATTATTATTTTT-SH
[0078] S15：TTTTTTTTTTTTTTTAGCG-SH
[0079] 优选地，步骤(1)中，修饰所用的两种DNA链与金纳米棒的摩尔比分别为2500:1。
[0080] 优选地，步骤(1)中，用DNA链修饰金纳米棒，应在特殊的修饰液中进行。修饰液的配制方法如下：800ul 5×TBE缓冲溶液、40ul 1％SDS溶液和400ul 5M NaCl溶液混合，加水稀释至总体积4ml，用盐酸调pH至3.6。
[0081] 优选地，步骤(1)中用DNA修饰金纳米棒时，DNA链与金纳米棒混合后在30℃恒温水浴孵育6h以完成修饰。
[0082] 优选地，步骤(2)所述DNA折纸结构是由172条人为设计的短链DNA(包含32条捕获链)；与一条从M13mp18噬菌体中提取的，长度为7249个碱基的天然DNA长链，通过严格的碱基互补配对组装而成的核酸纳米结构。由M13mp18噬菌体中提取出的长度为7249个碱基的DNA长链。172条短链DNA和长链DNA的核酸序列分别如SEQ ID NO:1-173所示。
[0084] Staple1：TAAAGTACCATTCATCTCATTACTCCATGTTACTTAGCAG
[0085] Staple2：CAATACGCTGAGAGCCAGGATAGAAAAACATAGTTAATTGC AATAA[0086] Staple3：TTTATCACCGGAACAA
[0087] Staple4：CACCAATAATAATTTTTTAAACAACGAACTGGGAACCTG
[0088] Staple5：GGCATTTTCAAATGAACGCCATGGGCGCATCGTAACGC
[0089] 优选地，DNA折纸结构上设计的捕获链一共有32条，替换了32条相应的短链，32条捕获链的序列分别如SEQ ID NO:1-32所示。
[0090] 优选地，以上32条位于DNA折纸纳米结构上的捕获链与修饰在金纳米棒表面的DNA链互补，从而达到组装金棒的目的。
[0091] 优选地，在步骤(2)中，组装DNA折纸结构加入的由M13mp18噬菌体中提取出的长链，与人工设计的短链的摩尔比为1:10。
[0092] 优选地，在步骤(2)中，投入的M13mp18噬菌体中提取出的长链的浓度为10nM。
[0093] 优选地，步骤(2)中，组装DNA折纸纳米结构应在含Mg2+的1×TAE缓冲溶液中进行。
[0094] 优选地，步骤(2)中，组装DNA折纸纳米结构在PCR扩增仪中进行退火，以控制反应温度变化，退火温度程序为从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程约为8h。
[0095] 优选地，步骤(2)中，组装完成的DNA折纸纳米结构需要纯化以去除过量的短链DNA。所述纯化的步骤为：将得到的退火产物与含Mg2+的1×TAE缓冲溶液以1:4的体积比混合并加入100KDa的离心柱，进行离心。
[0096] 优选地，步骤(3)中，所述金纳米棒通过带有巯基官能团的DNA链修饰，修饰上金纳米棒的DNA链通过碱基互补配对的方式与DNA折纸结构上伸出的捕获链杂交，组装成所述的复合纳米结构。
[0097] 优选地，步骤(3)中，将上述修饰好的金纳米棒与带有捕获链的DNA折纸纳米结构以摩尔比8:1的比例混合。在PCR扩增仪中，以45℃～25℃，每1℃停留5分钟，当温度在25℃停留5min后，升温至45℃进行下一个循环，共6个循环，完成组装。
[0098] 优选地，步骤(4)中，提纯复合纳米探针结构所用的琼脂糖凝胶的质量分数为1％，用于配制凝胶的溶液为含10mM MgCl2的1×TBE缓冲溶液。
[0100] 本发明进行了大量实验，通过改变DNA折纸纳米结构上的捕获链位点调控金纳米棒组装的空间位置；并且采用了一系列紫外-可见光吸收波长从700nm～790nm的金纳米棒作为原料，探究了金纳米棒尺寸，距离与相互夹角之间的关系对于圆二色谱光学信号响应之间的关系。
[0101] 另一方面，本发明提供一种基于复合纳米探针材料与还原型谷胱甘肽作用可以形态的变化并且导致复合纳米探针结构对于圆二色光谱的光学响应发生变化的体系。因而，利用在与还原型谷胱甘肽与复合纳米探针结构反应后该结构不同形态在圆二色光谱中的信号变化，来检测还原型谷胱甘肽的浓度大小。
[0102] 优选地，还原型谷胱甘肽与复合纳米探针在含10mM MgCl2的1×TBE缓冲溶液中进行反应。
[0103] 优选地，还原型谷胱甘肽与复合纳米探针的反应温度为25℃。
[0104] 优选地，还原型谷胱甘肽与复合纳米探针的反应时间为6～12h。
[0105] 优选地，圆二色光谱检测复合纳米探针的波长范围为400～900nm。
[0106] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0107] 本发明所用仪器与试剂如下：
[0108] 仪器：
[0109] MastercycLer Pro梯度PCR仪(Eppendorf公司，德国)；UV-2600型紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)；Milli-Q Reference超纯水处理系统(Merck Millipore公司，德国)；FE20K pH计(mettler Toledo公司，瑞士)；5424小型高速离心机(Eppendorf公司，德国)；5810R大型高速离心机(Eppendorf公司，德国)；Vortex Genius 3型震荡混合仪(IKA公司，德国)；7700型透射电子显微镜(Hitachi公司，日本)；JY-SCZ9型垂直凝胶电泳装置(君意东方公司，中国)；YP5002型电子分析天平(Mettler Toledo公司，瑞士)。
[0110] 试剂：
[0111] 本发明中涉及的复合纳米结构的制备主要用到以下试剂：
[0112] 氯化镁，Tris碱，硼酸，EDTANa2,冰醋酸，氯化钠，十二烷基磺酸钠(SDS),十六烷基二甲基溴化铵(CTAB),三水合氯金酸，硼氢化钠，抗坏血酸，硝酸银，agarose(琼脂糖)。以上所用的试剂均为分析纯，购自Sigma-ALdrich公司。
[0113] 所用缓冲溶液：
[0114] 含Mg2+的1×TAE缓冲溶液(1×TAE/Mg2+缓冲溶液)的组成为：0.04M Tris，0.02M乙酸，0.003M EDTA和0.0125M醋酸镁，pH8.0。
[0115] 1×TBE缓冲溶液的组成为：89mM Tris，89mM硼酸和2mM EDTA，pH8.0，以水配制。
[0116] 实施例1带有捕获位点的DNA折纸纳米结构的制备及纯化
[0117] 首先将模板链(由M3mp18噬菌体中提取的天然长链，SEQ ID NO:173)和辅助折叠链(人为设计的短链DNA，SEQ ID NO:33-172)、捕获链(设计用于组装金纳米棒的短链DNA，SEQ ID NO:1-32)按照1:10:10的摩尔比进行混合。
[0118] 上述捕获链可以根据具体需要，调整链的个数与位点，已到达控制金纳米棒组装形态的目的。
[0119] 在1×TAE/Mg2+缓冲溶液条件下进行退火；退火条件为：从95℃到65℃，每5℃为一个梯度，每个梯度停留时间为5min；从65℃到25℃，每1℃为一个梯度，每个温度梯度停留时间为10min；整个退火过程约为8h；退火完成后，将DNA折纸结构样品加入离心柱(截留分子量大小为100KDa)，加入1×TAE/Mg2+缓冲溶液离心除去过量短链DNA；离心转速5000rpm，离心3min，重复三遍。
[0120] 实施例2金纳米棒的制备，纯化以及修饰
[0121] 金纳米棒的制备步骤如下：
[0122] 步骤(1)，合成晶种溶液。
[0123] 步骤(2)，以步骤(1)合成的晶种为基底生长金纳米棒。
[0124] 步骤(3)，用离心机纯化步骤(2)得到的金纳米棒。
[0125] 步骤(4)，用带有巯基的单链DNA修饰在金纳米棒的表面。
[0126] 步骤(1)合成晶种使用的试剂为：质量分数为2％的氯金酸溶液，6mM的硼氢化钠溶液，以及100mM的CTAB溶液。
[0127] 将50ul质量分数为2％的氯金酸溶液加入至9.5ml的CTAB溶液中，搅拌至均匀。将低温的水配制的6mM，1ml的硼氢化钠溶液，在强烈搅拌下快速加入，30℃水浴6h完成晶种的合成。
[0128] 步骤(2)中使用的试剂为：质量分数2％的氯金酸溶液，10mM的硝酸银溶液，100mM的抗坏血酸溶液，以及100mM的CTAB溶液。
[0129] 首先，在反应容器中加入100ml的CTAB溶液，然后在搅拌下加入780ul的2％氯金酸溶液，在搅拌条件下加入700ul的10mM硝酸银溶液，在搅拌的条件下加入480ul的100mM抗坏血酸溶液，加入160ul步骤(1)制备的晶种溶液，搅拌2min使之分散均匀，之后将溶液放入30℃水浴12h，得到制备好的金纳米棒。
[0130] 步骤(2)制备好的金纳米棒中往往带有一些杂质，如金纳米球，需要通过离心的方式去除。
[0131] 将步骤(2)制备好的金纳米棒胶体放入离心机中，以3000rpm的转速离心20min，下层沉淀即为金纳米球等杂质，去除下层杂质即得到纯化后的金纳米棒胶体(图3)。
[0132] 将人工合成的带有巯基的DNA链，用超纯水溶解成100uM的溶液，并加入TCEP至终浓度为20mM以确保所有的巯基都处于还原状态。
[0133] 带有巯基的DNA链序列如下(SEQ ID NO:174-175)：
[0134] S10：TATTATTATTATTATTTTT-SH
[0135] S15：TTTTTTTTTTTTTTTAGCG-SH
[0136] 将800ul 5×TBE溶液,40ul 1％SDS溶液,400ul 5M NaCl溶液混合，加入超纯水稀释至总体积4ml，并用盐酸调pH至3.6，得到修饰液。
[0137] 在震荡条件下，先将100ul还原后的100uM的S10或S5DNA溶液分别加入至修饰液中，再在震荡的条件下加入步骤(3)纯化好的金纳米棒。控制金纳米棒加入的量为S10或S15DNA链的1/2500(摩尔比)。最后将修饰液转移至30℃水浴孵育6h完成修饰。
[0138] 实施例3镊子状复合纳米探针的制备
[0139] 将实施例1制备好的带有捕获链的DNA折纸纳米结构与实施例2纯化的金纳米棒按照摩尔比1:8混合，并保持DNA折纸的浓度在3nM。混合均匀后放入PCR扩增仪中，设置温度程序为45℃～25℃，每℃停留5min，当温度在25℃停留5min后，升温至45℃进行下一个循环，反应6个循环结束，并保存在4℃，完成复合纳米探针结构的组装。但组装好的结构中还存在过量的金纳米棒，需要用凝胶电泳的方式去除。
[0140] 用含10mM MgCl2的1×TBE缓冲溶液配制质量百分数为1％的琼脂糖凝胶。将先前在PCR扩增仪中反应好的复合纳米探针结构与过量的金纳米棒的混合溶液，加入1/10体积的50％甘油作为凝胶电泳的加样缓冲液。
[0141] 用85V电压电泳样品1h，可以观察到电泳后的复合纳米探针结构与过量的金纳米棒的混合溶液在琼脂糖凝胶中被分成了两个条带，如图4所示，电泳速度较快的条带为金纳米棒，较慢的条带为复合纳米探针结构。最后，将属于复合纳米探针结构的条带切胶回收，即得镊子状复合纳米探针。
[0142] 图1为本实施例制备的复合纳米探针材料在引入还原型谷胱甘肽前后处于打开或闭合状态的三维模型示意图。图中，复合纳米探针结构是由一个镊子形状的DNA折纸结构与两条金纳米棒组装而成的。其中，镊子形状的DNA折纸纳米结构是由两根用于结合金纳米棒的悬臂与中间的含有双硫键的铰链组成的。待测底物中的还原型谷胱甘肽会切断复合纳米探针中间铰链上的双硫键，使得复合纳米探针结构从闭合达到打开状态。
[0143] 图2A和图2B为本发明复合纳米探针的设计图(设计软件：cadnano)。
[0144] 实施例4复合纳米探针对于还原型谷胱甘肽的响应
[0145] 向实施例3构建的复合纳米探针中加入一定浓度的还原型谷胱甘肽，在30℃恒温保持6h。还原型谷胱甘肽会与闭合的复合纳米探针结构(图5，A)反应；反应后的复合纳米探针处于打开状态(图5，B)。用圆二色光谱仪在400nm～900nm波长范围表征复合纳米探针结构在与还原型谷胱甘肽反应后的信号变化，通过对比如图6所示的信号强度可以推算出被检测样品中还原型谷胱甘肽的含量。还原型谷胱甘肽的线性检测范围为0.1mM～5mM，检测下限为0.1mM。
[0146] 本发明通过DNA折纸纳米结构与金纳米棒的自组装，构建了一种复合纳米探针结构，该结构通过在特定位置引入双硫键官能团，使得其结构可以在还原型谷胱甘肽的环境中，由闭合状态变为打开状态。复合纳米探针结构形态上的开合变化可以精确的反映在圆二色光谱仪的光学信号中。
[0147] 本发明提供的复合纳米探针结构可用于检测底物中的还原型谷胱甘肽浓度，且相较于传统的检测方法，本发明具有反应条件温和可控，反应产物无毒无害，良好的生物兼容性等优势，在分析化学，生物检测方面，细胞内环境监控等方面有着巨大的应用价值。
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