一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途
阅读：234发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种线性-树状共聚物，所述线性-树状共聚物的结构如式I所示。本发明还提供了一种 给药 系统，所述给药系统是上述线性-树状共聚物与 光敏剂 发生偶联反应后得到的。研究表明，本发明的给药系统PPDP可在选择性 溶剂 中自组装形成尺寸均一、单分散性良好、 稳定性 高且带弱负电荷的纳米颗粒，其不仅具有优良的光物理特性，还能有效地产生ROS实现对 肿瘤 细胞的杀灭；其显著降低了光敏剂的 皮肤 光毒性；其不仅表现出较好的 生物 安全性、优异的 荧光 成像功能、血液长循环功能和长时间和高浓度的肿瘤靶向和富集效应，还具有显著的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物中显示出良好的应用前景。，下面是一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种线性-树状共聚物，其特征在于：所述线性-树状共聚物的结构如式I所示：
n为聚合度，n选自22～88。
2.根据权利要求1所述的线性-树状共聚物，其特征在于：n为44。
3.一种给药系统，其特征在于：所述给药系统的结构如式II所示：
其中，R1、R2、R3、R4各自独立地选自H或 且不同时为H；
n为聚合度，n选自22～88。
4.根据权利要求3所述的给药系统，其特征在于：所述给药系统的结构如式III所示：
n为44。
5.一种权利要求1或2所述线性-树状共聚物的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl发生缩合反应，得到化合物1；
(2)化合物1先在脱保护试剂作用下，脱去-BuOt基团，得中间产物1，然后中间产物1继续与H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl发生缩合反应，得到化合物2；
(3)化合物2先在脱保护试剂作用下，脱去-Fmoc基团，得到中间产物2，然后中间产物2继续与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH发生缩合反应，得到化合物3；
(4)化合物3先在脱保护试剂作用下，脱去-BuOt基团，得中间产物3，然后中间产物3继续与炔丙胺发生缩合反应，得到化合物4；
(5)化合物4先在脱保护试剂作用下，脱去-Fmoc基团，得到中间产物4，然后中间产物4继续与mPEGx-N3反应，得到所述线性-树状共聚物；
其中，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的结构为 H-Glu(OtBu)-OtBu的结构
为 化合物1的结构为
化合物2的结构为
化合物3的结构为
化合物4的结构为
mPEGx-N3表示分子量为x的甲氧基聚乙二醇叠氮化物，其中x选自1000～4000；优选地，x为2000。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中：
所述Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与H-Glu(OtBu)-OtBu的摩尔比为1.0：(1.0～2.0)，优选为
1.0：1.5；
所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
所述反应条件为先在冰浴下反应1小时，再在室温下反应24～48小时；
所述反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
和/或，步骤(2)中：
所述脱保护试剂为三氟乙酸，所述脱去-BuOt基团的反应条件为先在冰浴下反应1h后，再在室温下反应5h；所述脱去-BuOt基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物1与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为2.16g：10mL：10mL；
所述化合物1与H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl的摩尔比为1：(2～4)，优选为1：3；
所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
所述缩合反应条件为先冰浴下反应1小时，继续在室温下反应24～48h；
所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
和/或，步骤(3)中：
所述脱保护试剂为二乙胺，所述脱去-Fmoc基团的反应条件为室温下反应6h；所述脱去-Fmoc基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物1与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为
2.08g：20mL：20mL；
所述化合物2与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的摩尔比为1：(2～4)，优选为1：3；
所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
所述缩合反应条件为先在冰浴下反应1h后，继续在室温下反应24～48h；
所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
和/或，步骤(4)中：
所述脱保护试剂为三氟乙酸，所述脱去-BuOt基团的反应条件为室温下反应12h；所述脱去-BuOt基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物3与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为
1.58g：10mL：10mL；
所述化合物3与炔丙胺的摩尔比为1：(5～7)，优选为1：6；
所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且炔丙胺与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
所述缩合反应条件为先在冰浴下反应1h后，继续在室温下反应24～48h；
所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
和/或，步骤(5)中：
所述脱保护试剂为二乙胺，所述脱去-Fmoc基团的反应条件为室温下反应12h；所述脱去-Fmoc基团的反应溶剂为N,N-二甲基酰胺，化合物4与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.2g：5mL：5mL；
所述化合物4与mPEG2k-N3的摩尔比为1.0：(7.0～8.0)，优选为1.0：7.2；
所述化合物4与mPEG2k-N3的反应是在CuSO4·5H2O和L-抗坏血酸钠的作用下完成的，mPEG2k-N3与CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.67：1.34；该反应条件为室温下避光反应48h；该反应溶剂为DMSO：H2O的体积比为4:1的混合溶液。
7.一种权利要求3-4任一项所述给药系统的制备方法，其特征在于：所述方法为：权利要求1或2所述线性-树状共聚物与光敏剂发生偶联反应，即得。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述反应中，光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；
和/或，所述线性-树状共聚物与光敏剂的摩尔比为1：(3～15)，优选为1：8；
和/或，所述偶联反应是在缩合剂和碱的作用下完成的；优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOAt和HATU，且光敏剂与HOAt，HATU和DIPEA的摩尔比为1：1.1：1.1：(0.5～0.6)；
和/或，所述反应条件为先在冰浴下反应1小时，再在室温下避光反应48小时；
和/或，所述反应溶剂为N,N-二甲基酰胺。
9.一种自组装体系，其特征在于：所述自组装体系是权利要求3-4任一项所述给药系统在水中自组装得到的球形纳米颗粒。
10.权利要求3-4任一项所述给药系统或权利要求9所述自组装体系在制备抗肿瘤药物上的用途，优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、膀胱癌、肺癌、食管癌、头颈部癌、皮肤癌。
一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于高分子材料领域，具体涉及一种PEG-Peptide线性-树状给药系统及其制备方法和用途。
背景技术
[0002] 目前，化疗是临床上恶性肿瘤治疗的主要手段之一。然而，传统化疗药物普遍毒副作用大，不仅缺乏肿瘤选择性，长期用药还容易导致肿瘤的多药耐药，这些不可避免的缺陷是造成化疗失败的重要原因。因此，如何改善传统化疗药物疗效差、毒副作用高等缺陷，寻求一种低毒、高效和经济恶性肿瘤的治疗手段是当前肿瘤学领域的热点研究方向。
[0003] 作为新兴的肿瘤治疗手段，光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)为实现恶性肿瘤高效低毒的治疗带来了新的契机。该疗法不同于手术、放疗和化疗等传统疗法，主要利用肿瘤细胞选择性地吸收光敏剂，然后利用特定波长的非热激光照射肿瘤部位，使肿瘤组织中的光敏剂发生剧烈的光化学反应，产生具有细胞毒性的ROS(reactive oxygen species，活性氧)，从而选择性地消灭肿瘤细胞。此外，目前已有研究表明利用光动力治疗恶性肿瘤不易引发耐药问题，且有不少研究还报道了光动力可有效地抑制已产生化疗抵抗的肿瘤细胞，其治疗效果显著优于化疗药物。因此，肿瘤的光动力治疗在肿瘤新型疗法研究领域具有潜在的研究价值和广阔的应用前景。
[0004] 光动力治疗恶性肿瘤的关键在于氧气、照射光源和光敏剂的合理搭配。其中，光敏剂是光动力疗法的核心，是决定其疗效和毒副作用的重要因素。理想的光敏剂应具备水溶性好、单线态量子产率高、理化性质稳定、肿瘤细胞靶向性、体内易清除和暗毒性低等特点，但目前临床已应用及正在研发的光敏剂仍普遍存在水溶性差、清除缓慢、靶向性差和易产生滞后的光毒性等问题。相比于临床应用的金标准—第一代光敏剂 第二代光敏剂焦脱镁叶绿酸a(pyropheophorbide a,Ppa)在更长波长(670nm左右)具有强吸收，光疗时组织穿透更深，并具备更高的单线态氧量子产率，有显著的临床应用的潜力。然而，其同样存在难溶于水、毒性大、清除缓慢和靶向性差等缺点，严重限制其在临床上的开发和应用。对此，Cooper等设计并开发了一种焦脱镁叶绿酸a的化学修饰物Photochlor(HPPH)，已进入临床I/II期试验。但HPPH仍不能完全解决光敏剂靶向性差和毒性大，尤其是皮肤光毒性较强等问题，导致其临床试验进展十分缓慢。
[0005] 此外，为了提高光敏剂对肿瘤组织的靶向性及富集浓度，通常需要采用给药系统载体对光敏剂进行传递。但是，化学结构不同的载体材料和光敏剂之间的相互作用存在差异，这种相互作用会差异会进一步影响到给药系统的生物学效应，进而影响给药系统的体内循环、清除、分布和抗肿瘤活性。
[0006] 中国专利CN105749280A公开了一种协同化疗与光动力治疗的肿瘤靶向纳米给药系统。该给药系统由羧甲基壳聚糖、叶酸、光敏剂二氢卟吩e6和阿霉素构成，先将二氢卟吩e6和叶酸通过酰胺键偶联到羧甲基壳聚糖链段上，再经离子交联法得到负载阿霉素的聚合物纳米粒形成靶向抗肿瘤纳米给药体系。但是，该载药体系的制备过程复杂，靶向分子叶酸的偶联增加了制备的工艺；阿霉素和光敏剂联用，也进一步使药物体系更加复杂。
[0007] 因此，通过对载体材料的合理选择、分子结构的优化设计和药物递送系统的巧妙构建，提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力给药系统具有广阔的应用前景。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于提供一种结构简单、制备方便，并且对肿瘤的治疗效果显著的光动力给药系统。
[0009] 本发明提供了一种线性-树状共聚物，所述线性-树状共聚物的结构如式I所示：
[0010]
[0011] n为聚合度，n选自22～88。
[0012] 优选地，n为44。
[0013] 本发明还提供了一种给药系统，所述给药系统的结构如式II所示：
[0014]
[0015] 其中，R1、R2、R3、R4各自独立地选自H或 且不同时为H；
[0016] n为聚合度，n选自22～88。
[0017] 进一步地，所述给药系统的结构如式III所示：
[0018]
[0019] n为44。
[0020] 载药量表示被测体系中，(药物的质量/线性-树状给药系统总质量)×100％。比如，焦脱镁叶绿酸a的载药量＝(焦脱镁叶绿酸a的质量/给药系统总质量)×100％。
[0021] 本发明给药系统中，焦脱镁叶绿酸a的载药量为16.01％。
[0022] 本发明还提供了上述线性-树状共聚物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
[0023] (1)Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl发生缩合反应，得到化合物1；
[0025] (3)化合物2先在脱保护试剂作用下，脱去-Fmoc基团，得到中间产物2，然后中间产物2继续与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH发生缩合反应，得到化合物3；
[0026] (4)化合物3先在脱保护试剂作用下，脱去-BuOt基团，得中间产物3，然后中间产物3继续与炔丙胺发生缩合反应，得到化合物4；
[0027] (5)化合物4先在脱保护试剂作用下，脱去-Fmoc基团，得到中间产物4，然后中间产物4继续与mPEGx-N3反应，得到所述线性-树状共聚物；
[0028] 其中，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的结构为 H-Glu(OtBu)-OtBu的结构为 化合物1的结构为 化
合物2的结构为 化合物3的结构为
化合物4的结构为
合物2的结构为 化合物3的结构为
化合物4的结构为
[0029] mPEGx-N3表示分子量为x的甲氧基聚乙二醇叠氮化物，其中x选自1000～4000；优选地，x为2000。
[0030] 进一步地，
[0031] 步骤(1)中：
[0032] 所述Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与H-Glu(OtBu)-OtBu的摩尔比为1.0：(1.0～2.0)，优选为1.0：1.5；
[0033] 所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
[0034] 所述反应条件为先在冰浴下反应1小时，再在室温下反应24～48小时；
[0035] 所述反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
[0036] 和/或，步骤(2)中：
[0037] 所述脱保护试剂为三氟乙酸，所述脱去-BuOt基团的反应条件为先在冰浴下反应1h后，再在室温下反应5h；所述脱去-BuOt基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物1与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为2.16g：10mL：10mL；
[0038] 所述化合物1与H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl的摩尔比为1：(2～4)，优选为1：3；
[0039] 所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
[0040] 所述缩合反应条件为先冰浴下反应1小时，继续在室温下反应24～48h；
[0041] 所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
[0042] 和/或，步骤(3)中：
[0043] 所述脱保护试剂为二乙胺，所述脱去-Fmoc基团的反应条件为室温下反应6h；所述脱去-Fmoc基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物1与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为2.08g：20mL：20mL；
[0044] 所述化合物2与Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的摩尔比为1：(2～4)，优选为1：3；
[0045] 所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且Fmoc-Lys(Fmoc)-OH与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
[0046] 所述缩合反应条件为先在冰浴下反应1h后，继续在室温下反应24～48h；
[0047] 所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
[0048] 和/或，步骤(4)中：
[0049] 所述脱保护试剂为三氟乙酸，所述脱去-BuOt基团的反应条件为室温下反应12h；所述脱去-BuOt基团的反应溶剂为二氯甲烷，化合物3与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为1.58g：10mL：10mL；
[0050] 所述化合物3与炔丙胺的摩尔比为1：(5～7)，优选为1：6；
[0051] 所述缩合反应是在缩合剂和碱的作用下完成的，优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOBt和HBTU，且炔丙胺与HOBt，HBTU，DIPEA的摩尔比为：1：1：1：(2～3)；
[0052] 所述缩合反应条件为先在冰浴下反应1h后，继续在室温下反应24～48h；
[0053] 所述缩合反应溶剂为N,N-二甲基酰胺；
[0054] 和/或，步骤(5)中：
[0055] 所述脱保护试剂为二乙胺，所述脱去-Fmoc基团的反应条件为室温下反应12h；所述脱去-Fmoc基团的反应溶剂为N,N-二甲基酰胺，化合物4与反应溶剂、脱保护试剂的质量体积比为0.2g：5mL：5mL；
[0056] 所述化合物4与mPEG2k-N3的摩尔比为1.0：(7.0～8.0)，优选为1.0：7.2；
[0057] 所述化合物4与mPEG2k-N3的反应是在CuSO4·5H2O和L-抗坏血酸钠的作用下完成的，mPEG2k-N3与CuSO4·5H2O、L-抗坏血酸钠的摩尔比为1：0.67：1.34；该反应条件为室温下避光反应48h；该反应溶剂为DMSO：H2O的体积比为4:1的混合溶液。
[0058] 本发明还提供了上述给药系统的制备方法，所述方法为：将上述线性-树状共聚物与光敏剂发生偶联反应，即得。
[0059] 进一步地，所述反应中，光敏剂为焦脱镁叶绿酸a；
[0060] 和/或，所述线性-树状共聚物与光敏剂的摩尔比为1：(3～15)，优选为1：8；
[0061] 和/或，所述偶联反应是在缩合剂和碱的作用下完成的；优选地，所述缩合剂选自HOBt，HBTU，HOAt，HATU中的一种或多种，所述碱选自DIPEA；更优选地，所述缩合剂选自HOAt和HATU，且光敏剂与HOAt，HATU和DIPEA的摩尔比为1：1.1：1.1：(0.5～0.6)；
[0062] 和/或，所述反应条件为先在冰浴下反应1小时，再在室温下避光反应48小时；
[0063] 和/或，所述反应溶剂为N,N-二甲基酰胺。
[0064] 本发明还提供了一种自组装体系，所述自组装体系是上述给药系统在水中自组装得到的球形纳米颗粒。
[0065] 本发明“球形”包括规则和不规则的球形；“纳米颗粒”是指纳米量级的实心或空心颗粒。
[0067] 实验结果表明，本发明设计并构建了两亲性的LD型PEG-Peptide线性-树状共聚物-焦脱镁叶绿酸a光动力给药系统PPDP，该给药系统可在选择性溶剂中自组装形成尺寸均一、单分散性良好、稳定性高且带弱负电荷的纳米颗粒，其不仅具有优良的光物理特性，还能有效地产生ROS实现对肿瘤细胞的杀灭；其显著降低了光敏剂的皮肤光毒性；其不仅表现出较好的生物安全性、优异的荧光成像功能、血液长循环功能和长时间和高浓度的肿瘤靶向和富集效应，还具有显著的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物中显示出良好的应用前景。
[0068] 本发明中，1-羟基苯并三唑即HOBt，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯即HBTU，2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐即HATU，1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑即HOAt，N,N'-二异丙基乙胺即DIPEA，2-Propynulamine即炔丙胺，mPEG-N3即甲氧基聚乙二醇叠氮化物；sodium ascorbate即L-抗坏血酸钠。
[0069] 本发明中，LD型即Linear-Dendritic，表示线性树状结构。
[0070] 自组装(self-assembly)，是指基本结构单元(分子，纳米材料，微米或更大尺度的物质)自发形成有序结构的一种技术。在自组装的过程中，基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。
[0072] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。附图说明
[0073] 图1为本发明给药系统PPDP的合成路线。
[0074] 图2为本发明给药系统PPDP的自组装示意图。
[0075] 图3为化合物1的核磁氢谱表征。
[0076] 图4为化合物1的ESI-TOF MS表征。
[0077] 图5为化合物2的核磁氢谱表征。
[0078] 图6为化合物2的ESI-TOF MS表征。
[0079] 图7为化合物3的核磁氢谱表征。
[0080] 图8为化合物3的ESI-TOF MS表征。
[0081] 图9为化合物4的核磁氢谱表征。
[0082] 图10为化合物4的ESI-TOF MS表征。
[0083] 图11为化合物5的MALDI-TOF MS表征
[0084] 图12为化合物6(PPDP)。
[0085] 图13为焦脱镁叶绿酸a在DMSO中的标准紫外吸收曲线。
[0086] 图14为PPDP在DMSO-d6(A)和D2O(B)中的核磁氢谱表征。
[0087] 图15为通过透射电镜表征粒径和形貌：载体材料(PPD)(A)和给药系统PPDP(B)。
[0088] 图16为通过DLS表征粒径：给药系统PPDP分别在纯水(A)和PBS中的粒径(B)。
[0090] 图18为通过DLS表征粒径的稳定性:给药系统PPDP分别在加入10％FBS的纯水和PBS缓冲液中随时间变化的粒径(A)，以及给药系统PPDP分别在10％FBS的纯水和PBS缓冲液中随时间变化的PDI(B)。
[0091] 图19为给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa分别在纯水、PBS和DMSO中的溶液颜色。
[0092] 图20为给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa经不同处理后的紫外-可见光吸收光谱(A和B)和荧光发射光谱(B)。
[0093] 图21为给药系统PPDP(B)和游离光敏剂Ppa(A)在不同溶剂中的光稳定性。
[0094] 图22为给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的DMA消耗曲线和转换拟合曲线。
[0095] 图23为给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa经660nm激光照射后对4T1细胞(A)的细胞毒性，在避光条件下对LO2细胞的毒性(B)，以及载体材料PPD对LO2细胞的毒性(C)，其中，n＝3，IC50值通过GraphPad Prism 5.01软件计算。
[0096] 图24为通过激光共聚焦显微镜(CLSM)考察给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在4T1细胞中孵育1h、3h和6h后的细胞摄取(A)；通过流式细胞仪考察给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在4T1细胞中孵育不同时间后的细胞摄取情况(B)，比例尺代表25微米。
[0097] 图25为(A)：4T1细胞经DCFH-DA探针测定ROS产生的情况并由倒置荧光显微镜获取图片，细胞经以下不同的处理：a)不加探针和光照的对照；b)加探针和不加光照的对照；c)加探针和光照的对照；d)加探针和活氢供体的对照；e)加探针、光照和给药系统PPDP；f)加探针、1J/cm2 660nm光照和游离光敏剂Ppa；(B)：通过流式细胞仪测定4T1细胞经不同处理后的ROS产生的情况，PBS:不加探针和光照的对照；DCFH-DA:只加探针的对照；DCFH-DA+laser:加探针和光照的对照；DCFH-DA+H2O2:加探针和活氢供体的对照；Ppa:加探针、光照2
和游离Ppa；PPDP:加探针、光照和给药系统PPDP；其中，光照剂量均为1J/cm 660nm，比例尺代表200微米。
和游离Ppa；PPDP:加探针、光照和给药系统PPDP；其中，光照剂量均为1J/cm 660nm，比例尺代表200微米。
[0098] 图26为红细胞经不同浓度的给药系统PPDP和载体材料PPD处理后的形貌和聚集情况(A)，以PBS处理后的红细胞为对照(B)。
[0099] 图27为红细胞经不同浓度的给药系统PPDP和载体材料PPD处理后的溶血情况(A)，以及溶血率的计算(B)。
[0100] 图28为健康小鼠在注射给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa后，在背部区域经光照后的皮肤毒性反应情况(A)及对毒性反应程度的计数统计(B)。
[0101] 图29为通过活体荧光成像实验比较给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在肿瘤模型小鼠体内的分布情况，各组的剂量均为每只小鼠5mg Ppa/kg。
[0102] 图30为通过离体荧光成像实验比较各时间点下(1d,3d,5d,7d,10d,14d)，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在4T1肿瘤模型小鼠中的肿瘤靶向聚集情况(n＝3)，各组的剂量均为每只小鼠5mg Ppa/kg。
[0103] 图31为通过对肿瘤的冰冻切片进行荧光染色，比较各时间点下(1d,3d,5d,7d,10d,14d)，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在4T1肿瘤模型小鼠中的肿瘤分布微观情况，其中，红色：光敏剂，绿色：血管，蓝色：细胞核；比例尺代表50微米。
[0104] 图32为定量测定各时间点，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在正常小鼠中的血液中的含量(A)，各组的剂量均为每只小鼠5mg Ppa/kg。
[0105] 图33为通过4T1体内肿瘤模型比较给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的体内抗肿瘤效果，以生理盐水组为对照(n＝6,每次给药剂量:5mg Ppa/kg每只)(A)；在治疗结束后，剖离肿瘤并称重(B)；根据瘤重计算抑瘤率(C)；并对所有的肿瘤进行拍照(D)。
[0106] 图34为通过肿瘤的TUNEL和CD-31染色，比较给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的治疗后，对肿瘤细胞凋亡水平的影响和对血管生成的抑制情况，比例尺代表50微米。
[0107] 图35为通过A549-R耐药株建立的耐药模型比较给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的体内抗肿瘤效果，以生理盐水组为对照(n＝5,每次给药剂量:5mg Ppa/kg每只)(A)；在治疗结束后，剖离肿瘤并称重(B)；根据瘤重计算抑瘤率(C)；并对所有的肿瘤进行拍照(D)。
具体实施方式
[0108] 本发明所以原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
[0109] 其中，焦脱镁叶绿酸a(Ppa)，购买于上海先辉医药科技有限公司；H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl、Fmoc-Lys(Fmoc)-OH，购买于吉尔生化(上海)有限公司。
[0110] 本发明所用SPF级小鼠均购于成都达硕生物科技有限公司实验动物，并饲养于四川大学华西临床药理实验动物中心级实验动物房。
[0111] 实施例1、本发明线性-树状共聚物的制备
[0112] 按照图1所示路线图，合成本发明的线性-树状共聚物(化合物5)。具体合成步骤如下：
[0113] (1)化合物1的合成
[0114] 在氮气保护下，将Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(4.00g,6.78mmol)，H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl(3.01g,10.17mmol)，HOBt(1.37g,10.17mmol)和HBTU(3.86g,10.17mmol)溶解到20mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA(3.50g,27.12mmol)。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应24h。反应结束后，将反应液稀释到300mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1M HCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色油状粗产品。最后，通过柱色谱法(流动相：体积比CH2Cl2:CH3OH＝40:1)对粗产品进行分离纯化，得到纯白色固体化合物1，质量为4.34g，产率为74.6％。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.16(d,J＝7.2Hz,1H),7.88(d,J＝7.5Hz,4H),7.75–7.66(m,4H),7.47(d,J＝8.2Hz,1H),7.40(t,J＝7.4Hz,4H),7.31(m,4H),
4.22(m,8H),2.96(s,2H),2.29(d,J＝27.5Hz,4H),1.90(d,J＝7.7Hz,2H),1.74(s,2H),
1.37(d,J＝6.8Hz,18H),1.23(s,2H)(图3)；ESI-TOF MS:m/z＝854.16([M+Na]+)(图4)。
4.22(m,8H),2.96(s,2H),2.29(d,J＝27.5Hz,4H),1.90(d,J＝7.7Hz,2H),1.74(s,2H),
1.37(d,J＝6.8Hz,18H),1.23(s,2H)(图3)；ESI-TOF MS:m/z＝854.16([M+Na]+)(图4)。
[0115] (2)化合物2的合成
[0116] 在氮气保护下，将化合物1(2.16g,2.59mmol)溶解到10mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的TFA。反应在冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应5h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水乙醚并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水乙醚反复处理三次，将得到的白色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将白色沉淀，H-Glu(OtBu)-OtBu·HCl(2.30g,7.77mmol)，HOBt(1.05g,7.77mmol)和HBTU(2.95g,7.77mmol)溶解到30mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA(2.68g,20.72mmol)。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应36h。反应结束后，将反应液稀释到300mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1M HCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到纯白色固体化合物2，质量为2.49g，产率为80.1％。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.17(d,J＝7.3Hz,1H),8.03(dd,J＝16.8,7.9Hz,2H),7.88(d,J＝7.5Hz,4H),7.69(dd,J＝18.2,
7.4Hz,4H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(t,J＝7.5Hz,4H),7.31(t,J＝7.5Hz,4H),4.35–
3.96(m,10H),2.96(s,2H),2.35–2.12(m,8H),1.96–1.82(m,4H),1.78–1.51(m,4H),1.36(d,J＝1.8Hz,36H)(图5)；ESI-TOF MS:m/z＝1224.40([M+Na]+)(图6)。
7.4Hz,4H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(t,J＝7.5Hz,4H),7.31(t,J＝7.5Hz,4H),4.35–
3.96(m,10H),2.96(s,2H),2.35–2.12(m,8H),1.96–1.82(m,4H),1.78–1.51(m,4H),1.36(d,J＝1.8Hz,36H)(图5)；ESI-TOF MS:m/z＝1224.40([M+Na]+)(图6)。
[0117] (3)化合物3的合成
[0118] 在氮气保护下，将化合物2(2.08g,1.73mmol)溶解到20mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的二乙胺。反应在室温下反应6h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水正己烷并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水正己烷反复处理三次，将得到的白色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将白色沉淀，Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(3.06g,5.19mmol)，HOBt(0.70g,5.19mmol)和HBTU(1.97g,5.19mmol)溶解到40mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA(1.79g,13.84mmol)。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应48h。反应结束后，将反应液稀释到400mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，1M HCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到白色固体化合物3，质量为2.25g，产率为68.3％。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.16(d,J＝7.5Hz,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝7.2Hz,1H),7.87(d,J＝7.5Hz,8H),7.68(dd,J＝17.7,7.1Hz,8H),
7.47(d,J＝8.1Hz,1H),7.39(t,J＝7.3Hz,8H),7.32–7.26(m,8H),4.31–3.84(m,18H),2.96(s,6H),2.21(m,8H),1.94–1.81(m,4H),1.77–1.59(m,6H),1.51(d,J＝7.5Hz,6H),1.46–
1.30(m,36H),1.22(m,6H)(图7)；MALDI-TOF MS:m/z＝1925.876([M+Na]+)(图8)。
7.47(d,J＝8.1Hz,1H),7.39(t,J＝7.3Hz,8H),7.32–7.26(m,8H),4.31–3.84(m,18H),2.96(s,6H),2.21(m,8H),1.94–1.81(m,4H),1.77–1.59(m,6H),1.51(d,J＝7.5Hz,6H),1.46–
1.30(m,36H),1.22(m,6H)(图7)；MALDI-TOF MS:m/z＝1925.876([M+Na]+)(图8)。
[0119] (4)化合物4的合成
[0120] 在氮气保护下，将化合物3(1.58g,0.83mmol)溶解到10mL的超干二氯甲烷中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的TFA。反应在室温下反应12h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到黄色油状粗产品。然后，向其中加入无水乙醚并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水乙醚反复处理三次，将得到的黄色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，将黄色沉淀，2-Propynulamine(0.27g,4.98mmol)，HOBt(0.67g,4.98mmol)和HBTU(1.89g,4.98mmol)溶解到40mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA(1.72g,13.28mmol)。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温下反应
48h。反应结束后，将反应液稀释到400mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，
1M HCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到浅黄色固体化合物4，质量为
0.88g，产率为57.8％。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.43(s,4H),8.29(m,4H),8.06(d,J＝
8.1Hz,4H),7.87(d,J＝7.1Hz,8H),7.68(dd,J＝16.0,7.4Hz,8H),7.38(d,J＝7.1Hz,8H),
7.30(s,8H),4.46–4.05(m,18H),3.83(d,J＝12.5Hz,8H),3.03(dd,J＝29.8,20.5Hz,10H),
2.18(m,12H),1.87–1.85(m,6H),1.52(s,6H),1.35(s,6H)(图9)；MALDI-TOF MS:m/z＝
1849.692([M+Na]+)(图10)。
48h。反应结束后，将反应液稀释到400mL乙酸乙酯中，并在冰浴下依次用饱和NaHCO3溶液，
1M HCl溶液及饱和NaCl溶液洗涤，收集有机层先用无水MgSO4进行干燥，再用旋转蒸发仪除去部分溶剂。最后，通过重结晶法对粗产品进行分离纯化，得到浅黄色固体化合物4，质量为
0.88g，产率为57.8％。1H NMR(400MHz,DMSO):δ8.43(s,4H),8.29(m,4H),8.06(d,J＝
8.1Hz,4H),7.87(d,J＝7.1Hz,8H),7.68(dd,J＝16.0,7.4Hz,8H),7.38(d,J＝7.1Hz,8H),
7.30(s,8H),4.46–4.05(m,18H),3.83(d,J＝12.5Hz,8H),3.03(dd,J＝29.8,20.5Hz,10H),
2.18(m,12H),1.87–1.85(m,6H),1.52(s,6H),1.35(s,6H)(图9)；MALDI-TOF MS:m/z＝
1849.692([M+Na]+)(图10)。
[0121] (5)化合物5的合成
[0122] 在氮气保护下，将化合物4(0.2g,0.11mmol)溶解到5mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加等体积的二乙胺。反应在室温下反应12h。反应结束后，用旋转蒸发仪除去溶剂，得到无色油状粗产品。然后，向其中加入无水正己烷并剧烈搅拌，有大量白色沉淀生成，高速离心除去上清液，继续用无水正己烷反复处理三次，将得到的黄色沉淀置于真空干燥箱。真空干燥1h后，在氩气保护下将浅黄色沉淀，mPEG2k-N3(1.60g,0.79mmol)，CuSO4·5H2O(0.13g,0.53mmol)和sodium ascorbate(0.21g,1.06mmol)溶解到
10mL的溶于DMSO/H2O(体积比为4:1)的混合溶液中，室温下避光反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在0.001M乙二胺四乙酸二钠的稀溶液中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on an FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得浅黄色固体化合物5(即PPD)，质量为0.78g，产率为78.8％。MALDI-TOF MS:m/z＝8960.69([M+Na]+)(图11)。
10mL的溶于DMSO/H2O(体积比为4:1)的混合溶液中，室温下避光反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在0.001M乙二胺四乙酸二钠的稀溶液中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on an FPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得浅黄色固体化合物5(即PPD)，质量为0.78g，产率为78.8％。MALDI-TOF MS:m/z＝8960.69([M+Na]+)(图11)。
[0123] 实施例2、本发明给药系统的制备
[0124] 按照图1所示合成路线，合成本发明线性树状纳米药物PPDP(即化合物6)，具体为：
[0125] 在氮气保护下，将化合物5(300.0mg,33.2μmol)，Pyropheophorbide a(142.0mg,265.6μmol)，HOAt(40.7mg,298.8μmol)和HATU(113.6mg,298.8μmol)溶解到10mL的超干N,N-二甲基酰胺中，然后在冰浴下向其中缓慢滴加DIPEA(154.4mg,1.20mmol)。反应于冰浴下搅拌1h后，继续在室温避光下反应48h。反应结束后，反应液用截留分子量为8000的透析袋在超纯水中透析2天，并通过尺寸排阻色谱柱(Superose 12HR/16/30column on anFPLC system(GEHealthcare)column)进一步提纯。最后，在超纯水中再次透析并冷冻干燥，即可获得浅黄色固体化合物6，质量为191.8mg，产率为52.0％。MALDI-TOF MS:m/z＝
11026.95([M+Na]+)(图12)。
11026.95([M+Na]+)(图12)。
[0126] 实施例3、本发明自组装体系的制备
[0127] 取上述实施例2中制得的化合物6加入纯水中配制成200μg/mL的溶液，自组装，得到本发明的自组装体系(如图2所示)。
[0128] 以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0129] 本发明采用的实验方法如下：
[0130] 1、质谱和核磁共振光谱
[0131] 称取样品1mg左右，充分溶解到相应的溶剂中，并在液相色谱质谱联用仪或基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪上进行测试；称取样品5mg左右，以0.5mL的重水或氘代二甲基亚砜为溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。
[0132] 2、载药量测试
[0133] 如表1所示，按照设定的八个浓度梯度(25,10,5,1,0.5,0.25,0.1,0μg/mL)配制游离光敏剂Ppa的二甲基亚砜溶液，一共8个浓度，用紫外-可见光谱仪在667nm处测定其吸光度，并绘制标准曲线。然后，测定一定浓度纳米药物PPDP(100μg/mL)的吸光度，带入标准曲线计算材料中游离光敏剂Ppa的浓度，最后计算载药量(图13)。
[0134] 表1不同浓度游离光敏剂Ppa的吸光度。
[0135]
[0136] 3、粒径分布、表面电荷及形貌表征
[0137] 称取给药系统PPDP样品1mg左右，用超纯水或PBS溶解并配制成浓度为200μg/mL的溶液。在常温下，利用Zetasizer Nano ZS纳米粒度-电位检测仪检测给药系统PPDP在水溶液和PBS溶液中纳米颗粒的粒径分布和表面电荷；将200μg/mL给药系统PPDP的水溶液滴加到铜网的碳膜上，待其自然风干后，用透射电子显微镜观察其形貌和尺寸。
[0138] 4、紫外-可见光光谱和荧光发射光谱
[0139] 配制浓度为1mg/mL的游离光敏剂Ppa二甲基亚砜溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为1mg/mL的给药系统PPDP二甲基亚砜溶液。然后，将这两种溶液分别用不同的溶液(DMSO,H2O,PBS,DMSO+0.1％SDS,H2O+0.1％SDS,PBS+0.1％SDS,DMSO+1％SDS,H2O+1％SDS,PBS+1％SDS)稀释20倍，在室温下分别测定其紫外-可见光光谱(波长范围：300～800nm)，以及荧光发射光谱(EX：405nm,Em:600～750nm)。
[0140] 为了评价给药系统PPDP的荧光自淬灭和解淬灭效应，我们可根据上述测量的样品在有无表面活性剂的水溶液或有机溶剂中的荧光强度，计算其荧光猝灭效率。记录各组样品的峰值强度，淬灭百分比由下式求得：
[0141]
[0142] 式中，F0为样品在水溶液中发生猝灭时的荧光强度，F1为样品在有机溶剂中处于分散状态未猝灭时的荧光强度。
[0144] (1)摩尔消光系数(Molar extinction coefficients,ε)
[0145] 根据朗伯-比尔定律，测量并计算PPDP的摩尔消光系数。准确称量并配制含不同浓度光敏剂Ppa的给药系统PPDP的DMSO溶液(0.01875,0.0375,0.075,0.15,0.3,0.6,1.2x10-6mol/L)。分别将各浓度的样品加入到96孔板中，并用酶标仪测定各孔在668nm处的吸光度。
根据不同浓度给药系统PPDP的吸光度A对其浓度C作图求出线性关系的斜率，即为摩尔消光系数(ε)。
根据不同浓度给药系统PPDP的吸光度A对其浓度C作图求出线性关系的斜率，即为摩尔消光系数(ε)。
[0146] (2)荧光量子产率(Fluorescent quantum yield,FQ)
[0147] 配制浓度为6.0×10-6mol/L的游离光敏剂Ppa甲苯溶液，及游离光敏剂Ppa浓度为6.0×10-6mol/L的给药系统PPDP甲苯溶液，测定其荧光发射光谱(EX：660nm,Em:600～
750nm)。在室温下，同时测定荧光发射光谱的峰面积和样品在660nm的吸光度。采用下式求出PPDP的荧光量子产率(ΦΔ):
750nm)。在室温下，同时测定荧光发射光谱的峰面积和样品在660nm的吸光度。采用下式求出PPDP的荧光量子产率(ΦΔ):
[0148]
[0149] 式中，A为660nm处的吸光度；P为荧光发射光谱的峰面积；S为样品，而R为Ppa参照；ref.ΦΔ为游离光敏剂Ppa在甲苯中的单线态氧量子产率(0.30)。
[0150] (3)单线态氧量子产率(singlet oxygen quantum yield,SOQ)
[0151] 通过定量检测9,10-二甲基蒽(9,10-dimethylanthracene，DMA)捕获1O2后的荧光降低程度可定量测定给药系统PPDP的单线态氧量子产率。分别在给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的DMSO溶液中加入一定量的DMA使DMA的终浓度均为6μM。分别将样品加入到96孔板2
中，采用660nm的激光进行照射(80mW/cm)，并用酶标仪在各时间点测定DMA的发射光强度(Ex:360nm；Em:440nm)。按照如下公式计算样品的单线态氧量子产率：
中，采用660nm的激光进行照射(80mW/cm)，并用酶标仪在各时间点测定DMA的发射光强度(Ex:360nm；Em:440nm)。按照如下公式计算样品的单线态氧量子产率：
[0152]
[0153] 式中，A为660nm处的吸光度；K为DMA消耗速率的斜率；S为样品，而R为Ppa参照；ref.ΦΔ为游离光敏剂Ppa在DMSO中的单线态氧量子产率(0.50)。
[0154] 6、临界胶束浓度测试
[0155] 采用芘荧光法测量给药系统PPDP在超纯水中的临界胶束浓度(CMC)。首先，配制浓度为1mg/mL给药系统PPDP的母液，并稀释成不同的浓度。其次，准确称取1mg的芘，用5mL丙-4酮溶解，转移至50mL容量瓶定容，得到浓度为1.0×10 mol/L的芘丙酮溶液。然后，用移液枪移取5μL芘/丙酮溶液加入到一系列5ml容量瓶中，通N2将丙酮吹干，分别将上述不同浓度的给药系统PPDP溶液移入容量瓶中，得到一系列含芘探针的胶束溶液，浓度分别为100,60,
30,10,6,3,1,0.6,0.3,0.1,0.06,0.03μg/mL。最后，将上述胶束溶液置于37℃的恒温振荡器中振荡分散2h，测定芘的荧光激发光谱(Em:668nm,Ex:310.0～350.0nm)。
30,10,6,3,1,0.6,0.3,0.1,0.06,0.03μg/mL。最后，将上述胶束溶液置于37℃的恒温振荡器中振荡分散2h，测定芘的荧光激发光谱(Em:668nm,Ex:310.0～350.0nm)。
[0156] 7、稳定性测试
[0157] (1)光稳定性
[0158] 分别将100μL游离光敏剂Ppa的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液，以及给药系统PPDP的DMSO溶液、水溶液、PBS缓冲液加入到96孔板中，每组设置3个复孔，各组溶液浓度设置为游离光敏剂Ppa浓度为10μg/mL。实验中，用660nm的激光照射所有溶液10分钟(5mW/cm2)，每照射1分钟，便用酶标仪测定一次各孔在667nm处的吸光度或光密度OD值。最后，计算照射后各个时间点相对于初始时间点的吸光度或光密度下降的百分比。
[0159] (2)胶体稳定性
[0160] 通过监测给药系统PPDP在模拟生理条件下的尺寸变化来评价其胶体稳定性。将给药系统PPDP分别加入到含有10％FBS的超纯水和含有10％FBS的PBS中，浓度均设置为200μg/mL溶液。在常温下，利用Zetasizer Nano ZS纳米粒度-电位检测仪检测不同时间点给药系统PPDP在含有10％FBS的超纯水和含10％FBS的PBS中的粒径分布、表面电荷和分散度的变化情况。
[0161] 8、细胞内ROS测定
[0162] 将4T1细胞分于六孔板中，每孔分别加入同药物浓度(1μg/mL)的游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP进行处理，并设活性氧供氢体处理的阳性对照组和无任何处理的阴性对照组。避光孵育24h后，用PBS换液并用660nm激光照射(1J·cm2)，随后加入1μM荧光探针DCFH-DA(南京建成生物工程研究所)。37℃下孵育细胞30min后，再次用PBS换液，置于倒置荧光显微镜下观察。用于流式检测的细胞则用胰酶消化并离心收集，将收集好的细胞用PBS重悬，用流式细胞仪进行定量检测。波长设置：最佳激发波长500nm或485nm(500±15nm)，最佳发射波长525nm(530±20nm)。
[0163] 9、细胞系及细胞毒性实验
[0164] 本章研究工作中采用的细胞系为小鼠乳腺癌细胞4T1、非小细胞肺癌耐药株A549-R(购于南京凯基生物科技发展有限公司)，及人源正常肝细胞L02(购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，维持培养条件均为改良型1640培养基(Hyclone)，且处于37℃和5％CO2环境中培养。培养细胞前，需在培养基中加入10％胎牛血清(FBS，Excell，北美洲)和
1％双抗(青霉素和链霉素)。为考察给药系统PPDP的细胞毒性，向处于生长对数期的4T1细胞中分别加入同浓度梯度的Ppa和给药系统PPDP进行处理。每个浓度设置3个复孔，并设置无药处理的对照组、含有100μL培养基的培养孔则作为空白对照组。对于需要光照的实验组，需预先避光孵育24h，再按不同时间但相同的单位面积功率用660nm激光进行照射。随后，再经避光孵育24h，各孔用10mmol/L、pH为7.4的PBS清洗2遍，再加入100μL含10％CCK-8试剂的培养基孵育2h，随后用酶标仪(BIO-RAD)测定其在450nm处的光密度OD值。为了考察给药系统自身可能存在的毒性，采用上述方法将L02细胞接种并培养于96孔的培养板中，再在避光条件下用不同浓度的给药系统PPDP和空白载体材料PPD进行处理。最后，按相同方法得到不同实验孔的光密度OD值。细胞存活率(cell viability)均采用以下公式进行计算：
1％双抗(青霉素和链霉素)。为考察给药系统PPDP的细胞毒性，向处于生长对数期的4T1细胞中分别加入同浓度梯度的Ppa和给药系统PPDP进行处理。每个浓度设置3个复孔，并设置无药处理的对照组、含有100μL培养基的培养孔则作为空白对照组。对于需要光照的实验组，需预先避光孵育24h，再按不同时间但相同的单位面积功率用660nm激光进行照射。随后，再经避光孵育24h，各孔用10mmol/L、pH为7.4的PBS清洗2遍，再加入100μL含10％CCK-8试剂的培养基孵育2h，随后用酶标仪(BIO-RAD)测定其在450nm处的光密度OD值。为了考察给药系统自身可能存在的毒性，采用上述方法将L02细胞接种并培养于96孔的培养板中，再在避光条件下用不同浓度的给药系统PPDP和空白载体材料PPD进行处理。最后，按相同方法得到不同实验孔的光密度OD值。细胞存活率(cell viability)均采用以下公式进行计算：
[0165] Cell viability(％)＝(ODt-OD0)/(ODc-OD0)×100％
[0166] 式中，ODt：实验组光密度；OD0：空白组光密度；ODc：对照组光密度。
[0167] 10、细胞摄取实验
[0168] 通过激光共聚焦显微镜(CLSM)和流式细胞仪检测给药系统PPDP的细胞摄取情况。
[0169] 激光共聚焦测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×104个细胞/皿的数量接种到玻底培养皿中，经48小时的培养使之充分贴壁，加入同浓度(1μg/mL Ppa)游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP分别处理1h、3h和6h。移去旧培养基后，用PBS洗涤2次，再加入4％多聚甲醛缓冲液对细胞进行固定。10min后弃去缓冲液，用CLSM进行观察。激发波长：630nm，发射波长：660nm。
[0170] 流式细胞仪测试：将处于生长对数期的4T1细胞消化后以2×104个细胞/皿的数量接种到12孔板中，加入同药物浓度(1μg/mL)的游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP分别处理2h、6h和24h。按不同的时间点加入待测样品，最后用胰酶消化细胞，1000g离心3分钟收集细胞，用PBS洗涤2次后，离心收集细胞并用流式细胞仪进行荧光检测。波长设置：参照APC的荧光检测条件检测，激发波长：630nm，发射波长：660nm。
[0171] 11、药代动力学实验
[0172] 选择体重为20g左右的健康雌性BALB/c小鼠(5-6周龄)为研究对象进行药代动力学实验。将小鼠随机分为两组，每组7只，一组小鼠尾静脉注射游离光敏剂Ppa，另一组小鼠尾静脉注射给药系统PPDP，注射剂量为每只小鼠5mg/Kg的游离光敏剂Ppa。分别在注射后的5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h,24h,36h,48h,72h进行眼眶取血，并加入肝素管中，
400W功率超声粉碎10分钟，1000g离心10分钟，取上层血浆清液。最后，利用酶标仪建立游离光敏剂Ppa的标准曲线(667nm处的吸光度)，并再根据标准曲线计算每个血液样品中Ppa的含量。
400W功率超声粉碎10分钟，1000g离心10分钟，取上层血浆清液。最后，利用酶标仪建立游离光敏剂Ppa的标准曲线(667nm处的吸光度)，并再根据标准曲线计算每个血液样品中Ppa的含量。
[0173] 12、生物分布实验
[0174] 为考察给药系统PPDP在4T1模型小鼠体内分布的情况，分别给模型小鼠尾静脉游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP，注射剂量均为每只小鼠5mg/Kg的游离光敏剂Ppa。在1h至14d的时间内，用小动物活体成像系统Maestro in vivo imaging system(CRi,U.S.)检测小鼠的荧光信号。离体荧光成像实验则将模型小鼠按设置的时间点(1d,3d,5d,7d,10d,14d)随机分为2组，每组3只，经尾静脉注射等剂量的游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP，并设置注射生理盐水的小鼠为实验对照组。按照设置的时间点安乐处死小鼠，解剖取出主要脏器和肿瘤，进行离体荧光成像实验，并统计分析各时间点肿瘤的荧光强度。
[0175] 13、体内抗肿瘤药效评价
[0176] 本实验建立了2种肿瘤模型，在4T1肿瘤模型中，选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠(购于成都达硕生物科技有限公司)为接种对象建立小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型。将培养的4T1细胞重悬到PBS缓冲液中，按5×105/只的接种量注射到小鼠后肢及背部相交处的皮下。
待肿瘤体积达到50mm3时，将模型小鼠随机分为5组，每组6只，分别为生理盐水对照、游离光敏剂Ppa单次治疗组和2次治疗组、给药系统PPDP单次治疗组和2次治疗组。治疗方案为：从治疗开始的第1天起，每周对小鼠进行尾静脉注射一次，每次剂量为为每只小鼠5mg游离光敏剂Ppa/kg。在给药后的第3天按150J·cm2/只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm2,8min)。在第一次给药后的第25天，安乐处死并解剖小鼠，收集其主要脏器(肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)，用10％的中性甲醛缓冲液充分固定，并进行H&E染色和免疫组化分析。同时对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照以下公式计算抑瘤率(Tumor growth inhibition,TGI)：
待肿瘤体积达到50mm3时，将模型小鼠随机分为5组，每组6只，分别为生理盐水对照、游离光敏剂Ppa单次治疗组和2次治疗组、给药系统PPDP单次治疗组和2次治疗组。治疗方案为：从治疗开始的第1天起，每周对小鼠进行尾静脉注射一次，每次剂量为为每只小鼠5mg游离光敏剂Ppa/kg。在给药后的第3天按150J·cm2/只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm2,8min)。在第一次给药后的第25天，安乐处死并解剖小鼠，收集其主要脏器(肿瘤、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏)，用10％的中性甲醛缓冲液充分固定，并进行H&E染色和免疫组化分析。同时对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照以下公式计算抑瘤率(Tumor growth inhibition,TGI)：
[0177]
[0178] 式中， 对照组的平均瘤重， 实验组的平均瘤重。
[0179] 在耐药模型中，则选择6-8周龄的BALB/c裸鼠(购于四川省人民医院实验动物中心)为接种对象建立A549-R耐药株的异种移植瘤耐药模型。将培养的A549-R细胞重悬到PBS缓冲液中，按5×106/只的接种量注射到小鼠后肢及背部相交处的皮下。待肿瘤体积达到3
50mm时，将模型小鼠随机分为三组，每组5只，分别为生理盐水对照组、游离光敏剂Ppa治疗组、给药系统PPDP治疗组。在治疗开始的第1天起，每周尾静脉注射一次上述制剂，每次的剂量为每只小鼠5mg游离光敏剂Ppa/kg，在给药后的第3天按150J·cm2/只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm2,8min)，共治疗4次。在第一次给药后的第
63天，安乐死并解剖小鼠，取出小鼠的肿瘤进行离体荧光成像实验。同时，对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照上述相同公式计算抑瘤率。
50mm时，将模型小鼠随机分为三组，每组5只，分别为生理盐水对照组、游离光敏剂Ppa治疗组、给药系统PPDP治疗组。在治疗开始的第1天起，每周尾静脉注射一次上述制剂，每次的剂量为每只小鼠5mg游离光敏剂Ppa/kg，在给药后的第3天按150J·cm2/只的剂量对小鼠的肿瘤部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm2,8min)，共治疗4次。在第一次给药后的第
63天，安乐死并解剖小鼠，取出小鼠的肿瘤进行离体荧光成像实验。同时，对剥离后的肿瘤进行拍照记录并称重，按照上述相同公式计算抑瘤率。
[0180] 14、血液相容性实验
[0181] (1)红细胞形貌和聚集
[0182] 选取体重为20g左右的健康雌性BALB/c小鼠，抽取其新鲜血液储存抗柠檬酸钠管子中，加入PBS，1000g离心5分钟，将上层清液吸出，如此重复三次，搜集红细胞。向1.5mL的EP管中，加入20μL的红细胞，然后再加入100μL的给药系统PPDP溶液和空白载体材料PPD溶液，使材料的最终浓度为0.1mg/mL，1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL，用涡旋仪充分混匀。孵育15min后，1000g离心5分钟，弃去上清液，加入1mL 4％的多聚甲醛，用涡旋仪充分混匀，固定
5小时。将固定的红细胞重悬，吸取10-20μL悬浮液均匀涂在24孔板底部，然后依次用65％，
75％，85％，95％，100％的乙醇水溶液进行脱水。最后，在常温下自然风干。将样品喷金，用扫描电子显微镜观察红细胞的形态和聚集情况。在上述相同的条件下，以PBS作为对照组开展同样的实验。
5小时。将固定的红细胞重悬，吸取10-20μL悬浮液均匀涂在24孔板底部，然后依次用65％，
75％，85％，95％，100％的乙醇水溶液进行脱水。最后，在常温下自然风干。将样品喷金，用扫描电子显微镜观察红细胞的形态和聚集情况。在上述相同的条件下，以PBS作为对照组开展同样的实验。
[0183] (2)红细胞溶血
[0184] 选取体重为20g左右的健康雌性BALB/c小鼠，抽取其新鲜血液储存抗柠檬酸钠管子中，加入PBS，1000g离心5分钟，将上层清液吸出，如此重复三次，搜集红细胞。取一定量的红细胞，和PBS配成16％的红细胞悬液向1.5mL的EP管中，加入50μL的红细胞，然后再加入1mL的给药系统PPDP溶液和空白载体材料PPD，使材料的最终浓度为0.1mg/mL，1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL，用涡旋仪充分混匀。在上述相同的条件下，以1mL超纯水和PBS分别作为阳性对照组和阴性对照组开展同样的实验。将上诉样品孵育12h后，用涡旋仪充分混匀，1000g离心5分钟，吸取上层清液200μL于96孔板中，每组设置3个复孔，用酶标仪测定样品在540nm的OD值。按照如下公式计算样品溶血百分率：
[0185] 溶血率(％)＝(A-B)/(C-B)×100
[0186] 式中，A为给药系统PPDP溶液或空白载体材料PPD溶液测试的吸光度；B为PBS样品测试的吸光度；C为超纯水样品测试的吸光度。
[0187] 15、皮肤安全性评价实验
[0188] 选取体重为20g左右的健康雌性BALB/c小鼠，将背部脱毛三天后的小鼠随机分为四个组，依次为给药系统PPDP+光照、游离光敏剂Ppa+光照、只光照组和无任何处理的对照组，每组5只小鼠。对上述各组小鼠尾静脉注射一次上述制剂，每次的剂量为每只小鼠2mg游离光敏剂Ppa/kg，注射后立即对小鼠进行麻醉，并按150J·cm2/只的剂量对小鼠脱毛部位进行660nm的激光照射(功率为0.26W/cm2,10min，108J/cm2)。观察各组小鼠背部皮肤的情况，并拍照记录，根据表2对皮肤的光反应情况进行考核和评分。到4天后，安乐死小鼠并解剖，收集其背部皮肤，用10％的中性甲醛缓冲液充分固定，并进行H&E染色和免疫组化分析。
[0189] 表2皮肤反应评分表
[0190]
[0191] 16、统计学分析
[0192] 所有实验数据用SigmaPlot 12.5软件、GraphPad Prism 5软件和Microsoft Excel 2010软件进行统计处理。所有结果以means±SEM表示，并采用Student’s t test分析各组数据差异，P＜0.05为统计具有显著性差异。
[0193] 实验例1、本发明给药系统的载药量测试
[0194] 通过紫外-可见光分光光度计的检测结果表明本发明给药系统PPDP中，Ppa的载药量较高，为16.01％，可满足恶性肿瘤光动力治疗的需要。
[0195] 实验例2、本发明给药系统的自组装表征
[0196] 1、自组装体系的结构表征
[0197] 为了验证给药系统PPDP在水相溶液中是否真的存在自组装行为，分别以D2O或DMSO-d6溶剂将样品充分溶解，并在高分辨超导核磁共振波谱仪上进行测试。
[0198] 如图14所示，给药系统PPDP在以D2O作为溶剂的氢谱中，光敏剂Ppa的特征峰完全消失，这表明给药系统PPDP在水相溶液中通过自组装形成稳定的纳米结构，将光敏剂Ppa包裹在内部疏水区域，因此其特征峰被完全抑制(自组装示意图如图2所示)。
[0199] 2、自组装体系的形貌表征
[0200] 我们用透射电子显微电镜(TEM)对给药系统PPDP和未连接游离光敏剂Ppa的空白载体材料PEG-Peptide Dendrimer(PPD，化合物5)进行了观测。结果如图15所示，空白材料PPD由于缺乏游离光敏剂Ppa的疏水作用和π-π堆叠作用，无法达到亲疏水的平衡，并没有形成规整的球形结构。而给药系统PPDP因具有疏水效应、π-π堆叠等分子间的相互作用形成了较为规整的球形纳米颗粒。
[0201] 3、自组装体系的粒径表征
[0202] 我们利用动态光散射粒度仪(DLS)对给药系统PPDP的水相粒径进行了表征(如图15和表3所示)，其在纯水中的水相粒径为160nm左右，而PBS中的水相粒径相对减小为100nm左右，且单分散系数PDI均小于0.3。
[0203] 表3给药系统PPDP在不同溶液中粒径、表面电荷和分散度
[0204]
[0205] 4、自组装体系的临界胶束浓度(CMC)表征
[0206] 为进一步考察给药系统PPDP的组装行为，我们进一步对其临界胶束浓度进行测定。结果如图17所示，通过对芘探针的荧光测定和线性拟合曲线公式的计算，测得给药系统PPDP在水相的CAC值为1.76μg/mL，该临界浓度远远低于实际应用中所需要的浓度，这表明给药系统PPDP在水相环境非常容易通过自组装而聚集，这与体外稳定性监测的实验结果是相符的。
[0207] 5、自组装体系在纯水和PBS中的胶体稳定性表征
[0208] 为进一步研究给药系统PPDP的稳定性，我们通过在纯水和PBS中加入10％的胎牛血清(FBS)来模拟体内的体液环境，并将纳米PPDP溶解于上述溶液中进行水相粒径的测定实验。结果如图18所示，在两种溶液中，给药系统PPDP均可在较长的时间内维持恒定的粒径大小。在长达7天的时间内，给药系统PPDP的粒径和PDI均处于较为稳定的状态，变化幅度较小且无统计学差异。该结果表明，给药系统PPDP在水相所形成的纳米结构在体液环境下仍具有较好的稳定性。
[0209] 综合上述的实验结果，给药系统PPDP能在水相环境中通过自组装形成尺寸均一、单分散性良好、稳定性高且带弱负电荷的纳米颗粒。
[0210] 实验例3、本发明给药系统PPDP的光稳定性表征
[0211] 1、紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱表征
[0212] 首先观测给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在不同待测溶液中溶解的颜色(图19所示)，发现二者有着相似的颜色变化特性，二者在水相和有机溶剂的溶液颜色均有着显著的差别。在DMSO中，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的溶液颜色相同；但在水相环境中，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的溶液颜色却不相同。这表明纳米PPDP在水相中的自组装行为对光敏剂Ppa产生了一定的影响。
[0213] 然后测定给药系统PPDP在不同溶剂环境中的紫外-可见光吸收光谱和荧光发射光谱。光谱实验的结果进一步探究了上述影响作用。结果如图20所示，给药系统PPDP在有机溶剂中处于完全分散的状态，共价偶联没有影响光敏剂Ppa的紫外-可见光光谱，二者的特征吸收波长保持一致。此外，由于游离光敏剂Ppa水溶性差而给药系统PPDP易溶于水，因此游离光敏剂Ppa在水相的吸收强度显著低于给药系统PPDP。而在纯水或PBS的水相环境中，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa均发生了特征吸收波长(670nm)的红移，且吸收强度也显著低于在有机相中的吸收强度。而在水溶液中加入表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)后，给药系统PPDP的聚集结构受到破坏，其特征吸收峰又发生了蓝移，且吸收峰的位置和吸收强度与其在有机溶剂中的相近。而SDS的增溶作用也增强了游离光敏剂Ppa的吸收强度。该结果表明给药系统PPDP在水相中发生自组装聚集后，因内部的光敏剂Ppa的聚集发生了特征吸收峰红移，但受表面活性剂破坏而处于分散状态后，该吸收峰又发生了蓝移。荧光发射光谱结果则显示，给药系统PPDP在不同的溶液环境中会发生不同程度的荧光淬灭效应。给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在有机溶剂中均处于完全分散的状态，因而它们的发射光谱基本一致。而在纯水和PBS中，给药系统PPDP发生荧光淬灭，淬灭率在98％以上(表4)。但在给药系统PPDP的水相溶液中加入SDS后，随着SDS浓度的增加，其发射光荧光可逐渐恢复，其淬灭率均可降低到15％以下。荧光发射光谱的现象表明给药系统PPDP能在水相环境中通过自组装聚集诱导荧光淬灭，而当聚集结构被破坏后，其荧光又可恢复。
[0214] 以上光谱实验的结果表明，给药系统PPDP并未改变光敏剂Ppa的基本光学性质，其荧光淬灭效应是因其自组装聚集行为导致的，但在自组装结构被破坏后光敏剂的荧光又会恢复。
[0215] 表4给药系统PPDP在不同溶剂环境中的荧光淬灭率
[0216]
[0217] 2、不同溶剂中的光稳定性实验表征
[0218] 我们通过光稳定性实验对给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的光稳定性同时进行了考察。结果如图21所示，在DMSO中，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa光吸收强度均有一定程度的减弱，但给药系统PPDP减弱的程度显著低于游离光敏剂Ppa，表明共价偶联光敏剂Ppa到PEG-Peptide线性-树状共聚物上对其有一定的保护作用。而在水相环境中，给药系统PPDP同样显示出显著的光稳定性，没有明显的吸光强度下降趋势，而游离光敏剂Ppa仍有一定程度的下降。这可能是由于给药系统PPDP在水相中的自组装行为对其内部的光敏剂Ppa产生了保护作用。
[0219] 光稳定性的实验表明，给药系统PPDP显著提高了游离光敏剂Ppa的光稳定性，在体内光动力治疗研究中具有潜在应用的前景。
[0220] 实验例4、本发明给药系统的单线态氧量子产率、摩尔消光系数和荧光量子产率测试
[0221] 摩尔消光系数、荧光量子产率和单线态氧量子产率是比较和评估光敏剂是否理想的重要指标。如图20和表5所示，给药系统PPDP最大吸收峰刚好落在理想光敏剂应在的600～800nm波长范围内，虽然其摩尔消光系数和荧光量子产率均略低于游离光敏剂Ppa，但完全满足理想光敏剂的要求。如图22所示，在660nm激光照射的过程中下，DMA溶液在空气中的荧光强度衰减速率较慢，因此可以忽略DMA自身氧化带来的干扰。同时，游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP溶液在370nm的激发光激发下在440nm处均不产生荧光，故也可排除光敏剂本身产生荧光的干扰，且所测含游离光敏剂Ppa或给药系统PPDP的DMA溶液的荧光强度值与光照时间呈一级动力学关系。通过计算，给药系统PPDP的单线态氧量子产率为0.51略高于游离光敏剂Ppa，表明给药系统PPDP具有较强的光敏化作用。
[0222] 以上研究表明，给药系统PPDP具有较高的摩尔消光系数和荧光量子产率和单线态氧量子产率，满足理想光敏剂的对光物理性质的要求，因此有必要进一步对其生物学效应进行深入的研究。
[0223] 表5给药系统PPDP的相关光学参数
[0224]
[0225] 实验例5、本发明给药系统的体外细胞评价
[0226] 1、细胞毒性试验
[0227] 为考察给药系统PPDP对肿瘤细胞的光动力治疗效果，我们通过CCK-8法比较了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa对4T1小鼠乳腺癌细胞的细胞毒性。
[0228] 结果如图23所示，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在所测试的各照射剂量下对4T1细胞均显示出较强的细胞毒性，且随着激光照射剂量的增加，IC50值也随之降低，细胞毒性也跟着增强。此外，在各对应的光照射剂量下，游离光敏剂Ppa的细胞毒性强于给药系统PPDP。一方面，小分子和大分子有着不同的入胞途径，这可能会导致入胞速率和入胞量的差异。另一方面，还必须考虑游离光敏剂Ppa自身对细胞的毒性作用。
[0229] 如图23所示，在避光条件即光照射剂量为0J时，游离光敏剂Ppa对4T1细胞仍表现出显著的细胞毒性。而给药系统PPDP改善了光敏剂Ppa自身的毒性作用，在避光条件下对4T1细胞的毒性明显低于游离光敏剂Ppa。我们以同样的方法检测了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在避光条件下对L02人源正常肝细胞的毒性，结果显示游离光敏剂Ppa对L02细胞产生了显著的细胞毒性，而给药系统PPDP的在所有检测浓度下均未导致L02细胞存活率的下降。
[0230] 为进一步验证载体材料的安全性，我们还考察了未连接光敏剂Ppa的载体材料PPD对L02细胞的毒性。实验的结果显示(图23)，载体材料PPD在各浓度下(0.66–41.97μg/mL，为PDT细胞毒性实验中给药系统PPDP在各浓度下所对应的载体材料PPD的浓度)对L02细胞分别处理24小时和48小时，2个时间点均未导致明显的细胞毒性，细胞存活率均在100％左右。在更高浓度下(167.88μg/mL，为PDT细胞毒性实验中对应最高载体材料浓度的4倍)，载体材料PPD仍未导致明显的细胞毒性，未见细胞存活率显著降低。
[0231] 这些实验结果证明了本发明线性-树状共聚物对细胞具有良好的相容性，从而显著降低了光敏剂Ppa自身对细胞的毒性作用。由此可推测，给药系统PPDP在体内应用时仍能有效地降低光敏剂Ppa自身的毒副作用。
[0232] 2、细胞摄取实验
[0233] 由于给药系统PPDP中的光敏剂Ppa是通过相对稳定的酰胺键共价偶联的，而光敏剂Ppa在激发条件下能产生较强的荧光发射光。因此，可通过对光敏剂Ppa荧光信号的检测来研究给药系统PPDP的入胞情况。
[0234] 为了考察给药系统PPDP的入胞效率，我们首先通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在胞内的荧光信号强度变化。结果显示(图24)，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa均能在孵育1h、3h和6h过程中，在胞内检测到较强的荧光信号。而游离光敏剂Ppa的入胞速率高于给药系统PPDP，在所测的三个时间点均有着更强的荧光信号。
[0235] 为进一步比较给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的入胞效率，我们通过流式细胞仪对胞内的荧光信号强度进行了定量测定。结果如图24所示，游离光敏剂Ppa仍有着更高的入胞速率和入胞量，在2h至6h阶段，游离光敏剂Ppa在胞内荧光强度增加显著，而6h至24h阶段的胞内荧光信号强度的增加不明显。而给药系统PPDP尽管在各个时间点的胞内荧光信号强度均低于游离光敏剂Ppa，但不同的是给药系统PPDP在整个时间段的胞内信号强度均在持续增加。这表明给药系统PPDP改变了光敏剂Ppa的入胞方式，游离光敏剂Ppa可能主要是通过主动转运途径入胞，该途径可因转运体底物浓度过高而饱和，因而入胞速率有先快后慢的变化；而给药系统PPDP作为纳米颗粒是通过胞吞方式入胞，故而入胞速率较慢，但持续时间更长。
[0236] 结合体外毒性实验的结果，可以看出，尽管给药系统PPDP改变了光敏剂Ppa的入胞方式，但仍可有效且持续地入胞，并能在激光照射下有效杀死肿瘤细胞。
[0237] 3、胞内ROS生成测试
[0238] 为进一步探讨给药系统PPDP对肿瘤细胞产生细胞毒性的机制，以及仅光照是否对细胞产生影响，我们利用荧光探针DCFH-DA对胞内的活性氧(ROS)进行检测，比较了不同条件下细胞内的ROS生成情况。首先，我们通过荧光显微镜的观测，定性比较了各条件下的ROS产生情况。结果如图25(A)所示，所使用的探针浓度没有显著的背景信号，不会干扰阳性结果。仅激光照射条件下，胞内观测到的荧光信号强度与探针的背景信号相当，表明仅光照不会导致胞内ROS水平的提高。而活氢供体过氧化氢的阳性对照组则显示出了较强的绿色阳性荧光信号，表明所使用的探针浓度能有效监测出胞内增加的ROS。此外，与给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa孵育后的细胞，在经特定波长(660nm)的激光照射后，也产生了显著的绿色荧光信号。
[0239] 这些结果表明，光敏剂和特定波长激光的共同参与才能发挥光动力治疗的效果，并且所需激光照射的强度并不高，只光照并不会影响胞内ROS的变化。另一方面，给药系统PPDP没有改变光敏剂在细胞内产生毒性作用的方式，仍能在胞内经光照后产生大量的ROS杀灭肿瘤细胞。
[0240] 此外，我们还通过流式细胞仪对胞内的荧光信号强度进行了半定量的测定，来更精确地研究各条件下胞内ROS的产生情况。结果同样显示(图25(B))，在经光照后，给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa均能有效地在胞内产生ROS。游离光敏剂Ppa产生的ROS荧光强度略高于给药系统PPDP但无统计学的差异。
[0241] 这表明在相同的光敏剂浓度和光照强度下，给药系统PPDP仍能高效地在肿瘤细胞内产生具细胞毒性作用的ROS。
[0242] 实验例6、本发明给药系统PPDP的生物安全性
[0243] 1、血液相容性
[0244] 给药系统PPDP经静脉注射给药后，会直接与血液中的细胞发生作用。由于红细胞是血液中含量最高的细胞，在血液相容性评价中，常作为研究对象来考察外源物质对血液的影响。同时红细胞膜可作为一个实际可行的预测模型来研究外源物质对哺乳动物细胞膜的作用。为考察给药系统PPDP的血液相容性，我们研究了给药系统PPDP和载体材料PPD对红细胞的形貌、聚集和溶血行为的影响。
[0245] 我们首先通过扫描电子显微镜(SEM)对红细胞的形貌和聚集情况进行了观测。如图26所示，与PBS处理的红细胞进行对照，给药系统PPDP和载体材料PPD在所测的各浓度(0.1mg/mL至10mg/mL)下均未导致红细胞形貌和聚集的异常。低倍下，经不同浓度给药系统PPDP和载体材料PPD孵育过的红细胞具有良好的分散性；在更高的放大倍数下，红细胞膜表面光滑完整，呈现正常的双凹结构，和PBS对照组相比，没有明显的结构变化。因此，给药系统PPDP和载体材料PPD对红细胞的形貌和聚集状态没有明显的负面影响，血液相容性良好。
[0246] 我们随之进行红细胞的溶血实验，其结果如图27所示，给药系统PPDP和载体材料PPD在所测的各浓度下均未导致明显的溶血现象。0.1mg/mL,1mg/mL，5mg/mL和10mg/mL浓度下的给药系统PPDP和载体材料PPD对红细胞溶血率，均没有超过5％的溶血率阈值。
[0247] 以上研究结果，表明给药系统PPDP和载体材料PPD在所测的各浓度下均未导致红细胞溶血现象的发生，更不会引起红细胞膜的破坏和血红蛋白的异常释放，证明本发明PEG-Peptide线性-树状共聚物作为载体材料有着良好血液安全性，即便共价偶联光敏剂Ppa仍不能对其产生不良影响。
[0248] 2、皮肤光毒性测试
[0249] 由于游离光敏剂Ppa在体内的分布缺乏选择性，因而在皮肤分布的光敏剂会在光照后对皮肤造成光毒性。以FDA批准的第一代光敏剂porfimer sodium为例，患者在接受PDT治疗阶段必须处于完全避光的状态，才能有效地避免毒副反应，对疾病的治疗造成了诸多不便及患者的依从性不佳。为了考察给药系统PPDP是否也存在显著的皮肤光毒性，我们进行了皮肤光毒性评价实验。
[0250] 结果如图28所示，在激光照射后，各处理组小鼠背部的照射区域并未立即产生明显的毒性反应。然而在一天后，游离光敏剂Ppa组的小鼠的背部照射区域出现了明显的红斑和中度的水肿，并随着时间的推移症状逐渐加重。而与对照组相比较，给药系统PPDP组的小鼠并未产生显著的皮肤毒性反应，在照射后各个时间点均未检测到皮肤有异常的症状。另一方面，仅用相同强度的激光对小鼠的背部皮肤进行照射，同样未造成照射区域皮肤的异常，表明游离光敏剂Ppa组小鼠皮肤的毒性反应是由光敏剂引起的。
[0251] 皮肤光毒性的实验表明。以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的光动力给药系统能显著降低光敏剂Ppa的皮肤光毒性，在临床光动力治疗研究中具有重大的现实意义。
[0252] 实验例7、给药系统PPDP的药动学和生物分布
[0253] 光敏剂的肿瘤靶向性差导致其在临床光动力治疗的效果不尽如人意。为了研究以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的给药系统PPDP能否也能改善光敏剂Ppa对肿瘤部位的靶向性，我们构建了小鼠异种移植瘤模型，比较了游离光敏剂Ppa和给药系统PPDP在荷瘤小鼠体内的分布情况。
[0254] 我们首先通过荧光活体成像实验进行观测(图29)，从3h起给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa均能在肿瘤部位检测到一定的荧光信号，但二者达到最强荧光信号的时间点却有所不同。给药系统PPDP在肿瘤部位的荧光信号在第3天左右达到最强，而游离光敏剂Ppa则在24h左右达到最强信号。此外，从12h起，给药系统PPDP于各时间点在肿瘤部位的荧光信号均强于游离光敏剂Ppa，而且至第9天时才出现明显的荧光信号下降。此外，给药系统PPDP至第14天仍能在肿瘤部位检测到明显的荧光信号，而光敏剂Ppa从第3天起就仅有微弱的残留信号。
[0255] 离体荧光成像实验也显示了与活体荧光成像实验相符的结果(图30)。给药系统PPDP在所有时间点检测到的肿瘤荧光信号均强于游离光敏剂Ppa，且至第5天才出现一定程度的荧光信号值下降，而达到最强信号的时间点也与活体荧光成像实验的结果基本一致。游离光敏剂Ppa从注射后的第1天起，肿瘤荧光信号逐渐减弱，而给药系统PPDP在达到最大肿瘤荧光信号后仍能维持较长的时间(第7天与第14天的荧光信号强度相近，且并无统计学差异)。我们还将剥离的肿瘤匀浆研磨后进行了提取，通过荧光分光光度计对肿瘤中的光敏剂进行了定量检测，其结果与荧光信号的测定基本一致，给药系统PPDP仍有着较长的肿瘤滞留时间。此外，我们通过制作冰冻切片比较了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa在肿瘤部位分布的微观情况。结果如图30所示，与定量实验相符合，给药系统PPDP有着更长的肿瘤滞留时间，其荧光信号可持续至第14天。同时，给药系统PPDP的荧光信号广泛分布于血管的近端和远端，表明给药系统PPDP有着较强的肿瘤组织渗透性。
[0256] 为了进一步研究以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的给药系统PPDP对光敏剂Ppa体内过程的影响，我们通过药动学研究比较了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa注射后在小鼠血液中的浓度变化情况。结果如图32所示，游离光敏剂Ppa在血液会被快速清除，仅能在12h内检测到荧光信号，之后便低于检测限而无法测定。而给药系统PPDP至72h仍能检测到荧光信号。因此，给药系统PPDP的消除相半衰期约为20h，显著长于游离光敏剂Ppa的4h。同时，给药系统PPDP的曲线上峰面积AUC显著高于游离光敏剂Ppa(表6)，而清除率CL显著低于游离光敏剂Ppa，稳态平均滞留时间MRT也显著大于游离光敏剂Ppa。这些药动学的参数均表明给药系统PPDP显著延长了光敏剂Ppa的血液循环时间，为光敏剂的肿瘤滞留提供了重要基础。
[0257] 表6给药系统PPDP和Ppa的药动学参数
[0258]
[0259] a t1/2:药物半衰期；b AUC:曲线下峰面积；c CL:清除率；d MRT:平均驻留时间；e Vz:表观分布容积。
[0260] 上述的实验结果表明，给药系统PPDP显著改变了光敏剂Ppa在体内的分布，延长了光敏剂在肿瘤部位的滞留时间。给药系统PPDP具备的肿瘤长滞留这一特点，既使得其在治疗过程中对照射的时间选择更为灵活，且在治疗过程还可通过对荧光信号的检测来监测肿瘤的实时变化情况，使得预后评估更加及时准确。
[0261] 实验例8、给药系统PPDP的体内抗肿瘤评价
[0262] 为了验证给药系统PPDP在体内的抗肿瘤效果，我们选择4T1小鼠乳腺癌细胞在雌性BALB/c小鼠皮下建立了小鼠乳腺癌移植瘤模型。以注射生理盐水(Saline)的小鼠为对照组，比较了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa的抗肿瘤效果。由于之前的实验中已验证了给药系统PPDP有较长的肿瘤滞留时间，我们又增加了每周治疗一次且只治疗1次和每周治疗一次且治疗2次的实验组，同时均在注射后的第3天进行光照。
[0263] 结果如图33所示，无论是治疗1次还是治疗2次，给药系统PPDP均有着显著优于游离光敏剂Ppa的抗肿瘤效果。其中，治疗2次的给药系统PPDP组有着最佳的治疗效果，有三只小鼠的肿瘤在治疗后完全消失。同时，给药系统PPDP有着显著更高的抑瘤率(TGI)，单次治疗组为79.00％，2次治疗组为91.77％。而游离光敏剂Ppa组的抑瘤率仅为11.59％和17.14％。
[0264] 为进一步验证给药系统PPDP的抗肿瘤效果，在抗肿瘤实验结束后，对剖离的肿瘤组织进行切片，考察了提示肿瘤组织中新生血管程度的免疫组化指标CD-31的阳性率和提示肿瘤组织中细胞凋亡水平的指标TUNEL的阳性率。实验结果显示(图34)，与肿瘤生长抑制的情况相符，给药系统PPDP可导致肿瘤组织凋亡水平的显著升高并显著降低CD-31的表达水平，表明经过给药系统PPDP的光动力治疗，可有效抑制肿瘤组织血管的生成并促进肿瘤细胞的凋亡。
[0265] 为了考察给药系统PPDP是否对耐药肿瘤模型也有较好的抗肿瘤效果，我们以具有多药耐药性A549-R细胞为研究对象，在裸鼠上构建了异种移植的耐药模型。以生理盐水(Saline)为对照，比较了给药系统PPDP和游离光敏剂Ppa对体内耐药肿瘤的抑制效果。由于给药系统PPDP具有较长的肿瘤滞留时间，故仍选择每周注射一次光敏剂并在注射后的第3天进行光照，共治疗4次。结果如图35所示，在长达9周的治疗期中，给药系统PPDP治疗组表现出显著优于游离光敏剂Ppa的抗肿瘤效果，抑瘤率达到了90.12％。而游离光敏剂Ppa治疗组的肿瘤体积达到了660.39±34.79mm3，瘤重达到了542.40±126.63mg，抑瘤率仅为25.66％。
[0266] 所以，以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的光动力给药系统充分发挥了载体材料的优势，使得该给药系统不仅改善了光敏剂Ppa水溶性和毒性，还赋予了其较长的血液循环时间和肿瘤滞留时间，同时实现了对对肿瘤治疗过程的实时监测和评估，最终在体内抗肿瘤实验中取得了显著的抑瘤效果。因此，以PEG-Peptide线性-树状共聚物为载体材料构建的光动力给药系统是一种安全性高且能有效地抑制恶性肿瘤的治疗手段。
[0267] 综上，本发明设计并构建了两亲性的LD型PEG-Peptide线性-树状共聚物-焦脱镁叶绿酸a光动力给药系统PPDP，该给药系统可在选择性溶剂中自组装形成尺寸均一、单分散性良好、稳定性高且带弱负电荷的纳米颗粒，其不仅具有优良的光物理特性，还能有效地产生ROS实现对肿瘤细胞的杀灭；其显著降低了光敏剂的皮肤光毒性；其不仅表现出较好的生物安全性、优异的荧光成像功能、血液长循环功能和长时间和高浓度的肿瘤靶向和富集效应，还具有显著的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物中显示出良好的应用前景。
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