Carrier for culturing cell
专利汇可以提供Carrier for culturing cell专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且PURPOSE:To provide a new cell culture carrier comprising a protein collected from a york skin extract and having a specific mol.wt., having a cell adhesion effect equal to those of collagen, etc., having good workability on its action, and useful for culturing animal cells, etc., at an extremely low cost. CONSTITUTION:An egg with a shell is broken, and the york is taken out in the state that the york skin is attached to the york. The york with the york skin is placed on filter paper and rotated. A part of the york skin is picked with a pincette, and most of the york inside the skin is removed. The obtained york skin is washed with a 0.15M physiological saline and homogenized in a tris-hydrochloric acid buffer solution (pH7.4). The produced york skin suspension is slowly stirred, allowed to stand for 15hr at 5 deg.C, and subsequently centrifuged. The supernatant is filtered, and the filtrate is gel-filtered. The eluted fraction is concentrated by an ultrafiltration method to obtain the objective cell culture carrier comprising a protein collected from the york skin extract and having a mol.wt. of approximately 18000, and having a high cell adhesion effect.，下面是Carrier for culturing cell专利的具体信息内容。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は細胞培養用担体に関する。 より詳しくは、接着依存性細胞の培養用担体に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、動物細胞に多く見られ、器壁に接着して増殖する性質のある接着依存性細胞を生体外の培養器内で培養する場合には、細胞の接着しうる担体がないと器壁への接着・増殖がし難いため、コラーゲン等の細胞接着活性を有する蛋白質を担体としてこれを培養器（マルチウェル、マイクロキャリア、中空糸等）の器壁に被覆（コーティング）して、培養細胞の器壁への接着率を高める工夫がなされている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、コラーゲンは、高価な蛋白質であるため、多量に使用する工業的な規模では実用に供し難いのが現状であり、したがって通常研究レベルで使用されているにすぎない。 以上のようなことから、本発明は、従来の細胞接着活性を有するコラーゲンと同等ないしそれ以上の細胞接着活性のある安価で新規な細胞培養用担体を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的を達しようと種々検討し、本発明に到達した。 すなわち、本発明は、細胞培養用担体に関し、卵黄膜抽出物から採取した、分子量約１８，０００の蛋白質からなることを特徴とするものである。
【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。 本発明における卵黄膜抽出物とは、卵黄膜から抽出した物質・成分をいう。 卵黄膜抽出物は、通常、卵黄膜から蛋白質の溶出を促す塩溶液などで抽出すれば得ることができる。
本発明の細胞培養用の担体は、卵黄抽出物から採取したものであり、分子量が約１８，０００の蛋白質からなる。 採取の手段は問わない。
【０００６】卵黄抽出物中の蛋白質は、一番量が多いのは分子量約１４，４００のものでこれはリゾチームと思われる。 次に多いのが分子量約１８，０００のものである。 その他の蛋白質は、以上の２種に比べると量が格段と少なくなる。 蛋白質の分子量は、電気泳動法、例えば、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などで定めることができ、したがって精度２桁程度の概数を示すものである。
【０００７】ここで、細胞培養用の担体とは、細胞を培養するに当たり、細胞が担持されて発育するものをいう。 担体の使用上の形態については問わない。 通常はマルチウェルなどの培養器の内面を被覆した薄膜状として用いられるが、担体を他の物に被覆しないで、それ自体をビーズ状その他の形状にすることも差し支えない。
【０００８】この担体に担持される細胞は、通常接着依存性の細胞である。 具体例としては、ヒト血管内皮細胞（ヒト臍帯静脈由来、以後ＵＣ細胞という）、Ｖ−７９
細胞（チャイニーズハムスターの肺由来）、ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸部由来）などが挙げられる。 本発明の細胞培養用担体は、分子量約１８，０００の蛋白質からなるが、必ずしもその蛋白質のみからなることを必要とするものでなく、本発明の目的を損なわない範囲で、任意の他の成分・原料を含んでいても差し支えない。
【０００９】次に本発明の細胞培養用担体の代表的な製造方法を説明する。 まず卵、具体的には鳥卵、その中でも一般的な鶏卵の卵黄膜を用意する。 すなわち、殻付鶏卵を割り、卵黄を膜付のまま取り出し、この膜付卵黄を濾紙上に置いて、卵黄膜が破れないようにそっと転がし、さらに薄い塩溶液を吹き付けるなどして膜の外側に付着している卵白をできるだけ除く。 次に、卵黄膜の一部を破り、卵黄膜の内容物（卵黄）を流し出した後、生理食塩水で洗浄し、膜の内側に付着している卵黄をできるだけ洗い流して付着物の少ない卵黄膜を得る。 卵黄膜を工業的に大量に得たい場合は、割卵工場で割卵して得た膜付卵黄を濾過したときに濾過用ストレーナーに付着したもの（膜が主成分）を得、これを生理食塩水で洗浄して得るようにすればよい。
【００１０】次に、このように前処理を済ませた卵黄膜から抽出物を得る。 抽出には、一般に塩（食塩）溶液、
通常は０．５Ｍ〜２．０Ｍ程度の濃度の塩溶液を使用すればよい。 これは、塩溶液は蛋白質の溶出を促すが、その濃度が０．５Ｍ未満だと卵黄膜の成分が充分に溶出しない傾向にあり、また濃度が２Ｍより高くても抽出効果はさして高まらないからである。 尚、抽出時のｐＨ変化による蛋白質収量の変動を避けるため、塩溶液は緩衝液（例えば、トリス−塩酸緩衝液など）とすると、一層好ましい。 使用する塩溶液の量は、あまり多いと後述する分画操作で時間がかかってしまうので、鶏卵の卵黄膜の場合は膜１枚（約５ｍｇ；乾燥物換算）あたり０．５〜
５ｍｌ程度がよい。
【００１１】また、抽出は、一般的には卵黄膜が細かく砕かれていた方がその効率がよいので、卵黄膜は塩溶液とホモゲナイズするのが望ましい。 ホモゲナイズした後充分抽出させるため１〜２０時間攪拌し、次いで遠心分離機にかけて上清を採取すれば、卵黄膜抽出物（液状）
が得られ、このものはさらにメンブランフィルター濾過等により除菌する。
【００１２】このようにして得られた卵黄膜抽出物より分子量約１８，０００の蛋白質を採取する。 採取の方法は、公知の方法を用いればよく、例えば、上記の除菌済みの卵黄膜抽出物（液状）を分画分子量１，０００〜３
００，０００程度のゲル濾過担体を充填したカラムに吸着させてから、卵黄膜からの抽出に用いたのと同じ塩溶液で展開し、溶出してくる液について蛋白質が特異的に吸収する紫外線２８０ｎｍの吸収スペクトルを分光光度計で計測しながら、最初の蛋白質の吸収ピークを示す溶出画分を集めればよい。
【００１３】この溶出画分は、分子量約１８，０００の蛋白質を含むものなので、この液をそのまま担体用として用いることもできるが、塩分が多いと接着依存性細胞の培養に際してその増殖を阻害する傾向が出てくることがあるので、望ましくは、透析チューブなどを用いて透析をして脱塩処理をする。 次いで脱塩処理した液は、使用し易くするため、通常、凍結乾燥するか、限外濾過などにより蛋白質濃度１〜１０ｍｇ／ｍｌぐらいに濃縮する。 濃縮液を保存使用する場合は、保存中の変質をし難くするため、０．４５μｍのフィルターを用いて除菌する。
【００１４】本発明の細胞培養用担体を使用するに当たっては、通常、上記の凍結乾燥物または、限外濾過による濃縮液を蒸留水で蛋白質濃度５〜５０μｇ／ｍｌ程度に希釈し、この液をマルチウェル等の培養器に入れ、数時間保持した後、液を捨て、表面に付着している液を生理的リン酸緩衝液で軽く洗い流し、風乾させ、本発明の細胞培養用担体で被覆された培養器とすればよい。
【００１５】
【作用】本発明で、卵黄膜抽出物から採取した分子量約１８，０００の蛋白質からなる細胞培養用担体に、細胞の接着を促す効果が生じる機作については定かではない。 おそらく、前期の蛋白質が固定した組織である膜の成分として、蛋白質の分子構造中に細胞の固定を促す構造を備えているものと推察される。
【００１６】以下、本発明の実施例および本発明の効果の一例を示す試験例について説明する。
実施例 殻付鶏卵１０個を割り、卵黄を卵黄膜が付いたまま取り出し、この卵黄膜付卵黄を濾紙上にのせて転がした後、
卵黄膜の一部をピンセットで突いて破り、膜内の卵黄の大部分を除去した。
【００１７】得られた卵黄膜（１０個分）は、内側に付着の卵黄をよく除くため、塩濃度０．１５Ｍの生理食塩水で３回洗浄した後、０．５Ｍの塩化ナトリウムを添加したトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を１０ｍｌ加えて５分間ホモゲナイズし、得られた卵黄膜懸濁液をゆるく攪拌しながら５℃で１５時間放置した。 その後、卵黄膜懸濁液を遠心分離（１５，００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ）
し、沈澱物を除去後、得られた上清を除菌のため０．４
５μｍのメンブランフィルターで濾過する。
【００１８】この濾液を分画分子量１，０００〜３０
０，０００のゲル濾過担体（ファルマシア社製、商品名「Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２」）を充填したカラムに吸着させた後、前記と同じトリス−塩酸緩衝液で展開し、溶出液を２８０ｎｍの紫外線を照射しながら蛋白質の溶出液を分光光度計で連続的に検出し、最初に目立つ吸収ピークが現れた溶出画分を集めた。 尚、この画分の蛋白質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で計測したところ、分子量が約１８，０００であることが確認された。
【００１９】この溶出画分は、透析により脱塩処理後、
限外濾過膜（ＴＯＹＯ ＵＫ膜；分画分子量１０，００
０）を用いて蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌとなるまで濃縮し、紫外線を照射して殺菌し、細胞培養用担体（溶液状）を得た。 尚、この液は１００倍に蒸留水で希釈し、
その１ｍｌを内径３５ｍｍのディッシュに入れ、５℃で２時間放置して残液を捨て、次に、ディッシュを１ｍｌ
の生理的リン酸緩衝液で洗浄した後、無菌的に風乾して、本発明の担体を被覆したディッシュを得た。
【００２０】
試験例 実施例の紫外線照射済みの細胞培養用担体（蛋白質濃度１ｍｇ／ｍｌの液状品）を、比較対照用のコラーゲン（タイプ１、タイプ４を使用）とともに、下記の表−１
にみられるように蛋白質濃度が、０．４７μｇ／ｍ
ｌ、３．５７μｇ／ｍｌ、７．５０μｇ／ｍｌおよび１５．００μｇ／ｍｌとなるように４とおりに希釈し、各希釈液を、本担体無使用の蒸留水（のみのもの）
とともに、格別に９６穴マルチウェルの各穴（セル）内に１００μｌずつ入れ、５℃で２時間放置した後、マルチウェル内の液を捨てて風乾し、紫外線を照射してマルチウェルを殺菌した。
【００２１】このマルチウェルの各穴（セル）に、ＵＣ
細胞を細胞数が０．５×１０ 5個／ｍｌになるように添加調整したイスコフ改変ＤＭＥ（Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕ
ｌｂｅｃｃｏ）培地に、インシュリンおよびトランスフェリンを各々６．３μｇ／ｍｌ並びに牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を１ｍｇ／ｍｌ各々添加した無血清培地を、
２００μｌずつ分注し、３７℃で２４時間培養した。
【００２２】培養後、マルチウェル内の培養液を捨て、
増殖した細胞をメタノールで固定してからギムザ染色を行ない、次いで、５５０ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。 尚、ＵＣ細胞以外の細胞の接着効果もみるため、Ｖ−７９細胞およびＨｅＬａ細胞についての細胞接着試験も同時に行なった。 その結果を表−１に示す。
【００２３】
【表１】
注：タイプ１、タイプ４中の数字１および４は、通常はローマ数字で表示されるものである。 表中の数値が高い程、細胞の接着効果が高いことを意味し、表より、本発明の細胞培養用担体は、コラーゲンと比べ、同等ないしそれ以上の効果があることが理解される。【００２４】
【発明の効果】以上のように、本発明によりコラーゲンと同等ないしそれ以上に細胞接着活性のある細胞培養用担体が提供される。 また、本発明の細胞培養用担体は、
これまで廃棄されていた卵黄膜を原料とすることができるため、非常に安価に製造することができる。 さらに、
コラーゲンは、希釈するのに強酸性溶液を必要とするが、本発明の細胞培養用担体は、乾燥粉末品であっても、構成する蛋白質がコラーゲンに比べ低分子のためか、そのままで水などに直ちに溶解分散するので、使用する際に作業が楽である。 さらにまた、本発明の細胞培養用担体は、卵黄膜からの抽出物そのもの（いろんな成分が多種類混ざっている）などと比べ、同じ蛋白質濃度では１０〜２０倍ほど細胞接着（増殖）効果が高い上、
成分がほぼ特定されているので、細胞培養試験などに際し、諸種の現象を解明をする上で好ましいものといえる。
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