技术领域
[0001] 本
发明涉及电化学分析技术领域，具体涉及一种用于检测雌二醇的电化学传感器及其制备方法和应用。
背景技术
[0002] 雌二醇(Estradiol)
别名求偶二醇，化学式为C18H24O2。它是一种类固醇雌，具有内分泌干扰效应，能够促进动物的成长以及提高禽畜的瘦肉比，在禽畜养殖业的应用较为广泛。因此，通过食物链可影响人体内雌二醇含量，进而影响人体健康。有证据表明，某些
疾病如
乳腺癌和
前列腺癌与雌二醇的摄入有关；过量的雌二醇还能降低男性的生育能
力，并能产生严重的先天性畸形
患儿。此外，雌二醇及其衍
生物也有着广泛的药理作用。临床上，药物的
质量和使用量是患者和医疗工作者都非常关心的问题。因此，开展对雌二醇的定量检测在医疗研究、禽畜养殖和环境监测等方面有着重要作用。
[0003] 目前，报道的关于雌二醇的定量检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法、酶联
免疫吸附法、
荧光免疫分析法和悬浮阵列技术等方法。这些测定方法往往需要多个样品制备步骤，包括提取和清理程序；有些技术还会产生含有
有机溶剂的废液，这导致环境污染且检测程序复杂、成本昂贵，不利于连续的原位分析。电化学方法具有仪器廉价、操作简易、可自动化以及准确度较高等众多优点。雌二醇分子中存在着具有不可逆
氧化性的酚基，使得采用电化学方法测定雌二醇成为可能。文献报道雌二醇在裸
电极上的检出限为1×10-5mol/L(Salci B等,Pharm Biomed Anal,2002,28:753)，说明雌二醇在裸电极表面
电流响应较低，利用
纳米材料对电极表面进行改性修饰，可增加雌二醇电化学响应。如有文献公开了Pt/多壁
碳纳米管(检测范围为5×10-7～1.5×10-5mol/L，检出限为1.8×10-7mol/L；Lin XQ等,Biosens Bioelectron,2006,22:253-259)、
石墨烯/双十六烷基
磷酸(检测范围为4.0×10-7～2.0×10-5mol/L，检出限为7.7×10-8mol/L；Janegitz BC等,Mater Sci Eng C,
2014,37:14-19)修饰电极制备雌二醇电化学传感器，其检测范围和检出限虽有所改善，但都还有进一步提升的空间。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是，提供一种检出限低、检测范围宽的用于检测雌二醇的化学修饰电极以及传感器。
[0005] 本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：
[0006] 一种用于检测雌二醇的化学修饰电极的制备方法，包含如下步骤：
[0007] (1)取氧化
石墨烯用
水分散得氧化石墨烯分散液，然后调节氧化石墨烯分散液的pH值至9～11；再加入肼在80～100℃下反应；反应结束后分离、纯化后得氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)；
[0008] (2)取氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)用水分散，得溶液1；取PdCl2用水分散，得溶液2；取NaBH4用水溶解，形成溶液3；
[0009] (3)将溶液2和溶液3分别逐滴加入溶液1中，随后静置30min以上，离心、纯化后得钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)；
[0010] (4)将钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)修饰在
工作电极表面，得用于检测雌二醇的化学修饰电极(又称Pd/N-RGO修饰电极)。
[0011] 优选地，步骤(1)中氧化石墨烯与水的用量比为50mg：40～80mL；氧化石墨烯与肼的用量比为50mL：0.8～1.5mL。
[0012] 更优选地，步骤(1)中氧化石墨烯与水的用量比为50mg：50～60mL；氧化石墨烯与肼的用量比为50mL：1～1.5mL。
[0013] 优选地，步骤(1)中氧化石墨烯分散液的pH值至9.5～10.5；加入肼在80～100℃下反应10～20h。
[0014] 更优选地，步骤(1)中氧化石墨烯分散液的pH值至10～10.5；加入肼在80～90℃下反应12～16h。
[0015] 优选地，步骤(2)中氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)与水的用量比为5mg：4～8mL；PdCl2和水用量比为2mg：1～2mL；NaBH4和水的用量比为10mg：1～2mL。
[0016] 更优选地，步骤(2)中氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)与水的用量比为5mg：5～8mL；PdCl2和水用量比为2mg：1～1.5mL；NaBH4和水的用量比为10mg：1～1.5mL。
[0017] 优选地，步骤(3)中将溶液2和溶液3分别逐滴加入溶液1中，加入用时控制为20～40min。
[0018] 更优选地，步骤(3)中将溶液2和溶液3分别逐滴加入溶液1中，加入用时控制为30～40min；步骤(3)中静置时间为1～2h。
[0019] 优选地，步骤(4)中将钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)修饰在工作电极表面的具体方法为：取钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)用N,N-二甲基甲酰胺超声分散，然后涂覆在工作电极的表面，在红外灯下烤干得用于检测雌二醇的化学修饰电极(又称Pd/N-RGO电极)；其中取钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)和N,N-二甲基甲酰胺的用量比为2mg：4～6mL；所述的工作电极为玻碳电极。
[0020] 对于使用纳米
复合材料制备测定具体某种化学物质成分含量的电极，则需要
发明人根据具体待测定的化学物质的性质制备不同的纳米复合材料。制备出的电极对所要测定物质的检出限、检测范围、灵敏度、
稳定性和抗干扰性等效果的好坏主要由纳米复合材料的制备方法决定。纳米复合材料的制备方法主要包括原材料的选择、原材料的配比，以及各个步骤反应条件等。对于用作电极的纳米复合材料，其制备方法中原材料的选择、配比以及各个步骤反应条件的不同都会导致后续制备得到的电极电化学性能的巨大差异，从而导致检出限、灵敏度、稳定性和抗干扰性等效果的巨大差异。
[0021] 根据雌二醇的特性，为得到具有低检出限的雌二醇检测电极，本发明发明人通过大量的实验，不断调整原料组成、配比以及制备过程中的工艺参数；制备得氮掺杂还原氧化石墨烯，并进一步将粒径为50～200nm的Pd
纳米粒子锚钉在氮掺杂还原氧化石墨烯
片层上，该工艺也成功克服了石墨烯片层容易团聚的现象，使得制备得到的Pd/N-RGO修饰电极具有优异的电化学响应性能，可以显著改善雌二醇的检出限和检测范围，以及提高检测的灵敏度、稳定性与抗干扰性。
[0022] 一种由上述制备方法制备得到的用于检测雌二醇的化学修饰电极。
[0023] 本发明还提供一种用于检测雌二醇的电化学传感器，其以上述用于检测雌二醇的化学修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag-AgCl电极为参比电极构成三电极体系，将三电极体系组装后与电化学工作站相连构成电化学传感器。
[0024] 本发明还提供一种应用电化学传感器定量检测雌二醇的方法，其使用上述电化学传感器，用差分脉冲
伏安法检测样品中的雌二醇含量。
[0025] 优选地，所述的定量检测雌二醇的方法，包含如下步骤：
[0026] 配置待测样品溶液；
[0027] 使用上述电化学传感器，用差分脉冲伏安法测定待测样品溶液中雌二醇的氧化峰电流值，根据线性方程换算出雌二醇浓度，进而得出样品中雌二醇的含量；
[0028] 所述线性方程为ip(μA)＝0.1391c(μmol/L)+1.3266(R2＝0.9965)和ip(μA)＝0.01602c(μmol/L)+4.7126(R2＝0.9978)，方程中c为雌二醇浓度，ip为差分脉冲伏安法得到氧化峰电流值；
[0029] 所述的差分脉冲伏安法的检测条件为以pH为7.0的磷酸缓冲液为底液，富集时间为100s；所述的差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。
[0030] 有益效果：(1)本发明提供了一种全新的用于雌二醇定量检测的化学修饰电极以及电化学传感器，该电极或传感器对雌二醇具有优异的电催化活性；(2)所述的用于雌二醇定量检测的化学修饰电极或电化学传感器具有较低的检出限(
实施例表明其检出限为1.8×10-9mol/L，低于
现有技术中的1×10-5mol/L、1.8×10-7mol/L和7.7×10-8mol/L)以及较宽的检测范围(实施例表明其检测范围为1.0×10-7～4.0×10-4mol/L，宽于现有技术中的5×10-7～1.5×10-5mol/L、4.0×10-7～2.0×10-5mol/L)以及良好的稳定性、抗干扰性和重现性；(3)基于本发明构建的雌二醇电化学传感器操作简单、成本低廉，在医疗研究、禽畜养殖和环境监测等方面有着重要作用。
附图说明
[0031] 图1为本发明所述的N-RGO(A)和Pd/N-RGO(B)的扫描电镜图。
[0032] 图2为本发明所述的N-RGO(A)和Pd/N-RGO(B)的红外
光谱图。
[0033] 图3为本发明所述的Pd/N-RGO的能谱图。
[0034] 图4为玻碳电极(a)、GO/玻碳电极(b)、N-RGO/玻碳电极(c)和本发明所述的Pd/N-RGO修饰电极(d)在5.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1mol/L KCl底液中的循环
伏安图。
[0035] 图5为玻碳电极(a)、GO/玻碳电极(b)、N-RGO/玻碳电极(c)和本发明所述的Pd/N-RGO修饰电极(d)在1.0mmol/L雌二醇溶液中的差分脉冲伏安图。
[0036] 图6为不同浓度的雌二醇在Pd/N-RGO修饰电极上的差分脉冲伏安图和雌二醇浓度与其氧化峰电流值之间的线性关系图。
具体实施方式
[0037] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
[0038] 实施例1钯-氮掺杂还原氧化石墨烯(Pd/N-RGO)的制备
[0039] (1)利用湿化学法合成氮掺杂还原氧化石墨烯(N-RGO)：将50mg氧化石墨烯加入50mL水，超声10min后用
氨水将分散液的pH值调到10，再加入1mL肼后于85℃下反应15h；反应结束后将产品离心分离、水洗至产品的pH呈中性后再次离心分离，随后将产品于60℃下烘干得到N-RGO；
[0040] (2)取5mg N-RGO在5mg水中超声15min，形成溶液1；取2mg PdCl2加入1mL水超声分散5min配成溶液2；取10mg NaBH4并加1mL水搅拌溶解，形成溶液3；
[0041] (3)在磁力搅拌的条件下，将溶液2和溶液3分别逐滴加入溶液1中，加入用时控制为30min，随后静置1h后离心分离，用
乙醇和水洗涤后再次离心分离、烘干后得到Pd/N-RGO。
[0042] 图1显示步骤(1)和步骤(3)制备分别得到的N-RGO(A)和Pd/N-RGO(B)的扫描电镜图。从图1A可见，N-RGO具有石墨烯典型的褶皱状结构，且片层边缘无序扭曲现象明显，这是因为氮
原子掺杂进氧化石墨烯后引起的。从图1B可见，小尺寸的类似立方结构的Pd纳米颗粒负载在N-RGO片层上，负载的Pd纳米粒子粒径在50–200nm之间，说明Pd/N-RGO被成功制备。纳米颗粒尺寸小且无明显团聚现象，有利于提高Pd/N-RGO材料修饰电极的
比表面积和电催化活性。图2显示步骤(1)和步骤(3)分别得到的N-RGO(A)和Pd/N-RGO(B)的红外光谱图。对比图2的(A)和(B)图发现而其大部分特征峰相近，但(B)图在470cm-1附近出现一个明-1 -1显的Pd特征峰，同时由于Pd的加入在1463cm 和839cm 处出现了新的强峰，这进一步说明了Pd成功负载在N-RGO上。图3显示了Pd/N-RGO的能谱图，从图中可见复合材料中含有C、O、Pd等元素。另外，Na、Cl、K等元素是样品合成过程中通过反应的原料引进的，它们的存在不影响材料的使用性能。
[0043] 实施例2用于检测雌二醇的化学修饰电极的制备
[0044] 取实施例1制备得到的Pd/N-RGO 2mg，在5mL N,N-二甲基甲酰胺超声10min后，利用微量加样器涂覆在工作电极的表面，在红外灯下烤干得用于检测雌二醇的化学修饰电极(又称Pd/N-RGO修饰电极)。
[0045] 以本实施例制备得到的用于检测雌二醇的化学修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag-AgCl电极为参比电极构成三电极体系，并将三电极体系组装后与电化学工作站相连用于测试所述电极的如下性能。
[0046] 为了便于对比，参照本实施例所述的方法，制备GO/玻碳电极以及N-RGO/玻碳电极。
[0048] 分别以玻碳电极(a)、GO/玻碳电极(b)、N-RGO/玻碳电极(c)和实施例2制备得到的Pd/N-RGO修饰电极(d)为工作电极在5.0mmol/L K3[Fe(CN)6]混合了0.1mol/L KCl的底液中进行循环伏安测试，测试条件为：扫描范围-0.2～0.6V、扫速0.05V/s，测试结果如图4。从图3-
4可见[Fe(CN)6] 探针离子在上述四种工作电极上出现明显的氧化还原峰，氧化峰电流分别为15.5μA、7.7μA、38.6μA和69.3μA，结果表明在本发明所述的Pd/N-RGO修饰电极的电化学响应性能最强，说明Pd/N-RGO复合材料修饰电极具有最强的电子传递性能。
[0049] (2)不同电极对雌二醇的电催化性能对比
[0050] 分别以玻碳电极(a)、GO/玻碳电极(b)、N-RGO/玻碳电极(c)和实施例2制备得到的Pd/N-RGO修饰电极(d)为工作电极在1.0mmol/L雌二醇溶液中的差分脉冲伏安测试。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s，图5为测试结果。从图中可见雌二醇在本发明所述的Pd/N-RGO修饰电极上的氧化峰电流最大(7.2μA)，且峰电位为0.456V。与N-RGO相比，雌二醇在本发明所述的Pd/N-RGO修饰电极上的氧化超电势下降了近50mV，说明了本发明所制备的Pd/N-RGO纳米材料修饰电极对雌二醇有着最好的电催化活性，有利于提高传感器的检测灵敏度。
[0051] (3)本实施例Pd/N-RGO修饰电极的电化学检测性能测试
[0052] 在pH为7.0的磷酸底液中，以富集时间为100s，对一系列雌二醇溶液进行差分脉冲伏安法测试，结果见图6。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。结果表明，雌二醇的氧化峰电流随其浓度增加而增大，在1.0×10-7～4.0×10-4mol/L的浓度范围内出现两段良好的线性关系(1.0×10-7～2.0×10-6mol/L和2.0×10-6～4.0×10-4mol/L)。线性方程分别2
为ip(μA)＝0.1391c(μmol/L)+1.3266(R ＝0.9965)和ip(μA)＝0.01602c(μmol/L)+4.7126(R2＝0.9978)，方程中c为雌二醇浓度，ip为差分脉冲伏安法得到氧化峰电流值。检出限利用下面方程得到：
[0053] DL＝K Sb/r
[0054] 上式中，DL为检出限；Sb为空白液测定20次所得
信号标准偏差，实验中测得标准偏差为2.625×10-10；K为置信系数，通常K取3；r为方法的灵敏度；经计算可得检出限为1.8×10-9mol/L。说明本发明所制备得到的电极具有良好的线性关系和极低的检出限。
[0055] (4)本实施例Pd/N-RGO修饰电极的稳定性和重现性测试
[0056] 按照实施例2的步骤制备6支相同的Pd/N-RGO修饰电极，分别以这6支电极为工作电极，用三电极法组装电极测试系统并连接电化学工作站(构建方法如上所述)，在pH为7.0的磷酸底液中，以富集时间为100s，利用差分脉冲伏安法对同一浓度的雌二醇进行测定。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。6支电极测定结果的相对标准偏差为3.55％。将其中一支Pd/N-RGO修饰电极常温下保存，选取6个不同的时间段(保存前测试第1次，然后每隔3天测试1次)，利用上述同样条件和方法对同一浓度的雌二醇进行测定，测定的相对标准偏差为2.97％。上述检测过程所得的相对偏差较低，表明本发明提供的Pd/N-RGO复合纳米材料修饰电极具有较好的稳定性和重现性。
[0057] (5)本实施例Pd/N-RGO化学修饰电极的抗干扰能力测试
[0058] 利用差分脉冲伏安法考察了外来干扰物质对雌二醇测定的影响。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。具体测试方法是，在9.5mL磷酸底液中加入0.5mL 1.0mmol/L的雌二醇，调节底液pH为7.0，以富集时间为100s通过差分脉冲伏安法测定其氧化峰电流值，再加入0.5mL 1.0mmol/L的干扰物质，通过差分脉冲伏安法测定雌二醇的氧化峰电流值。对比加入干扰物质前后雌二醇的氧化峰电流值的变化情况，如果偏差在±5％以内，可以认为干扰物对分析物的检测无影响。测试结果表明，本发明所制备的传感器在
色氨酸、氯+ + - 2- 3-化
铜、乙烯雌酚、
葡萄糖、维生素B1、K 、Na 、Cl 、SO4 和PO4 等物质的干扰下对雌二醇的检测值偏差在±5％以内，说明本发明提供的Pd/N-RGO修饰电极具有较好的抗干扰能力，能准确给出检测结果。
[0059] 实施例3用于检测雌二醇的电化学传感器
[0060] 以实施例2制备得到的用于检测雌二醇的化学修饰电极为工作电极、铂电极为对电极、Ag-AgCl电极为参比电极构成三电极体系，将三电极体系组装后与电化学工作站相连构成电化学传感器。
[0061] 实施例4一种应用电化学传感器定量检测雌二醇的方法
[0062] 所述方法采用实施例3所述的用于检测雌二醇的电化学传感器，用差分脉冲伏安法检测样品中的雌二醇含量；包含如下步骤：
[0063] 配置待测样品溶液；
[0064] 测定待测样品溶液中雌二醇的氧化峰电流值，根据线性方程换算出雌二醇浓度，进而得出样品中雌二醇的含量；
[0065] 所述线性方程为ip(μA)＝0.1391c(μmol/L)+1.3266(R2＝0.9965)和ip(μA)＝2
0.01602c(μmol/L)+4.7126(R＝0.9978)，方程中c为雌二醇浓度，ip为差分脉冲伏安法得到氧化峰电流值；
[0066] 所述的差分脉冲伏安法的检测条件为以pH为7.0的磷酸缓冲液为底液，富集时间为100s；所述的差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0167s、脉冲周期0.5s。
[0067] 实施例5猪肉中雌二醇的含量测定
[0068] 取某地产猪肉100mg，切碎后在50mL乙醇中浸泡12h，随后将其过滤后，取滤液1mL，用pH为7.0的磷
酸溶液定容至100mL作为实测样品。采用实施例3所述的用于检测雌二醇的电化学传感器，利用差分脉冲伏安法测定上述样品中的雌二醇含量。差分脉冲伏安法设置的操作条件为：电位增量4mV、振幅50mV、一次脉冲宽度0.2s、二次脉冲宽度0.05s、测样宽度0.0 167s、脉冲周期0.5s。具体测试方法是，取上述实测样品10mL，依次加入0.00mL、
1.00mL、1.50mL、2.00mL的浓度为1.0×10-4mol/L的雌二醇标准溶液，调节底液pH为7.0，以富集时间为100s通过差分脉冲伏安法测定雌二醇的氧化峰电流值，根据实施例4得到的线性关系找到对应的雌二醇浓度值。根据上述方法得到猪肉样品中雌二醇的浓度为2.95×
10-5mol/L，回收率在98.0–103.0％之间。
[0069] 本实施例也说明了本发明提供的化学修饰电极或传感器可用于药品质量监控、禽畜养殖和环境监测等领域中雌二醇含量的准确测定。
