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利用 磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法

阅读：388发布：2020-05-11

专利汇可以提供利用磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及包含经纯化的光合细胞膜囊泡及反式白藜芦醇生物合成相关酶的反式白藜芦醇(trans-resveratrol)的生物体外(in vitro)生产用组合物、利用其的生产方法及系统。，下面是利用磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种反式白藜芦醇的生产方法，其特征在于，包括：
4-香豆酸-辅酶A连接酶的酶促反应a)，通过聚合4-香豆酸和辅酶A来生成4-香豆酰辅酶A，并通过消耗腺苷三磷酸来形成腺苷一磷酸和焦磷酸酯；
丙二酰辅酶A合成酶的酶促反应b)，通过聚合丙二酸和辅酶A来生成丙二酰辅酶A，并通过消耗腺苷三磷酸来形成腺苷一磷酸和焦磷酸酯；
芪合酶的酶促反应c)，通过聚合分别在上述反应a)和反应b)中生成的4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A来形成反式白藜芦醇，并形成辅酶A和二氧化碳；
腺苷酸激酶的酶促反应d)，通过使在上述反应a)和反应b)中生成的腺苷一磷酸与腺苷三磷酸进行反应来转换为腺苷二磷酸；
焦磷酸酶的酶促反应e)，使在上述反应a)和反应b)中生成的焦磷酸酯转换为无机磷酸；
光合细胞膜囊泡的光反应f)，在光照射条件下，使分别在上述反应d)和反应e)中生成的腺苷二磷酸和无机磷酸转换为腺苷三磷酸。
2.根据权利要求1所述的反式白藜芦醇的生产方法，其特征在于，上述光合细胞膜囊泡为在适当的光源条件下能够从腺苷二磷酸和无机磷酸生成腺苷三磷酸的细胞膜-蛋白质复合体，并选自色素细胞膜囊泡或类囊体膜囊泡。
3.根据权利要求1所述的反式白藜芦醇的生产方法，其特征在于，上述光合细胞膜囊泡为通过将磁性粒子包含在囊泡的内部而借助磁铁受到引力的磁性光合细胞膜囊泡。
4.根据权利要求1所述的反式白藜芦醇的生产方法，其特征在于，各个上述酶能够以固定在琼脂糖树脂而被密封在网状物内的形态从酶促反应液分离出。
5.一种反式白藜芦醇生产系统，其特征在于，包括：
酶促反应部，包含4-香豆酸-辅酶A连接酶、丙二酰辅酶A合成酶、芪合酶、腺苷酸激酶及焦磷酸酶；以及
光反应部，由用于向上述酶促反应部提供腺苷三磷酸的光合细胞膜囊泡形成。
6.根据权利要求5所述的反式白藜芦醇生产系统，其特征在于，在上述生产系统中，酶促反应部利用4-香豆酸、丙二酸作为基质来生产反式白藜芦醇，并循环使用作为在此过程中所需的辅酶的腺苷三磷酸和辅酶A。
7.根据权利要求5所述的反式白藜芦醇生产系统，其特征在于，上述光合细胞膜囊泡为通过将磁性粒子包含在囊泡的内部而借助磁铁受到引力的磁性光合细胞膜囊泡。
8.根据权利要求5所述的反式白藜芦醇生产系统，其特征在于，在上述生产系统中生成的反式白藜芦醇以悬浮液的形态形成于反应液中，并能够以沉淀物的形态从反应液分离出。

说明书全文

利用磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及将包含磁性粒子(magnetic particle)的光合细胞膜囊泡(photosynthetic membrane vesicle)，即，磁性光合细胞膜囊泡(magnetic photosynthetic membrane vesicle)与固定化的生物合成酶一起使用来生成产物为固体的反式白藜芦醇(trans-resveratrol)的方法。

背景技术

[0002] 光合细胞膜(photosynthetic membrane)为在进行光合成的生物中出现的特征性细胞内结构，具有光吸收体(light-harvesting complex)、光反应中心(reaction center)、电子传递链(electron transfer chain)，单独进行光合成的光反应。光合细胞膜的种类为存在于紫色无硫细菌(purple nonsulfur bacteria)的色素细胞膜(chromatophore membrane，intracytoplasmic membrane，ICM)和存在于植物、藻类、蓝细菌的类囊体膜(thylakoid membrane，TM)。光合细胞膜在细胞中吸收光能并将其转换为化学能(光反应)，具体地，进行通过结合腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)和无机磷酸(inorganic phosphate，Pi)来形成腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)的反应，或者将氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidized，NADP+)转换为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯(nicotiamide adenine dinucleotide phosphate reduced，NADPH)。当破碎光合成细菌的细胞时，光合细胞膜会变成囊泡(vesicle)形态，将其称为光合细胞膜囊泡(photosynthetic membrane vesicle)。光合细胞膜囊泡在细胞外的环境(in vitro)下照射光时单独进行光合成的光反应并可通过此反应起到供给作为生物体酶促反应中所使用的辅酶的腺苷三磷酸和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯的作用(韩国专利授权第1017087520000)。

[0003] 白藜芦醇为大多是在葡萄种类中所发现的多酚类的化合物，其公知为具有睡眠延长效果(Bhullar and Hubbard.2015.Biochim.Biophys.Acta 1852：1209-1218)，因此被广泛利用为保健辅助剂。除了睡眠延长效果之外，还公知为具有抗氧化效果、抗血小板效果(anti-platelet)、抗炎症效果、降低血糖、抗癌效果等多种效果，还可以被利用为医药品(Kursvietiene et al.2016.Medicina52：148-155)。

[0004] 虽然白藜芦醇具有这些效果，但在产业上不易生产白藜芦醇。作为最典型的方法，广泛使用如葡萄或花生等植物中直接提取白藜芦醇的方法，但植物具有的白藜芦醇的含量低，因此具有其产率不佳且纯化度也降低的缺点。作为一个代替性方案，使用通过有机合成生产白藜芦醇的方法(Fan et al.2010.Mini Rev.Org.Chem.7：272-281)。但是，有机合成方法难以去除反应的副产物，且反应结构复杂，因此难以实现大批量生产。并且，作为其他代替性方案，使用利用在执行基因操作的大肠杆菌或酵母的菌体中生产的方法。大肠杆菌或酵母原本不能合成白藜芦醇，因此通过使其生物合成中所需的基因表达来生产白藜芦醇，从此变形为多种形态的方法。在利用菌体的情况下，可生产低至100mg/L，高至2300mg/L(Lim et al.2011.Appl.Environ.Microbiol.77：3451-3460)，但存在确保维持菌株所消耗的费用高、需要去除细胞内容物的额外工序、经过基因操作的菌体不稳定的问题(Afonso et al.2015.Biotech.Rep.5：7-13)。

[0005] 为了克服这些现有方法的问题，在本发明中建立了通过纯化白藜芦醇物合成酶来在细胞外生产白藜芦醇的系统。酶系统具有由于其特异性反应而副产物低、产物纯度高、没有用于维持细胞的能量消耗、容易抑制部分反应的优点。但是，酶的纯化费用高、供给成本高的辅酶(cofactor)的问题成为限制因素。在本发明中，为了克服利用酶的成产方法的缺点并最大化优点，在组合磁性光合细胞膜囊泡和固定化酶的整个生物合成过程中，通过反复地重复使用少量的成本高的辅酶来解决其供给问题。并且，可通过使用磁铁从反应液中容易地分离出磁性光合细胞膜囊泡来实现反复性的重复使用，并利用网状物(mesh)来反复地重复使用固定化的酶，从而开发了提高光合细胞膜囊泡及酶的适用度、消除制造及纯化费用高的问题、将作为反应产物的白藜芦醇以沉淀物形态容易分离的方法。

[0006] 作为上述背景技术说明的内容仅用于说明本发明的背景，而不应理解为属于本技术领域的普通技术人员公知的现有技术。

发明内容

[0007] 发明所要解决的问题

[0008] 本发明所要解决的问题在于，开发利用纯化的酶在生物体外(in vitro)合成反式白藜芦醇的方法。化学合成方法由于存在反应副产物且反应的复杂性而难以适用于实际性产业上。在菌体中生产的方法也在维持细胞时的不必要的能量浪费和基因操作菌体的不稳定性的方面上受到限制。为了克服这些限制，在本发明中，利用酶将4-香豆酸(4-coumaric acid)和丙二酸(malonic acid)作为初始基质来建立生产反式白藜芦醇的新的生物合成路径并为了将其适用于实际生产中而优化了反应。为了有效地操作上述生物合成路径，本发明所要解决的问题为如下：

[0009] 1)持续性供给在酶促反应中所需的高成本辅酶的方法；

[0010] 2)酶的高纯化费用；

[0011] 3)最终产物的回收方法。

[0012] 因此，以下的解决问题的方案中，提出对上述问题的详细说明及解决方法和多种适用可能性。并且，为了正确地理解本发明，明确定义术语的意思。

[0013] 用于解决问题的方案

[0014] 在本发明中，为了开发反式白藜芦醇的细胞外生产方法，建立了包含三种主酶(4-香豆酸-辅酶A连接酶、丙二酰辅酶A合成酶、芪合酶)和两种辅酶(腺苷酸激酶、焦磷酸酶)的酶系统(图1)。在上述酶系统中，将低成本的4-香豆酸及丙二酸作为初始基质来生产反式白藜芦醇，此时，作为辅酶需要辅酶A(coenzyme A，CoA)和腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)。由于上述辅酶的成本高，在反应时连续地供给是在经济方面上无法实现的，因此需要有效地供给辅酶的方法。辅酶A随着整个反应的进行而在酶系统内连续地循环并反复地重复使用，因此能够以少量进行整个反应。但是，当进行酶促反应时，腺苷三磷酸被转换为腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)和焦磷酸酯(pyrophosphate，PPi)而被消耗，因此，作为用于重复供给腺苷三磷酸的方法，本发明中结合了韩国专利申请第10-2017-0052361中公开的磁性光合细胞膜囊泡(magnetic photosynthetic membrane vesicle)和酶系统。上述酶系统中所包含的两种辅酶为腺苷酸激酶(adenylate kinase)和焦磷酸酶(pyrophosphatase)，且分别催化通过结合腺苷一磷酸和腺苷三磷酸来形成腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)的反应以及将焦磷酸酯转换为无机磷酸(inorganic phosphate)的反应。在适当的光源下，磁性光合细胞膜囊泡可通过光合成的光反应将借助辅酶形成的腺苷二磷酸和无机磷酸再次转换为腺苷三磷酸，其在酶反应中被反复地重复使用，最终，即使不进行额外的供给也能够以少量的腺苷三磷酸进行整个反应。

[0015] 本发明提供包含光合细胞膜囊泡及反式白藜芦醇生物合成相关酶的用于生产反式白藜芦醇的组合物。

[0016] 并且，本发明提供利用上述组合物的上述反式白藜芦醇的生产方法及系统。

[0017] 上述生产方法及系统包括：

[0018] 4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-CoA ligase)的酶促反应a)，通过聚合4-香豆酸和辅酶A来生成4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl CoA)，并通过消耗腺苷三磷酸来形成腺苷一磷酸和焦磷酸酯(pyrophosphate)；

[0019] 丙二酰辅酶A合成酶(malonyl-CoA synthetase)的酶促反应b)，通过聚合丙二酸和辅酶A来生成丙二酰辅酶A(malonyl CoA)，并通过消耗腺苷三磷酸来形成腺苷一磷酸和焦磷酸酯(pyrophosphate)；

[0020] 芪合酶(stilbene synthase)的酶促反应c)，通过聚合分别在上述反应a)和反应b)中生成的4-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A来形成反式白藜芦醇，并形成辅酶A和二氧化碳；

[0021] 腺苷酸激酶的酶促反应d)，通过使在上述反应a)和反应b)中生成的腺苷一磷酸与腺苷三磷酸进行反应来转换为腺苷二磷酸；

[0022] 焦磷酸酶(pyrophosphatase)的酶促反应e)，使在上述反应a)和反应b)中生成的焦磷酸酯(pyrophosphate)转换为无机磷酸(inorganic phosphate)；

[0023] 光合细胞膜囊泡的光反应(light reaction)f)，在光照射条件下，使分别在上述反应d)和反应e)中生成的腺苷二磷酸和无机磷酸转换为腺苷三磷酸。

[0024] 上述光合细胞膜囊作为在光合细胞膜囊泡(photosynthetic membrane vesicle)的内部包含磁性粒子(magnetic particle)的细胞膜-蛋白质复合体，能够以当与磁铁接触时向磁铁方向受引力为特征，在本说明书中，将这种光合细胞膜囊泡称为“磁性光合细胞膜囊泡(magnetic photosynthetic membrane vesicle)”。上述磁性光合细胞膜囊泡可在反应结束后利用磁铁容易地从反应液中分离出。

[0025] 上述“光合细胞膜囊泡”是指在适当的光照射条件下在细胞外(in vitro)单独进行光合成的光反应并可通过此反应将腺苷二磷酸和无机磷酸转换为腺苷三磷酸的细胞膜-蛋白质复合体。用于实现本发明的光合细胞膜囊泡可选自包含来源于紫色无硫细菌(purple nonsulfur bacteria)的色素细胞膜囊泡(chromatophore membrane vesicle)或来源于蓝细菌(cyanobacteria)、藻类(algae)的类囊体膜囊泡(thylakoid membrane vesicle)的组中，在本发明中，作为一个实例，使用色素细胞膜囊泡。

[0026] 上述色素细胞膜囊泡从紫色无硫细菌中分离出，优选地，可选自红杆菌属(Rhodobacter sp.)、红螺菌属(Rhodospirillum sp.)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)、Rhoseobacter sp.、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium sp.)及红长命菌属(Rubrivivax sp.)等中。

[0027] 上述类囊体膜囊泡从植物藻类(algae)或蓝细菌中分离出，优选地，可选自集胞藻属(Synechocystis sp.)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、念珠藻属(Nostoc sp.)、鱼腥藻属(Anabaena sp.)、Gloeobacter sp.及蓝细菌属(Cyanobacterium sp.)等中。

[0028] 上述“磁性粒子”是指通过永久磁铁(permanent magnet)或电磁铁(electromagnet)受吸引力的粒子。对磁性粒子的大小没有限制，优选地，可选自磁铁矿(magnetite，Fe3O4)或磁赤铁矿(maghemite，γ-Fe2O3)等中。磁性粒子通过表面处理经过作为在水溶液状态进行稳定化的过程的涂敷(coating)过程。用于本发明的优选实现的涂敷材料为水溶性化合物，可选自柠檬酸、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、葡聚糖(dextran)等中。

[0029] 对上述反式白藜芦醇的生产方法或可获得在生产系统中所包含的酶的碱基序列的基因组(genome)的种类没有限制，但优选地，可选自属于真核生物(eukaryote)或细菌(bacteria)的有机体的遗传体中。

[0030] 本发明的主要目的在于，解决持续供给在酶促反应中所需的高成本辅酶并纯化高费用酶的问题。在进行上述整个反应的过程中，作为高成本辅酶的辅酶A通过上述反应a)和反应b)被消耗，被消耗的辅酶A再次通过反应c)被游离，因此可以反复地重复使用。同时，作为其他辅酶的腺苷三磷酸通过上述反应a)、反应b)被消耗，被消耗的腺苷三磷酸通过上述反应d)、反应e)、反应f)再生而能够被反复地重复使用。在进行上述整个反应之后，随后在新的容器中进行新的反应的情况下，应需要从反应液中容易地分离出光合细胞膜囊泡及酶，为了解决此问题，向光合细胞膜囊泡中放入磁性粒子来制备磁性光合成囊泡，从而可利用磁铁分离囊泡，利用酶固定化(enzyme immobilization)和网状物(mesh)从反应液中容易地分离出三种主酶和两种辅酶。以下，在反应的具体说明中，以密封在网状物内的形态使用固定化的酶。即，在整个反应中可以反复地重复使用少量的上述高成本辅酶，因此，这可以为用于通过提高适用度来抵消购买费用的解决方案，从反应液中回收磁性光合成囊泡和固定化的酶来重复利用于新的反应中，因此，这可以为用于抵消高费用的光合成囊泡的制备及酶纯化费用的解决方案。

[0031] 上述“酶固定化”或“固定化(immobilization)”是指将酶或酶复合体与不溶性支撑体(insoluble support)结合。在本发明中所使用的方法为亲和度结合法(affinity binding)。具体地，利用多聚组氨酸标签(polyhistidine-tag)与二价阳离子的电性结合或者亲和素(avidin)与链球菌标签(strep-tag)的特异性结合。多聚组氨酸标签为连接有六个左右的组氨酸标签的肽(peptide)序列，与如镍离子(Ni2+)、钴离子(Co2+)等二价阳离子形成强的电性结合。多聚组氨酸标签序列可通过基因操作与蛋白质的末端结合，具有多聚组氨酸标签的蛋白质可固定化在与镍离子结合的琼脂糖树脂(Ni-NTA agarose resin)。亲和素统称为生物素或可通过特异性识别生物素相似物来强力结合的蛋白质，可从真核生物(eukaryote)及细菌(bacteria)中分离出。亲和素树脂(avidin resin)作为亲和素与琼脂糖聚合物共价或非共价结合的支撑体，与生物素或生物素相似物形成强的结合。链球菌标签为由八个氨基酸组成的生物素(biotin)的结构相似物(structural analog)，可通过基因操作与特定蛋白质的末端结合。根据本发明的优选实例，作为上述亲和素树脂的一种，可使用来源于链霉菌亲和素(Streptomyces avidinii)的链霉亲和素与琼脂糖聚合物结合的链霉亲和素树脂(streptavidin resin)。具有上述链球菌标签的蛋白质可固定化在上述链霉亲和素树脂。

[0032] 在本发明中所定义的“网状物”是指孔径(pore size)为10μm至100μm的膜(membrane)或织物(fabric)，可选择多种材质。在本发明的优选实例中，网状物的作用为通过在树脂中将固定化的酶密封在网状物的内部来防止不同的固定化的酶相互之间的混合，并且可从水溶液中容易地分离出固定化的酶。因此，优选地，以使酶固定化的支撑体不能通过的前提下使基质及产物自由地出入的方式选择网状物的孔径。

[0033] 利用反应液溶解通过上述生产方法或系统生产的反式白藜芦醇。但是，常温水溶液中的白藜芦醇的溶解度为0.03g/L，因此在生产量为其以上的情况下，在水溶液中以悬浮液(suspension)形态积累。在本发明的优选实例中，通过上述生产方法的反式白藜芦醇的生产量为1.06g/L/天，90％以上的反式白藜芦醇以悬浮液形态形成，这种形态的反式白藜芦醇通过离心分离而容易地被沉淀，因此，可从反应液中容易地分离出所生产的反式白藜芦醇。因此，不需要额外的产物纯化工序。因此，根据本发明的一方面，在反应过程中，在没有分离悬浮液状态的反式白藜芦醇的过程的情况下进行了整个反应，但是，根据另一方面，在反应过程中，可周期性地回收反式白藜芦醇的同时进行整个反应。

[0034] 根据本发明的一方面，在用于生产上述白藜芦醇的方法或系统中，进行整个反应一次。但是，根据本发明的另一方面，通过从反应液中分离及回收磁性色素细胞膜囊泡和固定化酶来在新的反应液中反复地使用，从而可通过进行至少5次以上的整个反应来提高白藜芦醇的生产率。

[0035] 上述生产方法或系统中的最终产物具有立体特异性(stereo-specific)。白藜芦醇根据其化学立体结构能够以反式(trans)或顺式(cis)形态的异构体存在。在通过上述酶系统生产白藜芦醇的情况下，可选择性地获取反式白藜芦醇。

[0036] 发明效果

[0037] 本发明的的优点在于，在利用酶的细胞外反式白藜芦醇的生产中，解决了高成本的辅酶的供给问题。在本发明的酶系统中，为了生产反式白藜芦醇所需的辅酶为辅酶A和腺苷三磷酸，辅酶A在整个反应过程中在反应液中可被反复地重复使用，由酶促反消耗的腺苷三磷酸通过基于腺苷酸激酶、焦磷酸酶及磁性光合细胞膜囊泡的反应在反应液中再生而被反复地重复使用。由此，即使不进行额外的供给也能够以少量的辅酶进行整个反应，因此增进了反式白藜芦醇生产系统的经济性。

[0038] 本发明的的再一优点在于，反应结束后，可从反应液中容易地分离出磁性色素细胞膜囊泡及固定化的酶。由此，从反应液中分离出的色素细胞膜囊泡及酶可重复利用在新的反应液中，因此，可通过提高色素细胞膜囊泡和酶使用效率来抵消高成本的色素细胞膜囊泡的制备及高成本的酶的纯化费用。另一种效果为，虽然在反应液中残留少量的辅酶，但可通过高成本的辅酶的回收容易地分离浓缩到离子交换树脂。

[0039] 本发明的另一优点在于，能够以沉淀物形态从反应液中容易地分离出白藜芦醇，从而不需要用于纯化白藜芦醇的额外的工序。

[0040] 本发明的还有一优点在于，最终反应产物具有立体特异性(stereo-specific)。即，可选择性地生产反式白藜芦醇作为最终反应产物，可获得纯度高的产物。
附图说明

[0041] 图1为利用磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法的图。

[0042] 图2为用12％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法确认对在反式白藜芦醇的生产中所需的主酶进行的纯化的图。

[0043] 图3为通过固定化在图2中所纯化的主酶来测定活性并确定酶动力学常数(enzyme kinetic parameters)的图。

[0044] 图4为对通过固定化在图2中所纯化的主酶来在4℃的温度下长期保管时的活性的变化进行测定的图。

[0045] 图5a、5b、5c为确认在图2中所纯化的主酶的酶的活性是否阻碍在反式白藜芦醇的生产中所使用的基质和所生产的反式白藜芦醇的图。图5a为测定基于丙二酸的4-香豆酸-辅酶A连接酶的活性变化的图，图5b为测定基于丙二酸的芪合酶的活性变化的图，图5c为测定基于反式白藜芦醇的丙二酰辅酶A合成酶的活性变化的图。

[0046] 图6a、6b、6c为利用图1中示出的方法来生产反式白藜芦醇12小时的图。图6a为确认在反应液中反式白藜芦醇形成为沉淀物的图。图6b为利用高效液相色谱法(HPLC)确认在上述反应液中的反式白藜芦醇的量的图，图6c为对其进行定量来确定生产率的图。

具体实施方式

[0047] 合成并筛选表面被涂敷(coating)的氧化铁磁性粒子(iron oxide magnetic particle)。首先，在被氮气填满的密封烧瓶中混合50ml的蒸馏水和5.88g的三氯化铁(FeCl3)后，将溶液加热至60℃，将在50ml的蒸馏水中溶解2.5g的氯化亚铁(FeCl2)的溶液与三氯化铁溶液进行混合后，利用搅拌棒(spin bar)以500rpm进行搅拌(stirring)并将溶液加热至80℃。其中放入12ml的氢氧化铵溶液(NH4OH)，以相同的搅拌速度在80℃的温度下搅拌30分钟。然后，向溶液中添加2.5g的柠檬酸，加热至90℃并搅拌90分钟，边搅拌边将溶液冷却至常温。利用蒸馏水稀释包含磁性粒子的上述溶液50倍后，从溶液中分离出被钕磁铁(neodymium magnet)吸引的磁性粒子。向分离出的磁性粒子中放入蒸馏水并通过0.22μm的过滤器(Merck Millipore)后，利用磁铁再次从溶液中分离出磁性粒子后，放入清洗缓冲液(50mM的Tris-Cl，pH 8.0)。反复进行用磁铁分离磁性粒子并放入清洗缓冲液的过程后，将磁性粒子放入清洗缓冲液中并在4℃的温度下进行保管。通过在5N的盐酸(HCl)中溶解磁性粒子来测量在355nm下的吸光度，由此决定磁性粒子的量(Belikov et al.2002.Pharma.Chem.J.36：333-336)。

[0048] 实施例2.磁性脂质体的制备

[0049] 在本实施例中，利用在上述实施例1中合成的磁性粒子制备磁性脂质体(magnetoliposome)。将10mg的溶解在三氯甲烷(CHCl3)的磷脂[phospholipid，在本实施例中，利用1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)(Avanti lipids)]放入容量为10ml的玻璃瓶中并通入氮气来去除三氯甲烷，从而在玻璃瓶的底部形成磷脂的薄膜(film)。其中放入3ml的脂质体缓冲液(50mM的Tris-Cl，pH 8.0，10％的蔗糖(sucrose))和50mg的磁性粒子后，以3000rpm搅拌30分钟。然后，利用超声波破碎仪(Branson sonifier 250)以输出(output)2在常温下向溶液照射超声波10分钟。之后，向溶液中添加氯化钙(CaCl2)以使溶液的浓度成为2mM，用1000g进行离心分离1分钟后获得上清液。从所获得的上清液中分离出被磁铁吸引的磁性脂质体后，丢掉剩余的溶液并添加新的脂质体缓冲液。反复进行此过程3次后，在脂质体缓冲液中溶解磁性脂质体并在4℃的温度下进行保管。利用Stewart方法(Stewart.1980.Anal.Biochem.104：10-14)对磁性脂质体中所包含的磷脂进行定量。

[0050] 实施例3.磁性色素细胞膜囊泡的制备

[0051] 本实施例中明确记载通过融合在上述实施例2中制备的磁性脂质体和色素细胞膜囊泡(chromatophore membrane vesicle)来制备磁性色素细胞膜囊泡(magnetic 2+
chromatophore membrane vesicle)的方法。利用聚乙二醇-钙融合法(PEG-Ca fusion.Yen et al.1982.Biochim Biophys Acta 688：605-621)进行融合。上述色素细胞膜囊泡作为光合细胞膜囊泡(photosynthetic membrane vesicle)的一种，仅为了实施发明而被任选的，即使选择其他光合细胞膜囊泡，也可以实现本发明。

[0052] 为了分离色素细胞膜囊泡，在光合成条件下，在250ml的Sistrom最小培养基(Sistrom.1962.J.Gen.Microbiol.28：607-616，组分如表1所示)中培养球形红细菌(Rhodobacter sphearoides 2.4.1，ATCC BAA-808，Cohen-Bazire et al.1956.J.Cell.Comp.Physiol.49：25-68)。上述光合成条件为15Watt/m2的光度、30℃的温度的厌氧条件。当进行光合成培养的细菌培养液在660nm中的吸光度为2.0时，在4℃的温度、7000g条件下进行离心分离10分钟来获得菌体(cell pellet)。之后，在本实施例实施的所有过程在由气体组分为90％的氮、5％的氢、5％的二氧化碳组成的厌氧培养室(anaerobic chamber，model 10，Coy laboratory product)内进行。用8ml的破碎缓冲液(10mM的Tris，pH 8.0，10％的蔗糖)溶解所获得的菌体并添加制造商所指示的量的蛋白酶抑制剂混合液(protease inhibitor cocktail，Roche)。为了破碎(lysis)所获得的上述菌体，利用超声波破碎仪(model VCX130，Sonics&Materials)以50％的扩增(amplification)照射超声波2分钟并在冰水中进行冷却，此过程反复进行4次，由此分离出在4℃的温度、7000g条件下进行离心分离10分钟后所形成的上清液(细胞破碎液)。分离出的细胞破碎液中包含色素细胞膜囊泡，且为了对其进行定量，在490μl的色素提取溶液(丙酮(acetone):
甲醇(methanol)＝7:2)中混合细胞破碎液并在6000g条件下进行离心分离1分钟的提取物中测量770nm下的吸光度，从而确定细菌叶绿素a(bacteriochlorophyll a，bch a)的量。细菌叶绿素a具有83.9mM-1(Kim and Lee.2010.J Bacteriol.192：198-207)的摩尔吸光系数(molar extinction coefficient)，因此，利用其计算细胞破碎液的细菌叶绿素a的浓度(μg bch a/ml)来确定细胞破碎液中的色素细胞膜囊泡的量，并将其利用于膜融合法上。将包含0.2mg bch a的细菌叶绿素a的上述细胞破碎液与包含0.8mg的磷脂(phospholipid)的磁性脂质体进行混合后，添加与混合液相同体积的融合缓冲液(25mM的Na2HPO4，pH 7.0，0.5mM的CaCl2，55％的聚乙二醇(polyethylene glycol)6000)并在30℃的温度下每10分钟一次进行混合(by vortexing)10秒钟，总共进行此过程6次。然后，利用磁铁获得被磁铁吸引的色素细胞膜囊泡(磁性色素细胞膜囊泡)后，去除剩余的溶液，利用脂质体缓冲液清洗后，最终通过溶解在脂质体缓冲液中并在4℃的温度下进行保管。当利用脂质体缓冲液清洗时，添加5μg bch a/ml的球形红细菌细胞破碎液作为磁性色素细胞膜囊泡的稳定剂(stabilizer)。当测定上述磁性色素细胞膜囊泡的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)合成活性时，向光反应缓冲液(50mM的Tris-Cl，pH 8.0，10mM的Na2PO4，100mM的蔗糖，
10mM的MgCl2，1mM的腺苷二磷酸(Adenosine diphosphate)，5mM的抗坏血酸钠(sodium ascorbate)，100μl的FeCl3)中投入浓度为1μg bch a/ml的磁性色素细胞膜囊泡，在
15Watts/m2的光度、30℃的温度下进行反应，利用腺苷三磷酸检测试剂盒(Sigma，CAT.FLAA)对作为反应产物的腺苷三磷酸进行定量。

[0053] 表1

[0054]

[0055] 实施例4.白藜芦醇生物合成酶的纯化及固定化

[0056] 为了通过本发明的系统生产白藜芦醇，作为其实例之一，将磁性色素细胞膜囊泡与白藜芦醇生物合成酶组合来生产白藜芦醇(图1)。为此，在本实施例中，使用合成白藜芦醇的三种主酶和两种辅酶的纯化及固定化方法。

[0057] 当合成白藜芦醇时所使用的三种主酶(图1)为4-香豆酸-辅酶A连接酶(4-coumarate-coA ligase)、丙二酰辅酶A合成酶(malonyl-CoA synthetase)以及芪合酶(stilbene synthase)。所使用的4-香豆酸-辅酶A连接酶来源于作为植物的烟草，通过合成用大肠杆菌密码子进行密码子优化(codon-optimization)的碱基序列(序列7)来克隆在pET29a载体(Novagen)。所使用的丙二酰辅酶A合成酶来源于作为细菌的高效固氮慢生根瘤菌(Bradyrhizobium diazoefficiens)，分别使用序列1和序列2作为正向引物、反向引物并通过聚合酶链式反应(PCR)确保碱基序列并将碱基序列克隆在pRSET-A载体(Invitrogen)。所使用的芪合酶来源于作为植物的Vitis vinifera(Vitis vinifera)，通过合成用大肠杆菌密码子进行密码子优化(codon-optimization)的碱基序列(序列8)来克隆在pET29a载体(Novagen)。利用包含上述三种酶的碱基序列的载体转化大肠杆菌来在大肠杆菌中分别表达三种酶。在利用包含上述三种酶的基因的载体表达酶的情况下，由于组氨酸标签(His6-tag)与各个酶的末端结合来表达，因此利用其纯化酶。当进行酶表达时，在LB(Luria-Bertani media)振荡培养(250rpm，37℃)上述所转化的各个大肠杆菌，当在600nm下的吸光度为0.5时，添加1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)，在30℃的温度下振动培养12小时。在6000g条件下离心分离上述培养溶液10分钟来获得菌体(pellet)，将其再悬浮(resuspension)在溶解缓冲液(50mM的Na2HPO4，pH 8.0，300mM的NaCl，10mM的咪唑(imidazole))中并利用上述超声波破碎来破碎细胞，在6000g条件下离心分离10分钟来获得上清液(细胞破碎液)。将上述细胞破碎液与镍琼脂糖树脂(Ni-NTA agarose resin，Qiagen)进行混合，从树脂(resin)去除细胞破碎液后用清洗缓冲液(50mM的Na2HPO4，pH 8.0，300mM的NaCl，20mM的咪唑)清洗后，最终再悬浮在PBS缓冲液(phosphate buffered saline，pH 7.4)并在4℃的温度下进行保管(固定化在镍琼脂糖树脂的白藜芦醇合成酶)。为了确认固定化的酶和定量及纯化度，将少量的上述树脂悬浮液与组氨酸标签(His6-tag)洗脱缓冲液(50mM的Na2HPO4，pH 8.0，300mM的NaCl，250mM的咪唑)进行混合来从树脂中分离各个酶后，利用Lowry氏法(Lowry method)确定与树脂结合的酶的量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析上述洗脱液，结果，三种主酶的大小均与预测值一致，且被纯化得很纯(图2)。

[0058] 辅酶的再循环中所需的两种辅酶(图1)为腺苷酸激酶(adenylate kinase)和焦磷酸酶(pyrophosphatase)。两种酶均在球形红细菌的遗传体中确保了序列。腺苷酸激酶分别利用序列3、序列4作为正向引物、反向引物且焦磷酸酶分别利用序列5、序列6作为正向引物、反向引物并通过聚合酶链式反应(PCR)确保基因碱基序列并分别将它们克隆在pASK-IBA3载体(IBA)。在上述载体克隆基因的情况下，由于以在末端结合链球菌标签(strep-tag)的状态表达酶，因此在酶的纯化过程中利用了链球菌标签。分别利用包含上述两种辅酶的碱基序列的载体转化大肠杆菌并在250rpm、37℃的温度下振荡培养后，当在600nm下的吸光度为0.5时，添加浓度为0.2μg/ml的无水四环素(anhydrotetracycline)后，在30℃的温度下振荡培养12小时。培养后，在6000g条件下离心分离上述培养溶液10分钟来获得菌体，用链球菌缓冲液(100mM的Tris-Cl，pH 8.0，150mM的NaCl)进行再悬浮并利用上述超声波破碎方法破碎细胞来获得细胞破碎液。将细胞破碎液与链霉亲和素树脂(streptavidin resin，IBA)进行混合，从树脂中去除细胞破碎液后，用链球菌缓冲液清洗链霉亲和素树脂，最终悬浮在PBS缓冲液中后在4℃的温度下进行保管。向少量的树脂悬浮液中添加洗脱缓冲液(100mM的Tris-Cl，pH 8.0，150mM的NaCl，2.5mM的脱硫生物素(desthiobiotin))分离链霉亲和素树脂和酶后，利用Lowry氏法(Lowry method)进行酶的定量。

[0059] 实施例5.白藜芦醇生物合成酶的活性及稳定性测定

[0060] 在本实施例中，为了分析在上述实施例4中在树脂对三种主酶进行固定化时对酶的活性产生的影响，确定固定化的各个酶的酶动力学常数(enzyme kinetic parameter)，并确认了固定化的酶的稳定性。在包含50mM的Tris-Cl(pH 8.0)、10mM的Na2HPO4、5mM的MgCl2、5mM的腺苷三磷酸、0.33mM的辅酶A、4～16μm的4-香豆酸(4-coumaric acid)、50μg的酶的缓冲液中测定4-香豆酸-辅酶A连接酶的活性，利用在333nm下的吸光度对作为反应产物的4-香豆酰辅酶A(4-coumaroyl CoA)进行定量(Stockigt and Zenk.1975.Z.Naturforsch.30c：352-358)。在包含50mM的Tris-Cl(pH 8.0)、10mM的Na2HPO4、1mM的MgCl2、0.4mM的腺苷三磷酸、0.2mM的辅酶A、2～16μm的丙二酸(malonic acid)、10μg的酶的缓冲液中测定丙二酰辅酶A合成酶的活性，利用在232nm下的吸光度对作为反应产物的丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)进行定量(2000.Koo and
Kim.Arch.Biochem.Biophys.378：167-174)。在包含50mM的Tris-Cl(pH8.0)、10mM的MgCl2、
6～48μm的4-香豆酰辅酶A、500μm的丙二酰辅酶A的缓冲液或者包含50mM的Tris-Cl(pH
8.0)、10mM的MgCl2、200μm的4-香豆酰辅酶A、2.5～18μm的丙二酰辅酶A的缓冲液中测定芪合酶的活性，利用高效液相色谱法(HPLC)对作为反应产物的白藜芦醇进行定量(Paulo et al.2011.J.Agric.Food Chem.59：2157-2168)。上述所有酶促反应都在30℃的温度下进行。
相比于未固定化的(free)形态，在固定化的(immobilized)4-香豆酸-辅酶A连接酶和丙二酰辅酶A合成酶中没有发生基质亲和度(Km)变化，但4-香豆酸-辅酶A连接酶经固定化后的转换数(turnover number，kcat)增加了1.5倍，从而提高了整体酶的功能(图3)。相比于未固定化的酶，芪合酶的对经固定化的酶的两个基质的基质亲和度减少了约2倍，但转换数增加了2倍，因此在整个酶的效率方面上没有发生很大的变化(图3)。总而言之，确认到在对三种主酶进行固定化的情况下，对酶的功能没有产生很大的影响。并且，在4℃的温度下保管固定化酶的情况下，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芪合酶维持100％的活性，丙二酰辅酶A合成酶维持60％的活性(图4)。因此，本发明的实施者可以应用其来长期保管并使用固定化的酶。

[0061] 实施例6.适用磁性色素细胞膜囊泡的白藜芦醇的合成

[0062] 在本实施例中，利用在上述实施例3中制备的磁性色素细胞膜囊泡和在上述实施例4中制备的固定化的白藜芦醇合成酶实际执行图1的整个反应。整个反应中，将1当量的4-香豆酸和3当量的丙二酸作为基质并使用腺苷二磷酸(adenosine diphosphate，ADP)及辅酶A(coenzyme A)作为辅酶来获得1当量的作为最终产物的白藜芦醇(图1)。各个主酶的反应在一个空间进行，其中，磁性色素细胞膜囊泡的作用为再生由酶消耗的ATP(ADP+Pi->ATP)。作为辅酶的腺苷酸激酶再生为腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)作为ADP，焦磷酸酶将来源于主酶的反应的焦磷酸酯(pyrophosphate，PPi)转换为无机磷酸(phosphate，Pi)来介导辅酶的循环。为了单独操作在上述实施例中制备的各个固定化的酶，分别密封在具有25μm的孔径(pore size)的网状物(mesh)内来利用于反应中。以下，本实施例中提及到的固定化的酶均意味着密封在网状物内。

[0063] 在上述反式白藜芦醇生产系统中，不同种类的连续的酶促反应在一个空间进行，因此，各个酶不仅与自身的基质及产物接触，而且还可与其他酶的基质及产物接触。因这些理由而会诱发预想不到的酶的活性变化，因此，为了确认这种现象，添加其他酶的基质及产物来确认了活性变化，而不是添加三种各个主酶自身的基质及产物。4-香豆酸-辅酶A连接酶和芪合酶的连续反应为自然界中经常进行的合成路径，因此，预测到两种酶的基质及产物之间并没有上述酶活性变化的问题。因此，在本实施例中，确认了基于作为丙二酰辅酶A合成酶的基质的丙二酸的其他酶的活性变化和基于作为最终产物的反式白藜芦醇的丙二酰辅酶A合成酶的活性变化。结果，在4-香豆酸-辅酶A连接酶(图5a)和芪合酶(图5b)中没有发生基于丙二酸的活性变化。并且，在丙二酰辅酶A合成酶中也没有产生基于作为最终产物的反式白藜芦醇的活性变化(图5c)。总而言之，确认到在一个空间进行用于生产上述白藜芦醇的整个反应是在酶活性方面上没有大问题。

[0064] 为了生产白藜芦醇，向包含50mM的Tris-Cl(pH 8.0)、10mM的Na2HPO4、40mM的4-香豆酸、120mM的丙二酸、5mM的MgCl2、5mM的腺苷三磷酸、6mM的辅酶A的反应液中投入0.1mg的固定化的4-香豆酸-辅酶A连接酶、0.5mg的固定化的丙二酰辅酶A合成酶、7.5mg的固定化的芪合酶、0.6mg的固定化的腺苷酸激酶、0.6mg的固定化的焦磷酸酶、0.2mg bch a的磁性色素细胞膜囊泡来进行反应。反应在上述光合成条件、30℃的温度下进行12小时，按反应时间分析形成在反应液中的白藜芦醇(图6)。图6a按时间示出上述反应液的状态。开始反应之后(0h)的反应液具有透明的性状，从反应2小时开始反应液变成不透明的白色，这是因为没有被溶解的白藜芦醇呈现为不透明的悬浮液(suspension)形态。由于在常温下白藜芦醇在水中的溶解度低至0.03g/L，在因酶反应而在反应液中白藜芦醇以溶解度范围以上形成的情况下，可生成为悬浮液。为了确认上述悬浮液是否实际包含白藜芦醇，通过高效液相色谱法对白藜芦醇进行定量，结果，白藜芦醇的生成量随着时间而增加，以12小时反应为基准计算了产率，结果，可生产0.53g/L(1.06g/L/天)的白藜芦醇(图6b、图6c)。然而，普通技术人员可通过进行重复使用酶的反复性反应来获得更高的产率。以上述悬浮液形态生产的白藜芦醇通过离心分离容易地被沉淀，从而易于从反应液中分离出，因此具有可简化反应后处理过程的优点。

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利用磁性光合细胞膜囊泡生产反式白藜芦醇的方法

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