具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法及其应用专利检索-微件软件组件软件套件软件固件电脑零配件专利检索查询-专利查询网

具有主动靶向、荧光成像及肿瘤 联合 治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法及其应用

阅读：241发布：2024-01-25

专利汇可以提供具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法及其应用，它涉及一种聚多巴胺量子点的制备方法及其应用。本发明的目的在于提供一种具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，及该材料在肿瘤诊断和治疗领域中的应用。制备方法：一、制备聚多巴胺溶液；二、制备四价铂前药；三、微波法，得到棕黄色粘性液体；四、透析，得到透析后的碳点水溶液；五、复合，得到具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子。应用：用于体外成像，用于体内成像，作为制备抗肿瘤药物使用。，下面是具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，其特征在于它是按以下步骤完成的：
一、制备聚多巴胺溶液：将盐酸多巴胺加入三羟甲基氨基甲烷溶液中，在室温下聚合至溶液由无色变为褐色为止，得到聚多巴胺溶液；所述三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为
8mmol/L～10mmol/L，且pH为7.5～8.5；所述盐酸多巴胺的质量与三羟甲基氨基甲烷溶液的体积比为(8～9)mg:(1～2)mL；
二、制备四价铂前药：①、将顺铂和质量分数为30％的过氧化氢溶液加入去离子水中，先在温度为50℃下搅拌1h，然后室温条件下搅拌12h，冻干后得到氧铂固体粉末；所述顺铂的质量与去离子水的体积比为(20～30)mg:1mL；所述质量分数为30％的过氧化氢溶液与去离子水的体积比为3～4:5；②、将氧铂固体粉末和琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，室温下搅拌反应24小时，冻干后得到四价铂前药；所述氧铂固体粉末的质量与二甲基亚砜的体积比为(50～60)mg:1mL；所述琥珀酸酐的质量与二甲基亚砜的体积比为(25～30)mg:1mL；
三、微波法：将甘油和聚多巴胺溶液放入容器中，将pH值调至9，超声分散5min，再置入微波炉中，在功率为800W～1000W下微波反应8min，得到棕黄色粘性液体；所述甘油与聚多巴胺溶液的体积比为(3～4):1；
四、透析：①、将棕黄色粘性液体溶于去离子水中，然后置于离心机中，在转速为
10000r/min下离心10min，得到棕黄色上清液；所述棕黄色粘性液体与去离子水的体积比为
1～2:1；②、将棕黄色上清液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理48h～72h，每透析处理6h～8h更换一次去离子水，得到透析后的碳点水溶液；
五、复合：①、向透析后的碳点水溶液中加入四价铂前药、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌条件下反应24h，再加入稀释后的EpCAM抗体水溶液，继续在室温搅拌条件下反应2h，得到初产物溶液；所述四价铂前药的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(1～2)mg:1mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(2～3)mg:10mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(3～4)mg:10mL；所述稀释后的EpCAM抗体水溶液与透析后的碳点水溶液的体积比为0.8～1.2:10；②、然后初产物溶液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理24h，得到透析后初产物，将透析后初产物旋蒸，旋蒸至透析后初产物呈棕色粘稠状为止，得到具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点，对具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行冷藏保存。
2.根据权利要求1所述具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，其特征在于步骤五中所述稀释后的EpCAM抗体水溶液按以下操作制备：
先按EpCAM抗体母液与水的体积比为10:990将EpCAM抗体母液稀释于水中，得到EpCAM抗体水溶液，再将EpCAM抗体水溶液稀释50倍，得到稀释后的EpCAM抗体水溶液。
3.如权利要求1所述的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，其特征在于具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用于体外成像；具体过程如下：
在细胞孵育开始时将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点加入细胞培养基中，孵育结束后，采用荧光显微镜观察细胞状态，即完成体外成像。
4.根据权利要求3所述具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，其特征在于将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为80μg/mL～120μg/mL，按照添加量为25μL/mL～50μL/mL加入细胞培养基中。
5.如权利要求1所述的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，其特征在于具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用于体内成像；具体过程如下：
采用静脉注射形式将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点注入待体内成像的动物体内，使用Perkinelmer体内成像系统进行活体成像检测，即完成体内成像。
6.根据权利要求5所述具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，其特征在于将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为80μg/mL～120μg/mL，按照注射量为0.5mg/kg进行注射。
7.如权利要求1所述的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，其特征在于具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点作为制备抗肿瘤药物使用。

说明书全文

具有主动靶向、荧光成像及肿瘤 联合 治疗功能的聚多巴胺量

子点的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种聚多巴胺量子点的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 聚合物碳点是由碳点发展出来的一类新型材料，是由线性聚合物或单体经过交联或者聚合得到，或是由碳核和表面连接的聚合物链组成。由于其优异的荧光特性，在生物成像中的应用越来越受到重视。因此，具有成像功能的碳点在辅助肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。聚多巴胺由于其结构类似于黑色素，因此本身具有良好的光热效应。聚多巴胺碳量子点，不仅保留了良好的光热效应，并且具有良好的荧光特性。上皮细胞黏附分子(EpCAM)是高致瘤性肝癌细胞膜上的重要标志物之一，在肿瘤治疗方面，EpCAM蛋白在癌细胞膜上的过表达，可以有效的作为抗肿瘤药物的重要靶点。顺铂(Pt(II))是一种广泛应用于多种实体肿瘤的抗肿瘤药物。与顺铂药物相比，四价铂(Pt(IV))配合物惰性较强，毒性较小，为克服Pt(II)药物的缺点提供了一种有前景的替代方案。进入细胞后，通过细胞内还原性分子谷胱甘肽(GSH)还原Pt(IV)前体药物，生成Pt(II)药物，从而恢复其细胞毒性。

发明内容

[0003] 本发明的目的在于提供一种具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，及该材料在肿瘤诊断和治疗领域中的应用。

[0004] 一种具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，具体是按以下步骤完成的：

[0005] 一、制备聚多巴胺溶液：将盐酸多巴胺加入三羟甲基氨基甲烷溶液中，在室温下聚合至溶液由无色变为褐色为止，得到聚多巴胺溶液；所述三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为8mmol/L～10mmol/L，且pH为7.5～8.5；所述盐酸多巴胺的质量与三羟甲基氨基甲烷溶液的体积比为(8～9)mg:(1～2)mL；

[0006] 二、制备四价铂前药：①、将顺铂和质量分数为30％的过氧化氢溶液加入去离子水中，先在温度为50℃下搅拌1h，然后室温条件下搅拌12h，冻干后得到氧铂固体粉末；所述顺铂的质量与去离子水的体积比为(20～30)mg:1mL；所述质量分数为30％的过氧化氢溶液与去离子水的体积比为3～4:5；②、将氧铂固体粉末和琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，室温下搅拌反应24小时，冻干后得到四价铂前药；所述氧铂固体粉末的质量与二甲基亚砜的体积比为(50～60)mg:1mL；所述琥珀酸酐的质量与二甲基亚砜的体积比为(25～30)mg:1mL；

[0007] 三、微波法：将甘油和聚多巴胺溶液放入容器中，将pH值调至9，超声分散5min，再置入微波炉中，在功率为800W～1000W下微波反应8min，得到棕黄色粘性液体；所述甘油与聚多巴胺溶液的体积比为(3～4):1；

[0008] 四、透析：①、将棕黄色粘性液体溶于去离子水中，然后置于离心机中，在转速为10000r/min下离心10min，得到棕黄色上清液；所述棕黄色粘性液体与去离子水的体积比为
1～2:1；②、将棕黄色上清液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理48h～72h，每透析处理6h～8h更换一次去离子水，得到透析后的碳点水溶液；

[0009] 五、复合：①、向透析后的碳点水溶液中加入四价铂前药、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌条件下反应24h，再加入稀释后的EpCAM抗体水溶液，继续在室温搅拌条件下反应2h，得到初产物溶液；所述四价铂前药的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(1～2)mg:1mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(2～3)mg:10mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(3～4)mg:10mL；所述稀释后的EpCAM抗体水溶液与透析后的碳点水溶液的体积比为0.8～1.2:10；②、然后初产物溶液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理24h，得到透析后初产物，将透析后初产物旋蒸，旋蒸至透析后初产物呈棕色粘稠状为止，得到具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点，对具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行冷藏保存。

[0010] 具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，用于体外成像；具体过程如下：在细胞孵育开始时将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点加入细胞培养基中，孵育结束后，采用荧光显微镜观察细胞状态，即完成体外成像。

[0011] 具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，用于体内成像；具体过程如下：采用静脉注射形式将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点注入待体内成像的动物体内，使用Perkinelmer体内成像系统进行活体成像检测，即完成体内成像。

[0012] 具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，作为制备抗肿瘤药物使用。

[0013] 本发明优原理及优点：一、本发明以聚多巴胺以及丙三醇为原料，采用微波方法一步合成聚合物碳点，使其具有光热治疗和选择性成像功能，进一步将顺铂前药以及EpCAM抗体修饰在碳点表面，赋予其主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能；二、本发明合成碳点的原料来源丰富、价廉易得，碳点制备过程方法简单，绿色环保，可大量合成生产；三、本发明制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的粒径小，尺寸均一，可以稳定分散在水中，无团聚现象；四、本发明制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点具有优良的荧光性质，荧光量子产率高，生物毒性低，可以实现活细胞体外成像，活体体内成像；五、本发明制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点具有优秀的光热转换能力，以及铂药的抗肿瘤效果，可以将光热治疗以及药物治疗相结合，起到更好的抗肿瘤效果，在肿瘤检测、药物递送等领域发挥重要作用。附图说明

[0014] 图1是红外谱图，图中A表示实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的红外谱图，B表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的红外谱图；

[0015] 图2是实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的低倍TEM图；

[0016] 图3是实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的高倍TEM图；

[0017] 图4是紫外图谱，图中A实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的紫外图谱，B表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的紫外图谱；

[0018] 图5是紫实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的荧光光谱，图中1表示激发波长为340m，2表示激发波长为360m，3表示激发波长为380m，4表示激发波长为400m，5表示激发波长为420m，6表示激发波长为440m；

[0019] 图6是实施例2在正常视野下HepG2细胞状态荧光显微镜成像图；

[0020] 图7是实施例2在荧光视野下HepG2细胞状态荧光显微镜成像图；

[0021] 图8是实施例3在正常视野下Hela细胞状态荧光显微镜成像图；

[0022] 图9是实施例3在荧光视野下Hela细胞状态荧光显微镜成像图；

[0023] 图10是对照组小鼠Perkinelmer体内成像图；

[0024] 图11是实验组小鼠Perkinelmer体内成像图；

[0025] 图12是实施例5的时间-温度曲线图，图中■表示多功能聚多巴胺碳点溶液的时间-温度曲线图，●表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的时间-温度曲线图；

[0026] 图13是实施例6的时间-温度曲线图，图中■表示注射多功能聚多巴胺碳点溶液的时间-温度曲线图，●表示注射实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的时间-温度曲线图；

[0027] 图14是材料浓度-细胞活力柱形图，图中A表示聚多巴胺碳点对照组材料浓度-细胞活力柱形图，B表示顺铂对照组材料浓度-细胞活力柱形图，C表示多功能聚多巴胺碳点实验组材料浓度-细胞活力柱形图，D表示多功能聚多巴胺碳点+808nm激光实验组材料浓度-细胞活力柱形图；

[0028] 图15是PI染色后的Hela细胞荧光显微镜成像图；

[0029] 图16是钙黄绿素染色后的Hela细胞荧光显微镜成像图；

[0030] 图17是叠加后的Hela细胞荧光显微镜成像图；

[0031] 图18是PI染色后的HepG2细胞荧光显微镜成像图；

[0032] 图19是钙黄绿素染色后的HepG2细胞荧光显微镜成像图；

[0033] 图20是叠加后的HepG2细胞荧光显微镜成像图。

具体实施方式

[0034] 具体实施方式一：本实施方式是具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，具体是按以下步骤完成的：

[0035] 一、制备聚多巴胺溶液：将盐酸多巴胺加入三羟甲基氨基甲烷溶液中，在室温下聚合至溶液由无色变为褐色为止，得到聚多巴胺溶液；所述三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为8mmol/L～10mmol/L，且pH为7.5～8.5；所述盐酸多巴胺的质量与三羟甲基氨基甲烷溶液的体积比为(8～9)mg:(1～2)mL；

[0036] 二、制备四价铂前药：①、将顺铂和质量分数为30％的过氧化氢溶液加入去离子水中，先在温度为50℃下搅拌1h，然后室温条件下搅拌12h，冻干后得到氧铂固体粉末；所述顺铂的质量与去离子水的体积比为(20～30)mg:1mL；所述质量分数为30％的过氧化氢溶液与去离子水的体积比为3～4:5；②、将氧铂固体粉末和琥珀酸酐溶于二甲基亚砜中，室温下搅拌反应24小时，冻干后得到四价铂前药；所述氧铂固体粉末的质量与二甲基亚砜的体积比为(50～60)mg:1mL；所述琥珀酸酐的质量与二甲基亚砜的体积比为(25～30)mg:1mL；

[0037] 三、微波法：将甘油和聚多巴胺溶液放入容器中，将pH值调至9，超声分散5min，再置入微波炉中，在功率为800W～1000W下微波反应8min，得到棕黄色粘性液体；所述甘油与聚多巴胺溶液的体积比为(3～4):1；

[0038] 四、透析：①、将棕黄色粘性液体溶于去离子水中，然后置于离心机中，在转速为10000r/min下离心10min，得到棕黄色上清液；所述棕黄色粘性液体与去离子水的体积比为
1～2:1；②、将棕黄色上清液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理48h～72h，每透析处理6h～8h更换一次去离子水，得到透析后的碳点水溶液；

[0039] 五、复合：①、向透析后的碳点水溶液中加入四价铂前药、N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌条件下反应24h，再加入稀释后的EpCAM抗体水溶液，继续在室温搅拌条件下反应2h，得到初产物溶液；所述四价铂前药的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(1～2)mg:1mL；所述N-羟基琥珀酰亚胺的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(2～3)mg:10mL；所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量与透析后的碳点水溶液的体积比为(3～4)mg:10mL；所述稀释后的EpCAM抗体水溶液与透析后的碳点水溶液的体积比为0.8～1.2:10；②、然后初产物溶液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理24h，得到透析后初产物，将透析后初产物旋蒸，旋蒸至透析后初产物呈棕色粘稠状为止，得到具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点，对具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行冷藏保存。

[0040] 具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤五中所述稀释后的EpCAM抗体水溶液按以下操作制备：

[0041] 先按EpCAM抗体母液与水的体积比为10:990将EpCAM抗体母液稀释于水中，得到EpCAM抗体水溶液，再将EpCAM抗体水溶液稀释50倍，得到稀释后的EpCAM抗体水溶液。

[0042] 其他与具体实施方式一相同。

[0043] 具体实施方式三：本实施方式是具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它用于体外成像；具体过程如下：

[0044] 在细胞孵育开始时将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点加入细胞培养基中，孵育结束后，采用荧光显微镜观察细胞状态，即完成体外成像。

[0045] 具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三的不同点是：将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为80μg/mL～120μg/mL，按照添加量为25μL/mL～50μL/mL加入细胞培养基中。其他与具体实施方式三相同。

[0046] 具体实施方式五：本实施方式是具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它用于体内成像；具体过程如下：

[0047] 采用静脉注射形式将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点注入待体内成像的动物体内，使用Perkinelmer体内成像系统进行活体成像检测，即完成体内成像。

[0048] 具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为80μg/mL～120μg/mL，按照注射量为0.5mg/kg进行注射。其他与具体实施方式五相同。

[0049] 具体实施方式七：本实施方式是具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它作为制备抗肿瘤药物使用。

[0050] 本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

[0051] 采用下述试验验证本发明效果

[0052] 实施例1：具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的制备方法，具体是按以下步骤完成的：

[0053] 一、制备聚多巴胺溶液：将90mg盐酸多巴胺加入10mL三羟甲基氨基甲烷溶液中，在室温下聚合至溶液由无色变为褐色为止(聚合时间为2h)，得到聚多巴胺溶液；所述三羟甲基氨基甲烷溶液的浓度为10mmol/L，且pH为8.5；所述聚多巴胺溶液的浓度为9mg/mL；

[0054] 二、制备四价铂前药：①、将100mg顺铂和3.5mL质量分数为30％的过氧化氢溶液加入5mL去离子水中，先在温度为50℃下搅拌1h，然后室温条件下搅拌12h，冻干后得到氧铂固体粉末；②、将100mg氧铂固体粉末和50mg琥珀酸酐溶于2mL二甲基亚砜中，室温下搅拌反应24小时，冻干后得到四价铂前药；

[0055] 三、微波法：将30mL甘油和9mL聚多巴胺溶液放入容器中，将pH值调至9，超声分散5min，再置入微波炉中，在功率为900W下微波反应8min，得到棕黄色粘性液体；

[0056] 四、透析：①、将10mL棕黄色粘性液体溶于10mL去离子水中，然后置于离心机中，在转速为10000r/min下离心10min，得到棕黄色上清液；②、将棕黄色上清液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理72h，每透析处理6h更换一次去离子水，得到透析后的碳点水溶液；

[0057] 五、复合：①、向10mL透析后的碳点水溶液中加入8mg四价铂前药、2.3mg N-羟基琥珀酰亚胺和3.8mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌条件下反应24h，再加入1mL稀释后的EpCAM抗体水溶液，继续在室温搅拌条件下反应2h，得到初产物溶液；②、然后初产物溶液转移至1000分子量的透析袋中，透析处理24h，得到透析后初产物，将透析后初产物旋蒸，旋蒸至透析后初产物呈棕色粘稠状为止，得到具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点，对具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行冷藏保存。

[0058] 步骤五中所述稀释后的EpCAM抗体水溶液按以下操作制备：

[0059] 先将10μL EpCAM抗体母液稀释于990μL水中，得到EpCAM抗体水溶液，再将EpCAM抗体水溶液稀释50倍，得到稀释后的EpCAM抗体水溶液。

[0060] 利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)对实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液和实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行表征，如图1所示，图1是红外谱图，图中A表示实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的红外谱图，B表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点-1水溶液的红外谱图；通过图1可知，3000～3500cm 的宽频带振动来自于N-H和O-H的伸缩振动。1586cm-1和1615cm-1的特征峰归因于N-H的伸缩振动，1288cm-1的峰属于C-N。说明实施例
1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液中聚多巴胺碳量子点表面存在氨基基团；由于聚多巴胺碳量子点中的氨基基团通过典型的NHS/EDC酰胺化反应与四价铂前体药物的羧基发生偶联，因此实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点与实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液相比红外特征峰发生明显变化。1620cm-1处的峰值归因于C＝O伸缩振动，即酰胺I带。特征峰在1386cm-1处属于酰胺Ⅲ带。酰胺键的特征峰表明四价铂前药以及EpCAM抗体成功的偶联到聚多巴胺碳量子点表面，形成了多功能碳量子点。

[0061] 利用透射电子显微镜(TEM)用来观测实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的尺寸与形貌特征，如图2和3所示，图2是实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的低倍TEM图，图3是实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的高倍TEM图；通过图2和3可知，实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的粒径较小，分布均匀，其平均直径为8±2nm，晶格间距为0.36nm。

[0062] 采用TU-1901紫外可见光谱仪对实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液和实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行测定，如图4所示，图4是紫外图谱，图中A实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的紫外图谱，B表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的紫外图谱；通过图4可知，实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液在270nm的吸收峰是由聚多巴胺碳点中的芳环结构π-π*跃迁引起的；经四价铂前药修饰碳点后，实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的CDs-Pt(IV)的吸收峰出现在360nm处。这是因为Pt(IV)附着在聚多巴胺碳量子点后，新的助色集团与共轭苯环形成了n-π*共轭引起的。

[0063] 采用珀金埃尔默LS-55荧光光谱仪对实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点进行测定，如图5所示，图5是实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的荧光光谱，图中1表示激发波长为340m，2表示激发波长为360m，3表示激发波长为380m，4表示激发波长为400m，5表示激发波长为420m，6表示激发波长为440m；通过图5可知，实施例1制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的激发波长范围较宽，激发波长从340m起调节至
440nm，所对应的发射峰的位置也从445nm移至500nm，最大激发波长在360nm左右，即随着激发波长的不断增加发射峰出现了逐渐红移的趋势。

[0064] 实施例2：具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它用于体外成像，所述具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点是实施例1制备的；具体过程如下：

[0065] ①、将HepG2肝癌细胞接种于DMEM培养基中，在温度为37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养使细胞贴壁；②、将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为100μg/mL，按照添加量为50μL/mL加入DMEM培养基中，得到含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基；③、将步骤①中的DMEM培养基移除，并加入步骤②制备的含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基，在温度为37℃、5％CO2的培养箱中孵育12h，得到孵育细胞，采用质量分数为4％多聚甲醛对孵育细胞固定20min，然后利用PBS洗涤3次，再进行封片处理，采用荧光显微镜(Olympus,BX51)在正常视野和荧光视野(360nm的激发光)下观察细胞状态，如图6和7所示。

[0066] 图6是实施例2在正常视野下HepG2细胞状态荧光显微镜成像图，图7是实施例2在荧光视野下HepG2细胞状态荧光显微镜成像图；从图7可以直观的观察到荧光(黄绿色荧光)，且细胞边界分明，说明具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点可以有效地被HepG2肝癌细胞内吞，并且仍具有荧光成像的能力。

[0067] 实施例3：实施例2对比实施例：

[0068] ①、将Hela 宫颈癌细胞接种于DMEM培养基中，在温度为37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养使细胞贴壁；②、将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为100μg/mL，按照添加量为50μL/mL加入DMEM培养基中，得到含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基；③、将步骤①中的DMEM培养基移除，并加入步骤②制备的含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基，在温度为37℃、5％CO2的培养箱中孵育12h，得到孵育细胞，采用质量分数为4％多聚甲醛对孵育细胞固定20min，然后利用PBS洗涤3次，再进行封片处理，采用荧光显微镜(Olympus,BX51)在正常视野和荧光视野(360nm的激发光)下观察细胞状态，如图8和9所示。

[0069] 图8是实施例3在正常视野下Hela细胞状态荧光显微镜成像图，图9是实施例3在荧光视野下Hela细胞状态荧光显微镜成像图；通过图9与图8对可知，成像效果不是很明显，说明具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点不能有效地被Hela宫颈癌细胞内吞，并且对Hela宫颈癌细胞荧光成像的能力不明显。通过实施例2与实施例3对比可知，本发明制备的具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点能有效的识别并应用于HepG2肝癌细胞的体外成像。

[0070] 实施例4：具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它用于体内成像，所述具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点是实施例1制备的；具体过程如下：

[0071] 采用雌性BALB/c小鼠(购自哈尔滨医科大学中心第二附属医院)进行体内荧光生物成像实验，将小鼠随机分为两组(每组5只平行)，对照组小鼠尾静脉注射200μL PBS缓冲溶液，实验组小鼠尾静脉注射200μL CDs溶液；用乙醚麻醉小鼠后，使用Perkinelmer(IVIS Lumina SeriesⅢ)体内成像系统进行活体成像检测；如图10和11所示。

[0072] 所述CDs溶液按以下步骤制备：将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为100μg/mL，得到CDs溶液。

[0073] 图10是对照组小鼠Perkinelmer体内成像图；图11是实验组小鼠Perkinelmer体内成像图；通过图11和图10对比可以看到，对照组小鼠注射PBS缓冲溶液后，由于毛发本身的原因，出现了轻微的荧光。在相同的条件下，实验组的体内荧光成像明显强于对照组，可以看出具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点在体内的大致分布在胸腺、心脏、脾脏位置，并且有较强的荧光信号。

[0074] 实施例5：体外光热转换性能检测：

[0075] 将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至-1浓度为0.1mg·mL ，得到多功能聚多巴胺碳点溶液；将1mL实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液和1mL多功能聚多巴胺碳点溶液分别加入两只3mL透明离心管中，采用光纤耦合连续半导体二极管激光器(808nm，北京维亚索科技有限公司)在功率密度为1.0W·cm-2的光源进行辐照；并用红外热成像摄像机(美国Flir T600)对温度变化进行监测，如图12所示。

[0076] 图12是实施例5的时间-温度曲线图，图中■表示多功能聚多巴胺碳点溶液的时间-温度曲线图，●表示实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的时间-温度曲线图；通过图5可知，实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液和多功能聚多巴胺碳点溶液的温度在5分钟内，迅速从27.5℃增加到54.5℃。说明多功能聚多巴胺碳点溶液可以快速、有效地将波长808纳米的激光能量转换成辐照下的热能。同时也表明Pt(VI)前药和anti-EpCAM的存在不影响具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的光热作用。

[0077] 实施例6：体内光热转换性能检测：

[0078] ①、在15g±0.5g的雌性BALB/c小鼠大腿处接种1×106HepG2肝癌细胞，小鼠随机分成实验组和对照组，每组5只；②、将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为0.1mg·mL-1，得到多功能聚多巴胺碳点溶液；③、当实验组和对照组雌性BALB/c小鼠的肿瘤体积生长到100mm3时，对实验组注射100μL多功能聚多巴胺碳点溶液，对照组注射100μL实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液，继续培养7天，采用光纤耦合连续半导体二极管激光器(808nm，北京维亚索科技有限公司)在功率密度为1.0W·cm-2的光源进行辐照进行瘤体照射，并用红外热成像摄像机(美国Flir T600)对温度变化进行监测，如图13所示。

[0079] 图13是实施例6的时间-温度曲线图，图中■表示注射多功能聚多巴胺碳点溶液的时间-温度曲线图，●表示注射实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液的时间-温度曲线图；通过图6可知，实验组照射5min后肿瘤温度由37.6℃升高至56.0℃，而对照组仅升高至39.1℃，证明本发明具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点可以在肿瘤部位有效富集，抗EpCAM可以有效、特异地识别HepG2肝癌细胞膜上过表达的EpCAM蛋白。

[0080] 实施例7：具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点的应用，它作为制备抗肿瘤药物使用；将具有主动靶向、荧光成像及肿瘤联合治疗功能的聚多巴胺量子点用水稀释，至浓度为100μg/mL，得到多功能聚多巴胺碳点溶液；

[0081] 材料细胞毒性实验：在含有DMEM培养基的96孔板中培养HeLa宫颈癌细胞(预留空白组，仅加同体积培养基)，在温度37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养使细胞贴壁；细胞分为2组，1、阴性对照组(Hela细胞)；2、阳性对照组，阳性对照组又分为：①、聚多巴胺碳点对照组(加入实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液，控制培养基溶液中聚多巴胺碳点的浓度)；②、顺铂对照组(加入顺铂，控制培养基溶液中顺铂的浓度)；③、多功能聚多巴胺碳点实验组(加入多功能聚多巴胺碳点溶液，控制培养基溶液中多功能聚多巴胺碳点的浓度)；④、多功能聚多巴胺碳点+808nm激光实验组(加入多功能聚多巴胺碳点溶液，控制培养基溶液中多功能聚多巴胺碳点的浓度)；每组材料以不同梯度浓度(浓度依次为0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)的培养基溶液孵育细胞，每个实验组设置5个平行；在温度37℃、5％CO2的培养箱中孵育12h，其中多功能聚多巴胺碳点+808nm激光实验组孵育12h后用808m激光照射5min；向每孔中加入20μL浓度为5mg/mL MTT的PBS溶液，并继续培养4小时，培养终止后吸掉培养基，再分别加入150μL DMSO，轻微震荡使结晶物充分溶解，然后用酶标仪(Rayto RT-2100C，深圳，中国)测其在490nm波长处的吸光度值，测试结果如图14所示。

[0082] 图14是材料浓度-细胞活力柱形图，图中A表示聚多巴胺碳点对照组材料浓度-细胞活力柱形图，B表示顺铂对照组材料浓度-细胞活力柱形图，C表示多功能聚多巴胺碳点实验组材料浓度-细胞活力柱形图，D表示多功能聚多巴胺碳点+808nm激光实验组材料浓度-细胞活力柱形图；通过图14可知，聚多巴胺碳点对照组中无论浓度高低，聚多巴胺碳量子点均无明显的细胞毒性，即实施例1步骤四中得到的透析后的碳点水溶液对细胞无明显毒性；顺铂对照组中采用传统顺铂对HepG2细胞的杀伤作用明显，且随浓度的增加而增加。多功能聚多巴胺碳点实验组与顺铂对照组相比，多功能聚多巴胺碳点对细胞毒性更小，进而在血管输送过程中对正常组织细胞的损伤降低。多功能聚多巴胺碳点+808nm激光实验组与多功能聚多巴胺碳点实验组相比，激光照射后的多功能聚多巴胺碳点对癌细胞的杀伤作用明显。这是由于化学-光热协同治疗所产生的效果。光热效应产生的部分热不可逆地杀死肿瘤细胞，而另一些热则加速Pt(IV)前药向顺铂的转化，恢复细胞毒性。

[0083] 体外细胞治疗效果评估：①、在含有DMEM培养基的96孔板中分别培养HeLa宫颈癌细胞和HepG2肝癌细胞，在37℃、5％CO2的培养箱中过夜培养使细胞贴壁；②、将多功能聚多巴胺碳点溶液按照添加量为50μL/mL加入DMEM培养基中，得到含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基；③、将步骤①中的DMEM培养基移除，并加入步骤②制备的含聚多巴胺碳量子点的DMEM培养基，在温度为37℃、5％CO2的培养箱中孵育12h，然后用808nm激光照射5min，PBS洗涤3次，然后分别用PI和calcein AM染色15min后，用PBS洗涤3次，封片处理后。采用荧光显微镜(Olympus,BX51)观察细胞死活的状态。PBS处理的细胞组作为对照组，测试结果如图15-20所示。

[0084] 碘化丙酯(PI)是一种细胞膜不渗透染料，当细胞死亡或凋亡时，PI可与核中的DNA结合，荧光显微镜下可观察到较强的红色荧光。钙黄绿素(calcein AM)只能对活细胞染色，可以通过活细胞内的酯酶作用，脱去-AM基团产生强绿色荧光。图15是PI染色后的Hela细胞荧光显微镜成像图；图16是钙黄绿素染色后的Hela细胞荧光显微镜成像图；图17是叠加后的Hela细胞荧光显微镜成像图；图18是PI染色后的HepG2细胞荧光显微镜成像图；图19是钙黄绿素染色后的HepG2细胞荧光显微镜成像图；图20是叠加后的HepG2细胞荧光显微镜成像图，通过图15-20可知，Hela细胞只有calcein AM成功染色，发出了绿色荧光，说明细胞状态良好。对于HepG2细胞来说，几乎所有的细胞被PI染色发出红色荧光，仅有个别的细胞发出绿色荧光。说明多功能聚多巴胺碳点在红外光的照射下可以有效地杀伤肝癌细胞。

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