技术领域
[0001] 本
发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法。
背景技术
[0002] 药物进入
生物体内后，在不同酶的作用下会发生一系列的
氧化、还原、
水解、结合等反应，肝脏是药物发生这些代谢反应的主要器官，是
机体进行生物转化的主要场所，含有参与药物代谢的一个庞大的细胞色素P450(CYP450)酶系，大多数药物的I相和II相代谢反应都依赖于肝脏酶系而发生(药物的首过效应来源于此)。因此在药物代谢领域，肝微粒体体外实验作为体外代谢研究的一个重要组成部分越来越受到人们的重视。
[0003] 虫草素是第一个从
真菌中分离出来的核苷类抗菌素，Bently等相继证实虫草素是由腺苷和有着
碳支链的脱氧戊糖组成的一种核苷酸，因此它也被称为3'-脱氧腺苷(3'-deoxyadenosine，3'-dA)，具有抑菌、抗
肿瘤、抗炎等生物学活性，目前已经成为一个研究热点。虫草素的分子式为C10H13N5O3，分子量为251，熔点230～231℃，紫外光最大吸收
波长为259nm。虫草素在体内大部分遵循嘌呤核苷酸代谢途径，在腺苷脱
氨酶(adenosine deaminase，ADA)的作用下快速脱氨基而成为无生物活性的代谢产物—3'-脱氧次黄嘌呤核苷，其余小部分则被磷
酸化为三
磷酸虫草素(可能为虫草素具有生物活性的成分)(Agarwal RP,Sagar SM,Parks RE.Jr Biochem Pharmacol,1975,24(6):693-701；YUNG-JEN TSAI,LIE-CHWEN LIN,TUNG-HU TSAI.Pharmacokinetics of Adenosine and Cordycepin,a Bioactive Constituent of Cordyceps sinensis in Rat,J.Agric.Food Chem.2010,58,
4638-4643)。目前，对于虫草素的研究，多集中在提取纯化工艺和药理活性研究，迄今为止，未见以肝微粒体为模型的体外代谢研究。
发明内容
[0004] 本发明目的是针对现有研究的空缺，提供测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用检测方法，该方法具有操作简便，样品处理简单、分析速度快、特异性强、灵敏度高的优点。为研究虫草素在肝微粒体中的体外代谢产物提供技术支持，同时为研究虫草素的体内外代谢研究奠定方法学
基础，具有重要意义。
[0005] 本发明采用的技术方案为：
[0006] 测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，包括以下步骤：
[0007] 1)虫草素肝微粒体的温孵培养
[0008] 在培养瓶中加入肝微粒体、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl2后，补加三(羟甲基)氨基甲烷
盐酸缓冲液配成肝微粒体孵育体系；在37℃全温
振荡器温孵2-5min，再定量加入虫草素三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液，开始反应，30min后将培养瓶从全温振荡器中取出，迅速加入冷的
有机溶剂A终止代谢反应，得温孵产物；
[0009] 2)样品处理
[0010] 将温孵产物涡旋振荡30s，5000r/min离心10min，准确吸取上清液，在氮气下吹干后得残留物；残留物用甲醇复溶，涡旋振荡后，5000r/min离心10min，吸取上清液，上清液过0.22μm微孔滤膜后，进样10μL，进行液质检测；
[0011] 3)样品分析
[0012] 进行肝微粒体中虫草素代谢物测定，具体条件如下：
[0013] 色谱条件：
[0014] 色谱柱：DiamonsilTM ODS C18；流动相：甲醇:水＝15:85；洗脱时间：t＝32min；进样量：10μL；检测波长：λ＝260nm；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；
[0015] 质谱条件：
[0016] 一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；电喷雾
电压：4.0bar；干燥气流速：10L/min；干燥气
温度：200℃；
[0017] 二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；碰撞气：氮气；毛细管电压：2.8kV；锥孔电压：3.0V；源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气体流量：10L/min；碰撞
能量：15-25eV。
[0018] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，所述步骤1)
有机溶剂A为甲醇或乙腈，其加入量体积为反应体系的2-4倍。
[0019] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，所述步骤3)中色谱柱型号为DiamonsilTM ODS C18，色谱柱250mm×4.6mm，5μm。
[0020] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的pH为7.4。
[0021] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，步骤1)孵育体系中肝微粒体的浓度范围为2.0-4.0mg/mL、NADP的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、NADH的浓度范围为0.5-1.0mmol/L、G-6-P浓度为10mmol/L、G-6-P DH的浓度范围为1.0-2.0IU/mL、MgCl2的浓度为
4.0mmol/L、虫草素的浓度范围为1.0-1.5mg/10mL。
[0022] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，所述肝微粒体为小鼠、大鼠或人的肝微粒体。
[0023] 所述的测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，步骤1)中三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液的浓度是50mmol/L。
[0024] 本发明具有以下有益效果：
[0025] 本发明采用大鼠肝微粒体对虫草素进行体外代谢，通过液质联用检测方法对代谢产物进行测定，经测定虫草素在大鼠肝脏中代谢途径，在脱氨酶(adenosine deaminase，ADA)的作用下快速脱氨基而成为无生物活性的代谢产物1，经MS1和MS2质谱分析确证，检测+到[M+H] 为253.0932,137.0413为脱去3'-脱氧核糖后腺嘌呤的碎片离子峰，110.0315为脱去3'-脱氧核糖后的腺嘌呤中六元环开环后得到的碎片。因此确定代谢产物1为3'-脱氧次黄嘌呤核苷。另外，在4.6min和10.3min左右有代谢物2和有代谢物3产生，结构待定。
[0026] 本发明采用大鼠肝微粒体对虫草素进行体外代谢，通过优化反应条件，确定其最佳孵育体系，并建立一种对虫草素代谢产物适用且简单快速、选择性好、检测灵敏度高的液质联用方法，可以为进一步研究虫草素体内外代谢奠定方法学基础。
附图说明
[0027] 图1为肝微粒体转化虫草素的总离子流色谱图
[0028] 图2为肝微粒体总离子流色谱图
[0029] 图3为虫草素总离子流色谱图
[0030] 图4为虫草素在肝微粒体中代谢产物1的提取离子图
[0031] 图5为虫草素在肝微粒体中代谢产物1的结构式
[0032] 图6为虫草素在肝微粒体中代谢产物1的质谱裂解途径
[0033] 图7为虫草素在肝微粒体中转
化成代谢产物1的途径
[0034] 图8为虫草素在肝微粒体中代谢产物2的提取离子图
[0035] 图9为虫草素在肝微粒体中代谢产物3的提取离子图
具体实施方式
[0037] 氧化型辅酶II(NADP)和还
原型辅酶I(NADH)购自上海如吉生物科技发展有限公司。
[0038] 6-磷酸
葡萄糖(G-6-P)和6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-P DH)购自南京都莱生物公司。
[0039] 三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自国药集团化学试剂有限公司。
[0040] 盐酸购自山东禹王实业有限公司化工分公司。
[0041] 氯化镁(带六个结晶水)购自天津市瑞金特
化妆品有限公司。
[0042] 甲醇(分析纯)、甲醇(色谱纯)购自山东禹王实业有限公司化工分公司。
[0043] 高效液相虫草素为实验室自制，含量≥98％。
[0044] SPF级SD雄性大鼠，体重230～250g，由辽宁长生生物科技有限公司提供。
[0045] 安捷伦1260高相液相色谱仪(美国Agilent公司)，配有四元
泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱和
二极管阵列检测器，及布鲁克7.0T FT-ICR质谱系统(德国Bruker公司)，沃特世高相液相色谱仪系统及Waters LCT Premier XE系统(美国Waters公司)，台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，
电子天平(梅特斯-托利多仪器(上海)有限公司)，全温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)，RE 52-99
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，KQ5200E型
超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
[0046] 溶液配制
[0047] Tris-HCl缓冲液：精密称取三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)6.0565g，盐酸3.5mL，加入去离子水定容至1000mL；
[0048] NADP溶液：精密称量18.96mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0049] NADH溶液：精密称量8.64mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0050] G-6-P溶液：精密称量72.96mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0051] G-6-P DH溶液：精密称量0.14mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0052] MgCl2溶液：精密称量19.44mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0053] 虫草素溶液：精密称量2mg，加入Tris-HCl缓冲液定容至2mL；
[0054] 肝微粒体溶液：实验室自制，浓度为25.88mg/mL。
[0056] 测定肝微粒体中虫草素代谢物的液质联用方法，包括以下步骤
[0057] 1)虫草素肝微粒体的温孵培养
[0058] 转化体系为2mL，在培养瓶中加入肝微粒体溶液154μL，NADP溶液166μL，NADH溶液164μL，G-6-P溶液166μL，G-6-P DH溶液144μL，MgCl2溶液166μL，补加840μL三(羟甲基)氨基甲烷盐酸缓冲液后摇匀，放入预热好的37℃全温振荡器温孵5min，再加入200μL虫草素溶液，开始反应。反应过程中，每20min在液面上通氧气30s，30min后将培养瓶从振荡器中取出，迅速加入冷的6mL甲醇终止代谢反应。
[0059] 2)样品处理
[0060] 温孵产物涡旋振荡30s，离心(转速5000r/min)10min，准确吸取上清液，在氮气下吹干后，残留物用1mL甲醇复溶，涡旋振荡后，离心(转速5000r/min)10min，吸取上清液，过0.22μm微孔滤膜，进样10μL进行HPLC-MS检测。
[0061] 3)液质联用分析
[0062] 温孵产物经样品处理后，进行代谢物的测定，具体条件如下：色谱柱：DiamonsilTM ODS C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇:水＝15:85；洗脱时间：t＝32min；进样量：10μL；检测波长：λ＝260nm；流速：0.5mL/min。
[0063] 质谱条件：
[0064] 一级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；电喷雾电压：4.0bar；干燥气流速：10L/min；干燥气温度：200℃。
[0065] 二级质谱：电离模式：电喷雾电离(ESI)；扫描模式：正离子扫描；碰撞气：氮气；毛细管电压：2.8kV；锥孔电压：3.0V；源温度：110℃；脱溶剂温度：350℃；脱溶剂气体流量：10L/min；碰撞能量：15-25eV。
[0066] 结果如1-9所示，图1为虫草素在肝微粒体中转化的总离子流色谱图，图2为空白肝微粒体总离子流色谱图，图3为虫草素标准品的总离子流色谱图，通过对比图1和图2、图3，可以看出，虫草素在肝微粒体中转化后，在保留时间分别为4.6min、10.3min和13.0min均出现了新增加的色谱峰，对比图3，可以看出虫草素已经完全转化，即虫草素在肝微粒体中转化后，通过液质检测的方法，得到了代谢产物。图4为虫草素在肝微粒体中代谢产物1的提取离子色谱图，可以看到在保留时间为4.6min的代谢物，并且通过液质二级碎片的推测如图6所示，得到了代谢产物1的结构如图5所示为3'-脱氧次黄嘌呤核苷。图7为结合文献推测得到的，虫草素的代谢途径示意图。图8和图9分别为虫草素在肝微粒体中代谢产物2和代谢产物3的提取离子图，图中看出，通过实施例1的方法可以测定虫草素在肝微粒体中转化的代谢产物。
