技术领域
[0001] 本
发明涉及一种准确定量重组肌钙蛋白I含量的方法，具体涉及一种肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法。
背景技术
[0002] 肌钙蛋白(cTnI)是检测心肌损伤最敏感的
生物学指标之一。然而，cTnI检测仍存在一些问题，主要是检测方法尚未标准化，不同方法间存在一定的差异，检测结果常常不具有跨
时空的可比性。
[0003] 同位素液相色谱-
串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC/MS/MS)的优点是高灵敏度、高精确性、高度特异性，其测量结果标准化可直接溯源至国际基本单位制。国内学者[1]建立
氨基酸同位素稀释质谱法定量重组cTnI，该法需高温
水解氨基酸，存在安全隐患。
[0004] 国内有关肽段同位素稀释质谱法定量蛋白含量的研究报道较少，主要与蛋白样品成分复杂、其
离子化程度容易受到其他杂质离子的影响，实验条件较为复杂。
[0005] 参考文献：
[0006] [1]孙
雪晴.重要生物标志物-甲胎蛋白、瘦素及肌钙蛋白I的绝对定量方法[D].北京化工大学，2014。
[0007] [2]Kuhn E，Addona T，Keshishian H，et al.Developing multiplexed assays for troponin I and interleukin-33in plasma by peptide immunoaffinity enrichment and targeted mass spectrometry.Clin Chem[J].2009，55(6)：1108-17。
[0008] [3]Keshishian H，Addona T，Burgess M，et al..Quantification of cardiovascular biomarkers in patient plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol Cell Proteomics[J].2009，8(10)：2339-49。
[0009] [4]Huillet C，Adrait A，Lebert D，et al.Accurate quantification of cardiovascular biomarkers in serum using Protein Standard Absolute Quantification(PSAQTM)and selected reaction monitoring[J].Molecular&Cellular Proteomics Mcp，2012，11(2)：8681-8696。
[0010] [5]Zhao C，Trudeau B，Xie H，et al.Epitope mapping and targeted quantitation of the cardiac biomarker troponin by SID-MRM mass spectrometry.Proteomics[J].2014，14(11)：1311-21。
发明内容
[0011] 本发明的目的是提供一种对重组cTnI特异性肽段液相质谱条件进行研究和改进，所建方法准确度好，速度快，出峰时间为4.20min的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法。
[0012] 为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法，包括以下步骤：
[0013] (1)特征肽段设计：在Pubmed
蛋白质数据库搜索人源Troponin I氨基酸序列，Accession：NP_000354.4，然后在线分析质谱肽段，网址：http：//web.expasy.org/peptide_mass/，结合实验室质谱仪器特点选择目的肽段，然后将目肽段在pubmed蛋白质数据库进行blast同源检索，确定为特异肽段。
[0014] (2)特征肽段质谱分析离子对的确定：用skyline
软件分析研究特异肽段的母离子和子离子，调节碰撞
能量选择
信号强的三对离子进行研究，信号最强的为定量离子对，其他为定性离子对。
[0015] (3)LC-MRM条件研究：超高压液相色谱(UPLC LC-30A)参数液相色谱仪：岛津效液相色谱输液
泵和自动进样器；色谱柱：CSH 130C18；柱温40℃，流动相A：0.1％
甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，流速0.3mL/min，流动相B 2min 5％，8min 50％，9min 90％，14min 5％。质谱分离条件，仪器AB 5500，离子喷射
电压5500V；
温度550℃；气帘气体(CUR)为25L/min，碰撞气体(CAD)8L/min；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)。
[0016] (4)样本分析前处理：主要步骤有：重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓缩样品。
[0017] (5)数据分析：用软件Analystl.2.1分析标准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内标肽(离子对626.8/1025.6)峰面积并制作标准曲线。根据标准曲线计算cTnI肽段浓度。重组蛋白cTnI浓度(ng/mL)为cTnI特异性肽段浓度乘以19.28；19.28由cTnI分子量(24016Da)除以cTnI特征肽分子量(1245.41Da)。
[0018] (6)回收率及精
密度：配制cTnI含量为62.1ng/mL、621ng/mL水溶液，按样本分析前处理和测定，测量值与理论值之比为方法回收率。同时，低、高两个浓度蛋白样品分别于1d内连续测定5次，连续测5天，计算批内和批间精密度。
[0019] 作为本发明的进一步改进；所述的步骤(1)的具体操作方法为：根据人源cTnI蛋白质氨基酸序列，用Peptide mass软件设计同位素稀释质谱法测cTnI特异性肽段NITEIADLTQK，经BLAST检索该肽段为特异性肽段，理论分子量为1245.7Da；合成肽分子量为1245.41Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为623.3Da；在特异性肽段L氨基酸位点标记同位素(13C615N)，标记同位素分子量为7Da，同位素标记肽段分子量为1252.6Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为626.8Da；仪器AB 5500三重四级杆质谱仪鉴定特异性肽段离子对为623.3/1018.6、623.3/675.1、623.3/788.6；同位素标记肽段离子对为626.8/1025.6、
626.8/682.1、626.8/795.5，其中623.3/1018.6与626.8/1025.6为绝对定量离子对。
[0020] 作为本发明的进一步改进；所述的步骤(4)中，样本分析前处理的具体步骤为：
[0021] I)变性，25μL蛋白液样品加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL，再加217.5μL 25mmol/L
碳酸氢铵混匀，加尿素96mg使其终浓度为6M，混匀，静置5min；
[0022] II)还原烷基化，加250μL 25mmol/L碳酸氢铵，加100mM二硫苏糖醇(DTT)50μL，60℃水浴30min。烷基化，加550mM碘乙酰胺(IAA)50μL。室温避光20min。加200mM DTT 50μL，室温20min。加25mmol/L碳酸氢铵1000μL，使尿素浓度小于1M；
[0023] III)酶解，加入胰酶，胰酶与样品
质量比为1∶10，37℃水浴4h，加0.1％三氟乙酸(TFA)30μL终止反应；
[0024] IV)纯化样品，加3.0mL甲醇活化OASIS MAX固相萃取柱(3cc/60μm)，待甲醇流尽后加3.0mL去离子平衡柱子，加酶解产物于柱中，先后用2.0mL10％
氨水、2.0mL甲醇洗涤，最后用2.0mL 2％甲酸甲醇洗脱；
[0025] V)浓缩样品，在氮吹仪上浓缩洗脱液，气体流量5mL/min，温度45℃，待
有机溶剂挥发后，用0.1mL 0.1％FA溶解。上机进行液相质谱检测，进样量5μL。
[0026] 作为本发明的进一步改进；所述的步骤(5)中，数据分析的具体方法为：
[0027] cTnI特异性肽段浓度，cTnI蛋白肽出峰时间4.20min，用软件Analyst1.2.1分析标准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内标肽(离子对626.8/1025.6)峰面积并制作标准曲线，权重线性回归方程(″1/x″weighting)：y＝0.208x-0.072(r＝0.9988)，根据标准曲线计算cTnI肽段浓度；cTnI肽标准曲线制备：标准肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位，将其用质谱级水配制不同浓度1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，分别加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL混匀，检测前处理过程与步骤(1)一步骤(4)相同。
[0028] 作为本发明的进一步改进；所述的步骤(6)中，含量为62.1ng/mL水溶液相当肽浓度3.22ng/mL、621ng/mL水溶液相当肽浓度32.2ng/mL；低、高cTnI蛋白回收率分别为94.65％和103.15％。cTnI低、高样品批间精密度(CV)分别为7.04％、5.69％，批内精密度(CV)分别为6.15％、4.76％。回收率及精密度符合规定要求。
[0029] 采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：
[0030] 根据Pubmed数据库筛选出cTnI特异性肽段，建立肽段同位素稀释质谱法定量重组cTnI的方法。本方法在标准品、同位素内标等方面明显不同与氨基酸同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I。本法检测结果同样可溯源至SI。为研究血清cTnI标准物质的研究奠定
基础。
附图说明
[0031] 图1为本发明所提供的
实施例的生物信息学分析特异性肽段的选择图；
[0032] 在http：//web.expasy.org/peptide_mass/数据库进行cTnI胰酶酶切位点分析，图1为cTnI胰酶酶切位点单价和二价预测结果，结合质谱仪器特点，方框为最终选择结果；
[0033] 图2为本发明所提供的实施例的特异性肽段离子质谱二级扫描图；
[0034] 图3为本发明所提供的实施例的同位素标记的肽段离子质谱二级扫描图；
[0035] 图4为本发明所提供的实施例的cTnI LC-MS/MS图。
具体实施方式
[0036] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0037] 本具体实施方式采用以下技术方案：一种肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法，包括以下步骤：
[0038] (1)肽段设计：
[0039] 根据人源cTnI蛋白质氨基酸序列，用Peptide mass软件设计同位素稀释质谱法测cTnI特异性肽段NITEIADLTQK，见图1，经BLAST检索该肽段为特异性肽段，理论分子量为1245.7Da。合成肽分子量为1245.41Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为623.3Da。我们在特异性肽段L氨基酸位点标记同位素(13C615N)，标记同位素分子量为7Da，同位素标记肽段分子量为1252.6Da，在溶液中主要为二价电荷，分子量为626.8Da。本具体实施方式标记肽段与国外报道不同，具体见表1：
[0040] 表1cTnI特异肽和同位素标记肽比较
[0041]
[0042] 仪器AB 5500三重四级杆质谱仪鉴定特异性肽段离子对为623.3/1018.6、623.3/675.1、623.3/788.6。同位素标记肽段离子对为626.8/1025.6、626.8/682.1、626.8/795.5。
结果见图2、图3，其中623.3/1018.6与626.8/1025.6为绝对定量离子对。
[0043] (2)液相分离条件：
[0044] 超高压液相色谱(UPLC LC-30A)参数液相色谱仪：岛津效液相色谱
输液泵和自动进样器(日本公司)；色谱柱：Water公司CSH 130C18(150mm×2.1，3.5μm，美国Waters公司)；柱温40℃，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液，流速0.3mL/min，流动相B：2min 5％，8min 50％，9min 90％，14min 5％。
[0045] (3)质谱分离条件：
[0046] 仪器AB 5500，离子喷射电压5500V；温度550℃；气帘气体(CUR)为25L/min，碰撞气体(CAD)8L/min；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)。具体参数见表2：
[0047] 表2质谱优化条件
[0048]
[0049] (4)样本分析前处理：
[0050] 主要步骤有：重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓缩样品。
[0051] a)变性，25μL蛋白液样品加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL，再加217.5μL 25mmol/L碳酸氢铵混匀，加尿素96mg使其终浓度为6M，混匀，静置5min。
[0052] b)还原烷基化，加250μL 25mmol/L碳酸氢铵，加100mM二硫苏糖醇(DTT)50μL，60℃水浴30min。烷基化，加550mM碘乙酰胺(IAA)50μL。室温避光20min。加200mM DTT 50μL，室温20min。加25mmol/L碳酸氢铵1000μL，使尿素浓度小于1M。
[0053] c)酶解，加入胰酶，胰酶与样品质量比为1∶10，37℃水浴4h，加0.1％三氟乙酸(TFA)30μL终止反应。
[0054] d)纯化样品，加3.0mL甲醇活化OASIS MAX固相萃取柱(3cc/60μm)，待甲醇流尽后加3.0mL去离子平衡柱子，加酶解产物于柱中，先后用2.0mL10％氨水、2.0mL甲醇洗涤，最后用2.0mL 2％甲酸甲醇洗脱。
[0055] e)浓缩样品，在氮吹仪上浓缩洗脱液，气体流量5mL/min，温度45℃，待
有机溶剂挥发后，用0.1mL 0.1％FA溶解。上机进行液相质谱检测，进样量5μL。
[0056] (5)cTnI肽标准曲线制备：标准肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位。将其用质谱级水配制不同浓度1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL，分别加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL混匀。检测前处理过程与步骤1-4相同。
[0057] (6)数据分析：
[0058] a)cTnI特异性肽段浓度，cTnI蛋白肽出峰时间4.20min，见图4。用软件Analystl.2.1分析标准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内标肽(离子对626.8/1025.6)峰面积并制作标准曲线。权重线性回归方程(″1/x″weighting)：y＝0.208x-0.072(r＝0.9988)。根据标准曲线计算cTnI肽段浓度。
[0059] b)重组蛋白cTnI浓度(ng/mL)等于cTnI特异性肽段浓度乘以19.28。注：19.28由cTnI分子量(24016Da)除以cTnI特征肽分子量(1245.41Da)。
[0060] (7)回收率及精密度
[0061] 配制cTnI含量为62.1ng/mL(相当肽浓度3.22ng/mL)、621ng/mL(相当肽浓度32.2ng/mL)水溶液，按样本分析前处理和测定，测量值与理论值之比为方法回收率。同时，低、高两个浓度蛋白样品分别于1d内连续测定5次，连续测5d，计算批内和批间精密度。低、高cTnI蛋白回收率分别为94.65％和103.15％。cTnI低、高样品批间精密度(CV)分别为
7.04％、5.69％，批内精密度(CV)分别为6.15％、4.76％。回收率及精密度符合规定要求。
[0062] 本具体实施方式与
现有技术的不同点在于：
[0063] 1、选择的肽段具有代表性，是cTnI特异性肽。应用生物信息学技术最终确定目的肽段NITEIADLTQK。与国外学者报道一致[2-4]。使用UPLC-MS法检测多肽时，多肽的响应信号增加或抑制与仪器和反应的化学
试剂的有关。Kuhn E等[2]和Keshishian H[3]合成了同位素特异肽NITEIAD[(13C6)，L]TQK，比标准肽多6Da。Huillet C[4]合成了同位素特异肽NITEIADLTQ[(13C615N2)K]，比标准肽多8Da。结合氨基酸特点合成了同位素特异肽NITEIAD[(13C615N)L]TQK，比标准肽NITEIADLTQK多7Da(见表1)。该同位素特异肽的理化性质与目标多肽完全一致，所表现出来的色谱质谱行为也一致，能校正由基质效应所带来的检测响应值
波动。
[0064] 2.LC-MS/MS结果，检测系统为AB Triple quad 5500LC/MS/MS，该系统
分辨率好，灵敏高，质谱优化条件见表2。Kuhn E用AB 4000Q TRAP LC/MS/MS检测系统，检测条件与本具体实施方式中基本一致，Huillet C用API5500Q-Trap检测系统，文献没有提供质谱优化条件。Kuhn E报道离子对623.3/1018.5信号最强，20min出峰。Huillet C报道离子对623.3/675.4信号最强，623.3/1018.5次之，出峰时间36.2min，本具体实施方式的离子对623.3/
1018.6信号最强，出峰时间4.20min。Zhao C等[5]建立cTnI另一种特异性肽段溶液标准曲线，标准曲线下限4ng/mL，本具体实施方式建立的肽溶液标准曲线下限为1ng/mL。
[0065] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附
权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0066] 此外，应当理解，虽然本
说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
