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基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法

阅读：792发布：2020-05-12

专利汇可以提供基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法，所述miR-100的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，所述miR-100的DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。利用DSN酶实现等温扩增同时利用电化学技术监测电流信号的变化，不需要提取RNA及其反转录等复杂的步骤直接检测血清样品中miR-100含量。本发明方法能够快速准确的检测血清样品中miR-100的含量。利用电化学的高灵敏检测方法实现对血液中的miRNA直接进行检测，该方法最短只需30min的反应时长明显缩短了反应时间，是一种快速、高效、高敏感性的血清中miR-100检测方法。，下面是基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于电化学检测人血清中miR-100的探针，其特征在于，所述miR-100的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’，所述miR-100的互补配对DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示：5’-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-SH-(CH2)6-3’。
2.根据权利要求1所述的一种基于电化学检测人血清中miR-100的探针，其特征在于，所述DNA探针第18，21位碱基经过锁核酸修饰及3端经过SH和-(CH2)6修饰。
3.根据权利要求1所述的一种基于电化学检测人血清中miR-100的探针，其特征在于，所述miR-100单碱基错配的核苷酸序列为：5’-AACCCGUAGACCCGAACUUGUG-3’,所述miR-100碱基完全错配的核苷酸序列为：5’-TTGGGCTUCUGGGCUUGAACAC-3’。
4.利用权利要求1所述的探针检测人血清中miR-100含量的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将DNA探针通过Au-S键连接在纳米金修饰金电极表面，采用电流计时法和循环伏安法将金电极表面修饰上纳米金；
(2)采用DNS酶实现短时等温扩增反应，进而实现信号放大，DSN特异性剪切DNA-RNA中的DNA单链暴露出更多的电极反应表面进而提高电流反应，循环RNA继续结合DNA从而实现信号放大；
(3)将待测样品稀释10倍后，加入10μL反应缓冲液，在37℃条件下反应1h，采用DPV法检测电流值；
(4)采用绝对定量的方法，将步骤(3)中待测样品改为Rnasefree water稀释的miR-100标准品溶液进行电化学分析测试，根据含反应液中miR-100标准品的浓度对应的电流值，得到miR-100含量与电流值的线性关系，绘制成浓度与电流值之间的标准曲线，根据待测样品电流，检测出血清中miR-100的含量。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应缓冲液包含2μL 10×DSN反应缓冲液，
0.5μL RNAse抑制剂，0.2μL DSN酶，7.3μL Rnasefree water。

说明书全文

基于电化学检测人血清中miR-100的探针及方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术，涉及人血清中miR-100的检测，尤其涉及基于电化学检测人血清中miR-100的DNA探针及方法。

背景技术

[0002] 非编码小RNA(miRNAs)由于表达量低，目前主要是通过荧光定量PCR的方法进行miRNA的检测，该方法虽然可以达到检测量的需求，但是存在检测过程复杂、成本较高等问题，因此，需建立一种简单、快速地检测人血清中miR-100的方法。

发明内容

[0003] 本发明目的是提供一种基于电化学检测人血清中miR-100的DNA探针，所述探针第18，21位经过锁核酸修饰及3端SH和-(CH2)6修饰。

[0004] 所述miR-100的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示：5’-AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG-3’，

[0005] 所述电化学检测人血清中miR-100的互补配对DNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示：5’-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-SH-(CH2)6-3’。

[0006] 所述DNA探针第18，21位碱基经过锁核酸化修饰以提高结合特异性。

[0007] 所述DNA探针在序列3端经过SH和-(CH2)6修饰以将探针连接到纳米金修饰电极上。

[0008] 所述miR-100单碱基错配的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示：5’-AACCCGUAGACCCGAACUUGUG-3’。

[0009] 所述miR-100碱基完全错配的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示：5’-TTGGGCTUCUGGGCUUGAACAC-3’。

[0010] 本发明的另一个目的是提供一种探针检测人血清中miR-100含量的方法，所述方法通过以下步骤实现：

[0011] (1)将DNA探针通过Au-S键连接在纳米金修饰金电极表面(采用电流计时法和循环伏安法将金电极表面修饰上纳米金，相比单独的金电极可以提高DNA探针的负载量进而进一步提高检测灵敏度)；

[0012] (2)采用DNS酶实现短时等温扩增反应，进而实现信号放大(DSN可以特异性剪切DNA-RNA中的DNA单链暴露出更多的电极反应表面进而提高电流反应，循环RNA继续结合DNA从而实现信号放大)；

[0013] (3)将待测样品稀释10倍后(1μL血液加入9μL Rnasefree water)，加入10μL反应缓冲液(包含2μL 10×DSN反应缓冲液，0.5μL RNAse抑制剂，0.2μL DSN酶，7.3μL Rnasefree water)，在37℃条件下反应1h，采用DPV法检测电流值；

[0014] (4)采用绝对定量的方法，将步骤(3)中待测样品改为Rnasefree water稀释的miR-100标准品溶液进行电化学分析测试，根据含反应液中miR-100标准品的浓度对应的电流值，得到miR-100含量与电流值的线性关系，绘制成浓度与电流值之间的标准曲线；根据待测样品电流，即可检测出人血清中miR-100的含量。

[0015] 待测样品为人血清。为了缩短血清与血细胞的接触时间，以避免由此而影响结果的准确性，血液标本收集后，必须尽可能早地将血清从全血中分离出来。一般应于采血后2小时内分离出血清(1200×g，离心时间为10min)分装后储存于-80℃。如果短时间内不能分离血清，全血标本可以在4℃冷藏条件下保存24小时，但要防止反复冻融。在处理过程中必须注意防止溶血。

[0016] 本发明的有益效果主要体现在：本方法与现有的检测方法相比，例如在实现荧光定量PCR中，由于血液中miR-100含量检测之前需要提前提取RNA，之后将RNA进行反转录成DNA,才可以进行实时荧光定量，此过程操作繁琐、成本高、耗时较长，另一方面，定量反应需要特定的仪器，进行升温和降温等复杂的循环过程。因此进行miRNA含量的检测十分的不便，本发明针对以上检测中存在的问题，设计一种纳米金修饰的金电极，利用电化学的高灵敏检测方法实现对血液中的miRNA直接进行检测，该方法最短只需30min的反应时长明显缩短了反应时间，是一种快速、高效、高敏感性的血清中miR-100检测方法。另一方面可以直接对血液中的miRNA进行检测，不需要提取RNA反转录cDNA等复杂的步骤，实现简便检测的操作。另外，我们通过引入DSN酶实现等温循环信号放大达到检测的目的，整个过程在37℃恒温中进行，只需要一台电化学检测仪器，该发明为miRNA的研究提供了便利。本发明利用电化学方法检测血清样品中miR-100含量，本发明方法能够快速准确的检测血清样品中miR-100的含量。
附图说明

[0017] 图1为本方法的特异性检测血清中miR-100的结果图。

[0018] 图2为标准曲线。

[0019] 图3是利用本发明引物检测正常血清中miR-100含量的结果图。

[0020] 图4是利用本发明引物检测术前血清中miR-100含量的结果图。

具体实施方式

[0021] 下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

[0022] 实施例1：

[0023] 根据碱基互补配对原则，设计出了与miRNA-100互补的DNA探针。

[0024] SEQ ID No：1：5’-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-SH-(CH2)6-3’。

[0025] 所述DNA探针中加粗划线为第18，21位碱基经过锁核酸化修饰以提高结合特异性。

[0026] 所述DNA探针3端经过SH-(CH2)6修饰以便将探针连接到纳米金修饰电极上。

[0027] miRNA-100互补的DNA探针验证

[0028] 设计单碱基错配、完全错配及完全互补的miR-100，将设计的miR-100标准品稀释适当的倍数后，加入10μL反应缓冲液(包含2μL 10×DSN反应缓冲液，0.5μL RNAse抑制剂，0.2μL DSN酶，7.3μL Rnasefree水)，在37℃条件下反应1h，采用DPV法检测电流值。

[0029] 结果见图1所示，从电流结果来看，单碱基错配、完全错配相比完全互补的miR-100的电流值明显减小，说明探针与miR-100之间的结合具有明显的特异性，DSN可以有效的识别单碱基错配。

[0030] 实施例2标准曲线

[0031] 将miR-100标准品用Rnasefree水配制成10-1、100、101、102、103、104fM的mi-100标准品溶液(10μL)，加入10μL反应缓冲液(包含2μL 10×DSN反应缓冲液，0.5μL RNAse抑制剂，0.2μL DSN酶，7.3μL Rnasefree water)，在37℃条件下反应1h，采用DPV法检测电流值。根据含反应液中miR-100标准品的浓度对应的电流值，绘制成浓度对数值与电流值之间的标准曲线；根据待测样品电流，即可检测出miR-100的含量。结果见图2所示。

[0032] I＝0.5568logC+1.258，c为miR-100标准品溶液中miR-100含量,I是电流峰值。

[0033] 实施例3待测样品的检测方法

[0034] 待测样品：血清

[0035] (1)将血液样品稀释10倍后(1μL血液加入9μL Rnasefree water)，加入10μL反应缓冲液(包含2μL 10×DSN反应缓冲液，0.5μL RNAse抑制剂，0.2μL DSN酶，7.3μL Rnasefree water)，在37℃条件下反应1h，采用DPV法检测电流值。

[0036] (2)依据实施例2制作的标准曲线；根据待测血清样品电流值，即可检测出miR-100的含量，结果见图3、4。

[0037] 为了缩短血清与血细胞的接触时间，以避免由此而影响结果的准确性，血液标本收集后，必须尽可能早地将血清从全血中分离出来。一般应于采血后2小时内分离出血清(1200×g，离心时间为10min)分装后储存于-80℃。如果短时间内不能分离血清，全血标本可以在4℃冷藏条件下保存24小时，但要防止反复冻融。在处理过程中必须注意防止溶血。

[0038] 图4是术前血清中miR-100含量＞5fM的共40例，miR-100含量＜5的共4例，图3正常血清40例中miR-100含量＞5fM没有，全部小于5fM。MiR-100作为指标的特异性为100％(40/40)，敏感性为92.5％(37/40)。以上这些结论是用本发明的设计的DNA探针做出来的结果，与现有的方法相比，可以快速、便捷、高特异性、高灵敏性地检测血清中miR-100的表达量，与已有的成熟的实时荧光定量PCR的结果对比，和本实验的设计的方法得出结论相一致，为精确检测血清中miR-100奠定基础。

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