技术领域
[0001] 本
发明属于传感器领域，涉及一种电化学发光传感器。
背景技术
[0002] 急性心肌梗死是目前世界上最常见的
疾病死亡原因之一。针对高发病率和高死亡率急性心肌梗死对快速、灵敏、低成本体外诊断技术的迫切需求，急需开展无标记纳米化学发光新一代体外诊断技术及其在急性心肌梗死快速诊断中的应用研究,发展高敏感性、高特异性的急性心肌梗死快速诊断新方法。对于
指定免疫对的免疫分析法，因免疫体系具有优良的特异识别特性而呈现出极好的选择性，故提高免疫分析的灵敏度已成为创新免疫分析法的关键切入点。因免疫检测对象(如
蛋白质)大都没有显著分析
信号的直接输出，
纳米材料的应用已成为免疫分析中的重要策略。迄今为止，纳米材料如金、
银等金属纳米材料、金属硫化物(或金属硒化物、金属碲化物)等
量子点(QDs)、金属
氧化物纳米材料、纳米
硅和纳米
碳具有独特的光学、电学、电化学、催化和
力学性质，用于电化学发光免疫分析亦可得到高敏的免疫信号输出。而金属有机
框架(MOFs)材料是由中心
金属离子和有机配体自行组装而成的一类新型类沸石多孔材料，因此可以通过设计特定结构的有机配体与不同的中心金属离子进行配位，从而构筑多种结构新颖的功能化合物。作为一种绿色环保、结构易于设计控制、功能多样化、来源广泛的新型多孔材料，由于其具有独特的光、电、磁、催化和
吸附等性能，使其显示出了诱人的应用前景，并在电化学发光免疫分析中得到实际应用。例如，Yuan等合成了N-(4-
氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺修饰的MOFs作为电化学发光指示剂标记于二抗上，在玻璃碳
电极上构建了夹心型的免疫传感器，实现了人
乳腺癌细胞中粘蛋白的超灵敏检测。类似地，钌复合物修饰的MOFs既可用于体内外标记、
生物光分析和生物光学成像，亦可用于电化学发光免疫分析。例如，Yin等将钌复合物功能化的MOFs与氧化
石墨烯混合滴涂于玻璃碳电极表面，进行电化学和电化学发光检测。然而，以往利用这些发光
试剂合成的MOFs修饰的
生物传感器通常采用先合成功能化的MOFs标记物再修饰于电极表面进行电化学发光分析的策略，这样，不可避免的复杂操作限制了电化学发光免疫分析在急性心肌梗死对快速、灵敏的体外诊断技术的迫切需求，溶液的更换也加大了实验操作的繁复性。
发明内容
[0003] 本发明的目的是提供一种电化学发光传感器。
[0004] 本发明要求保护一种的电化学发光传感器，也即由发光化合物修饰的金属有机框架薄层电极，其由电极和位于所述电极表面的发光化合物修饰的金属有机框架薄层组成。
[0005] 上述发光化合物修饰的金属有机框架薄层电极中，所述电极为玻碳电极、碳糊电极、碳电极、碳
纤维电极或ITO导电玻璃。
[0006] 所述发光化合物为三联吡啶钌和三联吡啶钌衍生物中的至少一种；
[0007] 所述金属有机框架薄层由金属盐和均苯三酸经
电沉积法制得；
[0008] 所述金属盐具体为锌盐或
铜盐；所述锌盐更具体为
硝酸锌、
醋酸锌或氯化锌。
[0009] 所述发光化合物修饰的金属有机框架薄层电极可由下述本发明提供的方法制得。
[0010] 本发明提供的制备所述三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极的方法，包括如下步骤：
[0011] 利用原位电沉积法对
工作电极进行电沉积，得到所述三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极；
[0012] 所用工作电极为玻碳电极、碳糊电极、碳电极、
碳纤维电极或ITO导电玻璃；
[0013] 所用反应液中含有发光化合物、形成金属有机框架薄层的配体、支持
电解质和
水；
[0014] 所述发光化合物具体为三联吡啶钌和三联吡啶钌衍生物中的至少一种；
[0015] 所述形成金属有机框架的配体为锌盐和均苯三酸；所述锌盐具体为硝酸锌、醋酸锌或氯化锌；
[0016] 所述支持
电解质选自硝酸
钾、硝酸钠、
氯化钠和
硫酸钾中的至少一种。
[0017] 上述方法中，所述反应液由锌盐的水溶液、三联吡啶钌的水溶液、均苯三酸的
乙醇溶液和硝酸钾组成；该反应液可由如下方法制得：将组成反应液的各物质混匀后，在室温下剧烈搅拌；所述搅拌的时间具体可为2.5-3.5小时，更具体可为3小时；
[0018] 所述工作电极的电极半径为1-5mm，具体为3mm。
[0019] 所述锌盐的水溶液的浓度为0.1mg/mL～1.8g/mL，具体为0.089g/mL；
[0020] 所述三联吡啶钌的水溶液的浓度为1mmol/L～0.1mol/L；
[0021] 所述均苯三酸的乙醇溶液的浓度为1mg/mL～3.5g/mL，具体为0.035g/mL；
[0022] 所述锌盐的水溶液、三联吡啶钌的水溶液、均苯三酸的乙醇溶液和硝酸钾的用量比为3mL：100μL：3mL：0.0303g。
[0024] 具体的，所述三电极系统中，所用
对电极为铂片电极；所用参比电极为饱和甘汞电极。
[0025] 所述电沉积步骤中，负电位为0V(vs.SCE)～-2.0V(vs.SCE)；“vs.SCE”意为相对于饱和甘汞电极的电位；
[0026] 电沉积时间为1-10800s，具体为1500s。
[0027] 所述方法还可包括如下步骤：
[0028] 在所述电化学沉积步骤之前，将金属有机框架薄层电极按照常规方法进行清洗；具体可为按照如下方法进行清洗：将金属有机框架薄层电极先后在0.5和0.05μm的氧化
铝悬浊液中打磨
抛光处理，再用超纯水充分地冲洗电极表面，接下来分别在超纯水、乙醇、超纯水中各超声5min以除去电极表面残留的氧化铝粉末；然后，在电极表面滴加浓H2SO4洗液并保持15s，用超纯水冲洗；最后用电化学清洗以彻底除
去污染物，再用大量超纯水冲洗后，氮气吹干。
[0029] 另外，所述三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极在电化学发光免疫分析或光电催化中的应用及所述在检测急性心肌梗死标志物中的应用，也属于本发明的保护范围。其中，所述急性心肌梗死标志物具体可为心型
脂肪酸结合蛋白；
[0030] 所述检测步骤中，所用电极系统为三电极系统；
[0031] 工作电极为所述免疫修饰的所述三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极；免疫修饰的方法为常规方法。
[0032] 对电极为铂丝；
[0033] 参比电极为Ag/AgCl电极；
[0034] 电解液为含有0.1mol/L三乙醇胺的0.1mol/L
磷酸缓冲液，pH值为7.0；
[0035] 扫描区间为0V～1.35V(vs.Ag/AgCl)，
光电倍增管PMT设置为800V。
[0036] 本发明利用电化学沉积法构建了一种新型的如三联吡啶钌等发光化合物修饰的金属有机框架薄层电极。本发明采用三电极系统，在电解池中加入所需反应液，在工作电极上施加负电位，电解池就发生电化学反应，在电极表面原位电生成氢氧根离子，激活中性配体去质子化，调控金属有机框架晶体薄层的生长。由于带负电的均苯三酸配体和带正电荷的三联吡啶钌离子的静电吸引作用，将三联吡啶钌等发光化合物分子带入到金属有机框架的晶体中，从而用一步原位电沉积法获得了三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极。将这种修饰电极用于无标记的电化学发光免疫分析，间接了实现样品中目标分析物的定量分析，使得电化学发光方法可以检测低至fg/mL水平的蛋白质。与
现有技术相比，本发明方法简单、成本低，且能够检测极低浓度的急性心肌梗死标志物(心型脂肪酸结合蛋白，FABP)，可用于基于生物亲和的单目标分析物检测与多目标分析物多通道检测。在研究基于三联吡啶钌的电化学发光以及光电催化等方面具有巨大的应用前景。
附图说明
[0037] 图1为
实施例1的(常规)电化学沉积法构建新型的三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层装置示意图，其中1-电化学工作站，2-溶液，3-工作电极，4-对电极，5-参比电极，6-三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极。
[0038] 图2为实施例1的免疫反应示意图。研究体系是心型脂肪酸结合蛋白在修饰电极上的免疫反应。
[0040] 图4为实施例1的标准曲线图。
具体实施方式
[0041] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
[0042] 实施例1、
[0043] (1)电沉积液的制备：将0.266g的硝酸锌溶于3mL水中，再加入0.0303g的硝酸钾作为支持电解质。将0.105g均苯三酸溶于3mL乙醇中，加入到硝酸锌水溶液中，混合均匀后加入100μL 0.1M的三联吡啶钌水溶液，室温下剧烈搅拌3小时。
[0044] (2)修饰电极的制备：玻碳电极(GCE)先后在0.5和0.05μm的氧化铝悬浊液中打磨抛光处理，再用超纯水充分地冲洗电极表面，接下来分别在超纯水、乙醇、超纯水中各超声5min以除去电极表面残留的氧化铝粉末；然后，在电极表面滴加浓H2SO4洗液并保持15s，用超纯水冲洗；最后用电化学清洗以彻底除去污染物，再用大量水冲洗后，氮气吹干。
[0045] 电化学清洗步骤为：在10mL 0.50mol/L H2SO4中以-1.0V到1.0V以0.1V/s的扫速循环伏安扫描至稳定。处理好的玻碳电极用大量水冲洗，然后用氮气吹干。
[0046] 将电极置于上述(1)中的电沉积液中，在-1.3V下电沉积1500s(vs.SCE(饱和甘汞电极))。然后用二次水清洗，得到三联吡啶钌修饰的金属有机框架薄层电极(Ru-MOFs/GCE)。
[0047] (3)制备无标记的免疫电极。将3.0μL 0.5％的壳聚糖(CS)滴于MOFs修饰的玻璃碳电极(Ru-MOFs/GCE)上，干燥后滴加6μL 2.5％的戊二
醛(GA)反应2h，然后滴加迅速将6.0μL含有1.0mg/mL一抗(Ab1)的PBS溶液滴至GA-CS/Ru-MOFs/GCE电极上，
冰箱(4℃)保存、过夜，以保证
抗体在电极表面的饱和吸附，得到Ab1/GA-CS/Ru-MOFs/GCE修饰电极。将电极依次用PBS溶液清洗、吹干后，将6.0μL含有3％BSA的PBS溶液滴至电极上，4℃保持1h以封闭非特异性吸附位点，得到BSA/Ab1/GA-CS/Ru-MOFs/GCE修饰电极。未使用时，电极保存在4℃的PBS中。
[0048] 将制备好的BSA/Ab1/GA-CS/Ru-MOFs/GCE修饰电极，滴加6.0μL含有150fg/mL、15fg/mL、1.5fg/mL、1.5pg/mL、15pg/mL、150pg/mL、1.5ng/mL、15ng/mL或150ng/mL不同浓度
抗原(FABP，人心型脂肪酸结合蛋白)的PBS，在37℃下温育1h，然后用PBS溶液清洗电极表面，得到FABP/BSA/Ab1/GA-CS/Ru-MOFs/GCE修饰电极。(Ab1、Ab2为抗人心型脂肪酸结合蛋白)。
[0049] (4)电化学发光检测过程。采用三电极系统(工作电极为上述(3)中制备好的免疫电极，对电极为铂丝，参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl))，将500μL含有0.1mol/L三乙醇胺的0.1mol/L磷酸缓冲液(pH＝7.0)加至电解池。检测条件为：扫描区间为0V～1.35V(vs.Ag/AgCl)，光电倍增管PMT设置为800V。获得该工作电极上的电化学发光信号，从而间接实现样品中目标分析物FABP的定量分析。
[0050] 上述电化学沉积装置如图1所示，免疫反应过程如图2所示。所得电化学发光信号如图3所示，由图可知，随着抗原浓度增加，电化学发光响应也随之降低；本发明中电化学发光强度与抗原浓度线性范围为150fg/mL～150ng/mL，
检测限为2.6fg/mL(
信噪比为3)。本发明方法线性范围宽，检测限低。
