技术领域
[0001] 本
发明属
生物技术领域，具体涉及一种包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法。
背景技术
[0002]
现有技术中，器官移植是目前
治疗器官衰竭的理想方法，但器官供应短缺、免疫排斥以及伦理争议等问题严重制约了其临床应用。因此，组织工程作为构筑可植入器官的一条新途径，就成为器官衰竭治疗的重要发展方向。组织工程主要是利用
生物相容性的
支架材料与细胞复合，制备具有细胞功能的可移植的工程化组织，植入后通过与受体整合以达到修复病损器官、替代器官功能及缓解供体器官短缺的目的。因此在组织工程的构建过程中，对体内细胞生长微环境的模拟，实现体外细胞的三维培养，进而改善体外培养的细胞的功能，就尤为重要。
[0003] 在现有技术中，微流控芯片技术在制备组织功能材料方面具有其他方法无法比拟的优势，它的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。这些优势使所制备出的功能材料具有尺寸均一、形貌及组成可控、材料性能稳定以及批次间差异小等优点。基于上述优势，基于微流控技术设计和制备功能材料成为了近几年的研究热点。微流控纺丝技术因其快速的传质
传热以及易于操纵的特性，可实现对纤维的结构、形貌、组成的精确控制，为制备功能性异质杂化微纤维提供了良好的微反应平台。
[0004] 我们利用微流控技术，设计相应的微
流体芯片，通过利用材料分子间的相互作用，在空腔微纤维的内壁上粘附上一层带有相反电荷或者有相互作用的材料，之后通过溶掉外层的微纤维材料，就得到超薄空腔复合微纤维材料。通过将细胞包载在空腔内，可以实现细胞的包埋和培养。通过此种方法可以实现包载有细胞的功能微纤维材料的大批量制备。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种技术效果优良的基于微流控技术的包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法，并对其在组织工程领域的应用做了一些探索。本发明提供了一种操作简单的微流控芯片平台并用于新型的超薄空腔复合微纤维材料的制备和应用。本发明所述的复合空腔微纤维可以用于细胞的包载和培养，为组织工程的构建提供一种思路。
[0006] 本发明提供了一种包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法，[0007] 采用微流控芯片，制备空腔内有涂层的复合微纤维材料；通过在中心流体内加入细胞，可以得到空腔内包埋有细胞的空腔复合微纤维材料；再溶去外层材料，而与内涂层有分子相互作用的部分得以保留，构成了微纤维的超薄壁，从而得到包载细胞的超薄微纤维材料。
[0008] 所述微流控芯片由上、下两层芯片封合而成，两层均为聚二甲基
硅氧烷材质；芯片具有至少三个平行通道入口、一个总出口，及与入口和出口相连接的多条独立的同轴
层流通道。
[0009] 所述微流控芯片为四通道结构，有四个平行通道入口、四个独立的同轴层流通道和一个总出口组成，
[0010] 所述的四个平行通道入口为鞘流流体入口、样品流体入口、内腔修饰流体入口和中心惰性流体入口，
[0011] 所述四个独立的同轴层流通道由内向外的通道依次为鞘流流体通道、样品流体通道、内腔修饰流体通道、中心惰性流体通道，
[0012] 所述的总出口为微纤材料出口。
[0013] 一种包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法，按照以下步骤进行[0014] (1)预先将
质量体积浓度为：1-5％g/ml的样品流体；1-5％g/ml的惰性流体；0.5-5％g/ml的修饰流体，0.5-5％g/ml的鞘流流体；；
[0015] (2)将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将1×107的细胞，用DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的惰性流体溶液，制备出包含细胞
密度为5×106的3％惰性流体溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的中心惰性流体使用；
[0016] (3)采用微流控芯片，用气压
泵控制鞘流流体的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体、修饰流体、样品流体以及鞘流流体；前三者的流速分别在0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-40μl/min；鞘流流体的气压泵的压
力为
20-200mbar；制备出包载有细胞的超薄空腔复合微纤维材料
[0017] (4)将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖超薄空腔复合微纤维材料浸泡在pH7.4的PBS溶液内10-100min，就得到包载细胞的超薄微纤维材料。
[0018] 所述样品流体为能够被迅速
固化的
生物材料；
[0019] 所述修饰流体是指与样品流体带有相反电荷的分子及其衍生物，或者是能与样品流体有一定相互作用的分子及其衍生物，又或者是黏附性强的分子及其衍生物；
[0020] 所述中心流体是指含有细胞的不与样品流体发生作用的惰性流体及其衍生物；
[0021] 所述鞘流流体是指样品流体的交联剂溶液。
[0022] 所述样品流体是下述几种之一或其组合：海藻酸钠、聚乙二醇双
丙烯酸酯、壳聚糖或多聚赖
氨酸；
[0023] 所述修饰流体是下述几种之一或其组合：壳聚糖、甲壳素、聚赖氨酸、聚多巴胺、透明质酸、海藻酸钠、琼脂糖、
胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维链接蛋白、III型胶原或血清扩展因子；
[0024] 所述中心流体是下述几种之一或其组合与细胞的
混合液：甲基
纤维素、羟甲基纤维素、聚乙烯醇或聚氧化乙烯；
[0025] 鞘流流体是下述几种之一或其组合：能够迅速交联海藻酸钠的CaCl2溶液或者Ca2+、Cu2+、Ba2+多价离子的溶液；或者能够交联壳聚糖的三聚
磷酸钠溶液；对于不需要溶液固化比如紫外光照就可以固化的聚乙二醇双丙烯酸酯，鞘流流体可以为惰性的缓冲溶液。
[0026] 所用的溶掉外层材料的溶液可以为可以结合
钙离子的
磷酸盐溶液、可以酶解外层材料的溶菌酶溶液、或者其它可以溶去外层材料的溶液。
[0027] 所述细胞为：人肝癌细胞、小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞、
成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、人肝
肿瘤细胞、
肺泡上皮细胞、肾细胞、乳腺
皮肤神经胶质细胞、内分泌细胞、黑色素细胞或各种肿瘤细胞。
[0028] 在制备包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料之前，将芯片通道加入全氟溶液进行表面疏
水处理。
[0029] 一种包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法，优选的方法具体步骤为：
[0030] (1)预先将含有NaCl和海藻酸钠的溶液作为样品流体；其中NaCl的质量体积浓度为0.85％g/ml，海藻酸钠的质量体积浓度为1-5％g/ml；
[0031] 质量体积浓度为0.5-5％g/ml的甲基纤维素作为惰性流体；
[0032] 用体积浓度0.25-5％的乙酸制备质量体积浓度0.5-10％g/ml的壳聚糖溶液作为修饰流体；或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；
[0033] 含有
蔗糖和CaCl2溶液作为鞘流流体；其中蔗糖的质量体积浓度为3％g/ml，CaCl2的质量体积浓度0.5-4％g/ml；
[0034] (2)将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将1×107的HepG2细胞(人肝癌细胞)或者Beta-TC-6细胞(小鼠胰岛素瘤胰岛β细胞)细胞，用DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的甲基纤维素溶液，制备出包含细胞密度为5×106的甲基纤维素溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用；
[0035] (3)采用微流控芯片，用气压泵控制CaCl2的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2；前三者的流速分别在0.1-5μl/min、0.1-5μl/min、1-40μl/min；鞘流流体的气压泵的压力为20-200mbar；
[0036] (4)将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖超薄空腔复合微纤维材料浸泡在pH7.4的PBS溶液内10-100min，就得到包载细胞的超薄微纤维材料。
[0037] 所述方法制备得到的是空腔内侧被修饰的空腔复合微纤维材料；空腔复合微纤维材料的内腔能够作为生物反应体，包载细胞并进行长期培养；空腔内侧的修饰涂层帮助细胞在微纤维的空腔内稳定和生长；
[0038] 在制备微纤维的过程中，通过对修饰流体的浓度以及流速进行调控，可以精确控制微纤维内部涂层的密度以及厚度，从而能够制备出更适合细胞生长的微环境。
[0039] 所述超薄空腔复合微纤维的制备方法具体用于制备含有细胞的超薄空腔复合微纤维材料，然后将微纤维内的细胞进行培养，能够得到负载有细胞的微纤维材料，为后期组织工程的构建提供力学性能支持。
[0040] 本发明通过利用微流控芯片技术，通过设计微流控通道，形成能够生成同轴层流流型的微米级通道，实现对样品流体的流型操控，并最终使样品流体固
化成具有特定结构的微米级纤维材料。通过选择合适的样品流体、修饰流体以及惰性流体，制备出适合细胞长期培养和功能性组织形成的空腔复合新纤维体系。其中修饰溶液的引入，可以赋予这种新型微纤维材料一定的生物学性能。这种通过制备功能性的新纤维材料模拟人体组织内的微结构，为组织工程和器官再生提供了新的方法和思路。相信这种新型的功能性微纤维材料在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
[0041] 本发明有以下优点：
[0042] (1)两步法制备含有空腔的超薄复合微纤维材料，操作方法简单可靠，效率高，为微纤维的改性提供了便利条件，有利于微纤维的大批量制备。
[0043] (2)超薄壁的特性，可以加快营养物质的交换，促进细胞的增值，为组织工程和器官再生提供了新的方法和思路。
[0044] (3)内部的修饰涂层，均匀稳定简单可控，利于细胞的粘附生长。
[0045] (4)内部的修饰涂层，还可以增强微纤维的机械性能，为后期组织工程的构建提供力学性能支持。
附图说明
[0046] 下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
[0047] 图1为微流控芯片结构示意简图；
[0048] 图2为包埋细胞1d后的超薄空腔微纤维材料；
[0049] 图3为包埋细胞7d后的超薄空腔微纤维材料。
[0050] 其中：1为鞘流流体入口，2为样品流体入口，3为内腔修饰流体入口，4为中心惰性流体入口，5为鞘流流体通道，6为样品流体通道，7为内腔修饰流体通道，8为中心惰性流体通道，9为微纤材料出口。
具体实施方式
[0051] 一种包载细胞的超薄空腔复合微纤维材料的制备方法，采用微流控芯片，制备空腔内有涂层的复合微纤维材料；通过在中心流体内加入细胞，可以得到空腔内包埋有细胞的空腔复合微纤维材料；再溶去外层材料，而与内涂层有分子相互作用的部分得以保留，构成了微纤维的超薄壁，从而得到包载细胞的超薄微纤维材料。
[0052] 所述微流控芯片由上、下两层芯片封合而成，两层均为聚二甲基硅氧烷材质；芯片具有至少三个平行通道入口、一个总出口，及与入口和出口相连接的多条同轴层流通道。
[0053] 如图1所示，本发明
实施例中所述微流控芯片为四通道结构，有四个平行通道入口、四个独立的同轴层流通道和一个总出口组成。
[0054] 所述的四个平行通道入口为鞘流流体入口1、样品流体入口2、内腔修饰流体入口3和中心惰性流体入口4。
[0055] 所述四个独立的同轴层流通道由内向外的通道依次为鞘流流体通道5、样品流体通道6、内腔修饰流体通道7、中心惰性流体通道8。
[0056] 所述的总出口为微纤材料出口9。
[0057] 实施例1
[0058] 预先将含有NaCl和海藻酸钠的溶液作为样品流体；其中NaCl的质量体积浓度为0.85％g/ml，海藻酸钠的质量体积浓度为1％g/ml；
[0059] 质量体积浓度为2％g/ml的甲基纤维素作为惰性流体；
[0060] 用体积浓度2％的乙酸制备质量体积浓度4％g/ml的壳聚糖溶液作为修饰流体；或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；
[0061] 含有蔗糖和CaCl2溶液作为鞘流流体；其中蔗糖的质量体积浓度为3％g/ml，CaCl2的质量体积浓度1％g/ml；
[0062] 采用微流控芯片，将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将2×107的HepG2细胞，用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的甲基纤维素溶液，制备出包含细胞密度为1×107的甲基纤维素溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用；
[0063] 在制备过程中，用气压泵控制CaCl2的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2；前三者的流速分别在0.4μl/min、0.1μl/min、5μl/min；鞘流流体的气压泵的压力为40mbar；
[0064] 将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在PBS(pH7.4)的溶液内，就得到包载有细胞的超薄空腔复合微纤维材料(图2)。然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养(图3)。
[0065] 实施例2
[0066] 预先将含有NaCl和海藻酸钠的溶液作为样品流体；其中NaCl的质量体积浓度为0.85％g/ml，海藻酸钠的质量体积浓度为2％g/ml；
[0067] 质量体积浓度为3％g/ml的甲基纤维素作为惰性流体；
[0068] 用体积浓度2.5％的乙酸制备质量体积浓度5％g/ml的壳聚糖溶液作为修饰流体；或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；
[0069] 含有蔗糖和CaCl2溶液作为鞘流流体；其中蔗糖的质量体积浓度为3％g/ml，CaCl2的质量体积浓度1％g/ml；
[0070] 采用微流控芯片，将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将2×107的HepG2细胞，用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的甲基纤维素溶液，制备出包含细胞密度为1×107的甲基纤维素溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用；
[0071] 在制备过程中，用气压泵控制CaCl2的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2；前三者的流速分别在0.8μl/min、0.2μl/min、10μl/min；鞘流流体的气压泵的压力为50mbar；
[0072] 将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在PBS(pH7.4)的溶液内，就得到包载有细胞的超薄空腔复合微纤维材料(图2)。然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养(图3)。
[0073] 实施例3
[0074] 预先将含有NaCl和海藻酸钠的溶液作为样品流体；其中NaCl的质量体积浓度为0.85％g/ml，海藻酸钠的质量体积浓度为5％g/ml；
[0075] 质量体积浓度为5％g/ml的甲基纤维素作为惰性流体；
[0076] 用体积浓度5％的乙酸制备质量体积浓度10％g/ml的壳聚糖溶液作为修饰流体；或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；
[0077] 含有蔗糖和CaCl2溶液作为鞘流流体；其中蔗糖的质量体积浓度为3％g/ml，CaCl2的质量体积浓度4％g/ml；
[0078] 采用微流控芯片，将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将2×107的HepG2细胞，用高糖DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的甲基纤维素溶液，制备出包含细胞密度为1×107的甲基纤维素溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用；
[0079] 在制备过程中，用气压泵控制CaCl2的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2；前三者的流速分别在5μl/min、5μl/min、40μl/min；鞘流流体的气压泵的压力为200mbar；
[0080] 将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在PBS(pH7.4)的溶液内，就得到包载有细胞的超薄空腔复合微纤维材料。然后移至高糖的DMEM培养基内进行培养。
[0081] 实施例4
[0082] 预先将含有0.85％NaCl的2％的海藻酸钠作为样品流体；3％的甲基纤维素作为惰性流体；用2.5％乙酸制备的5％的壳聚糖作为修饰流体，或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；含有3％蔗糖的1％CaCl2作为鞘流流体；
[0083] 预先将含有NaCl和海藻酸钠的溶液作为样品流体；其中NaCl的质量体积浓度为0.85％g/ml，海藻酸钠的质量体积浓度为2％g/ml；
[0084] 质量体积浓度为3％g/ml的甲基纤维素作为惰性流体；
[0085] 用体积浓度2.5％的乙酸制备质量体积浓度5％g/ml的壳聚糖溶液作为修饰流体；或者将壳聚糖和甲基纤维素混合，得到含有不同壳聚糖浓度的甲基纤维素溶液作为修饰流体；
[0086] 含有蔗糖和CaCl2溶液作为鞘流流体；其中蔗糖的质量体积浓度为3％g/ml，CaCl2的质量体积浓度1％g/ml；
[0087] 采用微流控芯片，将超净台提前紫外照射2h以上，然后制备包埋细胞的空腔复合微纤维材料：将2×107的Beta-TC-6细胞，用低糖DMEM培养基配成细胞悬浮液，然后加入相同体积的甲基纤维素溶液，制备出包含细胞密度为1×107的甲基纤维素溶液；混合后去除气泡，取下面无气泡的溶液作为包载细胞的惰性中心流体使用；
[0088] 在制备过程中，用气压泵控制CaCl2的流速，用哈佛泵控制其它三条通路的流体流速，在芯片内先后引入含有细胞的惰性流体即甲基纤维素、修饰流体即壳聚糖或者壳聚糖与甲基纤维素的混合液、样品流体海藻酸钠以及鞘流流体CaCl2；前三者的流速分别在0.8μl/min、0.2μl/min、10μl/min；鞘流流体的气压泵的压力为50mbar；
[0089] 将制备出的包载有细胞的海藻酸钠/壳聚糖复合空腔微纤维浸泡在PBS(pH7.4)的溶液内，就得到包载有细胞的超薄空腔复合微纤维材料(图2)。然后移至低糖的DMEM培养基内进行培养(图3)。
[0090] 本发明制备的微纤维材料，能够满足细胞培养的需求，实现细胞在微纤维空腔内的贴附和生长；同时，修饰涂层的存在，一方面能够促进细胞在微纤维内的黏附及生长，阻止细胞在操作及培养过程中从微纤维内滑出；另外一方面，内侧涂层的存在，能够增强微纤维在体内的
稳定性；而超薄微纤维可以为包埋在内部的细胞提供快捷的营养物质交换，能加快内部细胞的培养，从而为其在组织工程上的应用提供更加便利的条件。
