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一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用

阅读：500发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于组织工程领域，具体涉及一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用。所述芯片包括微流入口部、分形树状结构微通道、微流控腔室、细胞夹、微流出口部，所述每个微流控腔室中均内置一个细胞夹，利用所述分形树状结构微通道连接微流入口部和微流控腔室，所述微流入口部≥2个，所述微流控腔室≥3。本发明通过微流控芯片的分形树状结构微通道实现了不同交联程度的水凝胶的梯度分布，不同交联程度的水凝胶具有不同强度的组织强度，可以真实的模拟卵母细胞周围的力学强度，并研究了不同交联程度水凝胶对卵母生长、发育的影响，这对体外生命组织的三维立体培养具有重要的意义。，下面是一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片，其特征在于，包括微流入口部、分形树状结构微通道、微流控腔室、细胞夹、微流出口部，所述每个微流控腔室中均内置一个细胞夹，利用所述分形树状结构微通道连接微流入口部和微流控腔室，所述每个微流控腔室均单独连接一个微流出口部，所述微流入口部≥2个，所述微流控腔室≥3。
2.根据权利要求1所述的所述基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片，其特征在于，所述微流入口部为2个，所述微流控腔室为5个，所述微流出口部为5个。
3.根据权利要求2所述的所述基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片，其特征在于，所述分形树状结构微通道的分布为第一排3个混合通道、第二排4个混合通道、第三排5个混合通道，所述2个微流入口部通过分形树状结构微通道与所述5个微流控腔室相连接，所述5个微流控腔室分别连接所述5个微流出口部。
4.根据权利要求1所述的所述基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片，其特征在于，所述分形树状结构微通道中混合通道设置成螺旋型弯管。
5.权利要求1～4任一所述基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片的应用，其特征在于，具体包括如下方法：
(1)将含有卵母细胞的M16培养基泵入微流入口部，卵母细胞通过分形树状结构微通道流入微流控腔室内，并被细胞夹夹住；
(2)将不同浓度的水凝胶前驱溶液分别泵入各微流入口部，使水凝胶充满分形树状结构微通道，同时水凝胶前驱溶液在流经分形树状结构微通道过程中会发生均匀混合，最后在各微流控腔室内形成不同梯度的水凝胶前驱溶液混合液；
(3)随后将光掩模版覆盖在分形树状结构微通道上，对微流控腔室进行曝光，在各微流控腔室中形成包含卵母细胞的水凝胶块；随后将M16培养基泵入微流入口部，分形树状结构微通道中的水凝胶被排出，M16培养基充满各微流控腔室用于培养卵母细胞，观测卵母细胞的生长、发育情况。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述水凝胶为GelMA水凝胶。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微流入口部为2个，所述微流控腔室为
5个，将不同浓度的水凝胶前驱溶液分别泵入2个微流入口部，利用如下公式计算得到5个微流控腔室内水凝胶前驱体液梯度，所述公式为：
m为腔室总数，k为第几个腔室，C0为第一微流入口部水凝胶浓度，C1为第二微流入口部水凝胶浓度。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将浓度为5％、29％(w/v)水凝胶前驱溶液分别泵入2个微流入口部，根据公式计算可得，在微流控腔室内形成梯度为5％、11％、17％、
23％和29％(w/v)的水凝胶前驱溶液混合液。

说明书全文

一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯

片及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于组织工程领域，具体涉及一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用。

背景技术

[0002] 目前针对卵母细胞培养分为二维平面培养，三维立体培养。主流的二维培养不能满足真实的卵母生长发育环境，而三维立体培养能模拟体内组织环境，给与细胞更加真实的培养环境，既而使实验结果能更加贴近人体内的现象。因此基于卵母细胞的三维立体培养的研究具有重要意义。

[0003] 水凝胶是一种新兴的生命材料，其独特的化学结构与优良的物质传输性能，为生命的体外模型提供了可能。不同交联程度的水凝胶具有不同的组织强度，而人体组织中的细胞所处的组织强度具有很大的差异性，因此基于不同交联程度水凝胶的研究具有重要意义，基于卵母的水凝胶三维培养还有很大的发展空间。

发明内容

[0004] 本发明针对现有技术的不足，目的在于一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片及其应用。

[0005] 为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

[0006] 一种基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片，包括微流入口部、分形树状结构微通道、微流控腔室、细胞夹、微流出口部，所述每个微流控腔室中均内置一个细胞夹，利用所述分形树状结构微通道连接微流入口部和微流控腔室，所述每个微流控腔室均单独连接一个微流出口部，所述微流入口部≥2个，所述微流控腔室≥3。

[0007] 上述方案中，所述微流入口部为2个，所述微流控腔室为5个，所述微流出口部为5个。

[0008] 上述方案中，所述分形树状结构微通道的分布为第一排3个混合通道、第二排4个混合通道、第三排5个混合通道，所述2个微流入口部通过分形树状结构微通道与所述5个微流控腔室相连接，所述5个微流控腔室分别连接所述5个微流出口部。

[0009] 上述方案中，所述分形树状结构微通道中混合通道设置成螺旋型弯管。

[0010] 基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片的应用，具体包括如下方法：

[0011] (1)将含有卵母细胞的M16培养基泵入微流入口部，卵母细胞通过分形树状结构微通道流入微流控腔室内，并被细胞夹夹住；

[0012] (2)将不同浓度的水凝胶前驱溶液分别泵入各微流入口部，使水凝胶充满分形树状结构微通道，同时水凝胶前驱溶液在流经分形树状结构微通道过程中会发生均匀混合，最后在各微流控腔室内形成不同梯度的水凝胶前驱溶液混合液；

[0013] (3)随后将光掩模版覆盖在分形树状结构微通道上，对微流控腔室进行曝光，在各微流控腔室中形成包含卵母细胞的水凝胶块；随后将M16培养基泵入微流入口部，分形树状结构微通道中的水凝胶被排出，M16培养基充满各微流控腔室用于培养卵母细胞，观测卵母细胞的生长、发育情况。

[0014] 上述方案中，所述水凝胶为GelMA水凝胶。

[0015] 上述方案中，所述微流入口部为2个，所述微流控腔室为5个，将不同浓度的水凝胶前驱溶液分别泵入2个微流入口部，利用如下公式计算得到5个微流控腔室内水凝胶前驱体液梯度，所述公式为：

[0016]

[0017] m为腔室总数，k为第几个腔室，C0为第一微流入口部水凝胶浓度，C1为第一微流入口部水凝胶浓度。

[0018] 上述方案中，将浓度为5％、29％(w/v)水凝胶前驱溶液分别泵入2个微流入口部，在微流控腔室内形成梯度为5％、11％、17％、23％和29％(w/v)的水凝胶前驱溶液混合液。

[0019] 本发明的有益效果：本发明提供了一种微流控芯片结构并将其应用于卵母细胞培养，通过微流控芯片的分形树状结构微通道实现了不同交联程度的水凝胶的梯度分布。不同交联程度的水凝胶具有不同强度的组织强度，可以真实的模拟卵母细胞周围的力学强度，并研究了不同交联程度水凝胶对卵母生长、发育的影响，这对体外生命组织的三维立体培养具有重要的意义。附图说明

[0020] 图1为梯度水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片的结构组成，1、2为微流入口部，3、4、5、6、7为微流控腔室，8、9、10、11、12为微流出口部，13为细胞夹，14为分形树状结构微通道。

[0021] 图2为不同交联程度水凝胶在分形树状结构微通道的流动混合实物图。

[0022] 图3为不同交联程度水凝胶的物质传输性能研究。

[0023] 图4为卵母发育与生长显微图。

[0024] 图5为不同交联程度水凝胶对卵母发育，生长的影响分析。

具体实施方式

[0025] 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

[0026] 实施例1

[0027] 如图1所示，基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片包括：1和2入口部、3～7微流控腔室、8～12出口部、细胞夹13、分形树状结构微通道14。图1显示了芯片的原理图。分形树状结构微通道用于不同交联程度的水凝胶混合，流经分形树状结构微通道后得到梯度水凝胶分布；细胞夹固定卵母细胞；水凝胶充满芯片后，既而通过曝光，将水凝胶包裹的卵母细胞固定在微流控腔室中。最后在1，2入口部通入M16培养基，观测卵母生长，发育情况。

[0028] 本实施例所述微流控芯片，是通过标准的紫外光刻技术制作的。首先，按照所设计的芯片结构将模版图样画出来。然后刻画在掩膜版上，通过紫外光刻技术，对应于由SU8-2050光刻胶涂抹均匀的硅片，经过紫外曝光后，再由显影液冲洗硅片便可得到PDMS的模具。
在将未凝固的PDMS浇筑在模版上，经烤箱75摄氏度烘烤一个小时后，再取下PDMS。如此，在将所获得的PDMS沟道层与涂有一层PDMS的载玻片用等离子清洗机键合。如此便得到不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养微流控芯片。

[0029] 水凝胶：制备0.25％(w/v)LAP引发剂标准溶液。将GelMA加入引发剂标准溶液，制备5％，29％(w/v)浓度的GelMA溶液。60摄氏度水浴避光溶解30分钟，期间保持震荡。随后，在光学掩模下使用近紫外线提供聚合所需的能量。

[0030] 卵母培养基：M16培养基(Sigma)。

[0031] 本实施例所述芯片的微流入口部为2个，微流控腔室为5个，微流出口部为5个，在1和2入口部通入不同交联程度的水凝胶，经过分形树状结构微通道混合后在微流控腔室形成不同梯度的水凝胶，所述微流控腔室内水凝胶梯度浓度的计算公式如下：

[0032]

[0033] m为腔室总数，k为第几个腔室，C0为第一微流入口部水凝胶浓度，C1为第二微流入口部水凝胶浓度。

[0034] 具体地，在本实施例中以基于不同交联程度的水凝胶卵母体外三维培养操作方法进行说明：

[0035] (1)将含有卵母细胞的M16培养基泵入1和2入口部中，卵母细胞通过分形树状结构微通道流入微流控腔室，并被13细胞夹等夹住；

[0036] (2)将5％，29％(w/v)水凝胶前驱溶液泵入1和2入口部中，流速为30μl/min，使分形树状结构微通道和微流控腔室被水凝胶前驱溶液充满。如图2所示，我们将含蓝墨水混合29％水凝胶前驱液从1入口部注入，5％水凝胶前驱液从2入口部注入，我们发现蓝墨水的分布符合梯度分布，同时不同交联程度的水凝胶在经过分形树状结构微通道后，均匀的混合；

[0037] (3)随后将光掩模版覆盖在水凝胶前驱溶液充满分形树状结构微通道和微流控腔室的芯片上，使用405nm曝光，在3～7微流控腔室中形成包含卵母细胞水凝胶块；随后通入M16培养基培养卵母细胞，记录卵母生长、发育状态。

[0038] 如图3，我们发现不同交联程度的水凝胶在物质传输中存在着很大的差异。我们手动配置了5种不同交联程度的水凝胶(5％，11％，17％，23％，29％)，并固定在微量比色皿中，在微量比色皿中加入600μL蓝墨水，2min后，我们记录蓝墨水在水凝胶中的扩散距离，蓝墨水在5％，11％，17％，23％，29％的水凝胶中分别扩散了1.31mm，1.12mm，0.81mm，0.63mm，0.54mm，结果表明了低交联程度的水凝胶有着更高的物质运输能力。

[0039] 如图4，我们发现不同交联程度的水凝胶对卵母细胞的形态有着很大的影响，1微流控腔室(5％交联程度水凝胶)，2微流控腔室(11％交联程度水凝胶)，3微流控腔室(17％交联程度水凝胶)中卵母细胞初始状态良好，4微流控腔室(23％交联程度水凝胶)中卵母细胞已经开始轻微形变，5微流控腔室(29％交联程度水凝胶)中卵母细胞发生了严重形变。由此分析可得不同交联程度的水凝胶具有不同的结构强度，这在组织培养中具有重要意义，因为人体同一组织中的不同功能细胞周边具有不同的组织强度；同时也表明了卵母细胞成功被不同交联程度的水凝胶所包裹。

[0040] 如图5所示，记录不同交联程度水凝胶下卵母的生长，发育情况。我们发现1微流控腔室(5％交联程度水凝胶)卵母16h培养生存率为91％，极体排除率为85％；2微流控腔室(11％交联程度水凝胶)卵母16h培养生存率为95％，极体排除率为90％；3微流控腔室(17％交联程度水凝胶)卵母16h培养生存率为88.7％，极体排出率为72％；4微流控腔室(23％交联程度水凝胶)卵母16h培养生存率为61％，极体排出率为41％；5微流控腔室(29％交联程度水凝胶)卵母16h培养生存率为43％，极体排出率为19％；这表明了不同交联程度的水凝胶对卵母细胞生长，发育具有重要影响，在低交联程度的水凝胶中，卵母细胞有着较高的生存率与极体排出率，当交联程度增大时，卵母细胞的生长，发育都受到了很大的限制。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

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