在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞的富集
阅读：825发布：2020-05-08
专利汇可以提供在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞的富集专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及富集在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：将所述内分泌细胞聚集体解离为单细胞；用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低 温度 ，以获得冷冻保存的细胞；解冻所述冷冻保存的细胞；以及使解冻后获得的细胞再聚集为内分泌细胞。，下面是在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞的富集专利的具体信息内容。
1.冷冻保存在体外从干细胞衍生的胰腺内分泌细胞聚集体的方法，其包括以下步骤：
(i)将所述胰腺内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
(ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，以获得冷冻保存的单细胞。
2.根据权利要求1所述的冷冻保存胰腺内分泌细胞聚集体的方法，其中所述内分泌细胞是共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
3.富集在体外从干细胞衍生的内分泌细胞聚集体中共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)将所述内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
(ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，以获得冷冻保存的内分泌细胞，(iii)解冻所述冷冻保存的内分泌细胞；以及
(iv)再聚集在解冻后获得的所述内分泌细胞。
4.根据权利要求3所述的富集内分泌细胞聚集体的方法，其中步骤(i)的所述内分泌细胞是共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
5.根据权利要求4所述的富集内分泌细胞聚集体的方法，其中当步骤(i)的所述内分泌细胞是共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞时，所述方法进一步包括使所述共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞分化为共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞聚集体的步骤(v)。
6.根据权利要求1-5所述的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞，优选人胚胎干细胞。
7.冷冻保存的共表达NKX2.2和NKX6.1或共表达NKX6.1和C-肽的单个内分泌细胞。
8.按照根据权利要求1或2所述的冷冻保存方法获得的冷冻保存的单个内分泌细胞。
9.根据权利要求7或8所述的冷冻保存的单个内分泌细胞，其用于移植到受试者中或用于治疗糖尿病。
10.再聚集的内分泌细胞，其包含至少50％，优选至少60％，更优选至少70％，甚至更优选至少80％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
11.按照根据权利要求3-6中任一项所述的富集内分泌细胞聚集体的方法获得的再聚集的内分泌细胞。
12.根据权利要求10或11所述的再聚集的内分泌细胞，其用于移植到受试者中或用于治疗糖尿病或用作药物。
13.包含根据权利要求10或11所述的再聚集的内分泌细胞的组合物，其用于移植到受试者中或用于治疗糖尿病或用作药物。
14.包含根据权利要求12或13所述的再聚集的内分泌细胞的药物。
15.装置，其包含根据权利要求7-9中任一项所述的冷冻保存的单个内分泌细胞，或根据权利要求10-12中任一项所述的共表达NKX6.1和C-肽的再聚集的内分泌细胞，或根据权利要求13所述的组合物，或根据权利要求14所述的药物。
在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞的富集
技术领域
[0001] 本发明涉及富集并冷冻保存已在体外从干细胞衍生的内分泌细胞——NKX2.2和NKX6.1或NKX6.1和C-肽表达细胞的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 尽管胰岛素疗法可以挽救生命，但使用外源胰岛素可能难以获得稳定的血糖，并且控制不佳会导致严重的后期并发症(Nathan,D.M.,2014.The diabetes control and complications trial/epidemiology of diabetes interventions and complications study at 30years:overview.Diabetes care,37(1),pp.9–16)。将从人类供体中分离出的胰岛移植到1型糖尿病患者中已显示出良好的结果，其中一些患者变得完全不依赖于胰岛素(Barton F.B.等人,2012.Improvement in Outcomes of Clinical Islet Transplantation:1999-2010.Diabetes Care,35(7),pp.1436–1445)。尽管取得了这些进展，但是胰岛移植的主要挑战之一是供体胰岛的获取受限。这种供体材料的短缺可以通过经由人胚胎干细胞的分化在体外产生功能性胰岛素分泌细胞来克服。在体外从干细胞产生功能性胰岛素分泌细胞的方案正在不断发展(Pagliuca F.W.等人,2014.Generation of Functional Human PancreaticβCells In vitro.Cell,159(2),pp.428–439；Rezania A等人.Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.Nature Biotechnology,32(11),pp.1121–1133)；WO2012175633；WO2014033322；WO2015028614)。
[0004] 尽管这些方案令人印象深刻，但是它们会生成多个细胞群体，并且这些群体之间的比例因批次而异。冷冻保存细胞的大规模方法使得能够在移植前对每个细胞批次进行质量控制研究，并进一步简化移植后勤工作。另外，任何富集终产物中的内分泌群体的方法都被认为能改善移植的效力和安全性。
[0005] 因此，需要用于富集和保存在体外由干细胞获得的内分泌群体的大规模方法，该方法不仅允许改善表型和功能，而且还允许在储存和维持细胞的同时，在将这些细胞移植到受试者之前进行批次发放(batch release)研究。
[0006] 本发明人发现，包括解离、冷冻保存和再聚集共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的步骤的方法允许：
[0007] -富集细胞聚集体中的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞；
[0008] -减少细胞聚集体中的非内分泌细胞(即NKX6.1/C-肽/胰高血糖素阴性细胞)；
[0009] -降低团簇(cluster)异质性和团簇大小，从而减小体内差异；
[0010] -减小并控制批次间差异；
[0011] -储存并维持内分泌细胞和内分泌祖细胞；
[0012] -将细胞生产步骤与移植步骤分开，从而允许进行批次检验。
发明内容
[0013] 本发明提供了富集在体外由干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的大规模方法。本方法允许富集在体外由干细胞衍生的细胞聚集体中共表达NKX6.1和C-肽或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞。
[0014] 本发明提供了冷冻保存在体外由干细胞衍生的胰腺内分泌祖细胞的方法，该方法包括以下步骤：(i)将细胞聚集体解离为单细胞；以及(ii)冷冻保存所述单细胞。本发明涉及冷冻保存在体外由干细胞衍生的共表达NKX2.2和NKX6.1的单个内分泌祖细胞或共表达NKX6.1和C-肽的单个内分泌细胞的方法。
[0015] 本发明进一步涉及冷冻保存的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞和/或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞以及尤其是冷冻保存后在I型糖尿病治疗中的医学应用。
[0016] 本发明进一步涉及将冷冻保存的细胞解冻并再聚集为富含NKX6.1和C-肽共表达细胞的细胞聚集体。
[0017] 本发明进一步涉及再聚集的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞尤其在I型糖尿病治疗中的医学应用。
[0018] 本发明提供了富集在体外由干细胞衍生的细胞聚集体中的NKX6.1和C-肽共表达细胞，同时减小异质性、团簇大小和批间差异的方法。
[0019] 本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
[0021] 图1：过程概览：NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的富集
[0022] 使用已公开的方案(分别为WO2015/028614和WO2017/144695)将人胚胎干细胞(hESC)在体外分化为共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞或共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞。在任一阶段，使用酶消化或非酶消化使细胞聚集体解离。解离后，例如通过将细胞浸入冷冻保存介质中并将温度缓慢降低至-80℃来冷冻保存细胞，以获得冷冻保存的细胞。将这些冷冻保存的细胞快速解冻，并再聚集为共表达NKX6.1和C-肽的细胞。
[0023] 图2：共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的解离、冷冻保存和再聚集：在体外对内分泌表型的影响
[0024] A)在内分泌祖细胞阶段冷冻保存、解冻和再聚集后对内分泌细胞的富集。
[0025] 使hESC分化为β样细胞，并分析内分泌和非内分泌细胞群体的分布。对于每个实验，使用不包括(对照)或包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案分化来自同一批次的细胞。
[0026] B)上图：使用流式细胞术根据NKX6.1和C-肽共表达的存在来测量内分泌群体。结果以与对照相比的变化％来呈现。
[0027] 下图：当使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成细胞时，根据非内分泌标志物AFP、GHRL、KRT18和KRT 8的转录减少显示非内分泌细胞的去富集。当使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成细胞时，根据内分泌标志物GIPR、GLP1R和IAPP的转录增加来表征功能性内分泌细胞的富集。
[0028] C)解冻并再聚集后大小和异质性的减小
[0029] 左上图显示了使用不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的内分泌细胞聚集体。
[0030] 左下图显示了使用解离、冷冻保存和再聚集步骤生成的内分泌细胞聚集体。
[0031] 右上图和右下图(条形图)显示了使用 胰岛计数器测量的团簇大小分布。
[0032] 图3：共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的解离、冷冻保存和再聚集：体内功能性
[0033] A)当移植到非糖尿病小鼠内后进行攻击时，在内分泌祖细胞阶段冷冻保存后生成的内分泌细胞分泌C-肽
[0034] 来自同一批次的hESC在不进行(对照)或进行解离、冷冻保存和再聚集步骤的情况下进行分化，并移植到非糖尿病小鼠的肾被膜下，或者不移植(对照)。为了诱导从移植物分泌C-肽，在移植后两周通过胰岛素受体拮抗剂S961或在移植后七周通过口服葡萄糖耐量试验诱导急性胰岛素抵抗。在攻击后60和120分钟或20和60分钟测量人C-肽。使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案形成的团簇比使用不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的团簇分泌更高水平的C-肽。数据呈现为平均值+/-SEM。
[0035] B)NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体的富集减小了体内差异。
[0036] 对于接受使用包括或不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的细胞的动物，绘制了S961攻击过程中C-肽的增加倍数。使用包括解离、冷冻保存和再聚集的方案提高了C-肽表达的效力，并且减小了动物之间的差异。
[0037] C)NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的富集在移植后8周消除了非内分泌细胞，并且导致更均匀的体内移植物。
[0038] 移植后8周，将小鼠处死，收获带有移植物的肾脏，并通过免疫细胞化学进行分析。对细胞进行C-肽、NKX6.1和胰高血糖素染色。如白色箭头所示，非内分泌细胞(NKX6.1-/胰高血糖素-/C-肽-)区域存在于对照移植物中，该对照移植物含有在不进行解离、冷冻保存和再聚集步骤的情况下生成的细胞(4个移植物中的4个)。对于含有使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的细胞的移植物，未观察到这种区域(4个移植物中的0个)。
[0039] 图4：共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞的解离、冷冻保存和再聚集：在体外对内分泌细胞表型的影响
[0040] A)在内分泌细胞阶段(即BC03)解离、冷冻保存、解冻并再聚集后，共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞的富集。
[0041] 使hESC分化为β样细胞，并分析内分泌和非内分泌细胞群体的分布。对于每个实验，使用不包括(对照)或包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案分化来自同一批次的细胞。
[0042] 右图：使用流式细胞术根据NKX6.1和C-肽共表达的存在来测量内分泌细胞群体。结果以与对照相比的变化％来呈现。
[0043] 左图：当使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成细胞时，根据非内分泌标志物AFP、GHRL、KRT18和KRT 8的转录减少显示非内分泌细胞的去富集。
[0044] B)解冻并再聚集后大小和异质性的减小
[0045] 左上图显示了使用不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的内分泌细胞聚集体。
[0046] 左下图显示了使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的内分泌细胞聚集体。
[0047] 右上图和右下图(条形图)显示了使用 胰岛计数器测量的团簇大小分布。
[0048] 图5：NKX6.1和C-肽共表达内分泌细胞聚集体的解离、冷冻保存和再聚集：体内功能性
[0049] A)在内分泌细胞阶段(NKX6.1和C-肽共表达细胞(BC03))解离、冷冻保存并再聚集的细胞在移植到糖尿病Scid-beige小鼠中后降低血糖
[0050] hESC通过解离、冷冻保存和再聚集步骤进行分化，并移植到糖尿病小鼠的肾被膜下。移植后，观察到血糖迅速降低。
[0051] B)在内分泌细胞阶段(NKX6.1和C-肽共表达细胞(BC03))解离、冷冻保存并再聚集的细胞在移植到糖尿病小鼠中后分泌C-肽
[0052] 移植后20天的基础人C-肽分泌表明，血糖的降低与人C-肽分泌相关。
[0053] C)NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体的富集在移植后10周减少了非内分泌细胞。
[0054] 移植后10周，将小鼠处死，收获带有移植物的肾脏，并通过免疫细胞化学进行分析。对细胞进行C-肽、NKX6.1和胰高血糖素染色。如白色箭头所示，非内分泌细胞(NKX6.1-/胰高血糖素-/C-肽-)区域存在于对照移植物中，该对照移植物含有在不进行解离、冷冻保存和再聚集步骤的情况下生成的细胞(11个移植物中的9个)。对于含有使用包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的细胞的移植物，未观察到这种区域(3个移植物中的1个)。
[0055] 图6.C-肽临表达前和表达后早期的内分泌细胞的解离、冷冻保存和再聚集：对葡萄糖响应性的影响。
[0056] A)在C-肽表达之前和之后的测试分化时间点的概述以及对葡萄糖响应性的影响。
[0057] 在细胞分化过程中的不同时间点冷冻保存的细胞的解离、冷冻保存和再聚集。在胰腺内胚层阶段(PE)、C-肽表达启动前1天(BC00)、C-肽表达启动后2天(BC03)、C-肽表达启动后5天(BC06)和C-肽表达启动后8天(BC09)冷冻保存细胞，这些细胞均来自同一批细胞。在相同设置下在C-肽表达启动后13天(BC14)，将细胞解冻、分化并测试功能性。
[0058] B)通过在BC00、BC03、BC06和BC09冷冻保存的细胞的解离、冷冻保存和再聚集对NKX6.1和C-肽细胞的富集，所述时间点在C-肽表达启动前约1天和启动后约1至8天的时间范围内。
[0059] 使用流式细胞术在BC14测定NKX6.1和C-肽的表达。数据被表示为与使用不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案来自同一批次的细胞相比的百分比。结果表明，NKX6.1和C-肽细胞的富集对于在BC00和BC03冷冻保存的细胞最有效。
[0060] C)当细胞在BC00、BC03、BC06和BC09冷冻保存时的动态葡萄糖响应。
[0061] 在实验结束时，使用动态灌注系统对功能性进行测试。所有细胞均对20mM葡萄糖和毒蜥外泌肽-4的攻击具有响应，但分别在C-肽表达启动前约1天和启动后2天在BC00和BC03冷冻保存细胞时观察到最高响应。
[0062] 发明详述
[0063] 在最广泛的意义上，本发明涉及富集并冷冻保存在体外由干细胞衍生的胰腺内分泌细胞的方法。
[0064] 本发明涉及富集胰腺细胞聚集体中在体外由干细胞，即胚胎干细胞或人胚胎干细胞衍生的NKX6.1和NKX2.2或NKX6.1和C-肽共表达内分泌细胞的方法。
[0065] 本发明涉及在体外由干细胞获得的共表达NKX6.1和NKX2.2的内分泌祖细胞或共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞的解离、冷冻保存和再聚集后，富集细胞聚集体中的内分泌细胞的方法。
[0066] 本发明进一步涉及富集在体外由干细胞衍生的内分泌祖细胞和葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0067] 在一方面，本文描述了从含有内分泌和非内分泌细胞的细胞群体中选择内分泌细胞的方法。
[0068] 在另一方面，本方法允许将内分泌细胞的产生与移植分开。例如，这允许在移植之前转运细胞或进行质量和安全性研究，以控制批次之间的差异。特别是，根据本文所述方法获得的冷冻保存的胰腺内分泌细胞可以在生产步骤与移植步骤之间保存，从而允许收集并解冻样品以供运行纯度测试(例如通过流式细胞术)和/或功能性测试(例如通过静态GSIS灌注)。
[0069] 在另一方面，本方法允许获得均质的冷冻保存或再聚集的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞，以用于移植到人类受试者中，以及用于治疗糖尿病。
[0070] 在一方面，描述了冷冻保存在体外从干细胞衍生的胰腺内分泌细胞聚集体的方法，其包括以下步骤：
[0071] (i)将所述内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
[0072] (ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如降到至少-80℃，以获得冷冻保存的单细胞。
[0073] 在另一方面，本发明涉及富集在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0074] (i)将所述细胞聚集体解离为单细胞；
[0075] (ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如降至-80℃，以获得冷冻保存的单细胞；
[0076] (iii)解冻所述冷冻保存的细胞；以及
[0077] (iv)针对NKX6.1和C-肽表达细胞富集在解冻且再聚集后获得的细胞。
[0078] 在一方面，本方法涉及富集在体外从干细胞衍生的内分泌细胞聚集体中共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0079] (i)将所述内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
[0080] (ii)冷冻保存所述单细胞，这是通过用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如降到至少-80℃，以获得冷冻保存的单细胞；
[0081] (iii)解冻所述冷冻保存的内分泌细胞；以及
[0082] (iv)再聚集在解冻后获得的所述内分泌细胞。
[0083] 在特定实施方案中，本文所述方法的步骤(i)的所述内分泌细胞是共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。在优选的实施方案中，所述共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞是这样的内分泌细胞，其中C-肽表达开始了最多7天，最多6天，最多5天，最多4天，最多3天，或最多2天，优选最多2天。
[0084] 在优选的实施方案中，当步骤(i)的内分泌细胞是共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞聚集体时，所述方法进一步包括使所述共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞分化为共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞聚集体的步骤(v)。
[0085] 特别是，解离步骤(1)允许富集细胞聚集体中的内分泌细胞，因为单个非内分泌细胞似乎对冷冻保存的抵抗力较低。此外，本方法允许通过降低团簇异质性和团簇大小来减小体内性能的差异。
[0086] 本发明的另一个目的是再聚集的内分泌细胞(即在解离、冷冻保存和再聚集后获得的细胞聚集体)，其包含至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞。
[0087] 可以使用本领域技术人员已知的技术，通过使用诸如FACS的技术检测标志物NKX2.2、NKX6.1和C-肽，来检测并测量再聚集的细胞的细胞群体。
[0088] 如本文所用的，“内分泌细胞”或“胰腺内分泌细胞”在此是指“NKX6.1和C-肽共表达细胞”或“NKX2.2和NKX6.1共表达细胞”，或从C-肽表达启动前3天直到启动后7天选择的内分泌细胞。有利地，本文所述的内分泌细胞是从C-肽表达启动前2天直到启动后5天，或从C-肽表达启动前1天直到启动后2天获取的。
[0089] 如本文所用的，“NKX6.1和C-肽共表达细胞或细胞聚集体”是指葡萄糖响应性胰岛素分泌内分泌细胞，或指已经启动C-肽表达最多7天、最多6天、最多5天、最多4天、最多3天或最多2天，优选最多2天的内分泌细胞。
[0090] “葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞”或“共表达NKX6.1和C-肽的细胞”是指位于胰腺中的小细胞团簇或被称为朗格罕氏岛的细胞聚集体内的细胞。β细胞通过分泌肽激素胰岛素来响应高血糖水平，胰岛素作用于其他组织以促进从血液中摄取葡萄糖，例如在肝脏中，在其中它通过糖原合成促进能量储存。如本文所用的，“细胞聚集体”是指内分泌细胞的解离、冷冻保存和再聚集后获得的岛样细胞聚集体。如本文所用的，“NKX2.2和NKX6.1共表达细胞”是指共表达NKX2.2和NKX6.1但不表达C-肽或胰岛素的内分泌祖细胞。有利地，“NKX2.2和NKX6.1共表达细胞”是指在C-肽表达前最多3天，优选在C-肽表达前最多2天，更优选在C-肽表达前最多1天获取的细胞。
[0091] 如本文所用的，“NKX6.1和C-肽共表达细胞或细胞聚集体”是指葡萄糖响应性胰岛素分泌内分泌细胞，或指已经启动C-肽表达最多7天、最多6天、最多5天、最多4天、最多3天或最多2天，优选最多2天的内分泌细胞。
[0092] 在一方面，包含共表达NKX6.1和C-肽或NKX2.2和NKX6.1的细胞的细胞群体获自体细胞群体。
[0093] 在另一方面，体细胞群体已被诱导而去分化为胚胎样干(ES，例如多能)细胞。这类去分化的细胞也被称为诱导多能干细胞(iPSC)。
[0094] 在一个实施方案中，细胞聚集体用酶或非酶试剂来解离。
[0095] 如本文所用的，“酶”是指适合于解离在体外由干细胞衍生的内分泌细胞聚集体的酶。
[0096] 在优选的实施方案中，酶或酶混合物选自蛋白酶、蛋白酶混合物、胰蛋白酶、胶原酶和弹性蛋白酶或其混合物。优选地，本方法的酶选自酶混合物；优选地，该酶混合物是Accutase。
[0098] 在另一方面，包含共表达NKX6.1和C-肽或NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞的细胞群体获自胚胎干(ES，例如多能)细胞。在一些方面，包含共表达NKX6.1和C-肽或NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞的细胞群体是多能细胞，如ES样细胞。
[0099] 在另一方面，包含NKX6.1和C-肽或NKX2.2和NKX6.1的细胞群体是从胚胎干(ES或多能)细胞，优选从人胚胎干细胞分化而来的。
[0100] 在另一方面，所述细胞群体是干细胞群体。在一些方面，所述细胞群体是分化成内分泌祖细胞谱系的干细胞群体。在一些方面，所述细胞群体是分化成葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的干细胞群体。
[0101] 将干细胞分化为内分泌祖细胞和葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的分化方案是本领域已知的(分别为WO2015/028614和WO/2017/144695)。
[0102] 本发明的一个目的是通过解离内分泌细胞聚集体而获得的共表达NKX2.2和NKX6.1或共表达NKX6.1和C-肽的冷冻保存的单细胞。在另一方面，本发明涉及根据包括以下步骤的方法获得的冷冻保存的胰腺内分泌细胞：
[0103] (i)将胰腺内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
[0104] (ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如至少-80℃，以获得冷冻保存的单细胞。
[0105] 如本文所用的，“降低温度以获得冷冻保存的内分泌细胞”是指将细胞冷却至非常低的温度持续一段时间的步骤，即冷却到-70℃至-196℃，优选冷却到至少-80℃，以防止可能对目的内分泌单细胞造成损害的任何酶或化学活性。
[0106] 在一个实施方案中，步骤(ii)的温度为-70℃至-196℃，-80℃至-160℃，或-80℃至-120℃，优选地，步骤(ii)的温度至少为-80℃。在一个实施方案中，在一步中或逐步地降低温度以获得冷冻保存的细胞，优选地在一步中降低温度。
[0107] 如本文所用的，“冷冻保存的细胞”或“冷冻保存的单细胞”是指在将细胞聚集体解离为单细胞后，用冷冻保存介质处理，并通过将温度降低至非常低的温度例如-70℃至-196℃进行冷冻保存而获得的细胞。
[0108] 如本文所用的，“冷冻保存介质”是指适合于在冷冻保存步骤期间维持内分泌细胞或内分泌祖细胞的完整性的介质。大多数冷冻保存介质含有DMSO、血清或合成血清替代品，并使用例如HEPES或碳酸氢钠进行pH缓冲。
[0109] 在一个实施方案中，冷冻保存介质包含选自二甲基亚砜(DMSO)、血清、合成血清替代品或甘油的化合物。
[0110] 根据本发明，本文描述的冷冻保存的细胞可以保存至少一小时，至少一天，至少一周，至少一个月，至少两个月，至少三个月，至少一年，或该范围内提供的任何时间之间的任何时间段。
[0111] 在一个实施方案中，本文描述的冷冻保存的细胞或再聚集的内分泌细胞可以用于治疗糖尿病，例如通过植入需要这种治疗的患者中。
[0112] 干细胞是由其在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及最终分化的细胞。干细胞的特征还在于其在体外由多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能性细胞的能力，以及其在移植后产生多个胚层的组织的能力。
[0113] 干细胞按其发育潜力分类为：(1)全能的，意思是能够产生所有胚胎细胞类型和胚胎外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意思是能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的(multi-potent)，意思是能够产生细胞谱系的子集，但是全部都在特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元素(例如血小板)在内的子代)；(4)寡能的，意思是能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子集；以及(5)单能的，意思是能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
[0114] 如本文所用的，“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰腺细胞能够增殖并表达特征性标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。成熟的或分化的胰腺细胞不增殖并且能分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。术语“分化因子”是指添加到胰腺细胞中以增强其向成熟内分泌细胞(也包含产生胰岛素的β细胞)分化的化合物。示例性分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子和胰高血糖素样肽1。在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
[0115] 成熟的或分化的胰腺细胞不增殖并且能分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶，例如，完全分化的β细胞响应于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。
[0116] 术语“分化因子”是指添加到ES或胰腺前体细胞中以增强其向EP细胞分化的化合物。分化因子还可以驱动进一步分化为成熟的β-细胞。
[0117] 示例性分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、胰高血糖素样肽1、吲哚内酰胺V、IDE1和2以及视黄酸。
[0118] 在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
[0119] 在一个实施方案中，本发明涉及向至少一种胰腺激素的产生存在缺陷的哺乳动物提供胰腺内分泌功能的方法，该方法包括以足以在所述哺乳动物中产生可测量量的所述至少一种胰腺激素的量植入通过本发明的任何方法获得的内分泌细胞的步骤。
[0120] 如本文所用的，术语“人多能干(hPS)细胞”是指可来自任何来源的并且在适当条件下能够产生不同细胞类型的人子代的细胞，所述细胞类型是所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。hPS细胞具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的可识别细胞的能力。在人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括人胚泡衍生的干(hBS)细胞，它们在文献中通常表示为人胚胎干(hES)细胞。
[0121] 在一个方面，本文描述了冷冻保存在体外从干细胞衍生的内分泌细胞聚集体的方法，其包括以下步骤：
[0122] (i)将所述内分泌细胞聚集体解离为单细胞；
[0123] (ii)冷冻保存所述单细胞；
[0124] 其中所述内分泌细胞是共表达NKX6.1和NKX2.2的内分泌祖细胞或共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞，其中C-肽表达已经开始了最多7天，最多6天，最多5天，最多4天，最多3天，或最多2天，优选最多2天。
[0125] 在另一方面，本文描述了富集细胞聚集体中在体外从干细胞衍生的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
[0126] (i)将所述细胞聚集体解离为单细胞；
[0127] (ii)冷冻保存所述单细胞；
[0128] (iii)解冻所述冷冻保存的单细胞；以及
[0129] (iv)针对NKX6.1和C-肽表达细胞富集在解冻且再聚集后获得的细胞；
[0130] 其中所述内分泌细胞是共表达NNKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞或共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞，其中内分泌细胞C-肽表达已经开始了最多7天，最多6天，最多5天，最多4天，最多3天，最多2天，优选最多2天。
[0131] 在一方面，本文描述了根据本发明的方法获得的再聚集的共表达NKX6.1和C-肽或NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞。
[0132] 在一方面，本文描述了再聚集的内分泌细胞，其包含至少50％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞和/或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
[0133] 在一个实施方案中，本文描述了再聚集的内分泌细胞，其包含至少60％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
[0134] 在一个实施方案中，本文描述了再聚集的内分泌细胞，其包含至少70％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
[0135] 在一个实施方案中，本文描述了再聚集的内分泌细胞，其包含至少80％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
[0136] 在一方面，本文所述的再聚集的内分泌细胞用作药物。
[0137] 在一方面，本文所述的再聚集的内分泌细胞用于治疗糖尿病。
[0138] 此外，包含本文所述的再聚集的共表达NKX6.1和C-肽或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞的组合物用于治疗糖尿病。
[0139] 在另一方面，本文描述了包含富含根据本说明书的内分泌细胞的细胞聚集体的药物。在优选的实施方案中，本文所述的药物包含如本文所述的再聚集的共表达NKX6.1和C-肽和/或共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌细胞。
[0140] 在另一方面，本文描述了装置，其包含如本文所述的冷冻保存的内分泌细胞，或再聚集的内分泌细胞，或含有再聚集的内分泌细胞的组合物，或细胞聚集体，或药物。
[0141] 本文描述的各种方法和其他实施方案可能需要或利用来自多种来源的hPS细胞。例如，适合使用的hPS细胞可以从发育中的胚胎获得。另外地或备选地，合适的hPS细胞可以从已建立的细胞系和/或人诱导多能干(hiPS)细胞获得。
[0142] 如本文所用的，术语“hiPS细胞”是指人诱导多能干细胞。
[0143] 如本文所用的，术语“胚泡衍生的干细胞”被表示为BS细胞，而人形式被称为“hBS细胞”。在文献中，这类细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体地称为人胚胎干细胞(hESC)。因此，本发明中继而使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如例如WO 03/055992和WO2007/042225所述，或者是可商购获得的hBS细胞或细胞系。然而，进一步想到，任何人多能干细胞继而可用于本发明，包括通过例如用某些转录因子如OCT4、SOX2、NANOG和LIN28处理成体细胞而重新编程为多能细胞的分化成体细胞。
[0144] 如本文所用的，细胞的“活力”或“活细胞”是指在已经冷冻保存、解冻和/或再聚集后正常生长和发育的能力。在一方面，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的再聚集的内分泌细胞是活细胞。
[0145] 本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
[0146] 除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
[0147] 本文中引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均在此通过引用整体并入本文，并且其引用程度如同单独地且特别地指出每篇参考文献均通过引用而并入且在本文中以其全文进行阐述(在法律允许的最大程度上)。
[0148] 本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
[0149] 除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何用语均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
[0150] 虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
[0151] 本发明进一步的实施方案
[0152] 实施方案1：富集在体外从干细胞衍生的NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0153] (i)将所述细胞聚集体解离为单细胞；
[0154] (ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如降至-80℃，以获得冷冻保存的细胞；
[0155] (iii)解冻所述冷冻保存的细胞；以及
[0156] (iv)针对NKX6.1和C-肽表达细胞富集在解冻且再聚集后获得的细胞。
[0157] 实施方案2：实施方案1的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体是内分泌祖细胞或葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞，优选地，所述NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体是已经表达C-肽最多7天，最多6天，最多5天，最多4天，最多3天，最多2天，优选最多2天的内分泌细胞。
[0158] 实施方案3：实施方案2的方法，其中内分泌祖细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0159] 实施方案4：实施方案1-3中任一项的方法，其中干细胞是诱导的多能干细胞。
[0160] 实施方案5：实施方案1-3中任一项的方法，其中干细胞是胚胎干细胞。
[0161] 实施方案6：实施方案1-3中任一项的方法，其中干细胞是人胚胎干细胞。
[0162] 实施方案7：实施方案1-6中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为定形内胚层的干细胞。
[0163] 实施方案8：实施方案1-6中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为胰腺内胚层的干细胞。
[0164] 实施方案9：实施方案1-6中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为内分泌祖细胞的干细胞。
[0165] 实施方案10：实施方案1-6中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞的干细胞。
[0166] 实施方案11：实施方案1-6中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的干细胞。
[0167] 实施方案12：实施方案1-11中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用酶解离。
[0168] 实施方案13：实施方案12的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用选自蛋白酶或蛋白酶混合物的酶解离。
[0169] 实施方案14：实施方案12的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用选自胰蛋白酶、胶原酶和弹性蛋白酶或其混合物的酶解离。
[0170] 实施方案15：实施方案12的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用Accutase酶解离。
[0171] 实施方案16：实施方案15的方法，其中Accutase是蛋白酶和胶原酶的混合物。
[0172] 实施方案17：实施方案1-11中任一项的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用非酶试剂解离。
[0173] 实施方案18：实施方案17的方法，其中NKX6.1和C-肽表达细胞聚集体用非酶试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)解离。
[0174] 实施方案19：实施方案1-18中任一项的方法，其中冷冻保存介质含有冷冻保护剂。
[0175] 实施方案20：实施方案19的方法，其中所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。
[0176] 实施方案21：实施方案1-18中任一项的方法，其中冷冻保存介质不含冷冻保护剂。
[0177] 实施方案22：实施方案1-21中任一项的方法，其中在用冷冻保存介质处理单细胞之后，在一步中将温度降低至-70℃至-196℃、-80℃至-160℃或-80℃至-120℃或-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0178] 实施方案23：实施方案1-21中任一项的方法，其中在用冷冻保存介质处理单细胞之后，逐步将温度降低至-70℃至-196℃、-80℃至-160℃或-80℃至-120℃或-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0179] 实施方案24：实施方案1-21中任一项的方法，其中在用冷冻保存介质处理单细胞之后，在一步中将温度降低至-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0180] 实施方案25：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0181] 实施方案26：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少20％表达NKX2.2和NKX6.1。
[0182] 实施方案27：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少40％表达NKX2.2和NKX6.1。
[0183] 实施方案28：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少60％表达NKX2.2和NKX6.1。
[0184] 实施方案29：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少80％表达NKX2.2和NKX6.1。
[0185] 实施方案30：实施方案1-24中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0186] 实施方案31：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少20％表达NKX6.1和C-肽。
[0187] 实施方案32：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少40％或50％表达NKX6.1和C-肽。
[0188] 实施方案33：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少60％或70％表达NKX6.1和C-肽。
[0189] 实施方案34：实施方案1-24中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少80％表达NKX6.1和C-肽。
[0190] 实施方案35：实施方案1-34中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞是活细胞。
[0191] 实施方案36：实施方案1-34中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少20％是活细胞。
[0192] 实施方案37：实施方案1-34中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少40％是活细胞。
[0193] 实施方案38：实施方案1-34中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少60％是活细胞。
[0194] 实施方案39：实施方案1-34中任一项的方法，其中通过实施方案1的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞中的至少80％是活细胞。
[0195] 实施方案40：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞。
[0196] 实施方案41：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少7天，优选至少14天。
[0197] 实施方案42：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少21天。
[0198] 实施方案43：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少1个月。
[0199] 实施方案44：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少2个月。
[0200] 实施方案45：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少3个月。
[0201] 实施方案46：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞被保存至少1年。
[0202] 实施方案47：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于进一步分化。
[0203] 实施方案48：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于包封。
[0204] 实施方案49：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于包封到装置中。
[0205] 实施方案50：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到受试者中。
[0206] 实施方案51：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到哺乳动物中。
[0207] 实施方案52：通过实施方案1-39中任一项的方法的步骤(i)和(ii)获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到人体中。
[0208] 实施方案53：根据实施方案1-39中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞在Rock抑制剂的存在下解冻。
[0209] 实施方案54：根据实施方案53的方法，其中冷冻保存的细胞在10μM的Rock抑制剂的存在下解冻。
[0210] 实施方案55：根据实施方案1-39中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞在不存在Rock抑制剂的情况下解冻。
[0211] 实施方案56：根据实施方案1-39和53-55中任一项的方法，其中将解冻后获得的细胞再聚集。
[0212] 实施方案57：根据实施方案1-39和53-55中任一项的方法，其中将解冻后获得的细胞再聚集至少2天。
[0213] 实施方案58：通过根据实施方案1-39和53-57中任一项的方法获得的再聚集的细胞。
[0214] 实施方案59：根据实施方案1-39和53-57中任一项的方法，其中所述再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0215] 实施方案60：根据实施方案59的方法，其中至少20％的再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0216] 实施方案61：根据实施方案59的方法，其中至少40％的再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0217] 实施方案62：根据实施方案59的方法，其中至少60％的再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0218] 实施方案63：根据实施方案59的方法，其中至少80％的再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0219] 实施方案64：根据实施方案59的方法，其中至少20％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0220] 实施方案65：根据实施方案59的方法，其中至少40％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0221] 实施方案66：根据实施方案59的方法，其中至少60％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0222] 实施方案67：根据实施方案59的方法，其中至少80％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0223] 实施方案68：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于进一步分化。
[0224] 实施方案69：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于包封。
[0225] 实施方案70：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于包封到装置中。
[0226] 实施方案71：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到受试者中。
[0227] 实施方案72：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到哺乳动物中。
[0228] 实施方案73：通过根据实施方案1-39、53-57和59-66中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到人体中。
[0229] 实施方案74：冷冻保存在体外从干细胞衍生的NKX2.2和NKX6.1或NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0230] (i)将所述细胞聚集体解离为单细胞；
[0231] (ii)用冷冻保存介质处理所述单细胞，并降低温度，例如降到至少-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0232] 实施方案75：根据实施方案74的方法，其中将冷冻保存的细胞解冻。
[0233] 实施方案76：根据实施方案75的方法，其中使已经解冻的冷冻保存的细胞再聚集。
[0234] 实施方案77：根据实施方案76的方法，其中已经再聚集的冷冻保存的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0235] 实施方案78：根据实施方案74的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体是内分泌祖细胞。
[0236] 实施方案79：根据实施方案74-78中任一项的方法，其中干细胞是诱导的多能干细胞。
[0237] 实施方案80：根据实施方案74-78中任一项的方法，其中干细胞是胚胎干细胞。
[0238] 实施方案81：根据实施方案74-78中任一项的方法，其中干细胞是人胚胎干细胞。
[0239] 实施方案82：根据实施方案74-81中任一项的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为定形内胚层的干细胞。
[0240] 实施方案83：根据实施方案74-81中任一项的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为胰腺内胚层的干细胞，即共表达PDX-1/NKX6.1。
[0241] 实施方案84：实施方案74-81中任一项的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体在体外衍生自已分化为内分泌祖细胞的干细胞。
[0242] 实施方案85：实施方案74-84中任一项的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体用酶解离。
[0243] 实施方案86：实施方案85的方法，其中所述酶选自蛋白酶或蛋白酶混合物或蛋白酶和胶原酶混合物。
[0244] 实施方案87：实施方案85的方法，其中所述酶选自胰蛋白酶、胶原酶和弹性蛋白酶或其混合物。
[0245] 实施方案88：实施方案85的方法，其中所述酶是Accutase酶。
[0246] 实施方案89：实施方案88的方法，其中Accutase是蛋白酶和胶原酶的混合物。
[0247] 实施方案90：实施方案74-84中任一项的方法，其中NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体用非酶试剂解离。
[0248] 实施方案91：实施方案90的方法，其中所述非酶试剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)。
[0249] 实施方案92：实施方案74-91中任一项的方法，其中冷冻保存介质含有冷冻保护剂。
[0250] 实施方案93：实施方案92的方法，其中所述冷冻保护剂是二甲基亚砜(DMSO)。
[0251] 实施方案94：实施方案74-91中任一项的方法，其中冷冻保存介质不含冷冻保护剂。
[0252] 实施方案95：实施方案74-94中任一项的方法，其中在用冷冻保存介质处理单细胞之后，在一步中将温度降低至-70℃至-196℃、-80℃至-160℃或-80℃至-120℃或-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0253] 实施方案96：实施方案74-94中任一项的方法，其中在用冷冻保存介质处理单细胞之后，逐步将温度降低至-70℃至-196℃、-80℃至-160℃或-80℃至-120℃或-80℃，以获得冷冻保存的细胞。
[0254] 实施方案97：通过根据实施方案74-96中任一项的方法获得的冷冻保存的细胞。
[0255] 实施方案98：根据实施方案97的冷冻保存的细胞，其中冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0256] 实施方案99：根据实施方案97的冷冻保存的细胞，其中至少20％的冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0257] 实施方案100：根据实施方案97的冷冻保存的细胞，其中至少40％的冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0258] 实施方案101：根据实施方案97的冷冻保存的细胞，其中至少60％的冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0259] 实施方案102：根据实施方案97的冷冻保存的细胞，其中至少80％的冷冻保存的细胞共表达NKX2.2和NKX6.1。
[0260] 实施方案103：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少7天。
[0261] 实施方案104：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少14天。
[0262] 实施方案105：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少21天。
[0263] 实施方案106：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少1个月。
[0264] 实施方案107：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少2个月。
[0265] 实施方案108：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少3个月。
[0266] 实施方案109：根据实施方案97获得的冷冻保存的细胞可以保存至少6个月。
[0267] 实施方案110：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于进一步分化。
[0268] 实施方案111：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于包封。
[0269] 实施方案112：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于包封到装置中。
[0270] 实施方案113：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到受试者中。
[0271] 实施方案114：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到哺乳动物中。
[0272] 实施方案115：根据实施方案97-109中任一项获得的冷冻保存的细胞，其用于移植到人体中。
[0273] 实施方案116：根据实施方案74-96中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞在Rock抑制剂的存在下解冻。
[0274] 实施方案117：实施方案116的方法，其中冷冻保存的细胞在10μM的Rock抑制剂的存在下解冻。
[0275] 实施方案118：根据实施方案74-96中任一项的方法，其中冷冻保存的细胞在不存在Rock抑制剂的情况下解冻。
[0276] 实施方案119：根据实施方案74-96中任一项的方法，其中将解冻后获得的细胞再聚集。
[0277] 实施方案120：根据实施方案74-96中任一项的方法，其中将解冻后获得的细胞再聚集2天。
[0278] 实施方案121：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞。
[0279] 实施方案122：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中再聚集的细胞共表达NKX6.1和C-肽。
[0280] 实施方案123：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少20％的再聚集的细胞表达NKX6.1和C-肽。
[0281] 实施方案124：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少40％的再聚集的细胞表达NKX6.1和C-肽。
[0282] 实施方案125：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少60％的再聚集的细胞表达NKX6.1和C-肽。
[0283] 实施方案126：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少80％的再聚集的细胞表达NKX6.1和C-肽。
[0284] 实施方案127：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少20％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0285] 实施方案128：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少40％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0286] 实施方案129：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少60％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0287] 实施方案130：根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法，其中至少80％的再聚集的细胞是葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞。
[0288] 实施方案131：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于进一步分化。
[0289] 实施方案132：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于包封。
[0290] 实施方案133：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于包封到装置中。
[0291] 实施方案134：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到受试者中。
[0292] 实施方案135：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到哺乳动物中。
[0293] 实施方案136：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于移植到人体中。
[0294] 实施方案137：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用作药物。
[0295] 实施方案138：通过根据实施方案76-96和116-120中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于治疗糖尿病。
[0296] 实施方案139：再聚集的内分泌细胞，其包含至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞。
[0297] 实施方案140：再聚集的内分泌细胞，其包含至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。
[0298] 实施方案141：按照根据实施方案1-39、76-96和116-120中任一项的富集内分泌细胞聚集体的方法获得的再聚集的内分泌细胞。
[0299] 实施方案142：根据实施方案138-140中任一项的再聚集的内分泌细胞，其用作药物。
[0300] 实施方案143：根据实施方案138-140中任一项的再聚集的内分泌细胞，其用于治疗糖尿病。
[0301] 实施方案144：使用根据实施方案68-73和131-143中任一项的再聚集的细胞制备用于治疗糖尿病的药物的方法。
[0302] 实施方案145：冷冻保存的共表达NKX2.2和NKX6.1的单个内分泌细胞或共表达NKX6.1和C-肽的单个内分泌细胞。
[0303] 实施方案146：按照根据实施方案74-96和116-120中任一项的冷冻保存方法获得的冷冻保存的共表达NKX2.2和NKX6.1或共表达NKX6.1和C-肽的单个内分泌细胞。
[0304] 实施方案147：根据实施方案145或146中任一项的冷冻保存的单个内分泌细胞，其用于移植到受试者中。
[0305] 实施方案148：根据实施方案145或146中任一项的冷冻保存的单个内分泌细胞，其用于治疗糖尿病。
[0306] 实施方案149：根据实施方案145或146中任一项的冷冻保存的单个内分泌细胞，其用于移植到受试者中。
[0307] 实施方案150：根据实施方案145或146中任一项的冷冻保存的单个内分泌细胞，其用作药物。
[0308] 实施方案151：组合物，其包含通过根据实施方案1-39、76-96、116-120和122-130中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用作药物。
[0309] 实施方案152：组合物，其包含通过根据实施方案1-39、76-96、116-120和122-130中任一项的方法获得的再聚集的细胞，其用于治疗糖尿病。
[0310] 实施方案153：包含根据实施方案131-143的再聚集的内分泌细胞的组合物，其用作药物或用于治疗糖尿病，例如I型糖尿病。
[0311] 实施方案154：药物，其包含通过根据实施方案1-39、76-96、116-120和122-130中任一项的方法获得的再聚集的细胞。
[0312] 实施方案155：药物，其包含根据实施方案131-143中任一项的再聚集的内分泌细胞。
[0313] 实施方案156：装置，其包含根据实施方案40-52、97-115和145-150中任一项的冷冻保存的内分泌细胞，或根据实施方案58、68-73、131-143或149-153中任一项的再聚集的内分泌细胞，或根据实施方案151-153的组合物，或根据实施方案154或155的药物。
[0314] 令人惊讶的是，通过实施本发明的方法获得了富集的内分泌细胞群体。富集的内分泌细胞具有均匀且很小的团簇大小，这使其适合于移植到受试者中。实施例
[0315] 缩写列表
[0316] Alk5i II：TGFβ激酶/激活蛋白受体样激酶
[0317] DAPT：二氟苯基乙酰基)-丙氨酰基-苯基甘氨酸叔丁酯
[0318] DMBI：(Z)-3-[4-(二甲基氨基)苄亚基]吲哚啉-2-酮
[0319] DZNEP：3-去氮腺嘌呤A
[0320] BC：β细胞
[0321] DE：定形内胚层
[0322] DNA-Pki：DNA-PK拮抗剂V
[0323] EP：内分泌祖细胞
[0324] GABA：γ-氨基丁酸
[0325] hBS：人胚泡衍生干
[0326] hES：人胚胎干
[0327] hESC：人胚胎干细胞
[0328] hiPS：人诱导多能干
[0329] HSC：造血干细胞
[0330] iPS：诱导多能干
[0331] iPSC：诱导多能干细胞
[0332] KOSR：KnockOutTM血清替代品
[0333] PE：胰腺内胚层
[0334] Rocki：Rho激酶抑制剂
[0335] SC：干细胞
[0336] 实施例
[0337] 通常，富集NKX6.1和C-肽共表达细胞的过程经历各个阶段。图1中概述了示例性富集方法。
[0338] 实施例1：内分泌细胞群体的制备
[0339] 用于获得内分泌祖细胞和葡萄糖响应性胰岛素分泌细胞的方案分别在专利申请WO2015/028614和WO2017/144695中提供。
[0340] 实施例2：通过冷冻保存共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞，NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的富集
[0341] 在体外从干细胞获得的NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体经历以下步骤：
[0342] (i)解离
[0343] 使用Accutase(干细胞#07920)，将从干细胞获得的NKX2.2和NKX6.1共表达细胞聚集体解离为单细胞。通过添加补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)的RPMI1640培养基(Gibco#61870-044)终止消化，并通过40μm过滤器过滤悬浮液以去除任何残留的团簇。
[0344] (ii)冷冻保存
[0345] 离心后，将NKX2.2和NKX6.1共表达细胞重悬于冷冻保存介质中，并通过连续降低温度至-80℃进行保存。
[0346] (ii)解冻冷冻保存的单细胞
[0347] 为了使细胞恢复培养，将NKX2.2和NKX6.1共表达细胞迅速升温至37℃，并在预温的补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)的RPMI1640培养基(Gibco#61870-044)中洗涤一次。计数后，将细胞重悬于补充有50μg/mL DNaseI(Sigma#11284932001)和10μM Rocki(Sigma#Y27632-Y0503)的阶段特异性培养基中。
[0348] (iii)再聚集在解冻后获得的细胞
[0349] 将解冻后获得的NKX2.2和NKX6.1共表达细胞在锥形瓶中以0.5-2mio活细胞/mL的密度在减小的体积中再聚集。在37℃和70rpm水平振摇下进行再聚集两天，随后更换培养基。
[0350] 内分泌祖细胞培养基：补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)、0.1％P/S(Gibco#15140-122)、10mM烟酰胺(Sigma#N0636)、10μM Alk5i II(Enzo#ALX-270-445)、1μM DZNEP(Tocris#4703)、10μg/mL肝素(Applichem#A3004,0250)、2.5μM DAPT(Calbiochem#565784)和1μM T3(Sigma#T6397)的RPMI1640培养基(Gibco#61870-044)。
[0351] 冷冻保存后，回收活力高于60％的共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞。在再聚集并分化为共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞后，所述内分泌细胞形成团簇，产生小且更均匀的聚集体，这可能有助于体内更均匀的移植物(大小约为100μm，NKX6.1/C-肽/胰高血糖素阴性细胞减少<50％，NKX6.1阳性细胞增加>50％)。图2A和图2B中分别提供了在体外对共表达NKX2.2和NKX6.1表型的内分泌祖细胞的影响。
[0352] 在移植到非糖尿病小鼠中后，解离、冷冻保存且再聚集的共表达NKX2.2和NKX6.1的内分泌祖细胞是功能性的，并且在用葡萄糖或S961诱发的急性胰岛素抵抗攻击时分泌人C-肽(图3A)。
[0353] 接受使用包括或不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案生成的细胞的动物在S961攻击过程中显示C-肽增加。该结果表明，使用包括解离、冷冻保存和再聚集的方案提高了效力，并且减小了动物之间的差异(图3B)。
[0354] 对肾移植物的免疫组织化学分析表明，解离、冷冻保存和再聚集步骤导致内分泌细胞类型(胰岛素，胰高血糖素，NKX6.1)的富集和非内分泌细胞类型的减少(图3C)。该数据也可以解释移植后两周无应答者的减少。
[0355] 实施例3：通过冷冻保存共表达NKX6.1和C-肽的细胞，NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体的富集
[0356] 在体外从干细胞获得的NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体经历以下步骤：
[0357] (i)解离
[0358] 使用Accutase(干细胞#07920)，将从干细胞获得的NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体解离为单细胞。通过添加补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)的RPMI1640培养基(Gibco#61870-044)终止消化，并通过40μm过滤器过滤悬浮液以去除任何残留的团簇。
[0359] (ii)冷冻保存
[0360] 离心后，将NKX6.1和C-肽共表达细胞重悬于冷冻保存介质中，并通过连续降低温度至-80℃进行保存。
[0361] (iii)解冻冷冻保存的单细胞
[0362] 为了使细胞恢复培养，将NKX6.1和C-肽共表达细胞迅速升温至37℃，并在预温的补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)的RPMI 1640培养基(Gibco#61870-044)中洗涤一次。计数后，将细胞重悬于补充有50μg/mL DNaseI(Sigma#11284932001)和10μM Rocki(Sigma#Y27632-Y0503)的阶段特异性培养基中。
[0363] (iv)再聚集在解冻后获得的细胞
[0364] 将解冻后获得的NKX6.1和C-肽共表达细胞在锥形瓶中以0.5-2mio活细胞/ml的密度在减小的体积中再聚集。在37℃和70rpm水平振摇下进行再聚集两天，随后更换培养基。
[0365] 培养基：补充有12％KOSR(Gibco#10828-0280)、0.1％P/S(Gibco#15140-122)、50μM GABA(TOCRIS#0344)、10μM Alk5i II(Enzo#ALX-270-445)、1μM DZNEP(Tocris#4703)和1μM T3(Sigma#T6397)的RPMI1640培养基(Gibco#61870-044)。
[0366] 冷冻保存后，回收活力高于90％的NKX6.1和C-肽共表达细胞。NKX6.1和C-肽共表达细胞再聚集后，葡萄糖响应性胰岛素分泌表型得到改善(大小约为150um，NKX6.1/C-肽/胰高血糖素阴性细胞减少<25％，NKX6.1阳性细胞增加>25％)(图4A和图4B)。
[0367] 在体内，解离、冷冻保存并再聚集的共表达NKX6.1和C-肽的内分泌细胞已显示有效降低血糖，这与人C-肽的高分泌相关(图5A和图5B)。
[0368] 实施例4：NKX6.1和NKX2.2共表达细胞聚集体或NKX6.1和C-肽共表达细胞聚集体在冷冻保存后的基因表达谱
[0369] 解离、冷冻保存且再聚集的细胞在细胞分化过程中的不同时间点冷冻保存。在胰腺内胚层阶段(PE)、C-肽表达开始前1天(BC00)、C-肽表达开始后2天(BC03)、C-肽表达开始后5天(BC06)和C-肽表达开始后8天(BC09)冷冻保存细胞，这些细胞均来自同一批细胞。在相同设置下在C-肽表达开始后13天(BC14)，将细胞解冻、分化并测试功能性。结果表明，当细胞在BC00和BC03阶段冷冻保存时，葡萄糖响应以及NKX6.1和C-肽表达更高(图6A)。
[0370] 使用流式细胞术在BC14测定NKX6.1和C-肽的表达。数据被表示为与使用不包括解离、冷冻保存和再聚集步骤的方案来自同一批次的细胞相比的百分比。结果表明，NKX6.1和C-肽细胞的富集对于在BC00和BC03冷冻保存的细胞最有效(图6B)。
[0371] 在实验结束时，使用动态灌注系统对功能性进行测试。所有细胞均对20mM葡萄糖和毒蜥外泌肽-4的攻击具有响应，但分别在C-肽表达启动前1天和启动后2天在BC00和BC03冷冻保存细胞时观察到最高响应(图6C)。
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