气相沉积涂覆的流动路径用于改善金属相互作用分析物的色谱法的用途
阅读：891发布：2020-05-08
专利汇可以提供气相沉积涂覆的流动路径用于改善金属相互作用分析物的色谱法的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种用于分离分析物的装置。所述装置具有样品 注射器 ，样品注射针，与所述样品注射器连通的样品贮存器容器，在所述样品注射器下游的色谱柱，以及连接所述样品注射器和所述柱的 流体 导管 。所述流体导管、所述样品注射器、所述样品贮存器容器和所述柱的5个内表面形成具有润湿表面的流动路径。所述流动路径的所述润湿表面的一部分涂覆有烷基甲 硅 烷基涂层，所述烷基甲硅烷基涂层对所述分析物中的至少一种是惰性的。所述烷基甲硅烷基涂层具有式I： R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷 氧 基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤。RA表示与流体系统的内表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。，下面是气相沉积涂覆的流动路径用于改善金属相互作用分析物的色谱法的用途专利的具体信息内容。
1.一种用于分离样品中的分析物的色谱装置，包括：
样品注射器，所述样品注射器具有用于将所述样品注射到流动相中的样品注射针；
样品贮存器容器，所述样品贮存器容器与所述样品注射器流体连通；
在所述样品注射器的下游的色谱柱，所述色谱柱具有流体连接器；以及
流体导管，所述流体导管连接所述样品注射器和所述色谱柱；
其中所述流体导管、所述样品注射器、所述样品贮存器容器和所述色谱柱的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径；并且
其中所述流体流动路径的所述润湿表面的至少一部分涂覆有烷基甲硅烷基涂层，其中所述烷基甲硅烷基涂层对所述样品中的所述分析物中的至少一种是惰性的，所述烷基甲硅烷基涂层具有式I：
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤；
RA表示与所述流体系统的所述内表面的连接点；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA；并且
X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。
2.根据权利要求1所述的色谱装置，其中所述烷基甲硅烷基涂层具有至少15°，小于或等于30°，或者小于或等于90°的接触角。
3.根据权利要求1所述的色谱装置，还包括所述色谱柱下游的检测器，并且其中所述流体流动路径还包括所述检测器。
4.根据权利要求3所述的色谱装置，其中所述检测器为质谱仪，并且所述流体流动路径包括电喷针的润湿表面。
5.根据权利要求1所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
6.根据权利要求1所述的色谱装置，还包括与所述式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层，所述第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
其中
R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤；
R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代；
RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3，4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0；并且
y为0至20的整数。
7.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)丙基三氯硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)丙基三甲氧基硅烷、或水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
8.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I和式II的烷基甲硅烷基涂层提供约0°至约105°的期望接触角。
9.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
10.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
11.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氧硅烷。
12.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。
13.根据权利要求6所述的色谱装置，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷。
14.根据权利要求1所述的色谱装置，还包括具有式III的烷基甲硅烷基涂层，其与所述式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触，
其中
R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤；并且
Z为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。
15.根据权利要求14所述的色谱装置，其中所述式III的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
16.根据权利要求14所述的色谱装置，其中所述式1的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式III的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
17.一种分离包含聚糖、肽或杀虫剂的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述聚糖、所述肽或所述杀虫剂的所述样品引入到流体系统中，所述流体系统包括设置在所述流体系统内部的流动路径，所述流动路径包括具有式I的烷基甲硅烷基涂层：
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤；
RA表示与所述流体系统的所述内表面的连接点；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA；并且
X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-；以及
与所述式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层，所述第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
其中
R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤；
10 B
R 选自(C1-C6)烷基、-OR、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代；
RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3，4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0；并且
y为0至20的整数；以及
通过所述流体系统洗脱所述样品，从而隔离所述聚糖、所述肽或所述杀虫剂。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氯硅烷。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氯硅烷。
20.一种分离包含柠檬酸循环代谢物的样品的方法，所述方法包括：
将包含所述柠檬酸循环代谢物的所述样品引入到流体系统中，所述流体系统包括设置在所述流体系统的内部的流动路径，所述流动路径包括具有式I的烷基甲硅烷基涂层：
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤；
A
R表示与所述流体系统的所述内表面的连接点；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA；并且
X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-；以及
与所述式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层，所述第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
其中
7 8 9
R、R 和R各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤；
R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代；
RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3，4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0；并且
y为0至20的整数；以及
通过所述流体系统洗脱所述样品，从而隔离所述柠檬酸循环代谢物。
21.根据权利要求17和20所述的方法，其中所述流动路径至少部分地由所述色谱柱的内表面限定。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述流动路径进一步至少部分地由通过所述色谱柱的熔块的通道限定。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述流动路径进一步至少部分地由管材的内表面限定。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述式II的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且所述式II的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。
26.一种定制用于分离样品的流体流动路径的方法，所述方法包括：
评估所述样品中分析物的极性；
基于所述样品中的所述分析物选择色谱介质；
以及基于所述样品中的所述分析物的所述极性选择烷基甲硅烷基涂层，其中所述烷基甲硅烷基涂层对于所述样品中的所述分析物是惰性的，所述烷基甲硅烷基涂层具有式I：
其中
R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤；
RA表示与所述流体流动路径的润湿表面的连接点；
R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA；并且
X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-；以及
通过将所述烷基甲硅烷基涂层气相沉积到所述流体流动路径的所述润湿表面上来调节所述流体流动路径的所述润湿表面的疏水性。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述样品中的所述分析物以在归属于所述色谱介质的保留率的10％内的保留率，归属于所述色谱介质的保留率的5％内的保留率，或归属于所述色谱介质的保留率的1％内的保留率来保持。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述烷基甲硅烷基涂层提供约0°或约95°的期望接触角。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述流体流动路径的所述润湿表面至少部分地由柱的内表面或样品注射针的内表面限定。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述流体流动路径的所述润湿表面从样品注射针的内表面延伸穿过所述柱的内表面。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述流体流动路径的所述润湿表面从设置在整个所述流体系统中的样品注射针的内表面上游并与其流体连通的样品贮存器容器延伸到连接器或检测器的端口。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述检测器是质谱仪，并且所述流体流动路径的所述润湿表面包括电喷针的内表面。
33.根据权利要求17、20和26中任一项所述的方法，其中所述式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
34.根据权利要求26所述的方法，还包括用硅烷化试剂改性所述式I的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的所述烷基甲硅烷基涂层。
35.根据权利要求26所述的方法，还包括通过气相沉积与式I的所述气相沉积的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层来调节所述流体流动路径的所述润湿表面的所述疏水性，所述第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
其中
R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤；
R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、-[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、-[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代；
RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3，4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH；
R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0；并且
y为0至20的整数。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷、或水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述式I和式II的烷基甲硅烷基涂层提供约0°至约105°的期望接触角。
38.根据权利要求35所述的方法，还包括用硅烷化试剂改性所述式II的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的所述烷基甲硅烷基涂层。
39.根据权利要求26所述的方法，还包括评估所述色谱介质的极性，以及基于所述分析物和所述色谱介质的所述极性选择所述烷基甲硅烷基涂层。
40.一种定制用于分离样品的流体流动路径的方法，所述方法包括：
(a)在所述流体流动路径的润湿表面上渗透式III的烷基甲硅烷基的气化源；
其中
R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤；并且
Z为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-；以及
(b)控制将式III的第一涂层沉积在所述流体流动路径的所述润湿表面上的温度和压力，所述第一涂层具有至少 的厚度和至少15°的接触角。
41.根据权利要求40所述的方法，还包括在沉积所述式III的第一涂层之前用等离子体预处理所述流体流动路径的所述润湿表面。
42.根据权利要求40所述的方法，还包括用硅烷化试剂改性所述式III的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的所述烷基甲硅烷基涂层。
43.根据权利要求34、38和42中任一项所述的方法，其中所述硅烷化试剂为非挥发性两性离子。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述非挥发性两性离子为磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。
45.根据权利要求34、38和42中任一项所述的方法，其中所述硅烷化试剂为酸性或碱性硅烷。
气相沉积涂覆的流动路径用于改善金属相互作用分析物的色
谱法的用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年9月18日提交的名称为“Use of Vapor Deposition Coated Flow Paths for Improved Chromatography of Biomolecules(气相沉积涂覆的流动路径用于改善生物分子的色谱法的用途)”的美国临时申请no.62/559,895的优先权和权益。本申请还要求2018年9月17日提交的名称为“Use of Vapor Deposition Coated Flow Paths for Improved Chromatography of Metal Interacting Analytes(气相沉积涂覆的流动路径用于改善金属相互作用分析物的色谱法的用途)”的美国专利申请no.16/133,089的优先权和权益，该美国专利申请要求2017年9月18日提交的名称为“Use of Vapor Deposition Coated Flow Paths for Improved Chromatography of Biomolecules(气相沉积涂覆的流动路径用于改善生物分子的色谱法的用途)”的美国临时专利申请no.62/559,895的优先权。这些申请中的每个的内容据此全文以引用方式并入本文。
技术领域
[0003] 该技术涉及气相沉积涂覆的流动路径用于改善色谱法的用途。更具体地讲，该技术涉及用于分离具有涂覆的流动路径的样品中的分析物的色谱装置，使用包括涂覆的流动路径的流体系统来分离样品(例如，聚糖、肽、杀虫剂和柠檬酸循环代谢物)中的分析物的方法，以及定制用于分离样品的流体流动路径的方法。
背景技术
[0004] 与金属相互作用的分析物通常被证明分离极具挑战性。对于拥有具有最小分散度的耐高压色谱系统的期望已经要求流动路径的直径减小并且能够以越来越快的流速承受越来越高的压力。因此，色谱流动路径选择的材料本质上通常是金属的。尽管存在以下事实：已知某些分析物(例如，生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物和两性离子比如氨基酸和神经递质)的特性与金属表面具有不利的相互作用(所谓的色谱次级相互作用)。
[0005] 所提出的用于金属特异性结合相互作用的机制需要理解路易斯酸碱化学理论。纯金属和金属合金(连同它们的对应氧化物层)具有末端金属原子，该末端金属原子具有路易斯酸特性。更简单地，这些金属原子显示出接受供体电子的倾向。对于带有正电荷的任何表面金属离子而言，这种倾向甚至更为明显。具有足够的路易斯碱特性的分析物(任何可以提供非键电子的物质)可能吸附到这些位点，并且因此形成有问题的非共价复合物。正是这些物质被定义为与金属相互作用的分析物。
[0006] 例如，具有磷酸酯基团的分析物是能够进行高亲和力金属螯合的优异的多齿配体。这种相互作用导致磷酸化物质与流动路径金属结合，从而减少检测到的此类物质的量，这是特别麻烦的效应，因为磷酸化物质常常是测定中最重要的分析物。
[0007] 分析物的其他特性同样可引起问题。例如，羧酸酯基团也具有螯合到金属的能力，尽管亲和力比磷酸酯基团低。然而，羧酸酯官能团在例如生物分子中是普遍存在的，从而为累积的基于多齿的吸附损失提供了机会。这些复杂性不仅可存在于肽和蛋白质上，而且还存在于聚糖上。例如，N-聚糖物质有时可以包含一个或多个磷酸酯基团以及包含唾液酸残基的一种或多种羧酸酯。另外，较小的生物分子(诸如核苷酸和糖类，比如糖磷酸酯)可表现出与前述N-聚糖分子类似的行为。此外，色谱次级相互作用对于生物分子特别是较大的结构可能尤其成问题，因为它们具有形成微环境的能力(通过其大小和结构顺序)，该微环境可能与分离部件和流动路径表面发生不利的相互作用。在这种情况下，具有较大结构的生物分子或分析物可呈现具有化学性质的结构区域，该化学性质放大与流动路径的材料的次级相互作用。与累积的金属螯合效应结合，这缩减了生物分子、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物和两性离子比如氨基酸和神经递质的总体有效分离。
[0008] 使用金属流动路径的替代方案是使用由聚合物材料诸如聚醚醚酮(PEEK)构成的流动路径。PEEK管材与大多数聚合物材料一样，通过挤出方法形成。利用聚合物树脂，该制造方法可导致高度可变的内径。因此，PEEK柱硬件在保留时间中产生了不利的差异，如可从一根柱和下一根柱之间的切换所观察到的。通常，这种变化可以比金属构造的柱高三倍。此外，用于制造基于聚合物的熔块的技术尚未充分优化，无法为商业HPLC柱提供合适的坚固部件。例如，可商购获得的PEEK熔块往往表现出不可接受的低渗透性。
[0010] 本技术的烷基甲硅烷基涂层的一个优点在于，可使用金属色谱流动路径，同时使分析物与金属流动路径之间的相互作用最小化。用某些烷基甲硅烷基组合物涂覆仪器和色谱装置的流动路径会改善液相色谱分离的多个方面，其中感兴趣的分析物是与金属相互作用的分析物。在金属流动路径上使用烷基甲硅烷基涂层允许使用金属色谱流动路径，该金属色谱流动路径能够在快速流速下经受高压，同时最小化分析物与金属之间的次级色谱相互作用。因此，高压部件可由不锈钢或其他金属或高压材料制成。然后可定制由高压材料制成的这些部件，因为可以用涂层修改内部流动路径，以解决流动路径的疏水性并减少次级色谱相互作用。
[0011] 因此，本文提供了用于隔离分析物的方法，该方法包括使用气相沉积以将一种或多种烷基甲硅烷基衍生物气相沉积到流体系统的至少一个部件以形成生物惰性或低粘结涂层，以及通过该系统洗脱分析物。与环境液相硅烷化不同，气相沉积的涂层倾向于通过精确控制的厚度对基材产生更具弹性的改性。另外，由于气相沉积是非视线过程，因此这导致基材轮廓和复杂表面上的涂层更加均匀。该优点允许将涂层施加到具有窄内径和弯曲表面的流动路径上，因此解决了在越来越快的流速下对越来越高的压力的需要。
[0012] 本文还提供了定制用于分离包含分析物的样品的流体流动路径的方法，该方法包括通过流体流动路径渗透一种或多种烷基甲硅烷基衍生物的气化源以形成生物惰性(或低粘结)涂层，以及控制将第一涂层沉积在流动路径的润湿表面上的温度和压力。
[0013] 还提供了定制用于分离包含分析物的样品的流体流动路径的方法，该方法包括评估分析物的极性，选择适当的烷基甲硅烷基衍生物，以及通过气相沉积适当的烷基甲硅烷基衍生物以形成生物惰性的低粘结涂层来调节流动路径的润湿表面的疏水性。
[0014] 本文进一步提供了改善色谱系统中的基线返回的方法，该方法包括将包含分析物的样品引入包括至少一种气相沉积的烷基甲硅烷基衍生物的流体系统中以形成生物惰性的低粘结涂层，以及通过该系统洗脱样品。
[0016] 在一个方面，该技术包括用于分离样品中的分析物的色谱装置。该装置包括样品注射器，该样品注射器具有用于将样品注射到流动相中的样品注射针，与样品注射器流体连通的样品贮存器容器，样品注射器下游的色谱柱，其中色谱柱具有流体连接器，以及连接样品注射器和色谱柱的流体导管。流体导管、样品注射器、样品贮存器容器和色谱柱的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径的润湿表面的至少一部分涂覆有烷基甲硅烷基涂层，其中烷基甲硅烷基涂层对样品中的分析物中的至少一种是惰性的。烷基甲硅烷基涂层具有式I：
[0017]
[0018] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤。RA表示与流体系统的内表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。装置可以以下列实施方案的任何组合包括下列实施方案中的一个或多个。
[0020] 色谱装置还可包括在色谱柱下游的检测器。流体流动路径也可包括检测器。在一些实施方案中，检测器为质谱仪，并且流体流动路径包括电喷针的润湿表面。
[0021] 在一些实施方案中，流体流动路径具有至少20的长度与直径比率。烷基甲硅烷基涂层可具有至少 的厚度。
[0022] 在一些实施方案中，X为(C2-C10)烷基。在其他实施方案中，X为乙基。R1、R2、R3、R4、R5和R6可各自为甲氧基或氯。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0023] 在一些实施方案中，装置还包括与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层。第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
[0024]
[0025] R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤。R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、–[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、–[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代。RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH。R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0。y为0至20的整数。
[0026] 在一些实施方案中，y为2至9的整数。在一些实施方案中，为9，R10为甲基，并且R7、R8和R9各自为乙氧基或氯。
[0027] 式II的烷基甲硅烷基涂层可以是(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)丙基三氯硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(1-10)丙基三甲氧基硅烷。在一些实施方案中，式II的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
[0028] 式I和II的烷基甲硅烷基涂层可提供约0°至约105°的期望接触角。
[0029] 在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层可以是水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氯硅烷。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层可以是三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷。
[0030] 色谱装置还可包括烷基甲硅烷基涂层，该烷基甲硅烷基涂层具有式III，与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触，
[0031]
[0032] R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤。Z为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。
[0033] 在一些实施方案中，式III的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式III的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。在一些实施方案中，I和III的烷基甲硅烷基涂层具有约的总厚度。
[0034] 在另一方面，该技术涉及分离包含聚糖、肽或杀虫剂的样品的方法。该方法包括将包含聚糖、肽或杀虫剂的样品引入到流体系统中，该流体系统包括设置在流体系统内部的流动路径。流动路径包括具有式I的烷基甲硅烷基涂层：
[0035]
[0036] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤。RA表示与流体系统的内表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。第二烷基甲硅烷基涂层与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触。第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
[0037]
[0038] R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤。R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、–[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、–[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基。(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代。苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基的一个或多个基团取代。RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH。R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0。y为0至20的整数。该方法还包括通过流体系统洗脱样品，从而隔离聚糖、肽或杀虫剂。该方法可以以本文所述的实施方案的任何组合包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
[0039] 在一些实施方案中，流动路径至少部分地由色谱柱的内表面限定。流动路径可进一步至少部分地由通过色谱柱的熔块的通道限定。在一些实施方案中，流动路径进一步至少部分地由管材的内表面限定。流动路径可由不锈钢形成。
[0040] 在一些实施方案中，聚糖为磷酸聚糖。肽可以是磷酸肽。杀虫剂可以是草甘膦。
[0041] 在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式II的烷基甲硅烷基涂层可以是正癸基三氯硅烷。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氯硅烷。
[0042] 在另一方面，该技术包括分离包含柠檬酸循环代谢物的样品的方法。该方法包括将包含柠檬酸循环代谢物的样品引入到流体系统中，该流体系统包括设置在流体系统内部的流动路径。流动路径包括具有式I的烷基甲硅烷基涂层：
[0043]
[0044] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤。RA表示与流体系统的内表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-；第二烷基甲硅烷基涂层与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触。第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
[0045]
[0046] R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤。R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、–[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、–[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基。(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代。苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基的一个或多个基团取代。RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH。R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0。y为0至20的整数。该方法还包括通过流体系统洗脱样品，从而隔离柠檬酸循环代谢物。该方法可以以本文所述的实施方案的任何组合包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
[0047] 在一些实施方案中，流动路径至少部分地由色谱柱的内表面限定。流动路径可进一步至少部分地由通过色谱柱的熔块的通道限定。流动路径可进一步至少部分地由管材的内表面限定。柠檬酸循环代谢物可以是柠檬酸或苹果酸。
[0048] 在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式II的烷基甲硅烷基涂层可以是三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。
[0049] 在另一方面，该技术包括定制用于分离样品的流体流动路径的方法。该方法包括评估样品中分析物的极性，基于样品中的分析物选择色谱介质，以及基于样品中分析物的极性选择烷基甲硅烷基涂层。烷基甲硅烷基涂层对于样品中的分析物是惰性的。烷基甲硅烷基涂层具有式I：
[0050]
[0051] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤。RA表示与流体流动路径的润湿表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。该方法还包括通过将烷基甲硅烷基涂层气相沉积到流体流动路径的润湿表面上来调节流体流动路径的润湿表面的疏水性。该方法可以以本文所述的实施方案的任何组合包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
[0052] 在一些实施方案中，样品中的分析物以在归属于色谱介质的保留率的10％内的保留率来保持。在一些实施方案中，样品中的分析物以在归属于色谱介质的保留率的5％内的保留率来保持。在一些实施方案中，样品中的分析物以在归属于色谱介质的保留率的1％内的保留率来保持。
[0053] 烷基甲硅烷基涂层可提供约0°至约95°的期望接触角。
[0054] 在一些实施方案中，流体流动路径的润湿表面至少部分地由柱的内表面或样品注射针的内表面限定。流体流动路径的润湿表面可从样品注射针的内表面延伸穿过柱的内表面。在一些实施方案中，流体流动路径的润湿表面从设置在整个流体系统中的样品注射针的内表面上游并与其流体连通的样品贮存器容器延伸到连接器或检测器的端口。
[0055] 检测器可以是质谱仪，并且流体流动路径的润湿表面包括电喷针的内表面。
[0056] 在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0057] 该方法还可包括在将烷基甲硅烷基涂层气相沉积到流体流动路径的润湿表面上之后，使烷基甲硅烷基涂层退火。
[0058] 在一些实施方案中，该方法还包括用硅烷化试剂改性式I的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的烷基甲硅烷基涂层。硅烷化试剂可以是非挥发性两性离子。非挥发性两性离子可以是磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。硅烷化试剂可以是酸性或碱性硅烷。在一些实施方案中，硅烷化剂为甲氧基-聚乙烯氧基(6-9)硅烷。
[0059] 在一些实施方案中，该方法还包括通过气相沉积与式I的气相沉积的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层来调节流体流动路径的润湿表面的疏水性。第二烷基甲硅烷基涂层具有式II：
[0060]
[0061] R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤。R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、–[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、–[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基，其中所述(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代，并且其中所述苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基中的一个或多个基团取代。RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH。R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0。y为0至20的整数。
[0062] 在一些实施方案中，式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷。式II的烷基甲硅烷基涂层可以是水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。
[0063] 在一些实施方案中，式I和II的烷基甲硅烷基涂层提供约0°至约105°的期望接触角。
[0064] 该方法还可包括用硅烷化试剂改性式II的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的烷基甲硅烷基涂层。硅烷化试剂可以是非挥发性两性离子。非挥发性两性离子可以是磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。硅烷化试剂可以是酸性或碱性硅烷。在一些实施方案中，硅烷化剂为甲氧基-聚乙烯氧基(6-9)硅烷。
[0065] 在一些实施方案中，分析物为生物分子。生物分子是肽或肽片段、寡肽、蛋白质、聚糖、核酸或核酸片段、生长因子、碳水化合物、脂肪酸或脂质。分析物可以是柠檬酸循环代谢物。在一些实施方案中，分析物为杀虫剂。
[0066] 该方法还可包括评估色谱介质的极性，以及基于分析物和色谱介质的极性选择烷基甲硅烷基涂层。
[0067] 在一些实施方案中，该方法还包括通过流体流动路径洗脱样品，从而隔离分析物。
[0068] 在另一方面，该技术包括定制用于分离样品的流体流动路径的方法。该方法包括在流体流动路径的润湿表面上渗透式III的烷基甲硅烷基的气化源。
[0069]
[0070] R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤。Z为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。该方法还包括控制将式III的第一涂层沉积在流体流动路径的润湿表面上的温度和压力，该第一涂层具有至少 的厚度和至少15°的接触角。该方法可以以本文所述的实施方案的任何组合包括本文所述的实施方案中的一个或多个。
[0071] 在一些实施方案中，该方法还包括在沉积式III的第一涂层之前用等离子体预处理流体流动路径的润湿表面。
[0072] 该方法还可包括用硅烷化试剂改性式III的烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的烷基甲硅烷基涂层。硅烷化试剂可以是非挥发性两性离子。非挥发性两性离子可以是磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。硅烷化试剂可以是酸性或碱性硅烷。在一些实施方案中，硅烷化剂为甲氧基-聚乙烯氧基(6-9)硅烷。附图说明
[0073] 图1是根据该技术的示例性实施方案的包括色谱柱和各种其他部件的色谱流动系统的示意图。流体被载送通过色谱流动系统，其中流体流动路径从流体管理器延伸到检测器。
[0074] 图2是示出根据该技术的示例性实施方案的定制流动路径的润湿表面的方法的流程图。
[0075] 图3是示出根据该技术的示例性实施方案的定制用于分离包括生物分子的样品的流体流动路径的方法的流程图。
[0076] 图4A-图4C示出根据该技术的示例性实施方案的使用三种不同类型的柱硬件获得的荧光色谱图。图4A示出使用未涂覆的不锈钢硬件获得的色谱图，而图4B和图4C示出使用涂覆有示例性气相沉积的烷基甲硅烷基的硬件获得的色谱图。
[0077] 图5A和图5B示出根据该技术的示例性实施方案的用例示性生物惰性烷基甲硅烷基涂覆的不锈钢样品流动路径部件进行的分离。图5A示出了柱入口管材，而图5B涉及样品针。
[0078] 图6A-图6C示出使用未涂覆的LC系统部件与涂覆的LC系统部件的各种配置结合未涂覆和涂覆的不锈钢柱硬件而获得的荧光色谱图。图6A使用未处理的流动路径以及未处理的管和熔块组合而获得；图6B根据本技术的实施方案使用未处理的流动路径以及涂覆的管和熔块组合而获得；并且图6C根据本技术的实施方案使用涂覆的流动路径以及涂覆的管和熔块组合而获得。
[0079] 图7A-图7C示出用各种类型的柱硬件获得的UV色谱图。图7A示出使用未处理的不锈钢管/熔块组合获得的UV色谱图；图7B示出根据该技术的实施方案的涂覆的管/熔块组合；并且图7C示出根据该技术的另一个实施方案的另一个涂覆的管/熔块组合。
[0080] 图8示出根据该技术的示例性实施方案的将气相沉积涂覆的柱硬件(图8A)与未处理的柱硬件(图8B)用于葡萄糖-6-磷酸的反相LC分析的效果。
[0081] 图9示出根据该技术的示例性实施方案的将气相沉积涂覆的柱硬件(图9A)与未处理的柱硬件(图9B)用于果糖-6-磷酸的反相LC分析的效果。
[0082] 图10示出根据该技术的示例性实施方案的将气相沉积涂覆的柱硬件(图10A)与未处理的柱硬件(图10B)用于三磷酸腺苷的反相LC分析的效果。
[0083] 图11示出根据该技术的示例性实施方案的将气相沉积涂覆的柱硬件(图11A)与未处理的柱硬件(图11B)用于一磷酸腺苷的反相LC分析的效果。
[0084] 图12示出根据该技术的示例性实施方案的用未处理的不锈钢(图12A)与气相沉积涂覆的硬件(图12B)获得的胎球蛋白N-聚糖的荧光色谱图的比较。
[0085] 图13示出根据该技术的示例性实施方案的与涂覆不同类型的气相沉积涂层的不锈钢硬件相比，用未处理的不锈钢硬件获得的最丰富的二唾液酸化聚糖、三唾液酸化聚糖、四唾液酸化聚糖和五唾液酸化聚糖的荧光峰面积的比较。
[0086] 图14A-图14B示出根据该技术的示例性实施方案的用经过涂层处理的柱硬件部件获得的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的反相荧光色谱图。
[0087] 图15A-图15B示出根据该技术的示例性实施方案的用不锈钢替代品(即聚醚醚酮(PEEK)和低钛镍钴合金(MP35NLT))构造的柱的反相总离子色谱图，其中各个部件被涂覆。
[0088] 图16A示出根据该技术的示例性实施方案的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的荧光色谱图，以及当涂覆系统的各种部件时对基线返回的影响。
[0089] 图16B示出根据该技术的示例性实施方案的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的反相总离子色谱图(TIC)，以及当涂覆系统的各种部件时对基线返回的影响。
[0090] 图16C是根据该技术的示例性实施方案的被涂覆并用于获得图16A和图16B的色谱图的柱管和熔块的示意图。
[0091] 图17A示出根据该技术的示例性实施方案的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的荧光色谱图，以及当涂覆系统的各种部件时对基线返回的影响。
[0092] 图17B示出根据该技术的示例性实施方案的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的反相总离子色谱图(TIC)，以及当涂覆系统的各种部件时对基线返回的影响。
[0093] 图17C是根据该技术的示例性实施方案的被涂覆并用于获得图17A和图17B的色谱图的柱管和熔块的示意图。
[0094] 图18是示出根据该技术的一个或多个示例性实施方案的未涂覆的不锈钢熔块和涂覆的不锈钢熔块的在水和IPA的每一个中的泡点压力的条形图。对于每种类型的熔块，水中的泡点作为左侧条提供，并且IPA中的泡点作为右侧条提供。
[0095] 图19是示出根据该技术的一个或多个实施方案的未涂覆的不锈钢熔块与涂覆的不锈钢熔块的与水的熔块孔隙度接触角的比较的条形图。
[0096] 图20是示出根据该技术的一个或多个实施方案的根据ASTM G48方法A对裸露或未涂覆的不锈钢熔块与涂覆的不锈钢熔块的质量损失测试的比较的条形图。
[0097] 图21A-图21L呈现了根据该技术的示例性实施方案的从顺序阳离子交换分离和样品的重复注射获得的NIST参考材料8671(IgG1κmAb)的色谱图。在该评价中，呈现了来源于四种不同构造的柱。
[0098] 图22呈现了根据该技术的示例性实施方案的条形图，其示出在样品的三次注射中从顺序阳离子交换分离获得的NIST参考材料8671的峰面积。该条形图比较了四种不同构造的峰面积，其中每次注射中的最左侧条是未涂覆的硬件A构造。左侧第二是涂覆版本的硬件A。左侧第三条是未涂覆的硬件B构造，并且每次注射的第四或最后的条是涂覆的硬件B构造。
[0099] 图23A-图23F示出根据该技术的示例性实施方案的对应于5皮摩尔脱氧胸苷低聚物(15、20、25、30和35-mer)的三次初始顺序注射的反相色谱图。图23A-图23C提供了从用未处理的不锈钢(SS)管和熔块构造的2.1×50mm 1.7μm有机硅 C18柱获得的结果和UV峰面积，并且图23D-图23F提供了从用C2C10气相沉积涂覆的管和熔块构造的柱获得的结果和UV峰面积。
[0100] 图24是示出根据该技术的示例性实施方案的在反相色谱法以及到用未处理的不锈钢(SS)构造的2.1×50mm 1.7μm有机硅 C18柱或C2C10气相沉积涂覆的部件上的初始注射期间观察到的15-mer脱氧胸苷分析物的平均UV峰面积的图表。使用两个未处理的柱和两个C2C10气相沉积涂覆的柱，一式两份地进行分析。
[0101] 图25A-图25D示出了根据该技术的示例性实施方案的对应于柠檬酸和苹果酸的注射的反相MRM(多反应监测)色谱图。图25A和图25B提供了通过使用用未处理部件或C2C3气相沉积涂覆的部件构造的2.1×50mm1.8μm二氧化硅 C18 1.8μm柱获得的柠檬酸的结果和MRM峰强度。图25C和图25D提供了通过使用用未处理部件或C2C3气相沉积涂覆的部件构造的2.1×50mm 1.8μm二氧化硅 C18 1.8μm柱获得的苹果酸的结果和MRM峰强度。
[0102] 图26A和图26B示出了根据该技术的示例性实施方案的草甘膦的混合模式亲水相互作用色谱(HILIC)MRM(多反应监测)色谱图。图26A和图26B分别提供了通过使用用C2C10气相沉积涂覆的部件和未处理的涂覆部件构造的2.1×100mm 1.7μm二乙胺键合有机硅柱获得的草甘膦的结果和MRM峰强度。
[0103] 图27A和图27B分别提供了在使用用未处理的部件或C2C10气相沉积涂覆的部件构造的2.1×100mm 1.7μm二乙胺键合有机硅 柱的混合模式HILIC期间观察到的草甘膦的平均峰面积和峰宽。根据该技术的示例性实施方案，用六次重复注射进行分析。
具体实施方式
[0104] 一般来讲，该技术的多个方面涉及(1)具有烷基甲硅烷基涂层的装置；(2)定制或调谐用于隔离分析物(特别是金属相互作用的分析物)的流动路径的方法；(3)隔离样品中的分析物(特别是金属相互作用的分析物)的方法；以及(4)包括涂覆有烷基甲硅烷基涂层的各种色谱部件的试剂盒和使用说明。在一些方面，使用生物惰性的低粘结涂层来改性流动路径以解决与分析物的流动路径相互作用。也就是说，生物惰性的低粘结涂层使与金属相互作用的分析物的表面反应最小化，并且允许分析物沿着流动路径通过而不堵塞，从而附接到表面，或者改变分析物性质。减少/消除这些相互作用是有利的，因为这允许精确定量和分析包含金属相互作用的分析物的样品，例如生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物以及两性离子比如氨基酸和神经递质。生物分子可选自肽或肽片段、寡肽、蛋白质、聚糖、核酸或核酸片段、生长因子、碳水化合物、脂肪酸和脂质。在一个方面，生物分子为蛋白质、肽或聚糖。生物分子可以是磷酸聚糖或磷酸肽。
[0105] 在本技术中，在流体系统(例如，液相色谱系统)的润湿表面上的气相沉积的烷基甲硅烷基涂层改性流体路径并减少次级相互作用。因此，它们是生物惰性或低粘结的(意味着样品的分析物与烷基甲硅烷基涂层不相互作用或具有最小的相互作用)。此外，沉积的涂层是高度可调的，以提供一系列期望的接触角(例如，使润湿表面为亲水的或疏水的))、化学性质和特性，以实现对流动路径以及最终通过流动路径的样品的期望效果。
[0106] 装置
[0107] 图1是可用于分离样品中的分析物的色谱流动系统/装置100的代表性示意图。色谱流动系统100包括若干部件，包括流体管理器系统105(例如，控制流过系统的流动相)，管材110(其也可用微加工流体导管替换或与微加工流体导管一起使用)，流体连接器115(例如，流体盖)，熔块120，色谱柱125，样品注射器135(包括将样品插入或注射到流动相中的针(未示出))，用于在注射之前保持样品的小瓶、沉降器、或样品贮存器130，检测器150以及用于控制流的压力的压力调节器140。色谱系统/装置的部件的内表面形成具有润湿表面的流体流动路径。流体流动路径可具有至少20、至少25、至少30、至少35或至少40的长度与直径比率。
[0108] 检测器150可为质谱仪。流体流动路径可包括电喷针的润湿表面(未示出)。
[0109] 润湿表面的至少一部分可涂覆有本文详细描述的烷基甲硅烷基涂层以定制其疏水性。涂层可通过气相沉积来施加。因此，本技术的方法和装置提供以下优点：能够使用耐高压材料(例如，不锈钢)来形成流动系统，但也能够定制流体流动路径的润湿表面以提供适当的疏水性，因此对样品的不利相互作用或不期望的化学效应可被最小化。
[0110] 烷基甲硅烷基涂层可在整个系统中由从流体管理器系统105一直延伸到检测器150的管材或流体导管110提供。涂层也可被施加到流体流体路径的部分上。也就是说，可以选择涂覆一个或多个部件或者部件的部分，而不是整个流体路径。例如，柱125的内部部分及其熔块120和端盖115可被涂覆，而流动路径的其余部分可保持不被改性。此外，可以涂覆可移除/可替换的部件。例如，包含样品贮存器的小瓶或沉降器130以及熔块120可被涂覆。
[0111] 在一个方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由管材的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由微加工流体导管的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由柱的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由通过熔块的通道限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径至少部分地由样品注射针的内表面限定。在另一方面，本文所述的流体系统的流动路径在柱的整个内表面上从样品注射针的内表面延伸。在另一方面，流动路径从设置在整个流体系统中的样品注射针的内表面上游并与其流体连通的样品贮存器容器(例如，沉降器)延伸到连接器/检测器的端口。
[0112] 在一些实施方案中，仅色谱柱的润湿表面和位于色谱柱上游的部件涂覆有本文所述的烷基甲硅烷基涂层，而位于柱下游的润湿表面未被涂覆。可经由气相沉积将涂层施加到润湿表面上。
[0113] 流体流动路径的润湿表面的至少一部分涂覆有烷基甲硅烷基涂层。烷基甲硅烷基涂层对于样品中的分析物中的至少一种是惰性的。烷基甲硅烷基涂层可具有式I：
[0114]
[0115] R1、R2、R3、R4、R5和R6各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH、ORA和卤(即，卤素，例如氯)。RA表示与流体系统的内表面的连接点。R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为ORA。X为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。
[0116] 当在化学式的上下文中使用时，连字符(“-”)指示连接点。例如，当X为-[(C1-C10)烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-时，这意味着X经由(C1-C10)烷基连接到SiR1R2R3，并且经由另一4 5 6
个(C1-C10)烷基连接到SiRRR。这适用于其余的变量。
个(C1-C10)烷基连接到SiRRR。这适用于其余的变量。
[0117] 在一个方面，式I中的X为(C1-C15)烷基、(C1-C12)烷基或(C1-C10)烷基。在一些方面，式I中的X为甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、壬基或癸基。在另一方面，式I中的X为乙基或癸基。
[0118] 在一个方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少两个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少三个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。在另一方1 2 3 4 5 6
面，R、R、R、R、R和R中的至少四个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少五个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。
面，R、R、R、R、R和R中的至少四个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少五个为(C1-C6)烷氧基，例如乙氧基，其中X的值在式I或前述段落中描述。
[0119] 在一个方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少一个为卤，例如氯，其中X的值在式I或以上前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少两个为卤，例如氯，其中X的值在式I或以上前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少三个为卤，例如氯，其中X的值在式I或以上前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少四个为卤，例如氯，其中X的值在式I或以上前述段落中描述。在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6中的至少五个为卤，例如氯，其中X的值在式I或以上前述段落中描述。
[0120] 在另一方面，R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为甲氧基或氯。
[0121] 式I的烷基甲硅烷基涂层可具有至少约15°的接触角。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层可具有小于或等于30°的接触角。接触角可小于或等于约90°。在一些实施方案中，式I的烷基甲硅烷基涂层的接触角在约15°至约105°之间。例如，式I的烷基甲硅烷基涂层的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
[0122] 烷基甲硅烷基涂层的厚度可为至少约 例如，厚度可以在约 至约之间。式I的烷基甲硅烷基涂层的厚度可为约
[0123]或 烷基甲硅烷基涂层(例如，气相沉积的烷
基甲硅烷基涂层)的厚度可通过肉眼光学检测。例如，较高的不透明度和着色指示较厚的涂层。因此，具有明显视觉区别的涂层是该技术的实施方案。当在全光谱光(诸如太阳光)下观察到涂覆的部件时，从薄到厚，颜色从黄色，变成紫色，变成蓝色，变成略微绿色，然后变回黄色。例如，当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现黄色并反射峰值波长在
560nm和590nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现紫色并反射峰值波长在400nm和450nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现蓝色并反射峰值波长在450nm和490nm之间的光。参见例如2004年10月6日公布的Faucheu等人的Relating Gloss Loss to Topographical Features of a PVDF Coating(使光泽损失与PVDF涂层的形貌特征关联)；Bohlin，Erik，Surface and Porous Structure of Pigment Coatings,Interactions with flexographic ink and effects of print quality,Dissertation,Karlstad University Studies,2013:49(颜料涂层的表面和多孔结构，与苯胺印刷油墨的相互作用和印刷质量的影响，论文，卡尔斯塔德大学研究，2013年，第49期)。
基甲硅烷基涂层)的厚度可通过肉眼光学检测。例如，较高的不透明度和着色指示较厚的涂层。因此，具有明显视觉区别的涂层是该技术的实施方案。当在全光谱光(诸如太阳光)下观察到涂覆的部件时，从薄到厚，颜色从黄色，变成紫色，变成蓝色，变成略微绿色，然后变回黄色。例如，当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现黄色并反射峰值波长在
560nm和590nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现紫色并反射峰值波长在400nm和450nm之间的光。当烷基甲硅烷基涂层的厚度为 时，涂层可呈现蓝色并反射峰值波长在450nm和490nm之间的光。参见例如2004年10月6日公布的Faucheu等人的Relating Gloss Loss to Topographical Features of a PVDF Coating(使光泽损失与PVDF涂层的形貌特征关联)；Bohlin，Erik，Surface and Porous Structure of Pigment Coatings,Interactions with flexographic ink and effects of print quality,Dissertation,Karlstad University Studies,2013:49(颜料涂层的表面和多孔结构，与苯胺印刷油墨的相互作用和印刷质量的影响，论文，卡尔斯塔德大学研究，2013年，第49期)。
[0124] 在一个方面，式I的气相沉积涂层为气相沉积的双(三氯甲硅烷基)乙烷、双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷、双(三氯甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)辛烷、双(三甲氧基甲硅烷基)己烷和双(三氯甲硅烷基)己烷的产物。
[0125] 在一些方面，流体流动路径的润湿表面的至少一部分涂覆有多层相同或不同的烷基甲硅烷基，其中烷基甲硅烷基涂层的厚度与所进行的分层步骤的数量(例如，在色谱系统/装置的流体流动路径的润湿表面上的烷基甲硅烷基涂层的沉积层的数量)相关。这样，可以产生和定制越来越厚的生物惰性涂层，以实现期望的分离。
[0126] 色谱装置可具有与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触的第二烷基甲硅烷基涂层。第二烷基甲硅烷基涂层具有式II
[0127]
[0128] 其中R7、R8和R9各自独立地选自-NH(C1-C6)烷基、-N[(C1-C6)烷基]2、(C1-C6)烷氧基、(C1-C6)烷基、(C1-C6)烯基、OH和卤；R10选自(C1-C6)烷基、-ORB、–[O(C1-C3)烷基]1-10O(C1-C6)烷基、–[O(C1-C3)烷基]1-10OH和苯基。(C1-C6)烷基任选地被一个或多个卤取代。苯基任选地被选自(C1-C3)烷基、羟基、氟、氯、溴、氰基、-C(O)NH2和羧基的一个或多个基团取代。RB是-(C1-C3)烷基环氧乙烷、-(C1-C3)烷基-3,4-环氧基环己基或-(C1-C4)烷基OH。R10的散列键表示R10与桥接甲硅烷基基团以形成烯烃的碳之间的任选附加共价键，假如y不为0。y为0至20的整数。
[0129] 在一个方面，式II中的y为1至15的整数。在另一方面，式II中的y为1至12的整数。在另一方面，式II中的y为1至10的整数。在另一方面，式II中的y为2至9的整数。
[0130] 在一个方面，式II中的R10为甲基，并且y如上文对于式II或前述段落所述。
[0131] 在一个方面，式II中的R7、R8和R9各自相同，其中R10和y如上所述。在一个方面，R7、R8、R9各自为卤(例如，氯)或(C1-C6)烷氧基诸如甲氧基，其中R10和y如上所述。
[0132] 在一个方面，式II中的y为9，R10为甲基，并且R7、R8和R9各自为乙氧基或氯。
[0133] 在一个方面，式II的涂层为正癸基三氯硅烷、(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)、水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(GPTMS)、2-(3,4-环氧基环己基)乙基三甲氧基硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷、甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷、丙基三氯硅烷、丙基三甲氧基硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三(二甲基氨基)硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三氯硅烷、(十七氟-1,1,2,2-四氢癸基)三甲氧基硅烷、乙烯基三氯硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、烯丙基三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三氯硅烷、2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三甲氧基硅烷或2-[甲氧基(聚乙烯氧基)3丙基]三(二甲基氨基)硅烷。
[0134] 式I和II的烷基甲硅烷基涂层可具有至少约15°的接触角。在一些实施方案中，式I和II的烷基甲硅烷基涂层可具有小于或等于105°的接触角。接触角可小于或等于约90°。在一些实施方案中，式I和II的烷基甲硅烷基涂层的接触角在约15°至约105°之间。例如，式I和II的烷基甲硅烷基涂层的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
[0135] 多层烷基甲硅烷基涂层的厚度可为至少约 例如，厚度可以在约 至约之间。式I的多层烷基甲硅烷基涂层的厚度可为约
[0136]或
[0137] 在一个方面，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。在另一方面，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为水解之后的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷。在一个方面，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为正癸基三氯硅烷。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层可以是三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。在一个方面，式I的烷基甲硅烷基涂层为双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层为甲氧基-聚乙烯氧基(3)丙基三氯硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(3)丙基三甲氧基硅烷。
[0138] 色谱装置可具有与式III的烷基甲硅烷基涂层直接接触的烷基甲硅烷基涂层，该式III的烷基甲硅烷基涂层与式I的烷基甲硅烷基涂层直接接触。
[0139]
[0140] R11、R12、R13、R14、R15和R16各自独立地选自(C1-C6)烷氧基、-NH(C1-C6)烷基、-N((C1-C6)烷基)2、OH和卤(即，卤素，例如氯)。Z为(C1-C20)烷基、-O[(CH2)2O]1-20-、-(C1-C10)[NH(CO)NH(C1-C10)]1-20-或-(C1-C10)[烷基苯基(C1-C10)烷基]1-20-。
[0141] 在一些方面，式III中的Z为(C1-C10)烷基；并且R1、R2、R3、R4、R5和R6各自为甲氧基或氯。在其他方面，式III中的Z为(C2-C10)烷基。在其他方面，式III中的Z为乙基。
[0142] 在式I和式III的分层烷基甲硅烷基涂层中，式I和式III可以相同(例如，C2C2)，或者式I和式III可以不同。式III直接附接到式I的涂层，即，在式III中，不存在与流体系统的内部的连接点；相反，式III直接沉积在式I上。
[0143] 式III的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式III的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷。
[0144] 式I和III的烷基甲硅烷基涂层可具有至少约15°的接触角。在一些实施方案中，式I和III的烷基甲硅烷基涂层可具有小于或等于105°的接触角。接触角可小于或等于约90°。在一些实施方案中，式I和III的烷基甲硅烷基涂层的接触角在约15°至约105°之间。例如，式I和III的烷基甲硅烷基涂层的接触角可为约0°、5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、
45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°、95°、100°或105°。
[0145] 多层烷基甲硅烷基涂层的厚度可为至少约 例如，厚度可以在约 至约之间。式I的多层烷基甲硅烷基涂层的厚度可为约
或
或
[0146] 在一个方面，式II的烷基甲硅烷基涂层被直接施加到流体流动路径的润湿表面7 8 9 A A
上。因此，在一些实施方案中，式II的R 、R和R中的一个还可包括OR ，其中R 表示与流体系统的内表面(例如，润湿表面)的连接点。在其他实施方案中，式II的烷基甲硅烷基涂层的R7、R8和R9不包括ORA，因为式II的烷基甲硅烷基涂层直接沉积在已经用例如等离子体预处理的流体流动路径的润湿表面上。
上。因此，在一些实施方案中，式II的R 、R和R中的一个还可包括OR ，其中R 表示与流体系统的内表面(例如，润湿表面)的连接点。在其他实施方案中，式II的烷基甲硅烷基涂层的R7、R8和R9不包括ORA，因为式II的烷基甲硅烷基涂层直接沉积在已经用例如等离子体预处理的流体流动路径的润湿表面上。
[0147] 在一个方面，不锈钢流动路径部件(包括但不限于管材、微加工流体导管、柱熔块、柱入口管材和样品注射针)经由气相沉积用所公开的烷基甲硅烷基中的一种或多种涂覆。在一个方面，将这些涂覆的部件退火以改变它们的化学或物理性质。
[0148] 在另一方面，由除不锈钢或其他金属以外的其他材料制成的流动路径部件(例如，聚合物、玻璃等)经由气相沉积用所公开的烷基甲硅烷基中的一种或多种涂覆。具体地讲，对系统内使用的熔块或可连接到注射针的样品小瓶进行涂覆。
[0149] 表1中提供了具有其相应近似厚度和接触角的示例性涂层。
[0150] 表1
[0151]
[0152]
[0153]
[0154] 参见VPD#1(C2-GPTMS-OH)，下面所示的第一涂层C2是根据上述式I的层。
[0155]
[0156] 双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷的结构(C2)
[0157] 下面所示的VPD#1，GPTMS-OH的第二层是根据式II的层。
[0158]
[0159] GPTMS-OH的结构
[0160] VPD#3(C2-C2)是式I的涂层以及然后是式III的涂层的示例。
[0161] VPD#7(C2C10)是式I的涂层以及式II的第二层的另一个示例。上面示出了双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷的结构(C2)。下面示出了C10的结构。
[0162]
[0163] 正癸基三氯硅烷的结构(C10)
[0164] VPD#11(C2C3)是式I的涂层以及式II的第二层的另一个示例。上面示出了双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷的结构(C2)。下面示出了C3的结构。
[0165]
[0166] 三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷的结构(C3)
[0167] VPD#13是式I的涂层以及式II的第二层的另一个示例。上面示出了双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷的结构(C2)。甲氧基-聚乙烯氧基(3)丙基三氯硅烷(PEO)的结构在下面示出。
[0168]
[0169] 甲氧基-聚乙烯氧基(3)丙基三氯硅烷(PEO)的结构
[0170] 作为另外一种选择，可商购获得的气相沉积涂层可用于所公开的系统、装置和方法中，包括但不限于 (可从宾夕法尼亚州贝尔丰特的SikcoTek公司(SikcoTek Corporation,Bellefonte,PA)商购获得)。
[0171] 在一个方面，本文所述的烷基甲硅烷基涂层增强金属的腐蚀性能，例如如在金属色谱柱中。根据致密度和厚度，涂层充当屏障，从而防止水和腐蚀性分子与碱金属反应。虽然增加疏水性和致密度改善了腐蚀性能，但即使是衍生自C2和GPTMS(C2-GPTMS)的涂层，随后水解形成C2-GPTMS-OH，在ASTM G48方法A的点蚀中也显示出10倍的改善，参见下面的实施例4。就最不耐腐蚀而言，排序是由VPD#7形成的材料>由VPD#2形成的材料>由VPD#1形成的材料(双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷作为第一层，然后是GPTMS，然后水解以形成GPTMS-OH作为第二层)。这也与疏水性等级相关。
[0172] 定制流体流动路径的方法
[0173] 上述涂层可用于定制用于分离样品的色谱系统的流体流动路径。涂层可以是气相沉积的。一般来讲，沉积的涂层可用于调节与流体接触的流体流动路径的内表面(即，润湿表面或与流动相和/或样品/分析物接触的表面)的疏水性。通过涂覆色谱系统内流动路径的一个或多个部件的润湿表面，使用者可定制润湿表面，以在流动路径和其中的流体(包括任何样品，诸如流体内的生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物以及两性离子比如氨基酸和神经递质)之间提供期望的相互作用(或缺乏相互作用)。
[0174] 在一个方面，有效的涂层由低温、真空辅助气相沉积工艺产生。在一个方面，氧等离子体预处理步骤先于涂层沉积。氧等离子体移除有机化合物并改善涂层的表面可润湿性。控制每个处理步骤的时间、温度和压力。每个涂层运行可使用硅晶片来监控所得涂层的厚度和接触角。椭圆测量术可用于测量涂层厚度，并且光学测角计可用于测量涂层的接触角。可使用后涂覆退火步骤来增加涂层交联并增加涂层疏水性。
[0175] 图2是示出用于定制用于分离样品的流体流动路径的方法200的流程图，该样品包括生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物以及两性离子比如氨基酸和神经递质。该方法具有某些任选的步骤，如围绕特定步骤的虚线轮廓所指出的。方法200可从预处理步骤(205)开始，该预处理步骤用于清洁和/或准备用于定制的部件内的流动路径。预处理步骤205可包括用等离子体诸如氧等离子体清洁流动路径。该预处理步骤是任选的。
[0176] 接下来，开始渗透步骤(210)。将烷基甲硅烷基化合物(例如，式I、II和/或III的烷基甲硅烷基化合物)的气化源渗透到流动路径中。气化源自由地在流动路径的整个内表面上并且沿着流动路径的内表面行进。在渗透期间控制温度和/或压力，使得允许气化源渗入整个内部流动路径，并将来自气化源的涂层沉积在流动路径的暴露表面(例如，润湿表面)上，如步骤215中所示。可采取附加步骤以进一步定制流动路径。例如，在沉积涂层之后，可对其进行热处理或退火(步骤220)以在沉积涂层内产生交联和/或调节涂层的接触角或疏水性。除此之外或作为另外一种选择，可通过将气化源渗透到流动路径中并沉积与第一沉积层接触的第二或附加层来沉积烷基甲硅烷基化合物的第二涂层(具有相同或不同的形式)，如步骤225中所示。在沉积每个涂层之后，可进行退火步骤。可提供多个渗透和退火步骤以相应地定制流动路径(步骤230)。
[0177] 图3提供了示出定制用于分离包括生物分子或金属相互作用分析物的样品的流体流动路径的方法(300)的流程图。该方法可用于定制用于隔离、分离和/或分析生物分子或金属相互作用分析物的流动系统。在步骤305中，评估分析物以确定其极性。了解极性将允许操作者选择(通过查找表或进行确定)期望的涂层化学性质以及任选地接触角，如步骤310中所示。在一些实施方案中，除了评估生物分子或金属相互作用分析物的极性之外，还评估用于分离生物分子或金属相互作用分析物的固定相(例如，要包括在流体流动路径的至少一部分中的固定相)的极性。色谱介质可基于样品中的分析物进行选择。在某些实施方案中，由操作者使用对分析物和固定相两者的极性的了解，来在步骤310中选择期望的涂层化学性质和接触角。然后可将要定制的部件定位在具有环境控制(例如，压力、大气、温度等)的化学渗透系统内，并且将前体材料渗透到部件的流动路径中以沿着润湿表面沉积一个或多个涂层以调节疏水性，如步骤315中所示。在渗透、沉积和条件步骤(例如，退火)中的任一者期间，可监测从渗透系统沉积的涂层，并且如果需要，可根据需要调节前体和/或沉积条件，从而允许对涂层特性进行调谐。在步骤310中选择的烷基甲硅烷基涂层材料可以是式I、II和/或III的烷基甲硅烷基化合物。
[0178] 提供了一种定制用于分离样品的流体流动路径的方法，该方法包括评估样品中分析物的极性以及基于样品中的分析物选择色谱介质。基于样品中的分析物的极性来选择烷基甲硅烷基涂层。选择烷基甲硅烷基涂层，使得涂层对于被分离的分析物是惰性的。换句话讲，烷基甲硅烷基涂层不产生归因于烷基甲硅烷基涂层的任何次级色谱效应。在一些实施方案中，分析物为生物分子。生物分子可以是肽或肽片段、寡肽、蛋白质、聚糖、核酸或核酸片段、生长因子、碳水化合物、脂肪酸或脂质。分析物可以是柠檬酸循环代谢物。分析物可以是杀虫剂。
[0179] 烷基甲硅烷基涂层可具有如上所述的式I、II或III。在一个实施方案中，烷基甲硅烷基涂层具有式I作为第一层，以及式II作为第二层。在一些实施方案中，仅存在具有式I(例如，双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷)的单层涂层。在一些实施方案中，仅存在具有式II(例如，(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷、正癸基三氯硅烷、三甲基氯硅烷、三甲基二甲基氨基硅烷或甲氧基-聚乙烯氧基(3)硅烷)的单层涂层。在一些实施方案中，仅存在具有式III(例如，双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷)的单层涂层。
[0180] 该方法还包括通过将烷基甲硅烷基涂层气相沉积到流体流动路径的润湿表面上来调节流体流动路径的润湿表面的疏水性。在一些实施方案中，通过调节烷基甲硅烷基涂层的接触角来调节润湿表面的疏水性。例如，烷基甲硅烷基涂层的接触角可在约0°至约105°之间。
[0181] 样品中的分析物可以以在归属于色谱介质的保留率的10％内的保留率来保持。在一些实施方案中，样品可以以在归属于色谱介质的保留率的5％内或1％内的保留率来保持。因此，烷基甲硅烷基涂层解决了分析物与金属色谱材料之间的金属相互作用问题，而不引入将对分离质量具有负面影响的任何次级反应。烷基甲硅烷基涂层不赋予感兴趣分析物任何保留机制，使得涂层对于感兴趣分析物为惰性的并且是低粘结的。
[0182] 此外，烷基甲硅烷基涂层不会对峰宽产生任何变化。样品中的分析物的峰宽在归属于色谱介质的峰宽的10％、5％或1％内。
[0183] 流体流动路径的润湿表面可以是上文相对于色谱装置的方面和实施方案所述的那些中的任一个。
[0184] 该方法还可包括在将烷基甲硅烷基涂层气相沉积在流体流动路径的润湿表面上之后，使烷基甲硅烷基涂层退火。通常，退火循环涉及在真空下使涂层经受200℃持续3小时。
[0185] 该方法还可包括评估色谱介质的极性，以及基于分析物和色谱介质的极性选择烷基甲硅烷基涂层。该方法还可包括通过流体流动路径洗脱样品，从而隔离分析物。
[0186] 在一些实施方案中，用硅烷化试剂改性烷基甲硅烷基涂层以获得期望厚度的烷基甲硅烷基涂层。硅烷化试剂可以是非挥发性两性离子。非挥发性两性离子可以是磺基甜菜碱或羧基甜菜碱。在一些实施方案中，硅烷化试剂为酸性或碱性硅烷。硅烷化试剂可引入聚环氧乙烷部分，诸如甲氧基-聚乙烯氧基(6-9)硅烷，其结构在下面示出。
[0187]
[0188] 甲氧基-聚乙烯氧基(6-9)硅烷的结构
[0189] 在一些方面，定制用于分离包括生物分子的样品的流体流动路径的方法还包括：在沉积第一涂层之前用等离子体预处理流动路径的润湿表面。在其他方面，定制用于分离包括金属相互作用分析物的样品的流体流动路径的方法还包括在一定温度下使第一涂层退火以增加第一涂层中的交联。在又一方面，定制用于分离包括金属相互作用分析物的样品的流体流动路径的方法还包括在一定温度下使第一涂层退火以改变疏水性。
[0190] 在一个方面，定制用于分离包括金属相互作用分析物的样品的流体流动路径的方法还包括用具有式II的汽化源执行第二次渗透，其中式II的特征如上所述；沿着流体系统的内部流动路径并且在整个内部流动路径上形成第二涂层，该第二涂层被沉积成与第一涂层直接接触。在一个方面，在前述方法中进行第二次渗透的步骤还包括在沉积第二涂层之后进行退火步骤。在另一方面，前述方法还包括将至少一个涂覆的部件与流动路径流体连通连接，该涂覆的部件选自样品贮存器容器和熔块。
[0191] 本文还提供了定制用于分离包括金属相互作用分析物的样品的流体流动路径的方法，该方法包括：评估样品中分析物的极性；基于极性评估选择具有式I的烷基甲硅烷基涂层，其中式I的特征如上所述，并且选择期望的接触角；以及通过气相沉积具有式III的烷基甲硅烷基来调节流动路径的润湿表面的疏水性，其中式III的特征如上所述，并且提供期望的接触角。在上述方法的一些实施方案中，除了评估样品中分析物的极性之外，还评估设置在流动路径的至少一部分内的固定相的极性，并且从样品中的生物分子以及固定相两者的极性获得极性评估。
[0192] 隔离分析物的方法
[0193] 在一个方面，本文提供了隔离分析物的方法。该方法包括将包括聚糖、肽、杀虫剂或柠檬酸循环代谢物的样品引入到流体系统中，该流体系统包括设置在流体系统内部的流动路径。流动路径包括具有上述式I的第一气相沉积的烷基甲硅烷基惰性涂层和具有上述式II的第二气相沉积涂层。通过流体系统洗脱样品，从而隔离聚糖、肽、杀虫剂或柠檬酸循环代谢物。
[0194] 聚糖可以是磷酸聚糖。肽可以是磷酸肽，并且杀虫剂可以是草甘膦。柠檬酸循环代谢物可以是柠檬酸或苹果酸。
[0195] 当分析物为聚糖、肽或杀虫剂时，式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层可以是正癸基三氯硅烷。当分析物为柠檬酸循环代谢物时，式I的烷基甲硅烷基涂层可以是双(三氯甲硅烷基)乙烷或双(三甲氧基甲硅烷基)乙烷，并且式II的烷基甲硅烷基涂层可以是三甲基氯硅烷或三甲基二甲基氨基硅烷。
[0196] 流动路径可至少部分地由色谱系统的内表面限定。流动路径可进一步至少部分地由通过色谱柱的熔块的通道限定。流动路径可至少部分地由管材的内表面限定。流动路径可为本文所述的任何流动路径，例如相对于色谱装置描述的流动路径。
[0197] 改善基线返回的方法
[0198] 本文还提供了改善色谱系统中基线返回的方法，该方法包括：将包含分析物的样品引入到流体系统中，该流体系统包括设置在流体系统的内部的流动路径，该流动路径具有至少20的长度与直径比率，并且包括具有式I的气相沉积的烷基甲硅烷基涂层，其中式I的特征如上所述，厚度为至少100埃，并且接触角为约30度至110度；以及通过流体系统洗脱样品，从而隔离生物分子。在一些实施方案中，该方法包括式II或式III的第二层，其中式II和II的特征在上文描述。
[0199] 试剂盒
[0200] 此处还提供了试剂盒。试剂盒包括色谱部件，例如色谱柱，其已涂覆有如上所述的式I、II和/或III的烷基甲硅烷基涂层。在试剂盒中可提供其他部件，这些部件也可包括本文所述的涂层，例如管材、熔块和/或连接器。试剂盒还可包括用于分离分析物(例如，生物分子、蛋白质、聚糖、肽、寡核苷酸、杀虫剂、双膦酸、阴离子代谢物以及两性离子比如氨基酸和神经递质)的说明书。
[0201] 示例性分离
[0202] 磷酸聚糖的分离
[0203] 已发现，可气相沉积的所公开的涂层通过亲水性相互作用色谱(HILIC)显著改善磷酸聚糖的分离。为了证明这一点的意义，对来自重组α-半乳糖苷酶的释放的N-聚糖进行了评价，该重组α-半乳糖苷酶可用作法布莱氏病的酶替代疗法。这种特定类型的酶取自循环并通过甘露糖-6-磷酸途径在细胞内递送到溶酶体，使得重要的是识别并监测存在于其表面上的磷酸化聚糖的水平。首先针对对应的未处理不锈钢硬件测试气相沉积涂覆的不锈钢柱管连同匹配涂覆的不锈钢熔块。在这种情况下，使用两种不同类型的涂层化学品。用于涂覆熔块和管材的涂层化学品为VPD#2和VPD#7。图4A-图4C示出了用这些类型的柱硬件获得的荧光色谱图。根据这些数据，发现使用涂覆的柱硬件显著改善了每种磷酸化N-聚糖物质的回收率。例如，Man7-PP的峰面积显著增加，它是具有两个甘露糖-6-磷酸残基、甘露糖-7-二磷酸的高甘露糖聚糖。在用不锈钢柱硬件无法检测Man7-PP的情况下，用气相沉积涂覆的柱硬件容易地检测到它。这表明N-聚糖的这种物质以防止其到达检测器的方式与柱硬件的金属表面相互作用。当使用气相沉积涂覆的硬件时，Man-7-PP与Man5(无磷酸化的高甘露糖聚糖)的峰面积比率为0.24:1(图4A-图4C)。
[0204] 使用涂覆的柱硬件和熔块增加磷酸化聚糖回收率表明，吸附到金属柱硬件表面上对回收率不利。考虑到这一点，还使用气相沉积涂覆的不锈钢样品流动路径部件(图5A和图5B)进行分离。图6A-图6C示出使用涂覆的LC系统部件结合涂覆的不锈钢柱硬件而获得的荧光色谱图。通过使用涂覆的柱硬件和C2C10气相沉积涂覆的流动路径部件，磷酸聚糖的回收率甚至得到了更大的改善。最值得注意的是，Man7-PP与Man5的峰面积比率从单独使用涂覆的柱硬件所获得的0.24:1的比率增加到0.8:1。观察到的具有涂覆的系统和涂覆的柱硬件的Man7-PP的相对丰度指示磷酸化聚糖的完全回收，如可通过对RapiFluor-MS标记的释放聚糖的HILIC的正交测定来确定的。总之，这些结果证实通过使用气相沉积涂层可以减轻磷酸化N-聚糖物质到样品流动路径表面的损失。
[0205] 其他磷酸化分子的分离
[0206] 从使用气相沉积涂层进行磷酸聚糖分析中了解到的原理得到扩展，以有利于其他类型的磷酸化生物分子的分析。在这种情况下，已发现涂层有利于在反相色谱条件下改善磷酸化肽的回收率。为了证明这些回收优点，我们评价了含有磷酸肽的混合物。该特定样品包含三个单独磷酸化的肽和一个双重磷酸化的肽。首先针对对应的未处理不锈钢硬件测试气相沉积涂覆的不锈钢柱管连同匹配涂覆的不锈钢熔块。图7A-图7C示出用这些类型的柱硬件获得的UV色谱图。在每种情况下，与单独的不锈钢相比，添加VPD#2和VPD#7涂层使单独磷酸化肽的回收率增加了至少13％(图4A-图4C)。用双重磷酸化肽涂覆色谱流动路径的影响明显得多。当使用不锈钢柱硬件时，不能检测到双重磷酸化肽的回收率。然而，当使用任一类型的涂覆的柱硬件(VPD#2和VPD#7)时，该肽在所获得的色谱图中变得清晰可见。该结果再次表明，气相沉积涂层可用于使与色谱流动路径的金属表面的不期望相互作用最小化，并且这样做允许改善对磷酸化生物分子的分析。
[0207] 因此，在一个方面，气相沉积涂覆的柱硬件用于通过液相色谱在分析期间改善磷酸化生物分子的回收率。在本发明的又一个实施方案中，气相沉积涂覆的流动路径部件与气相沉积涂覆的柱硬件结合使用，以通过液相色谱在分析期间改善磷酸化生物分子的回收率。
[0208] 对于磷酸化生物分子、磷酸化聚糖和磷酸化肽的两个示例，已经证明了该发现的效果。磷酸化生物分子是指由含有磷酸基团的生物体自然产生的任何分子，包括但不限于磷酸化的蛋白质和多核苷酸。此外，合理的是设想本公开用于改善较小生物分子的液相色谱分析，该较小生物分子包括但不限于磷脂、核苷酸和糖磷酸酯。实际上，已发现气相沉积涂覆的柱硬件可用于改善糖磷酸酯和核苷酸的回收率和峰形状。在图8-图11中捕获了将气相沉积涂覆的柱硬件与未处理的柱硬件用于葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、三磷酸腺苷和一磷酸腺苷的反相LC分析的效果。有趣的是，这些数据表明，使用气相沉积涂覆的柱硬件可显著改善这些含磷酸酯的小生物分子的总体回收率和峰形状。因此，可预见的是，本公开还可用于改善非生物分子(诸如含有磷酸或膦酸酯官能团的小分子药物)的色谱。
[0209] 唾液酸化的聚糖和具有羧酸部分的分子的分离
[0210] 另外已发现，气相沉积涂覆的硬件可有利于唾液酸化的聚糖的混合模式分离。在这样的技术中，可使用表现出阴离子交换和反相保留机制的固定相来分解唾液酸化的聚糖。最近发现，被称为带电表面反相色谱材料并在作为WO2017/189357公布(并且全文以引用方式并入本文)的名称为“CHARGED SURFACE REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIC MATERIALS METHOD FOR ANALYSIS OF GLYCANS MODIFIED WITH AMPHIPATHIC,STRONGLY BASED MOIETIES(用于分析用两亲、强碱部分改性的聚糖的带电表面反相色谱材料方法)”的国际申请No.PCT/US2017/028856中描述的独特类别的固定相非常适合于产生这些类型的分离。使用具有由二乙氨基丙基(DEAP)可电离的改性剂、C18疏水基团构成并且在桥接的乙烯混合颗粒上封端的色谱表面的高纯度色谱材料(HPCM)已被证明是用于分离用两亲、强碱部分标记的聚糖的示例性实施方案，就像由国际申请No.PCT/US2017/028856(WO2017/189357)中所述的新型标记试剂所赋予的那样。这种所谓的二乙氨基丙基高纯度色谱材料(DEAP HPCM)固定相在分离酸性聚糖方面是有效的，因为它已用相对较高pKa(约10)的可电离改性剂改性，该改性剂产生了独特的明显阴离子保留。
[0211] 在向DEAP HPCM混合模式分离施加唾液酸化聚糖时，已表明气相沉积涂覆的硬件可产生改善的色谱回收率和包含多于三个唾液酸残基的聚糖的峰形状。在图12中提供了用未处理的不锈钢与VPD#7涂覆的硬件获得的胎球蛋白N-聚糖的荧光色谱图的比较，其中对四唾液酸化聚糖和五唾液酸化聚糖的峰形状和回收率的影响很容易可见。观察到的色谱差异同样易于定量。具体地讲，最丰富的二唾液酸化聚糖、三唾液酸化聚糖、四唾液酸化聚糖和五唾液酸化聚糖的荧光峰面积显示在回收率上确实存在非常明显的差异(图13)。该测试还用于证明其他化学上独特的气相沉积涂层可以以同样良好的效果使用。与VPD#7涂覆的硬件非常相似，VPD#2和SilcoTek 涂覆的硬件在改善四唾液酸化N-聚糖和五唾液酸化N-聚糖的峰形状和回收率方面显示出等效的能力。但是，有趣的是，发现并没有必要使用通过针或柱入口的涂覆流动来优化峰形状和回收率。
[0212] 与磷酸化物质一样，据认为，对唾液酸化聚糖的色谱的这种影响是由于掩蔽了硬件的金属表面，以及使吸附样品损失最小化，表现出金属螯合倾向的分析物可能会发生该吸附样品损失。然而，金属螯合的起源是不同的，因为该效果是聚糖携带多个羧酸酯残基而不是一个或两个磷酸化残基的结果。含羧酸酯的化合物通常对金属具有弱亲和力。然而，当在一个分子中存在多个羧酸酯部分时，形成多齿螯合的机会，与四唾液酸化聚糖和五唾液酸化聚糖的情况一样。
[0213] 因此，在本发明的实施方案中，在包含大于三个羧酸残基的生物分子的液相色谱期间使用气相沉积涂覆的柱硬件，作为改善它们的峰形状和回收率的方式。在本发明的又一个实施方案中，气相沉积涂覆的流动路径部件与气相沉积涂覆的柱硬件结合使用，以改善包含大于三个羧酸残基的生物分子的峰形状和回收率。
[0214] 蛋白质的分离
[0215] 还发现，某些气相沉积涂层有利地影响蛋白质反相色谱。为了证明这一点，我们评价了典范蛋白质分离，该蛋白质分离对生物药物的分析非常重要，它是利用MS友好型甲酸改性流动相的单克隆(mAb)亚基分离。使用这样的测试，已检查了柱硬件材料的许多组合。首先针对对应的未处理不锈钢硬件测试气相沉积涂覆的不锈钢柱管连同匹配涂覆的不锈钢熔块。图14A和图14B示出了用这些柱硬件材料获得的荧光色谱图。根据这些数据，发现涂覆有VPD#7的硬件，而不是涂覆有VPD#2的硬件，能够唯一地改善模型分离的基线质量，尤其是在提供更快的基线返回方面。这种对分离的色谱性能的改善通过以下事实来强调：用VPD#7涂覆的柱产生的色谱对于一些亚基也显示出较高的峰强度。该基线问题的性质(如存在于不锈钢硬件中一样)可以被认为是蛋白质分析物经历有问题的次级相互作用并且没有以一种特定的洗脱强度均匀洗脱的结果。有趣的是，在该示例中，VPD#7MVD硬件似乎未显著改善半高峰容量，也未显著改善柱的残留量，其被普遍认为是约0.9％。也就是说，对于蛋白质反相色谱，似乎气相沉积涂层可通过影响基线特性来显著改善分离质量。
[0216] 诸如此的效果对于蛋白质反相分离可能非常重要，尤其是旨在通过在线电喷雾电离(ESI)-质谱(MS)来促进检测的那些蛋白质反相分离。通常，在ESI MS数据中快速返回基线是至关重要的，因为这将使得色谱峰的分配不那么模糊。来自先前洗脱的物质的信号将不太丰富，并且因此在为稍后洗脱峰所积聚的数据中较少混淆。考虑到这一点，使用ESI-MS检测作为评估数据质量的方式，筛选了柱硬件材料的11种附加组合。图15A示出了这些材料中的一些的总离子色谱图(TIC)，包括用不锈钢替代物构造的柱，即聚醚醚酮(PEEK)和低钛镍钴合金(MP35NLT)。令人惊讶的是，发现由VPD#7涂覆的硬件构造的柱是唯一能够快速返回基线的柱。不锈钢、PEEK和VPD#2涂覆的硬件显示出相对较慢的基线返回。此外，对照实验表明，基线质量的改善可通过单独使用VPD#7涂覆的熔块来实现，并且不需要涂覆的管材来实现效果。进一步的实验最终在图15B的色谱图中达到最高水平，从而有可能收集附加见解。其中之一是，熔块的孔隙度是否为0.2或0.5μm或者VPD#7涂层是否已以退火工艺的形式热固化(产生VPD#8涂层)都没有关系。相比之下，较厚的VPD#3涂层(约 厚度)和接触角(一直从约35°)增加到90°的固化涂层(VPD#5)均不能产生效果。因此，VPD#7涂覆的熔块在其影响示例性蛋白质分离的基线的能力方面非常独特。虽然不限于理论，但似乎合理的是，建议该效果来源于该涂层的疏水性/接触角。这些涂覆的熔块可能紧密模拟了反相固定相的表面化学性质。因此，具有VPD#7涂覆的熔块的柱可表现出其化学特性更均匀的吸附位点(尤其是在熔块表面附近的那些吸附位点)。测试已表明，对蛋白质反相分离的这种效果可局限于柱的入口熔块，从而证实了该假设(图16)。实际上，在柱入口处的一个疏水性VPD#7气相沉积涂覆的熔块足以产生示例性mAb亚基分离的独特快速基线返回。蛋白质通过相当离散的吸附/解吸事件经受反相色谱。因此，在加载后，蛋白质分析物将最浓缩，并且同样在柱头处花费大量时间，其中在入口熔块和固定相填充床之间存在界面。在该界面处，蛋白质分析物将有机会建立不期望的次级相互作用，该不期望的次级相互作用将会累积并在能量上不同于与固定相的期望疏水相互作用。看似可信的是，使用具有类似于固定相的表面特性的熔块可减轻与在此填充床界面处存在能量和化学上不同的吸附位点有关的任何色谱问题。虽然不限于理论，但也有可能的是，熔块，诸如C2C10气相沉积涂覆的入口熔块(例如，涂覆有VPD#7的熔块)赋予蛋白质反相分离全新的聚焦效果，这不能由上述理解和描述来解释。此外，可能的是，熔块(诸如VPD#7气相沉积涂覆的入口熔块)对固定相如何填充到柱中做出了独特的贡献。使用气相沉积涂覆的熔块作为用于构建填充柱床的基材可以有利地影响固定相和所得色谱的特性。
[0217] 因此，在本发明的实施方案中，使用气相沉积涂覆的柱硬件来改善蛋白质反相分离的色谱性能。在本发明的又一个实施方案中，使用具有>90°的接触角，更优选大于的气相沉积涂层来涂覆柱的管材和熔块，或色谱装置，作为改善蛋白质分离的基线和/或拖尾因数的方式。
[0218] 在单独的实施方案中，本发明可利用由特定聚合物构造的熔块材料，使得实现相当疏水的表面，特别是接触角大于90°，更优选大于 的表面。聚四氟乙烯(PTFE)、聚甲基戊烯(PMP)、高密度聚乙烯(HDPE)、低密度聚乙烯(LDPE)和超高分子量聚乙烯(UHMWPE)是可适用作本发明的其他实施方案中的熔块或柱材料的疏水性聚合物的示例。事实上，发现由多孔PTFE(1.5mm厚，Porex PM0515)构造的入口熔块以类似于先前提及的VPD#7气相沉积涂覆的入口熔块的方式有利地影响蛋白质反相基线(图17)。替代组合物的熔块也与本发明相关。在又一个实施方案中，聚对二甲苯(也就是说，聚对二甲苯聚合物)涂层可用于处理柱熔块，从而改善蛋白质反相分离的特性。此外，玻璃膜可用作熔块材料的基础。在玻璃膜基材上，硅烷可以键合以有利地调控材料的疏水性和接触角。这些膜和其他此类膜也可与背衬材料(比如多孔聚合物片材)结合使用，以向设备提供物理刚度。
[0219] 最后，已经发现气相沉积涂覆的硬件有益于水性生物分子分离，诸如蛋白质离子交换色谱。当希望了解样品的电荷异质性时，分析人员通常会选择通过离子交换来分解样品的组分。就蛋白质治疗剂而言，这种类型的分析作为以下方式来进行：询问可对对应药物产品的功效具有不利影响的所谓的电荷变体，诸如脱酰胺变体。因此，通过离子交换的电荷变体分离对于蛋白质治疗(最特别是单克隆抗体)的表征方法的有效性可为至关重要的。作为此类重要的分析方法，蛋白质离子交换必须是稳健的并且能够快速且可靠地产生准确信息。
[0220] 为此，对单克隆抗体的离子交换分离进行了评价，并且对使用未涂覆的与气相沉积涂覆的柱硬件的效果进行了对比。图21A-图21L呈现了从顺序阳离子交换分离和样品的重复注射获得的NIST参考材料8671(IgG1κmAb)的色谱图。在该评价中，测试来源于四种不同构造的柱。这些柱相对于硬件设计和气相沉积涂层两者而改变。从观察到的结果来看，最明显的是未涂覆的硬件显示出显著的调理效果，表现为在初次注射时峰面积较低。虽然不限于理论，但据信未涂覆的柱硬件的金属表面对这些分离施加吸附损失，从而阻碍样品的回收。相比之下，即使在柱首次运行时，气相沉积涂覆的硬件(C2或C2-GPTMS-OH化学品两者)也产生相对高的峰面积(图22)。也就是说，涂覆的硬件没有证据表明需要钝化步骤，这使其具有更快地提供准确色谱数据的独特优势。此处，显而易见的是，所指出的气相沉积涂层增强了金属硬件的色谱特性。在区分两个测试的气相沉积涂层(即C2和C2-GPTMS-OH化学品)的色谱性能的方面几乎看不到。然而，C2-GPTMS-OH涂层具有非常低的接触角(与C2PEO一样)。可预见的是，某些类型和种类的生物分子将需要高度亲水性的流动路径。一个此类示例确实可以是水性蛋白质分离，其中疏水相互作用可能导致较差的回收率或峰拖尾。总体而言，据信气相沉积涂覆的硬件将对于多种形式的水性分离显示出优势，包括但不限于离子交换、尺寸排阻和疏水性相互作用色谱，并且最理想的气相沉积涂层将是非常亲水的。因此，在本发明的实施方案中，使用气相沉积涂覆的柱来改善来自水性色谱分离的样品的回收率。在更具体的实施方案中，使用接触角小于20°的气相沉积涂层来改善离子交换、尺寸排阻或疏水性相互作用色谱中生物分子的回收率。
[0221] 实施例
[0222] 实施例1
[0223] C2和C2C10气相沉积涂层
[0224] 在涂覆之前，根据硝酸钝化，将所有金属部件钝化。然后将钝化部件和硅晶片引入气相沉积室并建立真空。第一步骤是15分钟，200瓦，200cc/min氧等离子体清洁步骤。接下来是第一气相沉积循环。每个气相沉积循环包含硅烷气相沉积，然后引入水蒸气以进行硅烷水解。在2.0托的压力下递送硅烷蒸气5秒，然后在50托的压力下递送水蒸气5秒。递送后，使硅烷和水与基材反应15分钟。重复该循环以产生期望数量的层和涂层厚度。可实施附加处理循环以用又一种硅烷使涂层官能化。此外，涂覆后退火步骤可用于进一步交联并增加涂层的疏水性。通常，退火循环涉及在真空下使涂层经受200℃持续3小时。
[0225] 硅晶片用作试样块以测量涂层的厚度和接触角。为了测量厚度，使用盖特纳科学公司(Gaertner Scientific Corporation)的斯托克斯椭圆仪模型LSE。通过分析光的偏振变化并与模型进行比较，可确定膜厚度。为了测量接触角，使用莱姆哈特测角计模型190。在将受控量的水滴到完全水平的硅晶片上之后，使用光学技术来测量接触角。
[0226] 实施例2
[0227] C2-GPTMS-OH气相沉积涂层
[0228] 在涂覆之前，根据硝酸钝化，将所有金属部件钝化。然后将钝化部件和硅晶片引入气相沉积室并建立真空。第一步骤是15分钟，200瓦，200cc/min氧等离子体清洁步骤。接下来是第一气相沉积循环。每个气相沉积循环包含硅烷气相沉积，然后引入水蒸气以进行硅烷水解。在2.0托的压力下递送硅烷蒸气5秒，然后在50托的压力下递送水蒸气5秒。递送后，使硅烷和水与基材反应15分钟。重复该循环以产生期望数量的层和涂层厚度。在该示例中，使用双(三氯甲硅烷基)乙烷硅烷来建立约 的粘附或底漆层。在C2沉积之后，在气相沉积室中将3-(缩水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷无水递送至0.4托的压力。使该硅烷蒸气与C2涂覆的基材反应一小时。该过程得到具有50°的接触角的环氧化物封端的涂层。在沉积后，下一个步骤是水解环氧化物基团。这在液相或气相中用0.1M乙酸进行。在环氧化物水解之后，接触角为<20°。使用莱姆哈特测角计模型190在硅晶片上进行接触角测量。
[0229] 实施例3
[0230] 替代接触角测量
[0231] 使用测角计测量平坦硅晶片上的接触角是相对容易的。然而，并非所有的基材均具有此类平滑且平坦的表面。熔块可被认为是色谱柱的最重要的基材，因为在熔块中的流体表面积与质量比率高于任何其他柱硬件部件中的流体表面积与质量比率。为了测量熔块孔隙度的固体-液体润湿特性，并确认涂层的存在，我们可使用泡点测试。泡点测试用于确定熔块结构的最大孔径，并且泡点压力以以下公式与该直径相关：
[0232] P＝(2γcosθ)/r
[0233] 其中，
[0234] P＝泡点压力，Pa(测量)
[0235] γ＝测试液体的表面张力，N/m(已知)
[0236] Θ＝测试液体与孔材料之间的接触角(计算)
[0237] r＝最大孔半径，m(计算)
[0238] 该公式来自ASTM E128，并且从毛细管上升的平衡条件得出。
[0239] 使用泡点测试来计算接触角需要两个步骤。首先是测试IPA中的熔块，并且假定0接触角，因为IPA具有优异的润湿特性。这将产生最大孔径。下一个步骤是以水作为测试液体以及已知的孔半径重复实验。相对于IPA的假定的0度接触角，这将产生与水的接触角。图18显示了相对于涂层组合物记录的不同泡点压力。图19显示了得出的接触角与涂层组合物的关系。这些值与在平坦硅晶片上用测角计进行的测量很好地相关。
[0240] 实施例4
[0241] 硅烷涂层的腐蚀性能
[0242] ASTM G48方法A用于对各种等级的不锈钢的相对点蚀性能进行排序。它包括将一部分放置在约6％氯化铁溶液中72小时，以及检查部件的质量损失。该测试可在室温下或稍高的温度下运行以增加腐蚀速率。氯化铁溶液与“非加速”点蚀期间凹坑内的环境相似；即，酸性、氧化、含氯化物的环境。当整个感兴趣的部分浸没在氯化铁溶液中时，点蚀大大加快，正常的测试时间仅为72小时。图20显示了未涂覆的柱管和柱管上的各种涂层的腐蚀性能。改善范围为约10倍至约100倍。
[0243] 实施例5
[0244] 磷酸聚糖的HILIC-荧光-MS
[0245] 将重组α-半乳糖苷酶稀释至2mg/mL。然后将蛋白质溶液的7.5uL等分试样添加到1mL反应管中，该反应管含有15.3μL水和6μL缓冲的5％RapiGest SF溶液(可从马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation,Milford,MA)商购获得)(50mM HEPES NaOH，pH 7.9)。将混合物置于90℃的加热块中3分钟。然后，允许反应管在室温下冷却3分钟。然后向反应管中添加1.2μL的聚糖酶F并在50℃下温育5分钟。在温育后，再次允许反应在室温下冷却3分钟。向含有9mg的RapiFluor-MS试剂的小瓶中添加131uL的无水DMF并涡旋以产生标记溶液。接下来将12uL体积的该标记溶液添加到反应管中。允许该标记反应继续进行5分钟以产生最终样品。
[0246] 在2.1×50mm柱尺寸中使用全多孔酰胺HILIC固定相(1.7um， )，以便以0.4mL/min的流速和60℃的温度对样品进行色谱分析。梯度流动条件以75.0％有机溶剂(乙腈)和25.0％水性洗脱液(50mM甲酸铵，pH 4.4)开始，随后是至54.0％有机/46％水性洗脱液的11.66分钟的线性梯度。然后将柱以100％水性流动相以0.2mL/min的流速循环通过水性再生步骤1分钟。在水性再生后，将柱在初始条件下平衡4分钟。经由荧光(Ex265/Em 425，
2Hz)，然后在线ESI-MS依次检测在上述分离期间洗脱的物质。用Xevo G2-XS QToF质谱仪采集质谱，该质谱仪以2.2kV的毛细管电压、120℃的源温度、500℃的去溶剂化温度和50V的样品锥电压操作。在700-2000m/z范围内以2Hz的速率采集质谱，分辨率为大约40,000。图4A-图4C示出了用由不同涂层和材料构造的柱进行的来自重组α-半乳糖苷酶的标记为释放N-聚糖的RapiFluor-MS的这种HILIC分离的比较。图6A-图6C示出了用由不同涂层和材料构造的柱与由不同涂层构造的样品针和柱入口管材结合进行的该HILIC分离的比较。
2Hz)，然后在线ESI-MS依次检测在上述分离期间洗脱的物质。用Xevo G2-XS QToF质谱仪采集质谱，该质谱仪以2.2kV的毛细管电压、120℃的源温度、500℃的去溶剂化温度和50V的样品锥电压操作。在700-2000m/z范围内以2Hz的速率采集质谱，分辨率为大约40,000。图4A-图4C示出了用由不同涂层和材料构造的柱进行的来自重组α-半乳糖苷酶的标记为释放N-聚糖的RapiFluor-MS的这种HILIC分离的比较。图6A-图6C示出了用由不同涂层和材料构造的柱与由不同涂层构造的样品针和柱入口管材结合进行的该HILIC分离的比较。
[0247] 实施例6
[0248] 磷酸肽的RPLC-UV-MS
[0249] 用50uL的0.1％甲酸重构一小瓶磷酸肽测试标准液(马萨诸塞州米尔福德的沃特世公司(Waters Corporation,Milford,MA))。在2.1×50mm柱尺寸中使用全多孔CSH C18固定相材料(1.7um， )，以便以0.2mL/min的流速，以60℃的温度对样品进行色谱分析。梯度流动条件以0.7％有机流动相(乙腈中的0.075％甲酸)和99.3％水性流动相(0.1％甲酸)开始，随后是至50％有机/50％水性的30分钟的线性梯度。经由UV(220nm)，然后在线ESI-MS依次检测在上述分离期间洗脱的物质。用Xevo G2-XS QToF质谱仪采集质谱，该质谱仪以1.5kV的毛细管电压、100℃的源温度、350℃的去溶剂化温度和50V的样品锥电压操作。在
500-6500m/z范围内以2Hz的速率采集质谱，分辨率为大约40,000。图7A-7C示出了用由不同涂层和材料构造的柱进行的磷酸肽标准的这种反相分离的比较。
500-6500m/z范围内以2Hz的速率采集质谱，分辨率为大约40,000。图7A-7C示出了用由不同涂层和材料构造的柱进行的磷酸肽标准的这种反相分离的比较。
[0250] 实施例7
[0251] 小生物分子(核苷酸和糖磷酸酯)的RPLC/MS
[0252] 根据下文所述的方法参数，通过与有机硅C18固定相的反相分离，进行两种核苷酸(一磷酸腺苷和三磷酸腺苷)和两种糖磷酸酯(葡萄糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸)的RPLC/MS分析。图8-图11呈现了用由不同涂层和材料构造的柱进行的这些反相分离的比较。
[0253] LC条件
[0254]
[0255] 梯度表：
[0256]
[0257] 实施例8
[0258] 使用电荷表面反相色谱的高唾液酸化聚糖的LC-荧光-MS
[0259] RapiFluor-MS标记的N-聚糖由牛胎球蛋白(Sigma F3004)根据先前公布的协议(Lauber,M.A.；Yu,Y.Q.；Brousmiche,D.W.；Hua,Z.；Koza,S.M.；Magnelli,P.；Guthrie,E.；Taron,C.H.；Fountain,K.J.,“Rapid Preparation of Released N-Glycans for HILIC Analysis Using a Labeling Reagent that Facilitates Sensitive Fluorescence and ESI-MS Detection.”Anal Chem 2015,87(10),5401-9(“使用促进灵敏荧光和ESI-MS检测的标记试剂快速制备释放的N-聚糖以供HILIC分析”，《分析化学》，2015年，第87卷，第10期，第5401-5409页))制备。使用Waters ACQUITY UPLC H级Bio LC系统和分离方法，基于名称为“CHARGED SURFACE REVERSED PHASE CHROMATOGRAPHIC MATERIALS METHOD FOR ANALYSIS OF GLYCANS MODIFIED WITH AMPHIPATHIC,STRONGLY BASED MOIETIES(用于分析用两亲、强碱部分改性的聚糖的带电表面反相色谱材料方法)”(并且以引用方式并入)的国际申请No.PCT/US2017/028856中所述的前述的带电表面反相色谱材料来进行这些释放聚糖的分析。具体地讲，RapiFluor-MS标记的聚糖(例如，用PCT/US2017/028856中讨论的标记试剂标记的聚糖)在2.1×100mm柱配置中使用完全多孔 1.7μm二乙氨基丙基高纯度色谱材料(DEAP HPCM)根据混合模式分离来分离。该方法的细节在下文中描述。图12和图
13呈现了用由不同涂层和材料构造的柱进行的唾液酸化聚糖的这种混合模式分离的比较。
13呈现了用由不同涂层和材料构造的柱进行的唾液酸化聚糖的这种混合模式分离的比较。
[0260] LC条件
[0261]
[0262] 梯度表：
[0263]
[0264]
[0265] 实施例9
[0266] 还原的、IdeS消化的单克隆抗体(mAb)的LC/MS
[0267] 将配制的NIST mAb参考材料8671(IgG1κ)添加到100单元IdeS中并在37℃下温育30分钟。然后通过加入1M TCEP和固体GuHCl将所得IdeS消解的mAb变性和还原。用于变性/还原步骤的最终缓冲组合物为大约6M GuHCl、80mM TCEP和10mM磷酸盐(pH 7.1)。将IdeS消化的NIST RM8671(1.5mg/mL)在37℃下在该缓冲液中温育1小时，然后储存在4℃下。进行还原的、IdeS分段的mAb的反相(RP)分离，以证明采用不同气相沉积涂覆的柱硬件部件(即柱管和将固定相包封到其填料中的熔块)的效果。
[0268] 在2.1×50mm柱尺寸中使用C4键合的表面多孔的固定相(2μm，Rho0.63， )，以便以0.2mL/min的流速和80℃的温度，在线性梯度上对样品进行色谱分析，该线性梯度包括15％至55％有机流动相的20分钟线性梯度(水性流动相：水中的0.1％(v/v)甲酸；有机流动相：乙腈中0.1％(v/v)甲酸)。经由荧光(Ex 280/Em 320，10Hz)，然后在线ESI-MS依次检测在上述分离期间洗脱的物质。用Synapt G2-S质谱仪采集质谱，该质谱仪以3.0kV的毛细管电压、150℃的源温度、350℃的去溶剂化温度和45V的样品锥电压操作。在500-4000m/z范围内以2Hz的速率采集质谱，分辨率为大约20,000。图14-图17示出了用由不同涂层和材料构造的柱进行的还原的、IdeS消化的NIST参考材料8671的这种反相C4分离的比较。
[0269] 实施例10
[0270] 离子交换色谱
[0271] 使用由填充到未涂覆或气相沉积涂覆的硬件中的3μm无孔阳离子交换固定相构造的柱来分离NIST mAb参考材料8671(IgG1κ)。根据下述实验条件用ACQUITY UPLC H级Bio仪器进行分离。图21和图22示出了用由不同涂层和材料构造的柱所获得的这些分离及其所得的数据的比较。
[0272] LC条件
[0273]
[0274] 实施例11
[0275] 寡核苷酸离子对RPLC
[0276] 测试表明，用本发明的气相沉积涂层改性的流动路径也有助于改善寡核苷酸分离。实施例11提供了诸如以改善的回收率和样品组成的更准确分析的形式观察到的证据，特别是相对于用柱获得的第一色谱图。
[0277] 在该工作中，使用由填充到未涂覆或气相沉积涂覆的硬件中的1.7μm有机硅C18键合的固定相构造的柱来分离15、20、25、30、35和40-mer脱氧胸苷的混合物。根据下述实验条件用ACQUITY UPLC H级Bio仪器进行分离。图23A-图23F和图24示出了用由不同涂层和材料构造的柱所获得的这些分离及其所得的数据的比较。
[0278] LC条件
[0279]
[0280]
[0281] 实施例12
[0282] 柠檬酸和苹果酸的RPLC
[0283] 还应当指出的是，本发明的有益效果不限于仅生物分子或含磷酸化/磷酸基团的分析物。事实上，许多类型的所谓“小分子”可被视为通过采用气相沉积涂覆的流动路径和柱硬件来改善它们的分离。一类值得注意的小分子对应于具有羧酸部分的化合物。就其本质而言，它们是普遍存在的化合物，而一些化合物(比如柠檬酸和苹果酸)是生物体的重要代谢物，因为它们是克雷布斯循环的组成部分。
[0284] 在本文中，我们研究了用未处理的柱与气相沉积的涂覆的柱分离柠檬酸和苹果酸的效果。柠檬酸和苹果酸通过LC-MS分析，其中柱由1.8μm二氧化硅 C18键合的固定相构造，该固定相填充到未涂覆的或C2C3气相沉积涂覆的硬件中。用ACQUITY UPLC I级PLUS仪器进行分离，并根据以下概述的实验条件，用Xevo TQ-S三重四极质谱仪检测洗脱的分析物。图25A-图25D示出了这些分离及其所得数据的比较。从这些结果可以看出，使用气相沉积涂覆的柱硬件导致回收率和峰形状的改善，以及因此MS强度的大大增加。这是值得注意的，因为它突出了以下事实：气相沉积涂层可用于促进对这些化合物和其他化学上类似的化合物(包括但不限于异柠檬酸、ɑ-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、乌头酸、衣康酸、草酰乙酸、丙酮酸、泛酸、生物素和叶酸)进行更灵敏且更准确的定量测定。假定甚至两性离子小分子也将受益于本发明是合理的。这类化合物包括但不限于氨基酸和神经递质。同样，可以设想到，本发明将有利于用于分离和分析包含金属结合部分的化合物，诸如钴胺素和各种类型的卟啉。最后，这些相同化合物将表现出改善的分离，无论通过RPLC还是其他模式的色谱(诸如亲水相互作用色谱(HILIC)、离子交换或混合模式LC分离(即，离子交换/反相或离子交换/HILIC))进行分析。
[0285] LC条件
[0286]
[0287]
[0288] MS条件
[0289]
[0290] 实施例13
[0291] 杀虫剂的混合模式色谱
[0292] 草甘膦是在全球作为作物干燥剂广泛使用的非选择性广谱除草剂。由于会对消费者造成潜在的健康后果，因此在全球范围内对各种感兴趣商品实施最大残留限量(MRL)。草甘膦及其代谢物氨基甲基膦酸(AMPA)需要用于样品制备和色谱分离的独特方法。可以采用各种方法进行定量，无论它们是基于反相、多孔石墨化碳、离子色谱、亲水性相互作用色谱(HILIC)还是混合模式保留机制。无论分离模式如何，对草甘膦和其他相关除草剂化合物的测定都可被证明是有问题的。首先，极性杀虫剂难以在没有衍生的情况下保留在反相柱上。其次，草甘膦与活性金属表面相互作用。因此，众所周知，其以宽峰或具有明显拖尾的峰的形式被观察到。
[0293] 在本文中，我们研究了用未处理的与气相沉积涂覆的混合模式HILIC柱来分离草甘膦。草甘膦通过LC-MS用1.7μm二乙胺键合的有机硅 柱进行分析，该柱由未涂覆的或C2C10气相沉积涂覆的不锈钢硬件构造。根据以下概述的实验条件，用与Xevo TQ-S三重四极质谱仪联接的ACQUITY UPLC H级Bio进行分离。
[0294] 图26A-图26B和图27A-图27B示出了在溶剂标准中草甘膦的涂覆和未涂覆的柱性能的比较。如图26B中所见，草甘膦表现为严重拖尾、宽峰。相比之下，如图26B中所见，在气相沉积涂覆的柱上，草甘膦以显著改善的峰形状分离。从这些结果可以看出，使用气相沉积涂覆的柱硬件导致峰形状显著改善，峰宽减小，并且因此MS强度大大增加(图27A-图27B)。假定气相沉积涂覆的柱也产生更高的回收率是合理的。这些结果是值得注意的，因为它们证明了对草甘膦和其他化学上类似的化合物(包括但不限于杀虫剂，诸如乙烯利、2-羟乙基膦酸(HEPA)、草铵膦、N-乙酰基-草铵膦、3-甲基膦酸丙酸(MPPA)、氨基甲基膦酸(AMPA)、N-乙酰基-草甘膦、N-乙酰基-AMPA、三乙膦酸铝、膦酸、马来酰肼、高氯酸盐和氯酸盐)进行更灵敏且更准确的定量测定的方式。
[0295] LC条件
[0296]
[0297] 梯度表：
[0298]
[0299] MS条件
[0300]
[0301] 替代方案：
[0302] 本技术有多种替代方法和用途。虽然上述方法通常相对于色谱或柱的使用进行了讨论。具有内部流动路径的其他类型的流体部件可受益于本技术。例如，通常认为毛细管电泳(诸如毛细管区电泳)表现出相对较差的再现性。可以认为，许多再现性问题是由用于进行分离的管状毛细管的内径上不可再现的表面化学性质引起的。因此，旨在用于CE分离的毛细管上的气相沉积涂层可能会避免再现性问题，因为它可能产生非常厚的坚固涂层。因此，本文所述的发明可适用于改善小生物分子和大生物分子的CE分离。
[0303] 此外，虽然所述方面的示例采用相对疏水的涂层，其中水接触角在15°至110°的范围内，但合理的是建议可通过施加亲水性涂层来增强一些分离，该亲水性涂层包括但不限于二醇、酰胺/脲基类型和聚环氧乙烷/乙二醇键合。
[0304] 尚未明确描述的其他分析物也可受益于气相沉积涂覆的色谱流动路径，例如硫代磷酸化的寡核苷酸。核酸固有地包含重复的磷酸二酯键作为其主链的一部分。在一些情况下，磷酸二酯主链部分地被硫代磷酸酯主链取代，该硫代磷酸酯主链本身会带来独特的分离挑战。类似地，完整的和蛋白水解消化的抗体缀合物可受益于需要使用气相沉积色谱流动路径的方法。最后，包含组氨酸残基的生物分子可能受益于本发明，因为像含有磷酸化和羧酸酯的残基一样，它们具有与金属键合的倾向。
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