含有丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物及其制备方法
阅读：1022发布：2020-07-21
专利汇可以提供含有丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供制备组合成型组合物的方法和提高组合成型组合物的物理特性的方法。所述复合成型组合物为通过将具有β 片层 结构的肽或聚 氨 基酸配合在天然或被人工改造的丝心蛋白来源的 蛋白质 中而提高了 抗拉强度 、应变及韧性等特性的复合膜、复合 纤维 等的复合成型组合物。，下面是含有丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种组合物,其特征在于,包含
丝心蛋白来源的蛋白质；
和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于,
其中，所述组合物为复合成型组合物,其通过在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而成型。
3.如权利要求2所述的复合成型组合物，其特征在于,
其中，在所述复合成型组合物中保持着所述多肽和/或聚氨基酸来源的β片层结构。
4.如权利要求2或3所述的复合成型组合物，其特征在于,
其中，所述复合成型组合物选自复合纤维、复合膜、复合凝胶或复合模具成型物。
5.一种复合成型组合物,其特征在于,
其为在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合成型组合物，
所述复合成型组合物选自复合纤维、复合膜、复合凝胶，
且以含有以下：
(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)由所述纺丝液成型复合成型组合物的步骤的制备方法进行制备。
6.一种预拉伸复合成型组合物，其特征在于，
其为复合成型组合物，且所述复合成型组合物选自复合纤维或复合膜，并以在含有除如权利要求5所述的步骤(i)、步骤(ii)以外，还含有步骤(iii)的制备方法进行制备，所述步骤(iii)为在溶剂中拉伸在所述步骤(ii)所得到的复合成型组合物且对其进行干燥的步骤。
7.一种复合成型组合物，其特征在于，
其为复合成型组合物，且所述复合成型组合物为复合模具成型物，
并为以含有
(i)通过混合丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而制备混合物的步骤；以及
(ii)对所述混合物负载压力且对其进行加热的步骤的制备方法进行制备的模具成型物。
8.如权利要求2～7中任一项所述的复合成型组合物，
其所述丝心蛋白来源的蛋白质选自
(i)天然的丝心蛋白来源的蛋白质和/或
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
9.如权利要求8所述的复合成型组合物，其特征在于，
其中，所述天然的丝心蛋白来源的蛋白质为选自由蚕丝丝心蛋白来源的蚕丝蛋白质(蚕丝丝心蛋白的蛋白质)、蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质(蛛丝丝心蛋白的蛋白质)以及蜂丝丝心蛋白来源的蜂丝蛋白质构成的组中的至少一种。
10.如权利要求8所述的复合成型组合物，其特征在于，
所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质为含有以下述通式(I)所表示的结构域序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质；
化学式1
[(A)n基序-REP]m (I)
其中，其所述结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比较具有甘氨酸残基含量降低的氨基酸序列，即至少在REP中的一个或多个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代，在通式(I)中，
(A)n基序表示为由2～20个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为40％以上，
REP表示为由2～200个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，
m为2～300的整数，
多数存在的(A)n基序互相可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，多数存在的REP互相可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列。
11.一种复合成型组合物，其特征在于，
其中，在如权利要求10所述的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,与天然来源的丝心蛋白相比,所述结构域序列在选自REP中的GGX和GPGXX(X表示甘氨酸以外的氨基酸残基)的至少一个基序序列中，具有相当于至少一个或多数的当该基序序列中的一个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代的氨基酸序列，且相对于全部基序序列，所述甘氨酸残基被其他的氨基酸残基所取代的基序序列的比例为10％以上。
12.一种复合成型组合物，其特征在于，
其中，在权利要求10或11所记载的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,从N末端侧朝向C末端侧,依次比较相邻的2个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数目，将在氨基酸残基数目少的REP的氨基酸残基数作为1时，另一方的REP的氨基酸残基数的比为2～3.5的所述相邻的2个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加所得到的总值作为x，在所述结构域序列的总氨基酸残基数为y时，其x/y(％)的最大值为20％以上。
13.如权利要求10～12中任一项所述的复合成型组合物，其特征在于，其中，以所述通式(I)表示的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质为具有以序列号1～19表示的氨基酸序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
14.一种复合成型组合物，其特征在于，
其中，所述丝心蛋白来源的蛋白质为相对如权利要求8～13中任一项所述的丝心蛋白来源的蛋白质的氨基酸序列具有80％以上的一致性的丝心蛋白来源的蛋白质。
15.如权利要求2～14中任一项所述的复合成型组合物,其特征在于,
其中，所述具有β片层结构的聚氨基酸为聚丙氨酸。
16.如权利要求15所述的复合成型组合物,其特征在于,
所述聚丙氨酸选自线型聚丙氨酸或远螯型聚丙氨酸。
17.一种制备方法，其特征在于，
其为选自在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合纤维、复合膜以及复合凝胶的复合成型组合物的制备方法，所述制备方法含有，(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)通过对所述纺丝液进行纺丝或拉伸而制备所述复合成型组合物的步骤。
18.一种制备方法，其特征在于，
其为在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合模具成型物的制备方法，所述制备方法含有：
(i)通过混合粉状的丝心蛋白来源的蛋白质和粉状的具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而制备混合物的步骤；
(ii)对所述混合物负载压力且进行加热的步骤。
19.一种制备方法，其特征在于，
其为预拉伸复合成型组合物的制备方法，所述制备方法含有：
(i)在溶剂中拉伸以权利要求17或18所记载的制备方法而制备的复合成型组合物的步骤；和
(ii)使已被拉伸的复合成型组合物干燥的步骤。
20.如权利要求17～19中任一项所述的制备方法，其特征在于，
其中，所述丝心蛋白来源的蛋白质选自
(i)天然丝心蛋白来源的蛋白质和/或、
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
21.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，
其中，所述天然的丝心蛋白来源的蛋白质为选自由蚕丝丝心蛋白来源的蚕丝蛋白质(蚕丝丝心蛋白的蛋白质)、蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质(蛛丝丝心蛋白的蛋白质)以及蜂丝丝心蛋白来源的蜂丝蛋白质构成的组中的至少一种。
22.如权利要求17～21中任一项所述的制备方法,其特征在于,
其中，所述具有β片层结构的聚氨基酸为聚丙氨酸。
23.如权利要求22所述的制备方法,其特征在于,
其中，所述聚丙氨酸选自线型聚丙氨酸或远螯型聚丙氨酸。
24.一种提高复合成型组合物的物理特性的方法,其特征在于,
在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸。
25.一种提高复合成型组合物的物理特性的方法,其特征在于,
其中，在如权利要求24中所述的方法中，进一步在溶剂中拉伸所述复合成型组合物,然后对其进行干燥。
26.如权利要求24或25所述的方法,其特征在于,
其中，所述物理特性的提高是指拉伸强度的增加、应变的增加和/或韧性的增加。
含有丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及含有丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物及其制备方法。
背景技术
[0002] 由丝心蛋白构成的天然的蛛丝，其为对抗拉强度(tensile strength)、韧性(toughness)以及延伸性(extensibility)等的物理性变化的特性优异，例如，其韧性与同一重量的铁相比具有约5倍的多肽纤维。另外，由于耐热性也优异，且以多肽所形成，因此具有高生物相容性(biocompatibility)和生物降解性(biodegradability)。但是，其与工业上利用的天然丝的蚕不同，由于蜘蛛难以大量饲养，因此，人们尝试着制备模仿蛛丝的人工合成纤维，且尝试着对具有所述物理性变化的特性，同时具有生物相容性和生物降解性的丝、敷布等的原料和材料的应用(专利文献1～专利文献5)。但是，有关上述特性与天然的蛛丝相相匹敌的人工纤维的制备尚未成功。
[0003] 天然的蛛丝其具有优异特性的机制被认为，通过将在其结构中形成β片层结构的聚丙氨酸和富含甘氨酸的极限区域重复进而成为核心部分，被高度保持的非重复型的氨基末端和羧基末端区域被配置在其核心部分的两侧，进而具有随机卷曲状结构、β片层结构及螺旋结构，且这些结构混合存在。并且，人们探讨着其结构的特性(非专利文献1～非专利文献3)。另外，在蜘蛛体内进行纺丝时与通常的蛋白质的情况不同，其蛋白质虽然在以高浓度储藏时显示出高可容性，但根据需要可变化为非常坚韧的纤维(非专利文献2)。但是，其结构的特性和蛛丝的产生机制尚未完全清楚。
[0005] 专利文献1国际公开公报WO2007/078239专利文献2国际公开公报WO2010/123450
专利文献3国际公开公报WO2011/112046
专利文献4国际公开公报WO2012/165476
专利文献5国际公开公报WO2013/065650
专利文献6国际公开公报WO2017/030197
非专利文献
专利文献3国际公开公报WO2011/112046
专利文献4国际公开公报WO2012/165476
专利文献5国际公开公报WO2013/065650
专利文献6国际公开公报WO2017/030197
非专利文献
[0006] 非专利文献1 Numata K们、Soft Matter 2015年6月30日、11、6335-6342非专利文献2 Hagn F们、Nature.2010；465(7295):239-242非专利文献3 Teule F们、Nature Protocols 2009；4:341-355
发明内容
发明要解决的问题
[0007] 本发明的目的在于，基于在蜘蛛体内产生天然的蜘蛛牵引丝的机制和由此带来优异特性的主要因素，且通过将该机制应用在人工纤维的制备，进而能够能提供含有具有高强度和高韧性等的特性的丝心蛋白样蛋白质的复合成型组合物，制备该组合物的方法以及以该制备方法所制备的复合纤维、复合膜以及复合树脂等的复合成型组合物，同时提供提高该复合成型组合物的物理特性的方法。用于解决问题的方案
[0008] 本发明人们将通过在天然丝心蛋白质或以人工所制备的丝心蛋白样蛋白质中配合具有β片层结构的多肽或聚氨基酸进行成型而制备的复合成型组合物，与不配合具有β片层结构的多肽或聚氨基酸的成型组合物相比较，发现了前者具有优异的抗拉强度、应变以及韧性等的物理特性，进而完成了本发明。
[0009] 具体说来，本发明提供一种含有丝心蛋白来源蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的组合物。
[0010] 另外，所述组合物为复合成型组合物,其通过在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而成型。
[0011] 所述复合成型组合物也可为持有所述多肽和/或聚氨基酸来源的β片层结构的复合成型组合物。
[0012] 所述复合成型组合物也可为选自复合纤维、复合膜、复合凝胶或复合模具成型物的复合成型组合物。
[0013] 另外，本发明提供一种复合成型组合物，其为在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合成型组合物，所述复合成型组合物选自复合纤维、复合膜、复合凝胶，
且以含有以下：
(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)由所述纺丝液成型复合成型组合物的步骤的制备方法进行制备。
且以含有以下：
(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)由所述纺丝液成型复合成型组合物的步骤的制备方法进行制备。
[0014] 本发明提供一种预拉伸复合成型组合物，其为复合成型组合物，且所述复合成型组合物选自复合纤维或复合膜，并以含有除所述步骤(i)、步骤(ii)以外，还含有步骤(iii)的在溶剂中拉伸在所述步骤(ii)所得到的复合成型组合物且对其进行干燥的步骤的制备方法进行制备。
[0015] 本发明提供一种为复合模具成型物的复合成型组合物，其为复合成型组合物，且所述复合成型组合物为模具成型物，且以含有(i)通过混合丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而制备混合物的步骤；
(ii)对所述混合物负载压力且对其进行加热的步骤的制备方法进行制备。
(ii)对所述混合物负载压力且对其进行加热的步骤的制备方法进行制备。
[0016] 在本发明的复合成型组合物中，所述丝心蛋白来源的蛋白质也可选自(i)天然的丝心蛋白来源的蛋白质和/或
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0017] 在本发明的复合成型组合物中，所述天然的丝心蛋白来源的蛋白质也可为选自蚕丝心蛋白来源的丝蛋白质(丝丝心蛋白的蛋白质)、蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质(蛛丝丝心蛋白的蛋白质质)以及蜂丝丝心蛋白来源的蜂丝蛋白质构成的组中的至少一种。
[0018] 在本发明的复合成型组合物，所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质也可为含有以下述通式(I)所表示的结构域序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质；其中，改造的丝心蛋白的蛋白质，其所述结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比较，具有至少在REP中的一个或多个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代，且具有甘氨酸残基含量降低的氨基酸序列，
在通式I中，
(A)n基序表示为由2～20个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且，
相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为40％以上，
REP表示为由2～200个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，
m为2～300的整数，
多数存在的(A)n基序相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，多数存在的REP相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，
化学式1
[(A)n基序-REP]m (I)。
在通式I中，
(A)n基序表示为由2～20个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且，
相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为40％以上，
REP表示为由2～200个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，
m为2～300的整数，
多数存在的(A)n基序相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，多数存在的REP相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，
化学式1
[(A)n基序-REP]m (I)。
[0019] 在本发明的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,与天然来源的丝心蛋白相比,所述结构域序列也可在选自REP中的GGX和GPGXX(其中，X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)的至少一个基序序列中，具有相当于至少一个或多数的当该基序序列中的一个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代的氨基酸序列，且相对于全部基序序列，所述甘氨酸残基被其他的氨基酸残基所取代的氨基酸序列的比例为10％以上，优选为20％以上，更优选为30％以上，进一步优选为40％以上。
[0020] 在本发明的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,也可在从N末端侧朝向C末端侧,依次比较相邻的2个[(A)n基序-REP])单元的REP的氨基酸残基数目，将氨基酸残基数目少的REP的氨基酸残基数作为1时，将另一侧的REP的氨基酸残基数的比为2～3.5的所述相邻的2个[(A)n基序-REP])单元的氨基酸残基数相加所得到的总值作为x，在所述结构域序列的总氨基酸残基数为y时，其x/y(％)的最大值为20％以上。
[0021] 本发明的复合成型组合物，其以所述通式(I)表示的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质也可为具有以序列号1～19表示的氨基酸序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0022] 在本发明的复合成型组合物中，其所述丝心蛋白来源的蛋白质也可为相对所述丝心蛋白来源的蛋白质的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的一致性的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0023] 在本发明的复合成型组合物中,其具有所述β片层结构的聚氨基酸也可为聚丙氨酸。
[0024] 在本发明的复合成型组合物中,其所述聚丙氨酸也可选自线型聚丙氨酸(L-polyAla)或远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)。
[0025] 另外，本发明提供一种制备方法，其为选自在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合纤维、复合膜、复合凝胶的复合成型组合物的制备方法，且为含有，制备(i)已溶解丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)通过纺丝或拉伸所述纺丝液而制备所述成型复合成型组合物的步骤的制备方法。
(ii)通过纺丝或拉伸所述纺丝液而制备所述成型复合成型组合物的步骤的制备方法。
[0026] 进一步，本发明提供一种制备方法，其为在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合模具成型物的制备方法，且所述制备方法中含有：
(i)通过混合粉状的丝心蛋白来源的蛋白质和粉状的具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而制备混合物的步骤；
(ii)对所述混合物负载压力且进行加热的步骤。
(i)通过混合粉状的丝心蛋白来源的蛋白质和粉状的具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸而制备混合物的步骤；
(ii)对所述混合物负载压力且进行加热的步骤。
[0027] 进一步，本发明提供一种制备方法，其为预拉伸复合成型组合物的制备方法，且所述制备方法中含有：(i)以在溶剂中拉伸以所述的制备方法而制备的复合成型组合物的步骤；和
(ii)干燥被拉伸的复合成型组合物的步骤。
(ii)干燥被拉伸的复合成型组合物的步骤。
[0028] 在本发明的制备方法中，所述丝心蛋白来源的蛋白质也可选自(i)天然丝心蛋白来源的蛋白质和/或、
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
(ii)被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0029] 在本发明的制备方法中，所述天然的丝心蛋白来源的蛋白质也可为选自由蚕丝心蛋白来源的丝蛋白质(丝丝心蛋白的蛋白质)、蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质(蛛丝丝心蛋白的蛋白质)以及蜂丝丝心蛋白来源的蜂丝蛋白质所构成的组中的至少一种。
[0030] 在本发明的制备方法中，所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质也可为含有以下述通式(I)所表示的结构域序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质；其中，被改造的丝心蛋白的蛋白质，其所述结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比较，具有至少在REP中的一个或多个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代，且具有甘氨酸残基含量降低的氨基酸序列，
在通式I中，
(A)n基序表示为由2～20个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且，
相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为40％以上，
REP表示为由2～200个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，
m为2～300的整数，
多数存在的(A)n基序相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，多数存在的REP相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，
化学式2
[(A)n基序-REP]m (I)。
在通式I中，
(A)n基序表示为由2～20个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，且，
相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为40％以上，
REP表示为由2～200个氨基酸残基所构成的氨基酸序列，
m为2～300的整数，
多数存在的(A)n基序相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，多数存在的REP相互地可为相同的氨基酸序列，也可为不同的氨基酸序列，
化学式2
[(A)n基序-REP]m (I)。
[0031] 在本发明的制备方法的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,与天然来源的丝心蛋白相比,所述结构域序列也可在选自REP中的GGX和GPGXX(其中，X表示甘氨酸以外的氨基酸残基。)的至少一个基序序列中，具有相当于至少一个或多数的当该基序序列中的一个甘氨酸残基被其他的氨基酸残基取代的氨基酸序列，且相对于全部基序序列，所述甘氨酸残基被其他的氨基酸残基所取代的氨基酸序列的比例为10％以上，优选为20％以上，更优选为30％以上，进一步优选为40％以上。
[0032] 在本发明的制备方法的所述被改造的丝心蛋白来源的蛋白质中,也可在从N末端侧朝向C末端侧,依次比较相邻的2个[(A)n基序-REP])单元的REP的氨基酸残基数目，将氨基酸残基数目少的REP的氨基酸残基数作为1时，将另一侧的REP的氨基酸残基数的比为2～3.5的所述相邻的2个[(A)n基序-REP])单元的氨基酸残基数相加所得到的总值作为x，在所述结构域序列的总氨基酸残基数为y时，其x/y(％)的最大值为20％以上。
[0033] 在本发明的制备方法中,其以所述通式(I)表示的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质也可为具有以序列号1～19表示的氨基酸序列的被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0034] 所述丝心蛋白来源的蛋白质也可为相对以序列号1～19表示的丝心蛋白来源的蛋白的蛋白质的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的一致性的丝心蛋白来源的蛋白质。
[0035] 在本发明的制备方法中,具有所述β片层结构的聚氨基酸也可为聚丙氨酸。
[0036] 在本发明的制备方法中,所述聚丙氨酸也可选自线型聚丙氨酸或远螯型聚丙氨酸。
[0037] 本发明提供一种提高复合成型组合物的物理特性的方法,其方法中，在丝心蛋白来源的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸。
[0038] 本发明提供一种提高复合成型组合物的物理特性的方法,在其方法中，进一步在溶剂中拉伸所述复合成型组合物,然后对其进行干燥。
[0039] 在提高所述复合成型组合物的物理特性的方法中，所述物理特性的提高也可是指拉伸强度的增加、应变的增加和/或韧性的增加。发明的效果
[0041] 图1为表示改造丝心蛋白的结构域排列的模式图。图2为表示天然来源的丝心蛋白的x/y(％)值的分布的图。
图3为表示天然来源的丝心蛋白的z/w(％)值的分布的图。
图4为表示由用于纺丝为本发明的复合成型组合物的复合纤维的纺丝液进行纺丝的纺丝方法的概略图。
图5为表示对已以100％的预拉伸率预拉伸将L-polyAla或T-polyAla以各种比例配合在天然蚕·丝心蛋白的蛋白质中而制备的复合膜而制备的预拉伸复合膜进行测定抗拉强度、应变以及韧性的变化的结果的图。
图6为表示对在甲醇中已以各种拉伸率拉伸将T-polyAla以5wt％的比例配合在为改良蛛丝丝心蛋白的蛋白质的ADF3 Kai-noNR中而制备的预拉伸复合膜进行测定抗拉强度、应变以及韧性的变化的结果的图。
图7为表示对将L-polyAla或T-polyAla以各种比例配合在为改良蛛丝丝心蛋白的蛋白质的ADF3 Kai-noNR中，且以100％的预拉伸率预拉伸而制备的复合膜进行测定广角X射线散射(WAXD)的结果的图。
图3为表示天然来源的丝心蛋白的z/w(％)值的分布的图。
图4为表示由用于纺丝为本发明的复合成型组合物的复合纤维的纺丝液进行纺丝的纺丝方法的概略图。
图5为表示对已以100％的预拉伸率预拉伸将L-polyAla或T-polyAla以各种比例配合在天然蚕·丝心蛋白的蛋白质中而制备的复合膜而制备的预拉伸复合膜进行测定抗拉强度、应变以及韧性的变化的结果的图。
图6为表示对在甲醇中已以各种拉伸率拉伸将T-polyAla以5wt％的比例配合在为改良蛛丝丝心蛋白的蛋白质的ADF3 Kai-noNR中而制备的预拉伸复合膜进行测定抗拉强度、应变以及韧性的变化的结果的图。
图7为表示对将L-polyAla或T-polyAla以各种比例配合在为改良蛛丝丝心蛋白的蛋白质的ADF3 Kai-noNR中，且以100％的预拉伸率预拉伸而制备的复合膜进行测定广角X射线散射(WAXD)的结果的图。
具体实施方式
[0042] 1.复合成型组合物1-1未拉伸复合成型组合物
本发明的实施方式之一为含有丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的组合物。尤其所述组合物为复合成型组合物，且为将具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸配合在丝心蛋白来源的蛋白质进而所形成的组合物的未拉伸复合成型组合物。
本发明的实施方式之一为含有丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的组合物。尤其所述组合物为复合成型组合物，且为将具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸配合在丝心蛋白来源的蛋白质进而所形成的组合物的未拉伸复合成型组合物。
[0043] 能够使用本未拉伸复合成型组合物进行制备在其后所述的预拉伸复合成型组合物。
[0044] 作为所述复合成型组合物之例，可列举被保持所述多肽和/或聚氨基酸来源的β片层结构，且所述复合成型组合物选自复合纤维、复合膜、复合凝胶或复合模具成型物的复合成型组合物。
[0045] (1)丝心蛋白来源的蛋白质丝心蛋白已知为构成昆虫和蜘蛛类等的丝，且作为占其70％纤维状的蛋白质的总称。
在本说明书中所说的“丝心蛋白”包括昆虫和蜘蛛类的天然的丝以及模仿或定向这些天然的丝的构成和特性的人工性所制备的人工性的丝。在本说明书中所说的“丝心蛋白”虽然也将下述蛛丝蛋白I和蛛丝蛋白II等的蛛丝蛋白质也包括在内，但不仅这些蛛丝来源的丝心蛋白，其蚕的蚕丝来源的丝心蛋白等也包括在内。除天然的丝心蛋白外，丝心蛋白也可以通过基因重组法，例如，制备编码所希望的氨基酸序列的核酸序列，并将其嵌入在表达载体中，通过公知的方法制作重组表达载体，并将其导入在细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物、昆虫细胞等适当的宿主中,进而制作转化子,将它们离析纯化而利用(国际公开公报WO2012/
165476等)。另外，一部分的丝心蛋白可为利用在商业上，例如能够将其入手加以使用。
在本说明书中所说的“丝心蛋白”包括昆虫和蜘蛛类的天然的丝以及模仿或定向这些天然的丝的构成和特性的人工性所制备的人工性的丝。在本说明书中所说的“丝心蛋白”虽然也将下述蛛丝蛋白I和蛛丝蛋白II等的蛛丝蛋白质也包括在内，但不仅这些蛛丝来源的丝心蛋白，其蚕的蚕丝来源的丝心蛋白等也包括在内。除天然的丝心蛋白外，丝心蛋白也可以通过基因重组法，例如，制备编码所希望的氨基酸序列的核酸序列，并将其嵌入在表达载体中，通过公知的方法制作重组表达载体，并将其导入在细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物、昆虫细胞等适当的宿主中,进而制作转化子,将它们离析纯化而利用(国际公开公报WO2012/
165476等)。另外，一部分的丝心蛋白可为利用在商业上，例如能够将其入手加以使用。
[0046] 涉及本发明的丝心蛋白来源的蛋白质，并无特别的限定，可为天然的丝心蛋白，或也可为通过基因重组技术以微生物等进行制备的，或通过合成所制备的所谓天然丝心蛋白来源的蛋白质。
[0047] 另外，这样的丝心蛋白来源的蛋白质，可为选自由例如蚕丝心蛋白来源的丝蛋白质(丝丝心蛋白的蛋白质)、蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质(蛛丝丝心蛋白的蛋白质)以及蜂丝丝心蛋白来源的蜂丝蛋白质构成的组中的一种以上。其中，优选使用蛛丝丝心蛋白来源的蛛丝蛋白质。
[0048] 在本说明书中所说的“来源丝心蛋白的蛋白质”是指包括构成来源所述昆虫和蜘蛛类的天然的丝心蛋白的蛋白质和这些天然的蛋白质以外的，例如通过基因重组法人工性所制备的人工性的丝心蛋白和结构和特性类似的蛋白质。
[0049] 所说的丝心蛋白的结构类似之事是指包括天然的丝心蛋白的氨基酸序列、且其氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的同一性的蛋白质、以及具有这些蛋白质的部分序列的蛋白质片段、以及这些蛋白质或蛋白质片段与其他蛋白质或肽的融合蛋白质等。另外，在本说明书中，有时也基于其结构性特性将“丝心蛋白来源的蛋白质”记载为“丝心蛋白来源的多肽”。
[0050] 另外，所说的与丝心蛋白的特性类似的蛋白质是指，选自具有天然的丝心蛋白的抗拉强度、韧性以及伸缩性的至少一种的特性与天然的丝心蛋白相比较，具有至少为80％以上、优选为85％以上、更优选为95％以上、进一步优选为100％以上的优异的特性的蛋白质。另外，在本说明书中，在记载有关这样的丝心蛋白的结构和物理特性等情况下，有时也将其记载为“丝心蛋白样多肽”或“丝心蛋白样蛋白质”。
[0051] 作为丝心蛋白，也可以使用如下的改造丝心蛋白。改造丝心蛋白为包括以通式(I):[(A)n基序-REP]m表示的结构域序列的蛋白质。改造丝心蛋白还可以在结构域序列的N末端侧和C末端侧的任一侧或两侧上进一步添加氨基酸序列(N末端序列和C末端序列)。N末端序列和C末端序列并不限定于此，但典型的例子为于丝心蛋白不具有特征性的氨基酸基序的重复的区域，且由100个左右的残基的氨基酸构成。有关含有以该通式(I):[(A)n基序-REP]m表示的结构域序列的蛋白质被详细地记载在PCT/JP2017/016917和PCT/JP2017/016925中，且通过引用被纳入本说明书。
[0052] 在本说明书中的“改造丝心蛋白”是指人为制备的丝心蛋白(人造丝心蛋白)。改造丝心蛋白可为其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列不同的丝心蛋白。也可为其结构域序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列相同的丝心蛋白。在本说明书中所述的“天然来源的丝心蛋白”也可为包括以通式(I)：[(A)n基序-REP]m表示的结构域序列的蛋白质。
[0053] 改造丝心蛋白只要是具有在本发明所特定的氨基酸序列的蛋白即可。可为直接利用天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列者，也可为根据来源天然的丝心蛋白的氨基酸序列进而改造其氨基酸序列者(例如，通过改造已克隆的天然来源的丝心蛋白的基因序列进而改造氨基酸序列者)，并且还可为不依赖天然来源的丝心蛋白而人工设计和人工合成者(例如通过化学合成编码已设计的氨基酸序列的核酸而具有所希望的氨基酸序列者)。
[0054] 在本说明书中所说的“结构域序列”是指在丝心蛋白特有的晶体区域(典型地相当于氨基酸序列的(A)n基序。)和产生无定形区域(通常对应于氨基酸序列的REP)。)的氨基酸序列，且以通式(I)：[(A)n基序-REP]m表示的氨基酸序列。在此,(A)n基序表示以丙氨酸残基为主的氨基酸序列,n可为2～20,优选为4～20,更优选为8～20,进一步优选为10～20,更进一步优选为4～16,再更一步优选为8～16,特别优选为10～16的整数。另外，相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基数的丙氨酸残基数的比例为40％以上即可，优选为60％以上，更优选为70％以上，进一步优选为80％以上，更进一步优选为90％以上，也可为100％(是指仅由丙氨酸残基构成)。REP表示为由2～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示为2～300的整数。多个存在的(A)n基序可以为彼此相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。多个存在的REP可以为彼此相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。作为大吐丝管拖丝来源的蛋白质的具体例，可例举为以含有天然排列的部分序列的序列号1～3、改造了天然序列的序列号4～19所示的氨基酸序列等的蛋白质。
[0055] 以序列号6所示的氨基酸序列(Met-PRT313)，在为天然来源的丝心蛋白的Nephila clavipes(GenBank登录号:P46804.1,GI:1174415)的氨基酸序列中，以具有连续丙氨酸残基的区域“(A)n基序”中的连续丙氨酸残基的数目以缺失5个序列的方式等对具有氨基酸残基进行改造的序列。以序列号12所示的氨基酸序列(PRT313)为将以序列号21所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以序列号6所示的氨基酸序列(Met-PRT313)的N末端的氨基酸序列。
[0056] 以序列号7表示的氨基酸序列(Met-PRT399),为从以序列号6表示的氨基酸序列,将1个(A)n基序-REP插入在每隔2个从N末端侧向C末端侧缺失(A)n基序((A)5),而且在C末端排列之前的氨基酸序列。且以序列号13表示的氨基酸序列(PRT399)为将以序列号21表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以该序列号7所示的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列。
[0057] 以序列号8所示的氨基酸序列(Met-PRT380)为将序列号6所示的氨基酸序列的REP中的所有GGX取代为GQX的氨基酸序列。且以序列号14表示的氨基酸序列(PRT380)为将以序列号21表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以该序列号8所示的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列。
[0058] 以序列号9所示的氨基酸序列(Met-PRT410)为将序列号7所示的氨基酸序列的REP中的所有GGX取代为GQX的氨基酸序列。且以序列号15表示的氨基酸序列(PRT410)为将以序列号21表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以该序列号9所示的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列。
[0059] 以序列号10所示的氨基酸序列(Met-PRT468)为相对于以序列号9所示的氨基酸序列，以将两个残基A嵌入序列号6中的聚A区域，且与以序列号9所示的氨基酸序列的分子量大致相同的方式两次削除C末端侧的重复序列，进而在从Q至S或者至P已13处进行取代的氨基酸序列。且以序列号16表示的氨基酸序列(PRT468)为将以序列号21表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以该序列号10所示的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列。
[0060] 以序列号11所示的氨基酸序列(Met-PRT799),为将四次重复以序列号9所示的氨基酸序列中存在的20个的结构域序列的区域的序列的C末端侧的数个氨基酸序列添加以序列号21表示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)的氨基酸序列；以序列号17表示的氨基酸序列(PRT799)为将以序列号21所示的氨基酸序列(标签序列和铰链序列)添加在以该序列号11所示的氨基酸序列的N末端的氨基酸序列。
[0061] 总结以上的氨基酸序列为如下所示。序列号1 Araneus diadematus的氨基酸序列
序列号2 Araneus diadematus的氨基酸序列
序列号3 Araneus diadematus的氨基酸序列
序列号4 recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1的氨基酸序列序列号5从序列号4中删除了His标签的氨基酸序列的氨基酸序列
序列号6 Met-PRT313:Met-CRY1_L_A5的氨基酸序列
序列号7 Met-PRT399:Met-CRY1_L_A5_giza的氨基酸序列
序列号8 Met-PRT380:Met-CRY1_L_A5_QQQ的氨基酸序列
序列号9 Met-PRT410:Met-CRY1_L_A5_giza_QQQ的氨基酸序列
序列号10 Met-PRT468:Met-CRY1_L_A7_giza_QQQ的氨基酸序列
序列号11 Met-PRT799:Met-CRY1_200_A5_giza_QQQ_WHis6的氨基酸序列
序列号12 PRT313的氨基酸序列
序列号13 PRT399的氨基酸序列
序列号14 PRT380的氨基酸序列
序列号15 PRT410的氨基酸序列
序列号16 PRT468的氨基酸序列
序列号17 PRT799的氨基酸序列
序列号18 ADF3 Kai_noNR的氨基酸序列
序列号19从序列号18的氨基酸序列中除去了His标签的氨基酸序列
序列号20 His标签和起始密码子的氨基酸序列
序列号21 His标签的氨基酸序列
序列号2 Araneus diadematus的氨基酸序列
序列号3 Araneus diadematus的氨基酸序列
序列号4 recombinant spider silk protein ADF3 KaiLargeNRSH1的氨基酸序列序列号5从序列号4中删除了His标签的氨基酸序列的氨基酸序列
序列号6 Met-PRT313:Met-CRY1_L_A5的氨基酸序列
序列号7 Met-PRT399:Met-CRY1_L_A5_giza的氨基酸序列
序列号8 Met-PRT380:Met-CRY1_L_A5_QQQ的氨基酸序列
序列号9 Met-PRT410:Met-CRY1_L_A5_giza_QQQ的氨基酸序列
序列号10 Met-PRT468:Met-CRY1_L_A7_giza_QQQ的氨基酸序列
序列号11 Met-PRT799:Met-CRY1_200_A5_giza_QQQ_WHis6的氨基酸序列
序列号12 PRT313的氨基酸序列
序列号13 PRT399的氨基酸序列
序列号14 PRT380的氨基酸序列
序列号15 PRT410的氨基酸序列
序列号16 PRT468的氨基酸序列
序列号17 PRT799的氨基酸序列
序列号18 ADF3 Kai_noNR的氨基酸序列
序列号19从序列号18的氨基酸序列中除去了His标签的氨基酸序列
序列号20 His标签和起始密码子的氨基酸序列
序列号21 His标签的氨基酸序列
[0062] 改造丝心蛋白相对例如，已克隆的天然来源丝心蛋白的基因序列，可通过对相当于取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列进行改造而获得。氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加可通过部分特异性诱发突变法等的本领域技术人员已知的方法进行实施。具体说来，可按照Nucleic Acid Res.10，6487(1982)、Methods in Enzymology，100，448(1983)等文献中所记载的方法进行实施。
[0063] 天然来源的丝心蛋白为包含以式(I)：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质，具体而言，可以列举例如昆虫或蜘蛛类产生的丝心蛋白。
[0064] 作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(Bombyx mori)、野桑蚕(Bombyx mandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、枫蚕(Eriogyna pyretorum)、蓖麻蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、樟蚕(Caligura japonica)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)、琥珀蚕(Antheraea assama)等蚕产生的蚕丝蛋白质、雀蜂(Vespa simillima xanthoptera)的幼虫喷出的蜂丝蛋白质。
[0065] 作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如蚕·丝心蛋白L链(GenBank登录号M76430(碱基序列)、AAA27840.1(氨基酸序列))。
[0066] 作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，可以列举例如大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和野岛园蛛(Araneus nojimai)等属于园蛛属(Araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(Neoscona属)的蜘蛛、小岬蛛等属于岬蛛属(Pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(Cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(Gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(Ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(Argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(Arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(Acusilas属)的蜘蛛、红云斑蛛、花云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(Cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(Poltys属)的蜘蛛、八瘤艾蛛、四突艾蛛、圆腹艾蛛和黑尾艾蛛等属于艾蛛属(Cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(Chorizopes属)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸和鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(Tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(Leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(Nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(Menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(Dyschiriognatha属)的蜘蛛、红斑寇蛛、哈氏寇蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于冠蛛属(Latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(Euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白质(蛛丝蛋白质)。作为蛛丝蛋白质，可以列举例如MaSp(MaSp1和MaSp2)、ADF(ADF3和ADF4)等牵引丝蛋白质、MiSp(MiSp1和MiSp2)等。
[0067] 作为蜘蛛类产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如丝心蛋白-3(adf-3)[来源十字园蛛(Araneus diadematus)](GenBank登录号AAC47010(氨基酸序列)、U47855(碱基序列))、丝心蛋白-4(adf-4)[来源十字园蛛](GenBank登录号AAC47011(氨基酸序列)、U47856(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白1[来源金纺蜘蛛(Nephila clavipes)](GenBank登录号AAC04504(氨基酸序列)、U37520(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[黑寡妇蜘蛛(来源Latrodectus hesperus)](GenBank登录号ABR68856(氨基酸序列)、EF595246(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白2[棒络新妇(来源Nephila clavata)](GenBank登录号AAL32472(氨基酸序列)、AF441245(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[非洲育儿网蛛(Euprosthenops australis)来源](GenBank登录号CAJ00428(氨基酸序列)、AJ973155(碱基序列))和大壶状腺蛛丝蛋白2[非洲育儿网蛛](GenBank登录号CAM32249.1(氨基酸序列)、AM490169(碱基序列))、小壶状腺丝蛋白1[金纺蜘蛛](GenBank登录号AAC14589.1(氨基酸序列))、小壶状腺丝蛋白2[金纺蜘蛛](GenBank登录号AAC14591.1(氨基酸序列))、小壶状腺蛛丝蛋白样蛋白质[Nephilengys cruentata](GenBank登录号ABR37278.1(氨基酸序列)等。
[0068] 作为天然来源的丝心蛋白的更具体的示例，可以进一步列举在NCBI GenBank中登记了序列信息的丝心蛋白。例如，可以通过从NCBI GenBank中登记的序列信息中包含INV作为分类码(DIVISION)的序列中提取出在定义(DEFINITION)中记载了蛛丝蛋白、壶状腺、丝心蛋白、“丝和多肽”或“丝和蛋白质”作为关键词的序列、从CDS中提取出指定产物的字符串、从来源数据(SOURCE)中提取出在组织类型(TISSUE TYPE)中记载了指定字符串的序列来确认。
[0069] 改造丝心蛋白可以为改造蚕丝心蛋白(为改造蚕产生的蚕蛋白质的氨基酸序列者)。也可为改造蛛丝丝心蛋白(为改造由蜘蛛类产生的蛛丝蛋白质的氨基酸序列者)。在这些蚕丝心蛋白中,优选为使用改造蛛丝丝心蛋白。
[0070] 作为改造丝心蛋白的具体例，可列举为来源于由蜘蛛的大瓶状线产生的大吐丝管拖丝蛋白质的改造丝心蛋白[涉及第1实施方式的改造丝心蛋白]、被降低了甘氨酸残基含量的改造丝心蛋白[涉及第2实施方式的改造丝心蛋白]、被降低了(A)n基序含量的改造丝心蛋白[涉及第3实施方式的改造丝心蛋白]以及被降低了甘氨酸残基的含量和(A)n基序含量的改造丝心蛋白[涉及第4实施方式的改造丝心蛋白]。
[0071] 作为涉及第1实施方式的改造丝心蛋白，可列举含有式(I)：[(A)n基序-REP]m表示的结构域序列的蛋白质。涉及第1实施方式的改造丝心蛋白，在式(I)中,n优选为3～20的整数,更优选为4～20的整数,进一步优选为8～20的整数,更进一步优选为10～20的整数,再进一步优选为4～16的整数，特别优选为8～16的整数，非常优选为10～16的整数。涉及第1实施方式的改造丝心蛋白，在式(I)中,构成REP的氨基酸残基的数优选为10～200个残基,更优选为10～150个残基,进一步优选为20～100个残基。再更优选为20～75个残基。涉及第1实施方式的改造丝心蛋白，相对于氨基酸残基总数，其在以式(I)：[(A)n基序-REP]m表示的氨基酸序列中所含有的甘氨酸残基、丝氨酸残基以及丙氨酸残基的总残基数，优选为40％以上，更优选为60％以上，进一步优选为70％以上。
[0072] 涉及第1实施方式的改造丝心蛋白，也可为多肽。所述多肽为含有以式(I)：[(A)n基序-REP]m表示的氨基酸序列的单元，且C末端序列被序列号1～3中的任意一个所示的氨基酸序列或序列号1～3中的任意一个所示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上，进一步优选为具有95％以上的一致性的氨基酸序列。
[0073] 序列号1所示的氨基酸序列与由ADF3(GI：1263287、NCBI)的氨基酸序列的C末端的50个残基的氨基酸构成的氨基酸序列一致；序列号2所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的C末端除去了20个残基的氨基酸序列一致；序列号3所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列与从序列号1所示的氨基酸序列的C末端除去了29个残基的氨基酸序列一致。
[0074] 作为涉及第1实施方式的改造丝心蛋白的更为具体的例子，可列举为含有与以(1-i)序列号4或序列号5(从序列号4的氨基酸序列中已除去His标签的氨基酸序列)表示的氨基酸序列或以(1-ii)序列号4表示的氨基酸序列具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。所述序列一致性也可为100％。
[0075] 序列号4所示的氨基酸序列为，在将由起始密码子、His10标签以及HRV3C蛋白酶(Human rhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列(序列号20)添加在N-末端的ADF3的氨基酸序列中，以增加约2倍第1～第13号的重复区域的方式，同时以使第1154号氨基酸残基终止转译的方式进行变异的氨基酸序列。序列号4所示的氨基酸序列的C末端的氨基酸序列与以序列号8所示的氨基酸序列一致。
[0076] (1-i)的改造丝心蛋白也可由序列号4表示的氨基酸序列所构成。
[0077] 涉及第2实施方式的改造丝心蛋白,相对于全部基序序列,其上述的甘氨酸残基被取代为其他的氨基酸残基的基序序列的比例可为10％以上。
[0078] 涉及第2实施方式的改造丝心蛋白为具有在含有以式(I)或通式[(A)n基序-REP]m表示的结构域序列，且由上述结构域序列中将从除位于最C末端侧的(A)n基序直至上述结构域序列的C末端的序列以外的序列中的全部REP中含有的XGX(其中，X表示甘氨酸以外的氨基酸残基)。)构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数作为z；由上述结构域序列中将除从位于最C末端侧的(A)n基序直至上述结构域序列的C末端的序列以外的序列中的总氨基酸残基数作为w时，z/w(％)为30％以上的氨基酸序列的改造丝心蛋白，也可为z/w(％)50.9％以上的氨基酸序列的改造丝心蛋白。也可相对于(A)n基序中的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为83％以上即可，但优选为86％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。进一步更优选为100％(其意味着仅由丙氨酸残基构成)。
[0079] 涉及第2实施方式的改造丝心蛋白，其优选为通过将GGX基序之一的甘氨酸残基置换为其他的氨基酸残基进而提高由XGX构成的氨基酸序列的含有比例。涉及第2实施方式的改造丝心蛋白，其优选为由结构域序列中的GGX构成的氨基酸序列的含有比例30％以下，更优选为20％以下，进一步优选为10％以下，更进一步优选为6％以下，再进一步优选为4％以下，特别优选为2％以下。由结构域序列中的GGX构成的氨基酸序列的含有比例可以利用与由下述XGX构成的氨基酸序列的含有比例(z/w)的计算方法同样的方法算出。
[0080] 进一步详细地说明z/w(％)的计算方法。首先，自从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中所含有的全部REP中提取出由XGX构成的氨基酸序列。构成XGX的氨基酸残基的总数为z。例如，在提取出50个由XGX构成的氨基酸序列的情况下(无重复)，z为50×3＝150。另外，例如在如由XGXGX构成的氨基酸序列的情况这样存在含有于两个XGX中的X(中央的X)的情况下，扣除重复的量来进行计算(XGXGX的情况下为5个氨基酸残基)。w为从结构域序列中除去位于最靠C末端侧的(A)n基序至结构域序列的C末端为止的序列而得到的序列中含有的总氨基酸残基数。例如，在图1所示的结构域序列的情况下，w为4+50+4+100+4+10+4+20+4+30＝230(除去了位于最靠C末端侧的(A)n基序)。接着，将z除以w，由此能够算出z/w(％)。
[0081] 在此，对天然来源的丝心蛋白中的z/w进行说明。首先，如上所述，利用例示出在NCBI GenBank中登记了氨基酸序列信息的丝心蛋白的方法进行确认，结果提取出663种丝心蛋白(其中，蜘蛛类来源的丝心蛋白为415种)。根据所提取的全部丝心蛋白中包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列、且丝心蛋白中的由GGX构成的氨基酸序列的含有比例为6％以下的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列，利用上述计算方法算出z/w。将其结果示于图3。图3的横轴表示z/w(％)，纵轴表示频率。由图3可知，天然来源的丝心蛋白中的z/w(％)均小于50.9％(最高为50.86％)。
[0082] 在涉及第2实施方式的改造丝心蛋白中，z/w(％)优选为50.9％以上，进一步优选为56.1％以上，更进一步优选为58.7％以上，再进一步优选为70％以上，再更进一步优选为80％以上。对z/w(％)的上限没有特别限制，例如也可以为95％以下。
[0083] 涉及第2实施方式的改造丝心蛋白，例如可以通过以下述方式进行改造而得到：从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中对编码甘氨酸残基的碱基序列的至少一部分进行置换，使其编码其他氨基酸残基。此时，可以选择GGX基序和GPGXX基序中的一个甘氨酸残基作为改造的甘氨酸残基，另外也可以进行置换以使z/w(％)为50.9％以上。另外，例如也可以通过根据天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列设计满足上述各实施方式的氨基酸序列，并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。也可以在任何的情况下，相当于将从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列的REP中的甘氨酸残基取代为其他的氨基酸残基的改造的基础上，或进一步进行相当于取代、缺失、插入和/或添加一个或多个的氨基酸残基的氨基酸序列的改造。
[0084] 作为上述其他氨基酸残基，只要是甘氨酸残基以外的氨基酸残基则没有特别限制，优选缬氨酸(V)残基、亮氨酸(L)残基、异亮氨酸(I)残基、甲硫氨酸(M)残基、脯氨酸(P)残基、苯丙氨酸(F)残基和色氨酸(W)残基等疏水性氨基酸残基、谷氨酰胺(Q)残基、天冬酰胺(N)残基、丝氨酸(S)残基、赖氨酸(K)残基和谷氨酸(E)残基等亲水性氨基酸残基，更优选缬氨酸(V)残基、亮氨酸(L)残基、异亮氨酸(I)残基和谷氨酰胺(Q)残基，进一步优选谷氨酰胺(Q)残基。
[0085] 涉及第2实施方式的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举包含以与(2-i)序列号8、序列号9以及序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列、或者以(2-ii)序列号8、序列号9以及序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0086] 对(2-i)的改造丝心蛋白进行说明。以序列号8所表示的氨基酸序列为将以相当于天然来源的丝心蛋白的序列号6所表示的氨基酸序列的REP中的全部GGX置换为GQX而得到的氨基酸序列。以序列号9所表示的氨基酸序列为由以序列号8所表示的氨基酸序列中从N末端侧向C末端侧使(A)n基序每隔两个缺失，进一步，将一个[(A)n基序-REP]插入在C末端序列的近前处的氨基酸序列。以序列号10所表示的氨基酸序列为将两个丙氨酸残基插入在以序列号9所表示的氨基酸序列的各(A)n基序的C末端侧、进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基取代为丝氨酸(S)残基、并使N末端侧的一部分氨基酸缺失以使其与序列号9的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。以序列号11所表示的氨基酸序列为，将His标签添加在四次重复以序列号10所表示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域的序列的C末端的氨基酸序列。
[0087] 在以序列号6所表示的氨基酸序列(相当于天然来源的丝心蛋白)中的z/w(％)的值为46.8％。在以序列号8所表示的氨基酸序列、序列号9所表示的氨基酸序列、序列号10所表示的氨基酸序列以及序列号11所表示的氨基酸序列中的z/w(％)的值分别58.7％、70.1％、66.1％以及70.0％。另外，以序列号6、8、9、10以及11所表示的氨基酸序列中的锯齿(giza)比率(在后面叙述)1：1.8～11.3时的x/y(％)的值分别为15.0％、15.0％、93.4％、
92.7％以及89.3％。
92.7％以及89.3％。
[0088] (2-i)的改造丝心蛋白可以为由以序列号8、序列号9、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列构成的改造丝心蛋白。
[0089] (2-ii)的改造丝心蛋白为包含与序列号8、序列号9、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。并且，(2-ii)的改造丝心蛋白也为包含以式(I)：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
[0090] (2-ii)的改造丝心蛋白在将与序列号8、序列号9、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列相比具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上以及进一步优选为95％以上的序列一致性，且由在REP中所含有的XGX(但是，X表示为甘氨酸以外的氨基酸残基)所构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数作为z，将上述结构域序列中的REP的总氨基酸残基数作为w时，其z/w(％)优选为50.9％以上。
[0091] 上述改造丝心蛋白可以在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。由此，能够进行改造丝心蛋白的分离、固定化、检测和可视化等。
[0092] 作为标签序列，可以列举例如利用与其他分子的特异性的亲和性(结合性、affinity)的亲和性标签。作为亲和性标签的具体例，可以列举组氨酸标签(His标签)。由于His标签是以约4至10个组氨酸残基排列而成的短肽，且具有与镍等的金属离子特异性地结合的性质，因此能够用于通过金属螯合层析(chelating metal chromatography)进行的改造丝心蛋白的分离。作为标签序列的具体例，可以列举例如序列号21所表示的氨基酸序列(包含His标签的氨基酸序列)。
[0093] 另外，也可以利用与谷胱甘肽特异性地结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、与麦芽糖特异性地结合的麦芽糖结合蛋白质(MBP)等的标签序列。
[0094] 进一步，也可以使用已利用抗原抗体反应的“表位标签”。通过添加显示抗原性的肽(表位)作为标签序列，进而能够使针对该表位的抗体进行结合。作为表位标签，可列举HA(流感病毒的血凝素的肽序列)标签、myc标签、FLAG标签等。通过利用表位标签，能够以高特异性容易地对改造丝心蛋白进行纯化。
[0096] 作为包含标签序列的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举包含与(2-iii)序列号14、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列、或者与(2-iv)序列号14、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0097] 序列号12、13、14、15、16以及17所表示的氨基酸序列为将以序列号21所表示的氨基酸序列(包含His标签)分别添加在序列号6、7、8、9、10以及11所表示的氨基酸序列的N末端而得到的氨基酸序列。
[0098] (2-iii)的改造丝心蛋白可为由序列号14、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列构成的改造丝心蛋白。
[0099] (2-iv)的改造丝心蛋白为包含与以序列号14、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。(2-iv)的改造丝心蛋白也为包含以式(I)：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
[0100] (2-iv)的改造丝心蛋白在将包含与以序列号14、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列，且在REP中所含有的XGX(但是，X表示为甘氨酸以外的氨基酸残基)所构成的氨基酸序列的总氨基酸残基数作为z，将上述结构域序列中的REP的总氨基酸残基数作为w时，其z/w(％)优选为50.9％以上。
[0102] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白其结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比具有(A)n基序的含量被减少的氨基酸序列。当该改造丝心蛋白的结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比能够具有相当于至少缺失一个或多个的(A)n基序的氨基酸序列。
[0103] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白为可具有相当于从天然来源的丝心蛋白缺失10～40％(A)n基序的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0104] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白为也可以具有，其结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比相当于从N末端侧向C末端侧至少每隔1～3个的(A)n基序缺失一个(A)n基序的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0105] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白为也可以具有，其结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比相当于至少缺失了从N末端侧向C末端侧的顺序重复使(A)n基序连续缺失两个或缺失一个(A)n基序的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0106] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白也可以具有，相当于其结构域序列从N末端侧向C末端侧每隔两个(A)n基序缺失一个(A)n基序的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0107] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白包为，含有以式(I)：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列，且在从N末端侧向C末端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较，将氨基酸残基数少的REP的氨基酸残基数设为1时，另将一者的REP的氨基酸残基数之比为1.8～11.3的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加之和所得到的合计值的最大值设为x；将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时，具有x/y(％)为20％以上的氨基酸序列、或具有x/y(％)为50％以上的氨基酸序列的改造丝心蛋白。相对于(A)n基序的全部氨基酸残基的丙氨酸残基数为83％以上，优选为86％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，更进一步优选为100％以上(意味着仅由丙氨酸残基构成)。
[0108] 参考图1进一步详细地说明x/y(％)的计算方法。图1中示出从改造丝心蛋白中除去N末端序列和C末端序列而得到的结构域序列。该结构域序列从N末端侧(左侧)起具有(A)n基序-第一REP(50个氨基酸残基)-(A)n基序-第二REP(100个氨基酸残基)-(A)n基序-第三REP(10个氨基酸残基)-(A)n基序-第四REP(20个氨基酸残基)-(A)n基序-第五REP(30个氨基酸残基)-(A)n基序这样的序列。
[0109] 从N末端侧向C末端侧依次选择相邻的两个[(A)n基序-REP]单元，使其不重复。此时，可以存在未被选择的[(A)n基序-REP]单元。图1中示出了方式1(第一REP与第二REP的比较、以及第三REP与第四REP的比较)、方式2(第一REP与第二REP的比较、以及第四REP与第五REP的比较)、方式3(第二REP与第三REP的比较、以及第四REP与第五REP的比较)、方式4(第一REP与第二REP的比较)。需要说明的是，除此之外还存在其他的选择方法。
[0110] 接着，对于各方式，将所选择的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元中的各REP的氨基酸残基数进行比较。比较通过求出将氨基酸残基数更少的一者设为1时的、另一者的氨基酸残基数之比来进行。例如，在第一REP(50个氨基酸残基)与第二REP(100个氨基酸残基)比较的情况下，将氨基酸残基数更少的第一REP设为1时，第二REP的氨基酸残基数之比为100/50＝2。同样地，在第四REP(20个氨基酸残基)与第五REP(30个氨基酸残基)比较的情况下，将氨基酸残基数更少的第四REP设为1时，第五REP的氨基酸残基数之比为30/20＝1.5。
[0111] 图1中，用实线示出了将氨基酸残基数更少的一者设为1时、另一者的氨基酸残基数之比为1.8～11.3的[(A)n基序-REP]单元的组。在本说明书中，将这样的比称为锯齿比率。将氨基酸残基数更少的一者设为1时、另一者的氨基酸残基数之比小于1.8或超过11.3的[(A)n基序-REP]单元的组用虚线表示。
[0112] 在各方式中，将用实线表示的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的全部氨基酸残基数相加(不仅是REP的氨基酸残基数，还有(A)n基序的氨基酸残基数)。并且，对相加得到的合计值进行比较，将该合计值最大的方式的合计值(合计值的最大值)设为x。在图1所示的示例中，方式1的合计值为最大。
[0113] 接着，将x除以结构域序列的总氨基酸残基数y，由此可以算出x/y(％)。
[0114] 在涉及第3实施方式的改造丝心蛋白中，x/y(％)优选为50％以上，更优选为60％以上，进一步优选为65％以上，进一步更优选为70％以上，再进一步更优选为75％以上，特别优选为80％以上。对x/y(％)的上限没有特别限制，例如可以为100％以下。在锯齿比率为1∶1.9～11.3的情况下，x/y(％)优选为89.6％以上；在锯齿比率为1∶1.8～3.4的情况下，x/y(％)优选为77.1％以上；在锯齿比率为1∶1.9～8.4的情况下，x/y(％)优选为75.9％以上；
在锯齿比率为1∶1.9～4.1的情况下，x/y(％)优选为64.2％以上。
在锯齿比率为1∶1.9～4.1的情况下，x/y(％)优选为64.2％以上。
[0115] 在涉及第3实施方式的改造丝心蛋白为结构域序列中多数存在的(A)n基序中的至少7个仅由丙氨酸残基构成的改造丝心蛋白的情况下，x/y(％)优选为46.4％以上，更优选为50％以上，进一步优选为55％以上，进一步更优选为60％以上，再进一步更优选为70％以上，特别优选为80％以上。对x/y(％)的上限没有特别限制，为100％以下即可。
[0116] 在此，对天然来源的丝心蛋白中的x/y(％)进行说明。首先，如上所述，利用例示出在NCBI GenBank中登记了氨基酸序列信息的丝心蛋白的方法进行确认，结果提取出663种丝心蛋白(其中，蜘蛛类来源的丝心蛋白为415种)。根据所提取出的全部丝心蛋白中由式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列构成的天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列，利用上述计算方法算出x/y(％)。将锯齿比率为1∶1.9～4.1的情况的结果示于图2。
[0117] 图2的横轴表示x/y(％)、纵轴表示频率。由图2表明，天然来源的丝心蛋白中的x/y(％)均小于64.2％(最高为64.14％)。
[0118] 涉及第3实施方式的改造丝心蛋白例如可以通过从克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列中使编码(A)n基序的序列中的一个或多个缺失以使x/y(％)为64.2％以上而得到。另外，例如也可以通过设计相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中缺失了一个或多个(A)n基序以使x/y(％)为64.2％以上的氨基酸序列，并化学合成编码所设计的氨基酸序列的核酸而得到。在任意一种情况下，都可以在相当于从天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列中缺失了(A)n基序的改造的基础上，进一步进行相当于置换、缺失、插入和/或添加有一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列的改造。
[0119] 作为涉及第3实施方式的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举包含与(3-i)序列号7、序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列、或者(3-ii)序列号7、序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为
90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0120] 对(3-i)的改造丝心蛋白进行说明。以序列号7所表示的氨基酸序列是从相当于天然来源的丝心蛋白的序列号6所表示的氨基酸序列中从N末端侧向C末端侧使(A)n基序每隔两个发生缺失、进一步在C末端序列的近前处插入一个[(A)n基序-REP]而得到的氨基酸序列。以序列号9所表示的氨基酸序列是将以序列号7所表示的氨基酸序列的REP中的全部GGX置换为GQX而得到的氨基酸序列。序列号10所表示的氨基酸序列是以在序列号9所表示的氨基酸序列的各(A)n基序的C末端侧插入两个丙氨酸残基、进一步将一部分谷氨酰胺(Q)残基置换为丝氨酸(S)残基、并使N末端侧的一部分氨基酸缺失以使其与序列号9的分子量大致相同而得到的氨基酸序列。以序列号11所表示的氨基酸序列是将His标签添加在四次重复以序列号10所表示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域(但是，该区域的C末端的数个氨基酸残基被取代)的序列的C末端而得到的氨基酸序列。
[0121] 在以序列号6所表示的氨基酸序列(相当于天然来源的丝心蛋白)的锯齿比率为1∶1.8～11.3时的x/y(％)的值为15.0％。在以序列号7所表示的氨基酸序列和以序列号9所表示的氨基酸序列中的x/y(％)的值均为93.4％。在以序列号10所表示的氨基酸序列中的x/y(％)的值为92.7％。在以序列号11所表示的氨基酸序列中的x/y(％)的值为89.3％。在以序列号6、7、9、10以及11～12所表示的氨基酸序列中的x/y(％)的值分别为46.8％、56.2％、
70.1％、66.1％以及70.0％。
70.1％、66.1％以及70.0％。
[0122] (3-i)的改造丝心蛋白可以为由序列号7、序列号9、序列号10或序列号11所表示的氨基酸序列构成的改造丝心蛋白。
[0123] (3-ii)的改造丝心蛋白为包含与序列号7、序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。(3-ii)的改造丝心蛋白也是包含以式1：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性为80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上。
[0124] (3-ii)的改造丝心蛋白具有与以序列号7、序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性，并且从N末端侧向C末端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较，将氨基酸残基数少的REP的氨基酸残基数设为1时，另一者的REP的氨基酸残基数之比为1.8～11.3锯齿比率为1∶1.8～11.3)，将这样的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x、将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时，x/y(％)为64.2％以上。
[0125] 上述改造丝心蛋白可以在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。
[0126] 作为包含标签序列的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举与3-(iii)序列号13、序列号15、序列号16以及序列号17所表示的氨基酸序列、或者(3-iv)序列号13、序列号
15、序列号16以及序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为
90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
15、序列号16以及序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为
90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
[0127] 序列号12、13、14、15、16以及17所表示的氨基酸序列是分别以在序列号6、7、8、9、10以及11所表示的氨基酸序列的N末端添加以序列号21所表示的氨基酸序列(包含His标签)而得到的氨基酸序列。
[0128] (3-iii)的改造丝心蛋白可以为由序列号13、序列号15、序列号16以及序列号17所表示的氨基酸序列构成的改造丝心蛋白。
[0129] (3-iv)的改造丝心蛋白为包含与序列号13、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。并且，(3-iv)的改造丝心蛋白也是包含式(I)：[(A)n基序-REP]m所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
[0130] (3-iv)的改造丝心蛋白优在与以序列号13、序列号15、序列号16或序列号17所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性，并且从N末端侧向C末端侧将相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的REP的氨基酸残基数依次进行比较，将氨基酸残基数少的REP的氨基酸残基数设为1时，另一者的REP的氨基酸残基数之比为1.8～11.3，将这样的相邻的两个[(A)n基序-REP]单元的氨基酸残基数相加得到的合计值的最大值设为x、将结构域序列的总氨基酸残基数设为y时，其x/y(％)优选为64.2％以上。
[0131] 上述的改造丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统中生产的蛋白质释放到宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主的种类适当设定。
[0132] 涉及第4实施方式的改造丝心蛋白其结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比具有(A)n基序的含量被减少，且在此基础上，甘氨酸残基也被减少的氨基酸序列。当该改造丝心蛋白的结构域序列与天然来源的丝心蛋白相比较，能够具有相当于至少缺失一个或多个的(A)n基序，在此基础上进一步具有至少REP中的一个或多个甘氨酸残基被取代为其他的氨基酸残基的氨基酸序列。即，其为兼具上述涉及第2实施方式的改造丝心蛋白和涉及第3实施方式的改造丝心蛋白的特征的改造丝心蛋白。其具体的形态等如在涉及第2实施方式的改造丝心蛋白和涉及第3实施方式的改造丝心蛋白中所说明的那样。
[0133] 作为涉及第4实施方式的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举包含与以(4-i)序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列、或者(4-ii)序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列具有80％以上，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。包含以序列号9、序列号10以及序列号11所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白的具体的形态为如上所述。
[0134] ＜蛋白质的制备方法＞涉及本实施方式的蛋白质，可通过例如，由具有编码该蛋白质的核酸序列和可运作连接在所述核酸序列的一个或多个调节序列的表达载体使其遗传转化的宿主，并表达所述核酸所产生。
[0135] 对编码蛋白质的核酸的制备方法并无特别地限制。例如，通过使用编码天然丝心蛋白的基因，用聚合酶连锁反应(PCR)等进行扩增、克隆，再通过基因工程方法进行改造的方法，或通过化学合成的方法来制备所述核酸。核酸的化学合成方法也无特别地限制，例如，基于从NCBI的网络数据库等获得的蛋白质的氨基酸序列信息，通过用PCR等连接以AKTA oligopilot plus 10/100(GE Healthcare Japan Co.,Ltd.)等自动合成的寡核苷酸的方法化学合成基因。此时，为了使蛋白质的纯化和/或确认变得容易，也可合成编码将由起始密码子和His10标签构成的氨基酸序列添加在上述氨基酸序列的N末端的氨基酸序列所构成的蛋白质的核酸。
[0136] 调节序列是对宿主中的改造丝心蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。作为启动子，也可使用能够在宿主细胞中起作用，进而表达诱导改造丝心蛋白的诱导性启动子。诱导性启动子为通过诱导物质(表达诱导剂)的存在、阻抑物分子非存在、或者温度、渗透压以及pH值的上升或降低等的物理性要素能够调控转录的启动子。
[0137] 表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人造染色体载体等。作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够并入到宿主的染色体中、且在能够对编码蛋白质的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。
[0138] 作为宿主，其原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以优选使用。
[0139] 作为原核生物宿主的优选例，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、分枝杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的细菌。作为埃希氏菌属的微生物，可列举例如大肠杆菌等。作为短芽孢杆菌属的微生物，可列举例如土壤短芽孢杆菌等。作为沙雷氏菌属的微生物，可例如列举液化沙雷氏菌等。作为芽孢杆菌属属的微生物，可列举例如枯草芽孢杆菌等。作为分枝杆菌属属的微生物，可列举例如嗜氨分枝杆菌等。作为属于短杆菌属的微生物，可列举例如叉开短杆菌的微生物。作为属于棒杆菌属的微生物，可列举例如产氨棒杆菌的微生物。作为属于假单胞菌((Pseudomonas)属的微生物，可列举例如恶臭假单胞菌的微生物。
[0140] 在将原核生物作为宿主的情况下，作为导入编码蛋白质的核酸的载体，可列举例如pBTrp2(白林格纳海姆公司制备)pGEX(Pharmacia公司制备)、pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold、pUB110、pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
[0141] 作为真核生物的宿主，可列举例如酵母和丝状真菌(霉菌等)。作为酵母，可列举例如属于酵母属、毕赤酵母属、裂殖酵母属等的酵母。作为丝状真菌，可列举例如属于曲霉属、青霉属、木霉(Trichoderma)属等的丝状真菌。
[0142] 在将真核生物作为宿主的情况下，作为导入编码改造丝心蛋白的核酸的载体，可举出例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)等。作为向上述宿主细胞导入表达载体的导入方法，只要是向上述宿主细胞导入DNA的方法都可以使用。可列举例如，使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110(1972)]、电穿孔法、原生质球法、原生质体法、醋酸锂法、感受态法等。
[0143] 作为通过用表达载体转化的宿主的核酸的表达方法，除了直接表达之外，也可依据分子克隆第2版记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。
[0144] 蛋白质例如可以通过将利用表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使所述蛋白质在培养用培养基中生成蓄积，并从该培养用培养基中收集来进行制备。将宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。
[0145] 在宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为培养用培养基，只要是含有该宿主可同化而获得的碳源、氮源以及无机盐类等、且能够高效地进行所述宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
[0146] 作为碳源，只要是上述转化微生物同化所得的碳源即可，可使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉以及淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、乙醇和丙醇等醇类。作为氮源，可使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。作为无机盐，可使用例如磷酸亚钾、正磷酸钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
[0147] 大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养，例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的pH优选为保持于3.0～9.0。培养用培养基的pH的调节可以通过使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙以及氨等进行。
[0148] 另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
[0149] 能够以通常使用的方法对已被表达的蛋白质进行分离和纯化。例如，在所述蛋白质以溶解状态在细胞内进行表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、Manton-Gaulin匀浆器和戴诺研磨机(DYNO-MILL)等将宿主细胞破碎，进而得到无细胞提取液。从通过将所述无细胞提取液离心分离而得到的上清中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化成公司制备)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制备)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、色谱聚焦法、等电点电泳等电泳法等方法，进而能够得到纯化样品。
[0150] 另外，在蛋白质将不溶体形成在细胞内而进行表达的情况下，同样通过在回收宿主细胞后将其破碎，进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收蛋白质的不溶体。已回收的蛋白质的不溶体可以利用蛋白变性剂进行可溶化。所述操作后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到蛋白质的纯化样品。
[0151] (2)具有β片层结构的多肽和聚氨基酸在本发明的复合成型组合物中，上述实施方式配合具有所述β片层结构的多肽或聚氨基酸。在这种情况下，作为聚氨基酸的示例可列举为聚丙氨酸。
[0152] 所述聚丙氨酸可选自线型聚丙氨酸(L-polyAla)或远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)。线型聚丙氨酸可通过利用酶化学聚合法制备，且可基于公知的文献进行制备、使用(Baker P J们，Biomacromolecules 2012，13，947-951)。另外，远螯型聚丙氨酸如在下述实施例中记载那样，能够通过使用酶化学聚合方法进行制备，并且被记载在Tsuchiya K们，Macromol.Biosci.2016,1001-1008，并以引用的方式并入本说明书。
[0153] (3)含有丝心蛋白和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的复合成型组合物的制备在本说明书中，“具有β片层结构的多肽”是指在其二维结构中，含有限于具有β片层结构的任意的多肽，含有天然的多肽和人工制备的多肽，优选为人工制备的多肽，更优选为含有下述聚氨基酸的序列的多肽。
[0155] 另外，具有β片层结构的聚氨基酸是指为人工合成的L-或D-氨基酸的聚合物，以其二级结构具有β片层结构的任意的聚氨基酸。其优选为选自聚丙氨酸、聚苯丙氨酸、聚半胱氨酸、聚缬氨酸、聚亮氨酸、聚异亮氨酸、聚酪氨酸、聚色氨酸、聚谷氨酰胺、聚甲硫氨酸及其它们的衍生物的均聚氨基酸及其衍生物；进一步，不仅仅是它们的衍生物的均聚氨基酸及其衍生物，还可以含有由选自丙氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酰胺、蛋氨酸等氨基酸及其衍生物中的多种,优选为2～5种,更优选为2～4种,进一步为优选2种或3种的氨基酸的共聚物构成的聚氨基酸。这些聚氨基酸，可以通过例如化学酶聚合法等的公知的方法进行制备(Numata K.们，Polymer Journal，2015；47：537-545，和Baker J.P.们，Biomacromolecules 2012，13，947-951等)。聚氨基酸的聚合度为2～
100的范围,优选为5～50的范围,更优选为10～30的范围,进一步优选为10～20的范围。
100的范围,优选为5～50的范围,更优选为10～30的范围,进一步优选为10～20的范围。
[0156] 在本说明书中，聚氨基酸、多肽以及蛋白质的结构以本领域技术人员熟知惯用的氨基酸的3个或单个字母表示的方法来记述。在本文中的氨基酸除非特殊记载，其为L体。
[0157] 为构成蛛丝来源的丝的结构体之一，特别是构成纳米原纤的小型颗粒状结构体的纳米颗粒状结构体，是指其具有持有高长径比的颗粒状的形态，于丝中富含特征性的甘氨酸及丙氨酸，且将含有β片层结构的肽或多肽作为主要成分的结构体。有报道，在Nephila edulis的蛛丝的情况下，具有17％±4％的β片层结构(Ling S们，Biomacromolecules，2011，12，3344-3349)。另外,还有报道，更为坚韧的蜘蛛牵引丝其45-65％为β片层结构域(Vollrath F们,Polymer,2009,50,5623-5632)。
[0158] 在此，本发明的复合成型组合物，可通过制备已将富含β片层结构的多肽或聚氨基酸混合、溶解在作为原料的丝心蛋白样蛋白质中的纺丝液，进而成型复合纤维、复合膜、复合凝胶、复合蜂质体、复合颗粒以及复合模具成型物等进行制备。
[0159] 在制备复合膜的情况下,在国际公开公报WO2014/103799中记载了一种将丝心蛋白来源的蛋白质作为原料制备膜的方法,可以基本上根据该方法进行制备。在制备复合纤维的情况下,在国际公开公报WO2012/165476中记载了一种由丝心蛋白来源的蛋白质进行纺丝纤维的方法,可以基本上按照该方法进行制备。当制备复合凝胶的情况下，国际公开公报WO2014/175177中记载了一种由丝心蛋白来源的蛋白质进行制备凝胶的方法，可以基本上根据该方法进行制备。另外,在制备复合蜂质体的情况下,在国际公开公报WO2014/175178中记载了一种由丝心蛋白来源蛋白质制备蜂质体的方法,可以基本上按照该方法进行制备。进一步，在制备复合颗粒的情况下，在WO2014/175179中记载了一种由丝心蛋白来源的蛋白质制备颗粒的方法，可以基本上根据该方法进行制备。另外，在制备复合模具成型物的情况下，在日本特願2015-185777的说明书中记载了一种由丝心蛋白来源的蛋白质制备模具成型物的方法，可以基本上根据该方法进行制备。
[0160] 复合成型组合物在使用所述纺丝液所制备的复合膜的情况下，作为涂布方法，可以使用在本技术领域通常已知的，例如浇铸法、旋转涂布法、浸渍法、喷涂·涂布法、电场聚合法、蒸镀法、蒸镀聚合法、刷涂法、刮刀涂布法、辊涂法、凹版涂布法以及卷对卷制程(roll-to-roll process)等方法。
[0161] 另外，在使用在丝心蛋白的蛋白质中配合具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液进行纺丝的情况下，能够在纺丝工序中施加剪应力，同时通过改变与纺丝液的pH、盐的种类和浓度、湿度或水分浓度等的蛛丝等的丝心蛋白来源的多肽纤维的环境相关的要素，进而能够制备丝心蛋白来源的复合纤维。通过改变这些元素中的一种以上或通过改变组合多种要素，可以制造丝心蛋白来源的复合纤维。作为本发明的丝心蛋白来源的复合纤维的制备方法，具体而言，可以列举湿式纺丝法、干式纺丝法、干湿式纺丝法以及熔融纺丝法等公知的纺丝方法。
[0162] 在本发明的实施方式中，在使用湿式纺丝法或干湿式纺丝法的情况下，在纤维轴方向上施加剪应力，同时向纺丝液中添加凝固剂，或通过将所述纺丝液喷出、挤出或浸渍在含有凝固剂的溶剂中,进而能够制备丝心蛋白来源的多肽纤维。
[0163] 作为湿式纺丝法或干湿式纺丝法的凝固剂，只要是能够从纺丝液中除去用于溶解丝心蛋白来源的蛋白质等的溶剂(也称为去溶剂)而得到者即可，没有特别地限定。例如,作为凝固剂,可以使用甲醇、乙醇、2-丙醇等的碳原子数1～5的低级醇或丙酮等。另外，也可以使用含有无机盐的水溶液。该无机盐水溶液优选为弱酸性～酸性的溶剂。
[0164] 例如，在制造复合模具成型物的情况下，在将含有蛋白质的组合物(仅含有蛋白质或其他成分)导入在加压成型机的模具后，在加热模具的同时对组合物加压。在给定的加压下对蛋白质粉末持续实施达到给定温度的加热和加压，进而得到被加热加压的组合物。接下来，使用冷却器(例如spot cooler)使模具的温度下降，在组合物达到给定的温度时取出内容物，进而得到模具成型物。其加热优选为在80～300℃下进行,更优选为在100～180℃下进行,进一步优选为在100～130℃下进行。其加压优选为在5kN以上进行，更优选为在10kN以上进行，进一步优选为在20kN以上进行。另外,达到给定的加热加压条件后,在该条件下继续处理的时间(保温条件)优选为0～100分钟,更优选为1～50分钟,进一步优选为5～30分钟。
[0165] 例如，在制造树脂的情况下，制备将上述本发明的组合物已溶解或悬浮于溶剂中的纺丝液，通过本领域技术人员所公知的惯用的方法使该纺丝液的蛋白质不溶化，进而能够制备本发明的树脂。作为溶剂，可列举例如，水或极性有机溶剂或它们的混合溶剂。作为使本发明的蛋白质不溶化的方法，可列举蒸馏纺丝液的溶剂的方法、变化溶剂中的盐的种类和/或浓度的方法、变化离子强度或盐浓度的方法、和/或变化pH的方法等。
[0166] 在本说明书中，“纺丝液”是指已混合、溶解为用于制备复合纤维或复合膜等的复合成型组合物的原料的丝心蛋白来源的蛋白质和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的溶液。
[0167] 作为在上述的纺丝液中使用的极性有机溶剂，可选自例如，二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇(HFIP)、甲酸或它们的混合物，但也并不仅限于此。
[0168] 另外，纺丝液也可以进一步含有无机盐。无机盐可以作为蛋白质的增溶剂而起作用。作为无机盐，可列举例如，碱金属卤化物、碱土金属卤化物、碱土金属硝酸盐以及硫氰酸盐。作为无机盐的具体例，可列举磷酸铝、碳酸锂、碳酸铝、硫酸铝、氟化铝、乙酸亚铁、乙酸铝、氢氧化锌、氢氧化钡镁、氢氧化亚铁、氢氧化锰、氢氧化铬、氢氧化铁、氢氧化铝、氯化镍、氯化钴、氯化锌、氯化铁、氯化锰、氯化铬、氯化亚铁、氯化铝、硝酸锂、硝酸锶、硝酸镍、硝酸钙、硝酸钴、硝酸锌、硝酸镁、硝酸铁、硝酸锰、硝酸铬、硝酸亚铁、硝酸铝、溴化锂、溴化钡、溴化锶、溴化镍、溴化钙、溴化钴、溴化锌、溴化镁、溴化铁、溴化锰、溴化铬、溴化亚铁、溴化铝、氯酸钡、氯酸锶、氯酸镍、氯酸钙、氯酸钴、氯酸锌、氯酸镁、氯酸铁、氯酸锰、氯酸铬、氯酸亚铁、氯酸铝、碘化铷、碘化钠、碘化铜、碘化锂、碘化钡、碘化锶、碘化镍、碘化钙、碘化钴、碘化锌、碘化镁、碘化铁、碘化锰、碘化铬、碘化亚铁、碘化铝、高氯酸钠、高氯酸铅、高氯酸铜、高氯酸锂、高氯酸钡、高氯酸锶、高氯酸镍、高氯酸钙、高氯酸钴、高氯酸锌、高氯酸镁、高氯酸铁、高氯酸锰、高氯酸铬、高氯酸亚铁、高氯酸铝、硫氰酸钾、硫氰酸钠、硫氰酸铅、硫氰酸铜、硫氰酸锂、硫氰酸钡、硫氰酸锶、硫氰酸镍、硫氰酸钙、硫氰酸钴、硫氰酸锌、硫氰酸镁、硫氰酸铁、硫氰酸锰、硫氰酸铬、硫氰酸亚铁、硫氰酸铝、氰酸铵、氰酸铯、氰酸铷、氰酸钾、氰酸钠、氰酸铅、氰酸铜、氰酸锂、氰酸钡、氰酸锶、氰酸镍、氰酸钙、氰酸钴、氰酸锌、氰酸镁、氰酸铁、氰酸锰、氰酸铬、氰酸亚铁以及氰酸铝。可在溶剂中添加上述中的至少一种的无机盐。
[0169] 纺丝液中所含有的无机盐的量并无特别限定，可以根据无机盐的种类、丝心蛋白来源蛋白质的量等适当决定。相对于蛋白质的总量100质量份，无机盐的量可为1.0质量份以上、5.0质量份以上、9.0质量份以上、15质量份以上、20质量份以上。另外，相对于蛋白质总量100质量份，无机盐的量也可为40质量份以下、35质量份以下、30质量份以下。
[0170] 在本说明书中，添加到丝心蛋白来源蛋白质中的多肽和/或聚氨基酸的添加量，可以用相对于丝心蛋白来源的蛋白质和所添加的多肽和/或聚氨基酸的总重量的多肽和/或聚氨基酸的重量的比例表示。例如，在已记载为“polyAla 5wt％的复合成型组合物”的情况下，(丝心蛋白来源的蛋白质)：(多肽和/或聚氨基酸)，表示以重量比为95：5的比例所配合的复合成型组合物。另外，根据情况，也可以相对于质量的比例来表示。
[0171] 含有本发明的丝心蛋白和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的组合物，可通过将具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的水溶液或水悬浮液添加在已溶解丝心蛋白的纺丝液中再进行混合后，使其成型、干燥而制备。具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的配合比例为0.1～50.0％的范围,优选为0.5～30.0％的范围,更优选为1～10.0％的范围,进一步优选为1～5％的范围。
[0172] 在使用作为具有β片层结构的聚氨基酸的聚丙氨酸的情况下,其聚丙氨酸的聚合度为2～100的范围,优选为3～50的范围,更优选为10～30的范围，进一步优选为10～20的范围。另外,聚丙氨酸的配合率为0.1～30.0％的范围,优选为0.5～20.0％的范围,更优选为1.0～10.0％的范围,进一步优选为3.0～5.0％的范围。
[0173] 1-2.预拉伸复合成型组合物本发明的另一实施方式为预拉伸复合成型组合物。所述预拉伸复合组合物通过在所述复合成型组合物的制造工序中进一步含有进行预拉伸的工序而制备，且与未拉伸的复合成型组合物进行比较，可以提供更为优异的物理特性。
[0174] 具体而言，本实施方式的预拉伸复合成型组合物，为在已配合丝心蛋白来源的蛋白质中具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的预拉伸复合成型组合物。所述复合成型组合物可以选自纤维或膜，且以含有以下(i)制备溶解丝心蛋白来源的蛋白和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)通过所述纺丝液成型复合成型组合物的步骤；进一步，
(iii)在溶剂中拉伸在所述(ii)得到的复合成型组合物，且对其进行干燥步骤的制备方法而制备的预拉伸复合成型组合物。
(ii)通过所述纺丝液成型复合成型组合物的步骤；进一步，
(iii)在溶剂中拉伸在所述(ii)得到的复合成型组合物，且对其进行干燥步骤的制备方法而制备的预拉伸复合成型组合物。
[0175] 通过追加预拉伸工序，进一步提高抗拉强度、应变和/或韧性等的物理特性。作为预拉伸工序的例子，可以列举湿热拉伸、干热拉伸等。
[0176] 湿热拉伸可以在温水中、在温水中加入有机溶剂等的溶液中或有机溶剂中以及蒸气加热中进行。作为温度,例如可为50～90℃,优选为75～85℃。在湿热拉伸中,可以将未拉伸纤维或未拉伸膜(或，预拉伸纤维或预拉伸膜)例如拉伸1～10倍,优选为拉伸1～4倍。
[0177] 干热拉伸可以使用电管状炉、干热板等来进行。作为温度,例如可为140～270℃,优选为160～230℃。在干热拉伸中,未拉伸纤维或未拉伸膜(或，预拉伸纤维或预拉伸膜)例如可以从0.5倍拉伸至8倍,优选为拉伸1～4倍。
[0178] 湿热拉伸和干热拉伸可以分别单独进行，另外，也可以将它们以多步或组合进行。即，可以适宜组合湿热拉伸和干热拉伸，在第一步拉伸中进行湿热拉伸，在第二步拉伸中进行干热拉伸，或对第一步拉伸进行湿热拉伸，对第二步拉伸进行湿热拉伸，进一步对第三步拉伸进行干热拉伸等。
[0179] 根据这些本发明的复合成型组合物，例如，可以制备使用该组合物的丝、机织物、无纺布、编结物和针织物等。利用这些复合成型组合物的耐热性、高拉伸强度、韧性和/或延伸性(伸长率)等优异的特性，可用于例如，防弹衣、降落伞、机动车的车身等需要高耐冲击性的材料的制备。另外，利用该组合物的高强度、高延伸性以及高韧性和生物降解性和生物相容性，可将其作为创面封闭材料、缝合线、创可贴、再生医疗用支架材料等的医疗材料使用。
[0180] 2.本发明的复合成型组合物的制备方法2-1.未拉伸复合成型组合物的制备方法
本发明的另一个实施方式为所述复合成型组合物的制备方法。更具体地说来，本发明为选自在丝心蛋白来源的蛋白质中配合了具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纤维、膜以及凝胶的复合成型组合物的制备方法。所述制备方法为包括以下步骤的制备方法：
(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)通过纺丝或拉伸所述纺丝液进而制备所述复合成型组合物的步骤。
本发明的另一个实施方式为所述复合成型组合物的制备方法。更具体地说来，本发明为选自在丝心蛋白来源的蛋白质中配合了具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纤维、膜以及凝胶的复合成型组合物的制备方法。所述制备方法为包括以下步骤的制备方法：
(i)制备已溶解丝心蛋白来源的蛋白和具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的纺丝液的步骤；
(ii)通过纺丝或拉伸所述纺丝液进而制备所述复合成型组合物的步骤。
[0181] 如上所述，例如，丝心蛋白来源的蛋白质，其天然的丝心蛋白质可用在商业上，且也可将其入手用于本发明。另外，也可通过利用如上所述的基因重组法导入已人工制作的DNA的微生物来制造。在通过对其进行分离纯化，进而可以利用被改造的丝心蛋白来源的蛋白质。通过这些方法，入手丝心蛋白，再通过其它的，例如，以化学酶聚合法等的公知的方法(Numata K.们，Polymer Journal，2015；47：537-545和Baker J.P.们，Biomacromolecules 2012，13，947-951等)，制备具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸。再将多肽和/或聚氨基酸的水悬浮液混合在含有丝心蛋白来源蛋白质的纺丝液后，通过对其干燥等使其不溶化，进而能够制备本发明的组合物。
[0182] 作为该不溶化的方法，除了干燥的方法以外，例如，还可使用与在所述复合纤维的制备方法中记载的同样的方法。具体而言，可使用变化溶剂中的盐的种类和/或浓度的方法、变化离子强度的方法或盐浓度的方法和/或变化pH等的方法。
[0183] 另外，关于丝心蛋白来源蛋白质以外的材料，也可以使用在上述复合成型组合物中详细说明过的各种材料、且通过在上述详细说明的使用形态中使用，进而能够实施本发明的制备方法。
[0184] 2-2.预拉伸复合成型组合物的制备方法本发明的另一实施方式为，本发明为预拉伸复合成型组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤。
(i)在溶剂中拉伸由所述制备方法所制备的复合成型组合物的步骤；
(ii)干燥已被拉伸的复合成型组合物的步骤。
(i)在溶剂中拉伸由所述制备方法所制备的复合成型组合物的步骤；
(ii)干燥已被拉伸的复合成型组合物的步骤。
[0185] 通过追加预拉伸工序，进而能够进一步提高抗拉强度、应变及/或韧性等的物理特性。作为预拉伸工序的示例，可列举湿热拉伸、干热拉伸等。
[0186] 湿热拉伸可以在温水中、在温水中加入有机溶剂等的溶液中或有机溶剂中以及蒸气加热中进行。作为温度,例如可为50～90℃,优选为75～85℃。在湿热拉伸中,可以将未拉伸纤维或未拉伸膜(或预拉伸纤维或预拉伸膜)例如拉伸1～10倍,优选为拉伸1～4倍。
[0187] 干热拉伸可以使用电管状炉、干热板等来进行。作为温度,例如可为140～270℃,优选为160～230℃。在干热拉伸中,未拉伸纤维或未拉伸膜(或预拉伸纤维或预拉伸膜)例如可以从0.5倍拉伸至8倍,优选为拉伸1～4倍。
[0188] 湿热拉伸和干热拉伸可以分别单独进行，另外，也可以将它们以多步或组合进行。即，可以适宜组合湿热拉伸和干热拉伸，在第一步拉伸中进行湿热拉伸，在第二步拉伸中进行干热拉伸，或对第一步拉伸进行湿热拉伸，对第二步拉伸进行湿热拉伸，进一步对第三步拉伸进行干热拉伸等。
[0189] 根据上述本发明的制备方法所制备的复合成型组合物，进一步可以制备例如，使用这些组合物的丝、机织物、无纺布、编结物以及针织物等。利用这些复合成型组合物的耐热性、高拉伸强度、韧性和/或延伸性(伸长率)等优异的特性，可用于例如，防弹衣、降落伞、机动车的车身等需要高耐冲击性的材料的制备。另外，利用该组合物的高强度、高延伸性以及高韧性和生物降解性和生物相容性，可将其作为创面封闭材料、缝合线、创可贴、再生医疗用支架材料等的医疗材料使用。
[0190] 3.提高本发明的复合成型组合物的物理特性的方法本发明的另一优选的实施方式为提高选自由丝心蛋白等的多肽构成的复合成型组合物的拉伸强度、韧性和延伸性等中的至少一种物理特性的方法。作为复合成型组合物，可列举由多肽构成的复合膜、复合纤维、复合凝胶、复合蜂体、复合颗粒和复合模具成型物等。
[0191] 提高复合成型组合物的物理特性的方法，例如，可通过在树脂、膜及纤维等的成型组合物原料中配合具有聚丙氨酸等的β片层的聚氨基酸而制备复合成型组合物。更具体而言，为了制备例如，复合膜、复合纤维、复合凝胶及复合树脂等的复合成型组合物，在溶解有丝心蛋白等原料的纺丝液中，添加具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸，并混合后，例如，通过蒸馏除去溶剂，使多肽不溶化，进而可以获得与未添加具有β片层结构的多肽和/或聚氨基酸的成型组合物相比已提高物理特性的复合成型组合物。
[0192] 在本说明书中，所说的复合成型组合物的物理特性的提高其含义为，例如，以获得的市售的拉伸试验机进行拉伸强度试验，求出测试试样断裂时的极限应力，在该极限应力的值表示出比对比对象的试样高的值时，则意味着拉伸强度提高。另外,所说的韧性提高,其含义为，同样,用拉伸试验机测定被试验的试样,其应力-应变曲线图中曲线的面积的值在比对比对象的试样的面积值显示出高值的时候，则意味着韧性提高。进一步，所说的延伸性提高其含义为，同样在以拉伸试验机进行被试验试样的拉伸试验时，求出被测试试样断裂时的应变(拉伸率)，其被试验试样的断裂时的拉伸率与在对比对象的试样中同样的条件下测定所得到的断裂时的应变相比，显示出高值时，则意味着伸展率提高。
[0193] 在本发明的方法中，作为所使用的聚氨基酸，可列举容易形成β片层结构的聚氨基酸，更具体地说，可以列举聚丙氨酸、聚半胱氨酸等。这些聚氨基酸可以通过化学酶合成法等的公知的方法进行制备(Numata K.们，Polymer Journal，2015；47：537-545，和Baker J.P.们，Biomacromolecules 2012,13,947-951等)。
[0194] 例如，可通过在由丝心蛋白来源多肽构成的成型组合物原料中配合聚丙氨酸来实施。在提高复合成型组合物的物理特性的情况下,其为将聚合度为2～100的范围、优选为5～50的范围、更优选为10～30的范围、进一步优选为10～20的范围的聚丙氨酸，以作为配合率为0.1～30.0％的范围,优选为0.5～20.0％的范围,更优选为以1.0～10.0％的范围,进一步优选3.0～5.0％的范围的配合率配合在纺丝液中。
[0195] 通过使用本发明的方法，能够制备出更为提高复合成型组合物的物理特性的丝、机织物、无纺布、编结物和针织物等。利用这些复合成型组合物的耐热性、高拉伸强度、韧性和/或延伸性等优异的特性，可用于例如，防弹衣、降落伞、机动车的车身等需要高耐冲击性的材料的制备。另外，利用该组合物的高强度、高延伸性以及高韧性和生物降解性和生物相容性，可将其用于制备创面封闭材料、缝合线、创可贴、再生医疗用支架材料等的医疗材料。
[0196] 需要说明的是，在本说明书中提及的所有文献，其通过全部引用而被收入在本说明书中。[实施例]
[0197] 在以下所说明的本发明的实施例其目的仅用于说明，并不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅由方案的记载所限定。在不脱离本发明的主旨的前提下，可以进行本发明的变更，例如，可进行本发明的构成要件的追加、删除以及置换。实施例1
[0198] 在天然的蚕·丝心蛋白的蛋白质或改造蛛丝心蛋白的蛋白质中已配合聚丙氨酸(L-polyAla或T-polyAla)的复合成型膜的制备及其物理特性的评价1.在天然的蚕·丝丝心蛋白的蛋白质中已配合聚丙氨酸的复合成型膜的制备
按照以下所记载的方法，合成polyAla(L-polyAla或T-polyama)，制备溶解有天然蚕·丝心蛋白的蛋白质(Bombix mori)和通过下述方法制备的聚丙氨酸(L-polyAla为5wt％或
10wt％；T-polyAla为1wt％或2.5wt％)的纺丝液，利用浇铸法由该纺丝液制被复合成型膜，且对其进行张力变形试验，并对其物理特性的变化进行了评价。
按照以下所记载的方法，合成polyAla(L-polyAla或T-polyama)，制备溶解有天然蚕·丝心蛋白的蛋白质(Bombix mori)和通过下述方法制备的聚丙氨酸(L-polyAla为5wt％或
10wt％；T-polyAla为1wt％或2.5wt％)的纺丝液，利用浇铸法由该纺丝液制被复合成型膜，且对其进行张力变形试验，并对其物理特性的变化进行了评价。
[0199] 张力变形试验用小型台式试验机(EZ-LX型,股份有限公司岛津制作所,京都)进行实施。初始样品长度为15.0mm,并以0.5mm/min的恒定速度进行拉伸。记录结果，然后使用TRAPEZIUM(ver.1.3.0，股份有限公司岛津制作所，京都)进行了分析。所述测量在58％的湿度和室温下进行了实施。
[0200] 2.polyAla(L-polyAla或T-polyAla)的制备(1)远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)的合成
(i)使用亮氨酸引发剂(Leu-initiator)的合成
(a)亮氨酸引发剂的合成
使用亮氨酸引发剂(Leu-Initiator)的远螯型聚丙氨酸的合成，可通过以使用木瓜蛋白酶的化学酶合成法来制备。具体而言,将L-亮氨酸乙酯盐酸盐(6.07g)、三乙胺(9.2mL)以及二乙醚(100mL)添加到0℃、氮环境下的烧瓶中,在30分钟内向该溶液中滴加氯化琥珀酰(1.7mL)的二乙基醚溶液(50mL)，然后在0℃下搅拌2小时。将反应液加热至室温后，加入水，用二乙醚萃取水层。在用硫酸钠干燥有机层后进行了浓缩。真空干燥粗制品后,用己烷/乙酸乙酯＝5∶1(v/v)进行重晶化,进而得到了3.57g亮氨酸引发剂(Leu-initiator)的黄色针状晶体(产率60％)。
(i)使用亮氨酸引发剂(Leu-initiator)的合成
(a)亮氨酸引发剂的合成
使用亮氨酸引发剂(Leu-Initiator)的远螯型聚丙氨酸的合成，可通过以使用木瓜蛋白酶的化学酶合成法来制备。具体而言,将L-亮氨酸乙酯盐酸盐(6.07g)、三乙胺(9.2mL)以及二乙醚(100mL)添加到0℃、氮环境下的烧瓶中,在30分钟内向该溶液中滴加氯化琥珀酰(1.7mL)的二乙基醚溶液(50mL)，然后在0℃下搅拌2小时。将反应液加热至室温后，加入水，用二乙醚萃取水层。在用硫酸钠干燥有机层后进行了浓缩。真空干燥粗制品后,用己烷/乙酸乙酯＝5∶1(v/v)进行重晶化,进而得到了3.57g亮氨酸引发剂(Leu-initiator)的黄色针状晶体(产率60％)。
[0201] (b)利用化学酶合成法的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)的合成将丙氨酸乙酯盐酸盐(0.645g)、上述亮氨酸引发剂(0.080g)、磷酸盐缓冲液(2mL，1M，pH8.0)以及乙醇(1mL)添加在玻璃管中，并在40℃下搅拌直至所有底物溶解。向该溶液中一次性注入木瓜蛋白酶(0.300g)的磷酸盐缓冲液(2.2mL)溶液。丙氨酸和木瓜蛋白酶的最终浓度分别为0.7M和50mg/mL。将该混合物在40℃下搅拌6小时。将搅拌后的混合物冷却至室温，并离心分离(7000rpm、4℃、10分钟)使其沉淀。用去离子水两次清洗粗沉淀物并进行冻结干燥，进而得到了0.071g白色固体的寡肽。
[0202] (ii)已使用双(丙氨酸乙酯)引发剂的远螯型聚丙氨酸的合成(a)双(丙氨酸乙酯)引发剂的合成
使用双(丙氨酸乙酯)引发剂的合成为，在200mL烧瓶中加入丙氨酸乙酯盐酸盐
(4.76g)、三乙胺(9.2mL)和氯仿(100mL)，且在0℃、氮气氛下向该混合溶液中滴加氯化琥珀酰(1.7mL)的氯仿(50mL)溶液。在将该混合液在0℃下搅拌2小时后，添加水使其停止反应。
将该混合物用水、1M碳酸氢钠水溶液、盐水(brine)进行了清洗。在用硫酸钠干燥有机层后对其进行了浓缩。进而得到了3.58g用己烷/乙酸乙酯使其重晶化的白色针状晶体的粗制品(产率76％)。
红外吸收光谱和NMR光谱测定以及燃烧法元素分析的结果如下：
Infrared(IR)(neat)：v＝3301、2991、1729、1639、1545、1356、1238、1204、1168、-1 1
1020cm .H NMR(500MHz，CDCl3，25℃，ppm)：δ6.66(s，2H)，4.53(m，2H)4.20(q，J＝7.1Hz，
4H)，2.57(m，4H)，1.40(d,J＝7.1Hz,6H),1.28(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(125MHz，CDCl3，25℃)：δ173.16，171.73，61.37，48.18，31.55，17.97，14.04.Anal.Calcd for C14H24N2O6：C，
53.15；H，7.65；N，8.86.Found：C、53.08；H、7.61；N、8.85.
使用双(丙氨酸乙酯)引发剂的合成为，在200mL烧瓶中加入丙氨酸乙酯盐酸盐
(4.76g)、三乙胺(9.2mL)和氯仿(100mL)，且在0℃、氮气氛下向该混合溶液中滴加氯化琥珀酰(1.7mL)的氯仿(50mL)溶液。在将该混合液在0℃下搅拌2小时后，添加水使其停止反应。
将该混合物用水、1M碳酸氢钠水溶液、盐水(brine)进行了清洗。在用硫酸钠干燥有机层后对其进行了浓缩。进而得到了3.58g用己烷/乙酸乙酯使其重晶化的白色针状晶体的粗制品(产率76％)。
红外吸收光谱和NMR光谱测定以及燃烧法元素分析的结果如下：
Infrared(IR)(neat)：v＝3301、2991、1729、1639、1545、1356、1238、1204、1168、-1 1
1020cm .H NMR(500MHz，CDCl3，25℃，ppm)：δ6.66(s，2H)，4.53(m，2H)4.20(q，J＝7.1Hz，
4H)，2.57(m，4H)，1.40(d,J＝7.1Hz,6H),1.28(t,J＝7.1Hz,6H).13C NMR(125MHz，CDCl3，25℃)：δ173.16，171.73，61.37，48.18，31.55，17.97，14.04.Anal.Calcd for C14H24N2O6：C，
53.15；H，7.65；N，8.86.Found：C、53.08；H、7.61；N、8.85.
[0203] (b)利用化学酶合成法的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)的合成向10mL玻璃管中加入丙氨酸乙酯盐酸盐(0.922g)、上述双(丙氨酸乙酯)引发剂
(0.190g)、磷酸缓冲液(2.0mL，1M，pH8.0)以及四氢呋喃(1.0mL)，在40℃下搅拌直至所有的底物完全溶解。然后一次性注入木瓜蛋白酶(0.300g)的磷酸缓冲液溶液(2.0mL)。丙氨酸乙酯和木瓜蛋白酶的最终浓度分别为1M和50mg/mL。将该混合液在40℃下搅拌6小时。在将搅拌后的混合物冷却至室温后，通过离心分离(7000rpm，4℃，10分钟)使其沉淀。在将粗产物用去离子水和甲醇清洗两次后进行冻结干燥，进而得到了0.221g(61％)的白色粉末。
(0.190g)、磷酸缓冲液(2.0mL，1M，pH8.0)以及四氢呋喃(1.0mL)，在40℃下搅拌直至所有的底物完全溶解。然后一次性注入木瓜蛋白酶(0.300g)的磷酸缓冲液溶液(2.0mL)。丙氨酸乙酯和木瓜蛋白酶的最终浓度分别为1M和50mg/mL。将该混合液在40℃下搅拌6小时。在将搅拌后的混合物冷却至室温后，通过离心分离(7000rpm，4℃，10分钟)使其沉淀。在将粗产物用去离子水和甲醇清洗两次后进行冻结干燥，进而得到了0.221g(61％)的白色粉末。
[0204] (2)线型(直链状)聚丙氨酸的制备除了不含有双(丙氨酸乙酯)引发剂的条件以外,使用与远螯型聚丙氨酸(T-
polyAlaet)同样的方法合成了线型(直链状)聚丙氨酸(L-polyAla)。
polyAlaet)同样的方法合成了线型(直链状)聚丙氨酸(L-polyAla)。
[0205] (3)聚丙氨酸的平均聚合度和平均分子量的测定用NMR(Varian NMR System500,Varian Medical Systems,Palo Alto,CA,USA)测定所制备的L-polyAla和T-polyAla的平均分子量而算出时,L-polyAla的平均聚合度为5.8,平均分子量为531；T-polyAla的平均聚合度为5.9,平均分子量为593。
[0206] 这样的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)的合成的实施例被详细地记载在例如Tsuchiya K.们的文献(Tsuchiya K.们、Macromol.Biosci.2016,16,1001-1008)并被公开。通过引用全部该公开内容而将其收入在本说明书中。
[0207] 3.改造蛛丝丝心蛋白的蛋白质的制备和已配合polyAla的复合膜的制备作为改造蛛丝丝心蛋白的蛋白质，按照公知的方法(日本特开2014-129639号公报)制备基因重组蛛丝蛋白的蛋白质(recombinant spider silk protein ADF3KaiLargeNRSH1；
序列号4、和、ADF3Kai_noNR：序列号：18)，并将其用于复合成型膜的制备。
序列号4、和、ADF3Kai_noNR：序列号：18)，并将其用于复合成型膜的制备。
[0208] 使用上述改造蛛丝丝心蛋白的蛋白质，以与上述天然蚕·丝心蛋白的蛋白质的复合膜的制备同样的方法，进而采用浇铸法制备了改造蛛丝丝心蛋白的蛋白质的复合膜。
[0209] 4.复合膜的张力变形试验以与上述天然丝心蛋白的蛋白质的复合膜同样的方法对上述复合膜实施了张力变形试验。
[0210] 5.预拉伸复合膜的制备和张力变形试验使用在上述丝(天然丝心蛋白的蛋白质或改造丝心蛋白的蛋白质)中已配合有polyAla(L-polyAla或T-polyAla的复合膜，并通过以下的方法对载荷预拉伸而制被的预拉伸复合膜进行了张力变形试验。
[0211] 将仅为丝、配合T-polyAla的丝以及配合L-polyAla的丝的3种丝切成小片(3mm×15mm)，在甲醇中浸渍5分钟，缓慢地使用手动单轴拉伸机(IMC-1A11型、井元制作所)将上述各小片预拉伸为1.25倍、1.5倍、1.75倍或2倍的长度(各拉伸率为25％、50％、75％或
100％)。将各预拉伸的小片用双面胶带固定于玻璃制的培养皿上，在室温下用干燥器真空干燥3小时。使用各预拉伸膜,在拉伸速度为0.5mm/min、25℃、相对湿度55～60％的条件下,通过拉伸试验机(小型台式试验机EZ Test系列EZ-LX HS,岛津制作所)进行机械测定,并根据应力-失真曲线计算出最大张力、应变(极限拉伸率)以及韧性。各测定各实施5例，求出平均值和标准偏差。
100％)。将各预拉伸的小片用双面胶带固定于玻璃制的培养皿上，在室温下用干燥器真空干燥3小时。使用各预拉伸膜,在拉伸速度为0.5mm/min、25℃、相对湿度55～60％的条件下,通过拉伸试验机(小型台式试验机EZ Test系列EZ-LX HS,岛津制作所)进行机械测定,并根据应力-失真曲线计算出最大张力、应变(极限拉伸率)以及韧性。各测定各实施5例，求出平均值和标准偏差。
[0212] 6.广角X射线衍射(WAXD)的测定用BL45XU型束线(SPring-8,播磨)对已被100％预拉伸的仅为丝的膜和含有polyAla的膜实施广角X-射线衍射(WAXD)。
[0213] 7.结果(1)对天然蚕·丝心蛋白的蛋白质的复合膜的张力变形试验结果
将在天然蚕·丝心蛋白的蛋白质中配合5wt％或10wt％的线型聚丙氨酸(L-polyAla)或配合1wt％或2.5wt％的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)而制备的膜的未拉伸时的物理特性的结果分别表示在表6、表7和图5。
将在天然蚕·丝心蛋白的蛋白质中配合5wt％或10wt％的线型聚丙氨酸(L-polyAla)或配合1wt％或2.5wt％的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)而制备的膜的未拉伸时的物理特性的结果分别表示在表6、表7和图5。
[0214] 在天然·丝心蛋白质中配合了5wt％的线型聚丙氨酸(L-polyAla)的情况下，被确认为其拉伸强度、应变及韧性得以提高。
[0215] 表1在蚕(Bombyx mori)·丝心蛋白的蛋白质中配合了5％或10％的线型聚丙氨酸(L-
polyAla)而制备的膜的未拉伸时的物理特性
试样 A：对照组(未添加) B：L-polyA 5％ C：L-polyA 10％
拉伸强度[MPa] 65.6±4.5 71.7±7.8 78.7±4.2
应变[％] 102.5±17.6 113.9±37.5 80.8±31.1
韧性[MJm-3] 61.1±10.7 71.4±33.1 62.5±31.2
polyAla)而制备的膜的未拉伸时的物理特性
试样 A：对照组(未添加) B：L-polyA 5％ C：L-polyA 10％
拉伸强度[MPa] 65.6±4.5 71.7±7.8 78.7±4.2
应变[％] 102.5±17.6 113.9±37.5 80.8±31.1
韧性[MJm-3] 61.1±10.7 71.4±33.1 62.5±31.2
[0216] 表2在蚕(Bombyx mori)·丝心蛋白的蛋白质中配合1％或2.5％的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)而制备的膜的未拉伸时的物理特性
试样 A：对照组(未添加) B：T-PolyA 1％ C：T-polyA 2.5％
拉伸强度[MPa] 65.6±4.5 66.5±10.2 69.0±11.2
应变[％] 102.5±17.6 107.4±17.7 78.7±14.3
韧性[MJm-3] 61.1±10.7 63.4±17.7 44.1±6.3
试样 A：对照组(未添加) B：T-PolyA 1％ C：T-polyA 2.5％
拉伸强度[MPa] 65.6±4.5 66.5±10.2 69.0±11.2
应变[％] 102.5±17.6 107.4±17.7 78.7±14.3
韧性[MJm-3] 61.1±10.7 63.4±17.7 44.1±6.3
[0217] (2)使用天然蚕(Bombyx mori)丝丝心蛋白的蛋白质和改造蛛丝心蛋白的蛋白质的复合膜的物理特性的比较对天然蚕丝丝心蛋白(Bombyx.mori fibroin)中配合了5wt％的L-polyAla或1wt％的T-polyAla的复合膜(表3、表5)，以及在改造蛛丝蛋白质中配合10wt％的L-polyAla或1wt％的T-polyAla的复合膜(表4、表6)，进行张力变形测定，并比较了其物理特性。
[0218] 在将5wt％L-polyAla配合在蚕丝丝心蛋白中的情况下，复合膜的应变增加了11.1％，韧性增加了16.9％。另一方面，在改造蛛丝丝心蛋白的蛋白质(ADF Kai-noNR)中添加了1wt％的T-polyAla的情况下，被确认为应变增加了66.8％，韧性增加了133％，其显示出了显著的物理特性的提高。
[0219] 表3应变[％]：蚕·丝丝心蛋白(Bombyx.mori fibroin)
[0220] 表4应变[％]：改造蛛丝丝心蛋白(ADF3 Kai-noNR)
[0221] 表5韧性[MJm-3]：蚕·丝丝心蛋白(Bombyx.mori fibroin)
[0222] 表6-3
韧性[MJm ]：改造蛛丝丝心蛋白(ADF3 Kai-noNR)
韧性[MJm ]：改造蛛丝丝心蛋白(ADF3 Kai-noNR)
[0223] (3)对施加了预拉伸的复合膜的张力变形试验结果在配合5％的远螯型聚丙氨酸(T-polyAla)所制备的复合膜的制备工序中，对进一步负载拉伸率0％、25％、50％、75％或100％的预拉伸而制备的复合膜进行了张力变形试验，并将其结果表示在图6。通过进行预拉伸操作，其与不添加远螯型聚丙氨酸的复合膜相比，其拉伸强度、应变以及韧性显示出更明确地增加(图6)。
[0224] (4)广角X射线衍射(WAXD)的测定结果将以拉伸率100％进行预拉伸以0wt％、1wt％、2.5wt％、5wt％或10wt％的比例配合有L-polyAla或T-polyAla的复合膜而制备的预拉伸复合膜的WAXD的结果分别表示在图7。图
7a表示在添加了L-polyAla情况下的WAXD的变化；图7b表示在添加了T-polyAla情况下的WAXD的变化。
7a表示在添加了L-polyAla情况下的WAXD的变化；图7b表示在添加了T-polyAla情况下的WAXD的变化。
[0225] 仅由蚕丝组成的膜显示出源于基于ADF3的β片层的晶格的(020)、(210)以及(211)晶面的峰。各个晶面间距d分别为0.51nm、0.45nm以及0.37nm。T-polyA、L-polyA也同样表示基于β片层的晶体的峰,但(210)晶面的晶面间隔d为
0.43nm,在这一点上与丝的膜的晶面间隔d不同。
0.43nm,在这一点上与丝的膜的晶面间隔d不同。
[0226] 图7a为作为预拉伸100％的膜之间的比较，改变L-polyAla添加量而进行的测定。随着添加量的增加，基于L-polyA的所有β片层的峰强度增加。若添加量超过5％，聚丙氨酸的(210)晶面的峰不再增加，而丝的(210)晶面的峰强度进一步增加。本结果对起因于L-polyA与丝的序列结构上的相似性，且L-polyAla对丝的晶体结构赋予影响之事进行着启示。可以认为由L-polyAla引发的对丝的晶体生长的促进而与膜的应力的提高有关。
[0227] 在表示添加了T-polyAla的情况下WAXD的变化的图7b中，有关如果增加添加量，则聚丙氨酸的全部的峰强度增加的基于丝的(210)晶面的峰的强度未被确认为有明显的变化。其被认为，由于T-polyAla为远螯型的结构，对丝的β片层几乎不赋予影响。其原因被认为，因为聚丙氨酸单独地形成晶体并分散存在，所以以微少的添加量就能够提高膜的韧性。
[0228] 在以上的结果中,在改造蛛丝蛋白质中配合了5wt％的T-polyAla的复合膜的WAXD，随着T-polyAla或L-polyAla的配合比率的增加,其显示晶体的峰强度也在增加(图7a、图7b)。其原因被认为，T-polyAla或L-polyAla促进了在丝中的β片层晶体增加，由此对物理性质赋予了影响。
实施例2
实施例2
[0229] 复合纤维组合物的制备及其物理特性的评价1.实验材料和方法
以下所记载的试剂以外的试剂和溶剂从和光纯药工业股份有限公司(大阪)购入并加以使用。通过下述方法获得了蛋白质粉末(序列号：17)。在制备纺丝液之前，将蛋白质粉末在真空、100℃条件下干燥了2小时。使用甲酸作为纺丝液的溶剂，用1型台式的纺丝装置(Spiber股份有限公司，山形)且按照所述装置的说明书对进行纺丝。并确认了所纺丝的纤维的直径、拉伸应力、拉伸应变(应变)韧性。用尼康公司制造(东京)ECLIPSE LV100ND对其直径进行了测定。用INSTRON(东京)测定应力和应变率并进行了评价。使用Bluehill软件(INSTRON，东京)对其韧性进行了计算。
以下所记载的试剂以外的试剂和溶剂从和光纯药工业股份有限公司(大阪)购入并加以使用。通过下述方法获得了蛋白质粉末(序列号：17)。在制备纺丝液之前，将蛋白质粉末在真空、100℃条件下干燥了2小时。使用甲酸作为纺丝液的溶剂，用1型台式的纺丝装置(Spiber股份有限公司，山形)且按照所述装置的说明书对进行纺丝。并确认了所纺丝的纤维的直径、拉伸应力、拉伸应变(应变)韧性。用尼康公司制造(东京)ECLIPSE LV100ND对其直径进行了测定。用INSTRON(东京)测定应力和应变率并进行了评价。使用Bluehill软件(INSTRON，东京)对其韧性进行了计算。
[0230] 2.蛛丝蛋白质(PRT799)的制备(编码蛛丝蛋白质的基因的合成和表达载体的构建)
基于络新妇蛛(Nephila clavipes)来源的丝心蛋白(GenBank登录号：P46804.1，GI：
1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计了具有以序列号17所示的氨基酸序列的蛛丝蛋白质(以下，称之为“PRT799”。)。
基于络新妇蛛(Nephila clavipes)来源的丝心蛋白(GenBank登录号：P46804.1，GI：
1174415)的碱基序列和氨基酸序列，设计了具有以序列号17所示的氨基酸序列的蛛丝蛋白质(以下，称之为“PRT799”。)。
[0231] 由序列号17表示的氨基酸序列，相对于His标签被添加在4次重复以序列号15表示的氨基酸序列中存在的20个结构域序列的区域(但，所述区域的C末端侧的数个氨基酸残基已被取代。)的序列的C末端的氨基酸序列，为将以序列号21表示的氨基酸序列(含有His标签)添加在N末端的氨基酸序列。
[0232] 合成了编码所设计的PRT799的核酸。所述核酸，在5’末端添加了NdeI位点和在终止密码子下位添加EcoRI位点。将所述核酸克隆到克隆载体(pUC118)中。然后，在用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理切除后，重组为蛋白质表达载体pET-22b(+)，进而得到了表达载体。
[0233] 通过所得到pET22b(+)表达载体，对大肠杆菌BLR(DE3)进行转化。将所述转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养了15小时。将所述培养液添加到含有氨苄青霉素的100mL的种子培养用培养基(表7)中，使OD600达到0.005。将培养液温度保持在30℃，进行烧瓶培养直至OD600达到5为止约为15小时，得到了种子培养液。
[0234] 表7
[0235] 将所述种子培养液添加到添加有500ml的生产培养基(下述表8)的发酵罐中，使OD600达到0.05。将培养液温度保持在37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[0236] 表8
[0237] 在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1mL/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物)120g/1L)。将培养液温度保持在37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％的同时，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以使终浓度达到1mM，进而诱导表达PRT799。在添加IPTG后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收了菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液所制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的相当于PRT799的大小的条带的出现，确认到了PRT799的表达。
[0238] (蛛丝蛋白质的纯化)将添加IPTG始2小时后回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在含有约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，利用高压均质器(GEA Niro Soavi公司)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。使用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到
100mg/mL的浓度的方式悬浮在8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝集蛋白质(PRT799)。利用冷冻结干燥燥机从已回收的凝集蛋白质除去水分，进而得到PRT799的冷冻结干燥燥粉末。
100mg/mL的浓度的方式悬浮在8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝集蛋白质(PRT799)。利用冷冻结干燥燥机从已回收的凝集蛋白质除去水分，进而得到PRT799的冷冻结干燥燥粉末。
[0239] 在所得到的冷冻结干燥燥粉末中的PRT799的纯化度通过使用Totallab(nonlinear dynamics ltd.)进行图像分析，确认了粉末的聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。其结果，PRT799的纯化度约为85％。
[0240] 将通过上述方法所制备的改造蛛丝蛋白质(PRT799，序列号17)用于下述试验。
[0241] 3.实验方法(1)纺丝液的制备(L-polyAla和T-polyAla未添加)
使用了上述蛋白质粉末。准确地称量3.6g的干燥粉末并将其收集在透明的小玻璃瓶中。将11.1g甲酸加入到小玻璃瓶中，在40℃条件下搅拌过夜，进而得到了透明的深黄色液体。在该纺丝液中的蛋白质浓度为24wt％。
使用了上述蛋白质粉末。准确地称量3.6g的干燥粉末并将其收集在透明的小玻璃瓶中。将11.1g甲酸加入到小玻璃瓶中，在40℃条件下搅拌过夜，进而得到了透明的深黄色液体。在该纺丝液中的蛋白质浓度为24wt％。
[0242] (2)添加了L-polyAla或T-polyAla的纺丝液的制备将0.036g的polyAla(L-polyAla或T-polyAla)(相对于上述蛋白质粉末为1wt％)收集在小玻璃瓶中，加入甲酸(11.364g)，在40℃下搅拌1-2小时进行溶解。在得到透明的液体后，加入了蛋白质粉末(3.6g)，在40℃下剧烈搅拌直至蛋白质粉末完全溶解(通常为8-12小时)。在所述纺丝液中的蛋白质浓度为24wt％。
[0243] (3)纺丝方法使用上述桌上式纺丝装置进行纺丝(参照图4)。其条件如表9和表10所示。在浴槽1中加入100％乙醇的状态下进行纺丝，在浴槽2和浴槽3中加入100％甲醇的状态下进行纺丝，在浴槽4中加入水(自来水)的状态下进行纺丝，在浴槽5、浴槽6中以空白的状态下进行纺丝。
纺丝后的纤维仅在浴槽4中被拉伸。
纺丝后的纤维仅在浴槽4中被拉伸。
[0244] 表9含有polyAla的纺丝液的喷出条件
[0245] 表10含有polyAla的纺丝液的纺丝条件
[0246] (4)复合纤维组合物的物理特性的评价相对于在浴槽拉伸中的喷出速度的拉伸速度的比例为0.6或0.5。将在以各拉伸速度比例且清洗水凝固浴槽中的拉伸速度为7.0倍或7.8倍进行纺丝时的纤维的直径、拉伸强度、应变、韧性以及拉伸应力的标准偏差和拉伸应变(应变)的标准偏差分别表示在表11和表
12。
表11
线速度：0.49m/min
在浴槽拉伸(MeOH)中的拉伸速度比例为0.6，浴槽2和浴槽3(甲醇)的滞留时间：2分20秒
表12
线速度：0.49m/min
在浴槽拉伸(MeOH)中的拉伸速度比例为0.5，浴槽2和浴槽3(甲醇)的滞留时间：2分55秒
12。
表11
线速度：0.49m/min
在浴槽拉伸(MeOH)中的拉伸速度比例为0.6，浴槽2和浴槽3(甲醇)的滞留时间：2分20秒
表12
线速度：0.49m/min
在浴槽拉伸(MeOH)中的拉伸速度比例为0.5，浴槽2和浴槽3(甲醇)的滞留时间：2分55秒
[0247] 浴槽拉伸中的拉伸速度比例(纤维的拉伸速度/纺丝液喷出速度)越小其凝集时间越长,进而纤维的凝集越强。上述结果表明,在拉伸速度比例为0.6和0.5的任一种中分别配合了1％的L-polyAla或T-polyAla的复合纤维，其拉伸强度、应变及韧性都得以提高。另外，在清洗水中的拉伸速度为7.8倍的情况下，在表11和12中的任一的不添加polyAla的对照组中，在纺丝过程中纤维断裂。这些结果表明，通过在丝心来源的蛋白质中配合L-polyAla或T-polyAla，其能够提高复合纤维的物理特性。
[0248] ＜总结＞上述所确认的结果其显示出，无论是对天然丝心蛋白质或还是通过被人工改造所制备的丝心蛋白来源的蛋白质，通过配合具有β片层结构的L-poyAla或T-polyAla等的多肽或聚氨基酸来制备复合成型组合物，能够提高拉伸张力、最大拉伸极限率以及韧性等的物理特性。另外，所述复合成型组合物的物理特性的提高其显示出，根据所使用的丝心蛋白来源的蛋白质的种类，其得到优选的特性的原因在于，具有β片层结构的多肽或聚氨基酸的种类不同。进一步，对于拉伸张力、最大拉伸极限率和韧性等的各种物理特性，也显示出其得到优选的特性原因在于，其各自的配合量不同。
[0249] 本结果显示出，根据复合成型组合物所需的特性，通过改变所使用的原料以及配合量，进而能够获得物理特性得以提高的复合成型组合物。
[0250] 另外，除了由天然氨基酸构成的多肽或聚氨基酸以外，还可通过将除这些天然氨基酸来源以外的具有β片层结构的聚合物配合在丝心蛋白来源的蛋白质中，进而用于本发明的复合成型组合物的制备。
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