一种羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片及
其制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 壳聚糖是一种优良的
生物材料，具有
生物相容性好、免疫原性低，还具有抗菌、消炎，可被人体代谢吸收等特性，广泛应用于控释剂、微球载体、缓释剂、药物增效剂等领域。壳聚糖分子表面具有功能性的自由
氨基和羟基，可进行改性，组成
复合材料。此外，壳聚糖还具有良好的降解性能，在体内环境中壳聚糖可经溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶等酶的作用后降解为寡聚糖，最终代谢排出体外，不会引起
机体的免疫反应。经羧甲基化后的壳聚糖具有较好的
水溶性，用
冷冻干燥法合成制备的
支架具相互贯通的多孔结构，可形成适宜结构、孔径和孔隙率，是多孔骨架型控释制剂的良好的骨架材料。选择不同用量、孔径和孔隙率的壳聚糖骨架，可调节多孔骨架型控释制剂的释药速率，有望广泛应用于控释制剂的制备。
[0003] 硒(Se)是一种人体必需的微量元素，有促进软骨细胞生长，延缓软骨细胞退变的作用，可用于软骨损伤性
疾病的
预防和
治疗。研究发现，一定浓度的硒具有保护软骨细胞的作用，硒元素还具有较强的抗
氧化特性，参与构成谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，可使有毒的过氧化物还原为无害的羟基化物，从而保护细胞及组织免于受过氧化物损伤。但硒元素的有效剂量和中毒剂量接近、生物利用效率低等缺点限制了其进一步广泛应用。
[0004] 硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)是一种重要的软骨基质，具有亲软骨性，广泛分布于软骨细胞外基质中，在维持关节功能和关节
力学的维持中发挥重要作用。CS具有良好的生物相容性、抗炎、抗氧化及抗
纤维化作用，在关节软骨的损伤修复中具有积极的作用。此外，还可促进细胞的增殖分化，常作为一种的关节补充剂，应用于各类骨关节疾病的预防和治疗中。目前应用广泛的CS多为人工合成制剂，仍具有潜在过敏反应、机体排异反应、免疫反应等缺点。
[0005] 现有的硒元素补充制剂(如亚硒酸钠等)，该类型的制剂无法有效控制释药速率，稳定体内药物浓度。因此经口摄入后，生物体内的硒含量分布曲线的
曲率高，浓度不稳定。目前市面上现有的此类制剂，均无法克服硒元素有效剂量和中毒剂量接近、生物利用效率低、吸收率低、
稳定性差等缺点。
发明内容
[0006] 为了克服上述
现有技术的缺点，为了克服现有技术中存在的
缺陷，本发明提供了一种羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的制备方法，可用于修复软骨损伤，治疗骨关节疾病，此外还可应用硒元素缺乏型疾病的预防和治疗。该制备工艺具有流程工序简单、
质量稳定可靠、生产成本较低等优点，经技术优化和工厂试产后，适用于规模化、工厂化、批量生产。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0008] 本发明公开了一种羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)制备硫酸软骨素A纳米硒溶液
[0010] 分别以亚硒酸钠、硫酸软骨素A和L-
抗坏血酸为原料，制备亚硒酸钠溶液、硫酸软骨素A溶液及L-抗坏血
酸溶液；
[0011] 将亚硒酸钠溶液和硫酸软骨素A溶液混合后，充分分散，然后向分散液中缓慢滴加L-抗坏血酸溶液，制得硫酸软骨素A纳米硒溶液；
[0012] 2)制备多孔骨架型控释基体
[0013] 以羧甲基壳聚糖为原料，制备羧甲基壳聚糖溶液；
[0014] 以羧甲基
纤维素钠为原料，制备
羧甲基纤维素钠溶液，与羧甲基壳聚糖溶液充分混匀，制得
聚合物，然后进行
真空冷冻干燥处理，制得多孔骨架型控释基体；
[0015] 3)制备羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片
[0016] 向硫酸软骨素A纳米硒溶液中加入
吸附剂，然后与多孔骨架型控释基体充分混匀后，向混合体系中加入
粘合剂，制备成软材，然后制粒、整粒，加入
润滑剂和抗粘剂，混合均匀，压制成片，制得羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片。
[0017] 优选地，步骤1)中，所述硫酸软骨素A溶液是按3g：20mL的用量比，将硫酸软骨素A溶于水中制得；
[0018] 所述亚硒酸钠溶液是按11g：100mL的用量比，将亚硫酸钠加入水中制得；
[0019] 所述L-抗坏血酸溶液是按33g：200mL的用量比，将L-抗坏血酸加入水中制得。
[0020] 优选地，步骤1)中，充分分散是在30℃、60Hz超声的条件下进行。
[0021] 优选地，步骤2)中，所述羧甲基壳聚糖溶液是按11g：100mL的用量比，将羧甲基壳聚糖溶于水中制得；
[0022] 所述羧甲基纤维素钠溶液是按11g：100mL的用量比，将羧甲基纤维素钠溶于水中制得。
[0023] 优选地，步骤2)中，真空冷冻干燥处理，具体包括如下步骤：
[0024] (1)预冻结阶段：设定油温为-60℃，待真空冷冻干燥仪油温和品温的
温度稳定后，继续保温4小时，使样品冻结完全，以备后续工序；
[0025] (2)
升华干燥阶段：将油温设定为-20℃，调节真空
泵参数，控制真空
冷冻干燥机的真空度为10～15pa，待真空冷冻干燥仪的油温和品温的温度均能稳定在-20℃后，保温8小时，以保证样品充分升华干燥；
[0026] (3)减速干燥阶段：将油温设定为38℃，调节
真空泵参数，控制真空冷冻干燥机的真空度为10～15pa，使得油温和品温在3小时内逐步升高至38℃；
[0027] (4)解析干燥：待真空冷冻干燥仪油温和品温的温度均能稳定在38℃后，控制真空冷冻干燥机的真空度为10～15pa，保温5小时，使得样品能够解析干燥完全；
[0028] (5)解析干燥完全后，结束冻干过程，保持样品的无菌环境。
[0029] 优选地，步骤3)中，所述吸附剂为
磷酸二氢
钙；粘合剂为
淀粉浆；润滑剂为微粉
硅胶；抗粘剂为
硬脂酸镁。
[0030] 优选地，以质量分数计算，吸附剂的含量为10％～20％；粘合剂适量(指符合常规药物辅料配比用量)；以质量分数计算，润滑剂和抗粘剂的含量均为2％～4％。
[0031] 本发明还公开了采用上述的制备方法制得的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片。
[0032] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0033] 本发明公开的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的制备工艺，壳聚糖是一种广泛应用的生物材料，具有生物相容性好、免疫原性低、可被人体代谢吸收等特性。本发明应用真空冷冻干燥技术制备成的羧甲基壳聚糖多孔骨架材料具有多孔的结构，不同的材料配比可改变材料的孔径和孔隙率，调节控释制剂的释药速率，可用于多孔骨架型控释制剂的制备。硫酸软骨素A纳米硒是研究团队前期研发的一种补硒制剂，其克服了无机补硒制剂有效剂量和中毒剂量接近的缺点，提高了硒元素的生物利用度，同时结合了硫酸软骨素A生物相容性佳、粒径小、生物利用率高、生物活性高等特点。因此，本发明的制备工艺具有流程工序简单、质量稳定可靠、生产成本低廉等优点，经技术优化和工厂试产后，适用于规模化、工厂化、批量生产。
[0034] 经本发明所述的生产工艺制备的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片，具备SeCSA作为新型补硒制剂的抗氧化、抗
炎症反应，延缓软骨细胞的退变、性质稳定、保存时间长等特性，同时还兼具羧甲基壳聚糖多孔骨架材料
比表面积大、可调节孔径和孔隙率、生物相容性佳、可降解性好、可控释放等特性。本发明研发的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片能够有效控制SeCSA的释放速率，稳定服药后体内硒浓度分布浓度，从而减少药物的摄入剂量和
频率，降低毒性作用，有效克服了现有补硒制剂(如亚硒酸钠)体内浓度分布不均、有效剂量和中毒剂量接近、生物利用效率低、吸收率低、稳定性差等缺点。经过本发明生产工艺制备的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片，可广泛应用于关节软骨损伤性疾病以及硒元素缺乏性疾病(如大骨节病、克山病等)，具有巨大的应用潜力和社会价值。
附图说明
[0035] 图1为本发明所述羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的制备工艺
流程图；
[0036] 图2为本发明所用多次真空冷冻干燥工艺的冻干曲线图。
具体实施方式
[0037] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明
实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
[0038] 需要说明的是，本发明的
说明书和
权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何
变形，意图在于
覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
[0039] 下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
[0040] 本发明所述的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的制备工艺(图1)：
[0041] 1)以质量分数计算，称取450g硫酸软骨素A加入3000mL蒸馏水，将硫酸软骨素A充分溶解，制得硫酸软骨素A溶液备用；
[0042] 2)以质量分数计算，称取110g亚硫酸钠加入1000mL蒸馏水，将亚硒酸钠充分溶解，制得亚硒酸钠溶液备用；
[0043] 3)以质量分数计算，称取330g L-抗坏血酸加入2000mL蒸馏水，将L-抗坏血酸充分溶解，制得L-抗坏血酸溶液备用；
[0044] 4)使用超声分散仪在60Hz超声以及30℃的温度环境下，将亚硒酸钠溶液和硫酸软骨素A溶液充分分散，将亚硒酸钠溶液缓慢倒入制备完成的硫酸软骨素A溶液并不断搅拌，充分混匀。得到硫酸软骨素A与亚硒酸钠的混合溶液，并使用超声分散仪将混合溶液充分分散。
[0045] 5)充分混匀酸软骨素A与亚硒酸钠的混合溶液，缓慢滴加如制备完成的L-抗坏血酸溶液，并不断搅拌，制成硫酸软骨素A纳米硒溶液，并在超声分散仪中将该药液充分分散均匀。将制备好的硫酸软骨素A纳米硒溶液用0.45μm微孔滤
膜过滤，初步过滤除去孔径大于0.45μm的杂质、细菌等；将初步过滤后的药液用用0.22μm微孔滤膜精滤，进一步除去孔径大于0.22μm的杂质、细菌等。将制备完成硫酸软骨素A纳米硒溶液，放入真空冷冻干燥机中进行真空冻干，制备得到硫酸软骨素A纳米硒有效药物成分。
[0046] 6)以质量分数计算，称取110g羧甲基壳聚糖粉末，加入1000ml蒸馏水，将羧甲基壳聚糖充分溶解，制得羧甲基壳聚糖溶液备用；
[0047] 7)以质量分数计算，称取110g羧甲基纤维素钠粉末，加入1000ml蒸馏水，将羧甲基纤维素钠充分溶解，制得羧甲基纤维素钠溶液备用；将制备好的羧甲基壳聚糖溶液与羧甲基纤维素钠溶液充分混合后，放入真空冷冻干燥机中进行真空冻干，制备得到多的羧甲基壳聚糖与羧甲基纤维素复合的多孔骨架型控释基体。
[0048] 本发明所采用的多次真空冷冻干燥工艺如下：
[0049] (1)预冻结阶段：设定油温为-60℃，大约经过2小时后，待真空冷冻干燥仪油温和品温的温度稳定后，继续保温4小时，使样品冻结完全，以备后续工序。
[0050] (2)升华干燥阶段：将油温设定为-20℃，调节真空泵参数，控制真空冷冻干燥机的真空度为10～15pa。待真空冷冻干燥仪的油温和品温温度均能稳定在-20℃后，保温8小时，以保证样品充分升华干燥。
[0051] (3)减速干燥阶段：将油温设定为38℃，调节真空泵参数，控制真空冷冻干燥机的真空度为10～15pa，使得油温和品温在3小时内逐步升高至38℃，准备进入下一道工序。
[0052] (4)解析干燥：待真空冷冻干燥仪油温和品温的温度均能稳定在38℃后，控制真空冷冻干燥机的真空度为10～15pa，保温5小时，使得样品能够解析干燥完全。图2为样品的冻干温度曲线。
[0053] (5)解析干燥完全后，结束冻干过程，保持样品的无菌环境。
[0054] 8)在制备完成的硫酸软骨素A纳米硒中加入适量的磷酸二氢钙吸附剂，之后与步骤二制备的多孔骨架型控释基体充分混匀，加入淀粉浆粘合剂，以保证硫酸软骨素A纳米硒与多孔骨架型控释基体吸附良好，粘合紧密。其中，吸附剂的质量百分含量为10％-20％，粘合剂适量，润滑剂和抗粘剂的质量百分含量均为2％-4％。
[0055] 9)将步骤8)所得物质制备成软材，过筛网得到湿颗粒，之后干燥所得湿颗粒，制备成整颗粒。在制备整粒好的干颗粒中，加入微粉硅胶润滑剂，硬脂酸镁抗粘剂后，充分混匀。
[0056] 10)放入自动压片机，制备成完整的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片。无菌
铝封，避光保存。
[0057] 本发明所述的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片制备工艺还包括对生产工艺的质量控制，定期对各个批次生产的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片进行批次抽样、质量控制，确保生产出优质、稳定、可靠的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片。此外还对羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片进行药物稳定试验、药物体外释放度实验、药物体内释放评价，对制备成的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片的稳定性、释放速率等指标进行综合评价。
[0058] 所述的药物体外释放度实验具体实验方法为，采用《中国药典》对控释药物的经典评价方法，即桨法，具体搅拌速度为50r/min，搅拌速度差异要保持在±4％以内。所用的释放介质为：0.1mol/L的HCl溶液500mL测试2h，之后换用pH为6.8的
磷酸盐缓冲液900mL。介质温度保持在37±0.5℃恒温，按照规定的0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、15、24h时间点，分别取样，取样点位于搅拌叶的尖端和距离容器最低点50-60mm处，每次取10ml，后经处理后采用高效液相色谱法(HPLC)测定控释药物的释放量。
[0059] 综上所述，本发明制备的羧甲基壳聚糖多孔骨架型硫酸软骨素A纳米硒控释片，能够控制硒的释药速率，稳定经口摄入后的体内硒浓度的分布，从而减少药物的摄入剂量和频率，显著降低硒的毒性作用。有望广泛应用于关节软骨损伤性疾病及补硒治疗，具有巨大的应用潜力和社会价值。
[0060] 以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案
基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
