技术领域
[0001] 本
发明属于生化分析技术领域，具体涉及一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法。
背景技术
[0002] 维持基因组DNA的完整性对于保持物种的稳定具有十分重要的意义，然而基因组DNA不可避免地收到体内外各种因素的影响，如
辐射、化学诱变剂、
活性氧(ROS)等。在各种各样的DNA损伤中，8-氧桥
鸟嘌呤(8-oxoG)是一种比较常见的氧化损伤，通常由暴露在细胞内的活性氧(ROS)导致产生。这种氧化损伤如果不进行及时修复，会导致一系列DNA结构的变换。而且，8-氧桥鸟嘌呤在DNA复制过程中能够和A
碱基发生错配，诱导G:C碱基
配对向A:T配对的突变，进一步导致多种癌症的发生。人体内，人8-氧桥鸟嘌呤DNA糖基化酶(human 8-oxoguanine DNA glycosylase，hOGG1)是一种专
门用于修复DNA损伤8-氧桥鸟嘌呤的碱基修复酶。hOGG1能够特异性识别双链DNA中的oxoG：C碱基对，将损伤的oxoG碱基从DNA中
切除，进一步切断DNA的骨架，然后在聚合酶和连接酶作用下完成受损DNA的修复。DNA糖基化酶hOGG1的异常表达与很多
疾病密切相关，如
肺癌、
乳腺癌、胃癌、胆囊癌、膀胱癌、
帕金森病。因此，发展一种高灵敏、高特异性检测DNA糖基化酶hOGG1的方法对于疾病的早期诊断具有重要意义。
[0003] 传统检测DNA糖基化酶hOGG1的方法主要包括凝胶
电泳(gelelectrophoresis)、
放射性标记(radiolabeling)、高效液相色谱分析(HPLC)以及质谱分析(MS)。这些检测方法十分有效，但是非常耗时，操作繁琐，而且存在安全隐患。
[0004] 为了克服以上缺点，近年来也发展了以
纳米技术为
基础的比色检测法以及
荧光染料为基础的荧光探针检测法，如CN105755101A公开了一种基于单个
量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法，检测时，DNA糖基化酶hOGG1会特异性识别并切除损伤鸟嘌呤，留下一个脱碱基位点，脱嘌呤核酸内切酶-1(APE1)会对脱碱基位点进一步剪切，留下一个核苷酸的缺口，DNA聚合酶β将三
磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸(Cy5-dGTP)聚合在该缺口处，生成双标记的双链核苷酸底物，通过
生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，DNA底物会结合在
覆盖有链霉亲和素的量子点表面，形成量子点-DNA-Cy5复合物，空间距离缩小，导致量子点和Cy5之间发生荧光共振
能量转移，从而可以在单分子水平观察到Cy5的荧光
信号，实现了hOGG1的快速、灵敏检测；CN104630363A公开了一种基于免标记无酶DNA机器荧光放大策略检测尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的方法，利用包含尿嘧啶碱基和引发序列的双链DNA探针识别UDG目标物并释放引发链，该引发链可激活免标记无酶的DNA机器，产生放大的荧
光信号，由于双链DNA探针及G-四联体的设计，检测方法成功实现了背景降低和信号放大，UDG活性的
检测限为0.00044U/mL。以上方虽然有效，但是纳米颗粒的处理较为麻烦，耗时长，操作复杂，而且必须进行荧
光标记和信号的循环放大才能达到较高的灵敏度。
[0005] 近年来，纳米孔传感技术因其快速、低成本、无需标记等优点，在化学和生物等诸多研究领域得到广泛应用，已发展成为一种新颖的、独具特色的单分子分析手段。由于单个待测分子在纳米通道中的物理占位作用等，改变了通道的
电阻，从而引发流经纳米通道的离子
电流发生变化，形成阻断电流信号。离子流阻断程度和阻断时间等信号可反映分子的序列、结构特征等信息，信号
频率可反映分子的浓度。将纳米孔技术应用于生物标志物的超灵敏检测，可实现对疾病的早期诊断和
治疗，在临床医学领域具有广阔的应用前景。
[0006] 如何设计有效的检测策略从而实现对DNA糖基化酶活性的高效、快速、灵敏检测，是本领域内亟待解决的技术问题。
发明内容
[0007] 为了解决传统方法操作复杂、灵敏度低，
现有技术依赖于各种标记或信号扩增的问题，本发明提出一种简单、灵敏、无需标记和扩增的利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法。
[0008] 本发明采用以下技术方案：
[0009] 一种利用α-溶血素纳米孔检测DNA糖基化酶活性的方法，它包括如下步骤：
[0010] (1)双链DNA底物探针的制备：将双链DNA通过生物素-链霉亲和素作用固定在链霉亲和素
磁珠(MB)表面，形成双链DNA-磁珠复合物作为探针；所述双链DNA底物由两条局部互补配对的DNA杂交形成，该双链DNA的其中一条链距离5′端18个碱基处为损伤碱基8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，3′端修饰一个生物素分子；
[0011] (2)DNA糖基化酶hOGG1与底物探针混合孵育反应：将步骤(1)所得双链DNA-磁珠复合物、1×NEB缓冲液、100μg/mL BSA以及各种不同浓度的DNA糖基化酶，37℃条件下孵育2小时，然后
磁性分离，收集上清液，并置于65℃孵育15分钟以使DNA糖基化酶hOGG1失活，得到的上清液即输出DNA，备用；
[0012] (3)α-溶血素纳米孔的组装：用貂毛笔在trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹磷脂溶液；将cis检测池和trans检测池组装后分别加入0.5M和3M KCl
电解质溶液，将一对Ag/AgCl
电极浸入
电解质溶液中，通过电流
放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加
电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜；在cis检测池中加入α-溶血素，当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃；在+120mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为195±10pA；
[0013] (4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将步骤(2)得到的上清液注入cis检测池，在外加
电场的驱动下，待测物逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号；实验产生的电流通过放大器放大采集，然后通过
数模转换器转换为
数字量，并传输到电脑上，通过
指定软件实时观测并记录纳米通道单分子实验数据；预实验在纳米孔道单分子电化学工作站Cube-D0上进行，利用软件和数据分析系统进行数据分析；产生的阻断信号频率与输出DNA的浓度呈正相关，实现对DNA糖基化酶hOGG1活性的检测。
[0014] 优选的，所述双链DNA底物中互补碱基的有效长度范围是15bp-60bp。
[0015] 优选的，所述双链DNA底物中互补碱基的长度为22bp。
[0016] 优选的，所述双链DNA底物的两条序列分别为P1(5’-ACGACAGAGTAGGATTCTCGACC30-3’)和P2(5’- /oxoG/TCGTT20-biotin-3’)，其中oxoG表示损伤碱
基8-氧鸟嘌呤，加粗碱基命名为P2R序列，斜体碱基命名为P2L序列，P2的3’端修饰一个生物素分子。
[0017] 优选的，所述步骤(2)中的1×NEB缓冲液具体组成为：50mM NaCl、10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、1mM DTT，pH 7.9。
[0018] 优选的，所述步骤(3)中涂抹的磷脂溶液为30mg mL-1的磷脂正癸烷溶液。
[0019] 优选的，所述步骤(3)中α-溶血素的加入量为1μL 5μg mL-1的α-溶血素。
[0020] 优选的，所述步骤(4)中
数模转换器为DigiData 1440A；指定软件为PClamp 10.6软件。
[0021] 本发明的检测方法对于DNA糖基化酶hOGG1的检测下限可达6.5×10-6U/μL。
[0022] 本发明所述检测方法的原理为：所述方法设计一个部分互补的双链DNA作为DNA糖基化酶hOGG1的底物，命名为P1/P2，该双链DNA的其中一条链P2距离5’端18个碱基处为损伤8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)，3’端修饰一个生物素分子，通过生物素-链霉亲和素作用，将该双链DNA固定在链霉亲和素磁珠表面，形成的双链DNA-磁珠复合物作为探针。DNA糖基化酶hOGG1存在时，会特异性识别8-氧鸟嘌呤并切除该损伤碱基。磁性分离后探针裂解成为两个部分，一部分是仍固定于磁珠表面的单链DNA，另一部分是释放下来的局部杂交双链，称为输出DNA。利用α-溶血素纳米孔检测该输出DNA，产生的阻断信号频率与输出DNA的浓度呈正相关，因此可以用来检测DNA糖基化酶hOGG1的活性。由于纳米孔技术具有无需标记、灵敏度高等优点，因此该方法可以实现灵敏、高效、免标记、免扩增检测DNA糖基化酶的活性。
[0023] 其中，本发明所述双链DNA底物中互补碱基的有效长度范围是15bp-60bp，小于15bp不利于常温下双链DNA的稳定；大于60bp时双链DNA可能容易形成二聚体或二级结构，影响DNA糖基化酶hOGG1对它的识别或切割。
[0024] 本发明所述链霉亲和素磁珠是指从公司Invitrogen(California,U.S.A.)购买得到的Dynabeads MyOneTM Streptavidin T1(10mg/mL，直径1.0μm)。
[0025] 本发明的有益效果是：
[0026] (1)特异性好：由于本方法是基于DNA糖基化酶hOGG1对损伤碱基8-氧鸟嘌呤的特异性识别和切割，这种识别是严格按照自然机制进行的，因此反应的特异性极高；不仅如此，
发明人对具体的反应条件也进行了较为全面细致的优化，因此几乎不发生非特异性反应；生成的产物在纳米孔中会产生高度特征性的阻断信号，这也大大提高了该方法的特异性。
[0027] (2)灵敏度高：纳米孔是一种非常灵敏的单分子分析手段，而且实验操作时在两个检测池中加入了不同浓度的KCl(0.5M/3M，cis/trans)以形成盐浓度差，大大提高了检测的灵敏度，本发明所述方法检测下限可达6.5×10-6U/μL。
[0028] (3)无需标记和循环放大：本方案中没有进行任何标记，没有引入任何循环扩增，仅仅利用纳米孔的高灵敏度优点即可实现DNA糖基化酶hOGG1的灵敏检测。这是其他检测方法如荧光法、比色法做不到的。
[0029] (4)设计简单：本方案只涉及一个双链DNA底物探针，该探针序列只要包括损伤碱基8-氧鸟嘌呤即可，在有效长度范围内对其他碱基的序列没有任何特殊要求。
附图说明
[0030] 图1利用纳米孔检测DNA糖基化酶hOGG1活性的原理图。
[0031] 图2非变性聚丙烯酰
氨凝胶电泳验证hOGG1对DNA底物的切割。(－)号是只有双链DNA底物P1/P2、没有hOGG1的样品，(+)号是双链DNA和hOGG1同时存在的样品。
[0032] 图3纳米孔检测hOGG1活性图。(A)有无hOGG1时的纳米孔检测图，Blank表示不加hOGG1的样品；hOGG1表示DNA糖基化酶hOGG1存在时的阻断信号，红色三
角表示特征性阻断信号(B)统计分析信号的阻断时间；(C)统计分析信号的阻断程度。
[0033] 图4信号频率随DNA糖基化酶hOGG1浓度的变化情况及线性分析图。
[0034] 图5本发明方法的特异性分析结果图。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0036] 实施例1
[0037] (1)双链DNA底物探针的制备
[0038] 1)制备含有损伤碱基8-氧鸟嘌呤(8-oxoG)的双链DNA底物探针：DNA链P1(40μL,10μM)和DNA链P2(40μL,10μM)在20μL缓冲液(150mM NaCl,20mM Tris-HCl,pH 7.9)中混合，95℃孵育5分钟后逐渐冷却至室温，得到浓度为4μM的双链DNA，命名为P1/P2。P1的序列是5’-ACGACAGAGTAGGATTCTCGACC30-3’，P2的序列是5’- /oxoG/TCGTT20-biotin-3’，其中oxoG表示损伤碱基8-氧鸟嘌呤，加粗碱基命名为P2R序列，斜体碱基命名为P2L序列，P2的3’端修饰一个生物素分子。
[0039] 2)双链DNA P1/P2固定在链霉亲和素磁珠(MB)表面：先用1mL 1×BW缓冲液(1M NaCl,1mM EDTA,10mM Tris-HCl,pH 7.5)将磁珠(50μL,10mg/mL)洗三次，然后将25μL双链DNA、25μL超纯水和磁珠在50μL 2×BW缓冲液中混匀，涡旋15分钟后磁性分离，将上清液倒出，保留磁珠。由于P2链的3’末端修饰一个生物素分子，通过生物素-链霉亲和素作用，双链DNA结合于磁珠表面形成P1/P2-磁珠复合物。最后用0.5mL1×BW缓冲液冲洗磁珠三次。
[0040] (2)DNA糖基化酶hOGG1与底物探针混合孵育反应：反应总体积为100μL，利用实施例1制备的P1/P2-磁珠复合物、1×NEB缓冲液(50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT,pH 7.9)、100μg/mL BSA以及各种不同浓度的hOGG1，37℃条件下孵育2小时，然后磁性分离，收集上清液，并置于65℃孵育15分钟以使hOGG1失活。由于hOGG1能够特异性识别双链DNA底物中的8-氧鸟嘌呤并将其切除，因此P1/P2-磁珠复合物与hOGG1孵育后形成两部分，一部分是自由的P1/P2R杂交链，另一部分是磁珠-单链DNA复合物。磁性分离后收集的上清液中含有的自由P1/P2R杂交链进行下一步分析。
[0041] (3)α-溶血素纳米孔的组装：将磷脂氯仿溶液抽空抽干，加入正癸烷配置成30mg mL-1溶液。用000号貂毛笔在1mL trans检测池的小孔内外两侧均匀涂抹30mg mL-1磷脂正癸烷溶液。将cis检测池和trans检测池组装后分别加入1mL电解质溶液((cis:0.5M KCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8；trans:3M KCl,10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 7.8))。将一对Ag/AgCl电极浸入电解质溶液中，通过电流放大器探头向磷脂双分子层膜两端施加+100mV电压，使用提拉法在trans池的小孔处形成磷脂双分子层膜。在cis检测池中加入1μL 5μg -1mL 的α-溶血素。当α-溶血素在磷脂双分子层膜上自组装形成一个稳定的纳米通道时，离子流将量子化阶跃。在+120mV电压条件下，单个纳米孔的稳定开孔电流为195±10pA。
[0042] (4)利用α-溶血素纳米孔检测输出DNA：将第(2)步得到的上清液注入cis检测池，在外加电场的驱动下，待测分子逐一通过α-溶血素纳米孔，产生阻断信号。实验产生的电流通过Axopatch 200B(Axon Instruments公司,美国)放大采集，通过DigiData 1440A数模转换器(Axon Instruments公司，美国)转换为数字量，并传输到电脑上。通过PClamp 10.6软件(Axon Instruments公司，美国)实时观测并记录纳米通道单分子实验数据。预实验在纳米孔道单分子电化学工作站Cube-D0(华东理工大学龙亿涛课题组研制)上进行。利用龙亿涛课题组研制的软件和OriginLab 9.0进行数据分析。
[0043] 实施例2
[0044] 实验的可行性验证
[0045] 为了验证DNA糖基化酶hOGG1在体外进行损伤碱基切除的可行性，首先利用非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳对反应产物进行初步分析，结果如图2所示。由于磁珠影响电泳检测，因此以不接磁珠的双链DNA(命名为P1/P2)为反应底物。从图2可以看出，只有双链DNA底物P1/P2、没有DNA糖基化酶hOGG1时，只有一条带。当DNA底物P1/P2和DNA糖基化酶hOGG1同时存在时，能够观察到两条带，一条是双链DNA底物，另一条明显小于双链DNA底物，说明DNA糖基化酶hOGG1特异性识别并切除受损碱基，产生了新的、缩短的局部互补DNA，推测这是P1/P2R杂交链。理论上应该还能观察到一条更短的单链DNA，但是由于该单链DNA序列简单、不易形成二级结构，从而影响与电泳中的染料溴化乙锭的结合，而电泳的检测灵敏度太低，所以没有出现相应的条带。
[0046] 实施例3
[0047] 本发明纳米孔检测hOGG1活性如图3所示。(A)有无hOGG1时的纳米孔检测图。Blank表示不加hOGG1的样品，纳米孔检测只出现背景信号，推测这是反应混合物与纳米孔开口端随机碰撞造成的；hOGG1表示DNA糖基化酶hOGG1存在时的阻断信号，红色三角表示特征性阻断信号。(B)统计分析信号的阻断时间。(C)统计分析信号的阻断程度。根据统计分析结果，阻断时间介于1～15ms、阻断程度超过80％的信号是产物P1/P2R产生的特征性阻断信号，能够作为hOGG1存在的依据。
[0048] 实施例4
[0049] 灵敏度实验
[0050] 为了评估本技术方案在检测DNA糖基化酶hOGG1活性的灵敏度，对不同浓度的hOGG1进行了分析检测，结果如图4所示，随hOGG1浓度的提高，其反应产物在纳米孔实验中的信号频率随之增加，频率的对数值与hOGG1的对数值在一定浓度范围内呈良好的线性关系。经过计算，检测限可达6.5×10-6U/μL，因此本方法具有较高的检测灵敏度。
[0051] 实施例5
[0052] 特异性实验
[0053] 为了评估本技术方案的特异性，实验中同时选用了
牛血清
白蛋白(BSA)、尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)、胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和脱嘌呤/嘧啶核酸内切酶1(APE1)作为检测样品，结果如图5所示。能够看出，DNA糖基化酶hOGG1产生了高频率的阻断信号，而其他几种
蛋白质或酶的信号都接近于阴性对照(不加任何蛋白或酶)。以上结果表明，该方法能够很好的区分hOGG1和其他蛋白或酶，证明本技术方案具有很高的特异性。
[0054] 应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附
权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
