喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物和
应用
技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术领域，尤其是一种喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物、检测方法和应用。
背景技术
[0002] 抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)作为一种新型的污染物造成的健康危害已引起世界关注，前期研究表明ARGs广泛存在于各种环境介质中。随着抗生素的大量使用，ARGs在环境中日益增多，对生态环境以及人类的健康造成的威胁渐渐凸显。因此，准确快速地对ARGs进行检测显得很有必要。
[0003] 喹诺酮类抗生素抗性基因作为在环境介质中被广泛检测到的基因类型，目前主要采用可培养
微生物的方法研究耐药性，但是这些方法对不可培养微生物的耐药基因无法进行检测。
[0004] 目前，关于ARGs的检测主要依赖于实时
荧光定量PCR技术。虽然该方法能实现对ARGs的检测和定量，但该方法依赖于标准曲线、Ct值并且受扩增效率等影响，这样会导致测得的基因拷贝数与样品中的实际基因拷贝数存在偏差，从而加大了定量结果的偏差。
[0005] 微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)是近年来发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术，它的基本原理是利用微流控技术生成油包
水乳化微滴颗粒，以每个油包水小颗粒作为反应器，进行PCR扩增及荧光检测。实现理论上的单分子扩增，有PCR扩增荧光
信号记为1，无荧
光信号记为0，反应结果采用泊松概率分布公式对核酸分子进行绝对定量分析。相比之下，ddPCR具有灵敏度高、特异性强、
检测限度低、无需标准品不依赖于标准曲线、采用终点PCR信号计数检测、不依赖于Ct值等优点。
[0006] 通过检索，尚未发现与本发明
专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
[0007] 本发明目的在于克服
现有技术的不足之处，提供一种喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)ib-cr的特异性引物、检测方法和应用，该引物具有较高的特异性，检测方法的检测过程无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是可以直接读取DNA分子的拷贝数，大大简化操作步骤，该方法结果判读直观准确、精确度高、灵敏度高，重复性好，同时具有高效性，最低可检测21个拷贝数。
[0008] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009] 一种喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物，所述引物的核苷酸序列为：
[0010] F1：SEQ ID NO:1，即5’-GCTCTATGAGTGGCTAAATCGATC-3’；
[0011] R1：SEQ ID NO:2，即5’-GCAATGTATGGAGTGACGGAC-3’。
[0012] 如上所述的喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物在检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数方面中的应用。
[0013] 利用如上所述的特异性引物快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法，所述方法中使用到微滴数字PCR、待测样品DNA和引物。
[0014] 而且，所述方法包括如下步骤：
[0015] ⑴样品的采集及处理；
[0016] ⑵提取样品DNA的提取；
[0017] ⑶微滴数字PCR：使用微滴数字PCR进行PCR扩增，分别以提取的待检样品DNA和ddH2O为模板，与ddPCR Supermix、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀，将反应
混合液加入微滴发生器，进行微滴数字PCR，检测荧光信号；
[0018] ⑷结果的判断：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，记录每个样品里阳性微滴的比例，最后分析数据，并以多种方式显示检测结果；
[0019] 其中，每次检测均设立阴性对照，阴性对照为ddH2O。
[0020] 而且，所述步骤⑷中使用Quantasoft分析
软件记录每个样品里阳性微滴的比例，使用Quantasoft软件自动分析数据。
[0021] 而且，所述步骤⑶中微滴数字PCR的扩增反应体系总体积为20μL，具体为：
[0022] 10μL 2×ddPCR Supermix，0.2μM SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O余量；
[0023] 反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；40个循环；72℃，5s；4℃，5min；90℃，5min；4℃，Hold。升降温速率均为2℃/s。
[0024] 本发明取得的优点和积极效果为：
[0025] 1、本发明快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法的检测过程无需依靠标准曲线来测定核酸量，而是可以直接读取DNA分子的拷贝数，大大简化操作步骤，该方法结果判读直观准确、精确度高、灵敏度高，重复性好，同时具有高效性，最低可检测21个拷贝数。
[0026] 2、本发明针对喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性设计了一对引物，具有较高的特异性。
[0027] 3、本发明快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法中运用了ddPCR的方法，该ddPCR方法具有技术可靠、灵敏度高、特异性强、方便快捷等优点，可实现对aac(6’)-ib-cr抗生素抗性记基因基因的绝对定量，准确、高效、稳定。
附图说明
[0028] 图1为本发明中特异性分析结果图(注：1为环境样本；2为待测样本；3为阴性对照)；
[0029] 图2为本发明中阴性对照的样本分析结果图；
[0030] 图3为本发明中拷贝数为21的样本分析结果图；
[0031] 图4为本发明中拷贝数为31的样本分析结果图；
[0032] 图5为本发明中拷贝数为55的样本分析结果图；
[0033] 图6为本发明中拷贝数为295的样本分析结果图；
[0034] 图7为本发明中拷贝数为2570的样本分析结果图。
具体实施方式
[0035] 下面详细叙述本发明的
实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0036] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
[0037] 一种喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物，所述引物的核苷酸序列为：
[0038] F1：SEQ ID NO:1，即5’-GCTCTATGAGTGGCTAAATCGATC-3’；
[0039] R1：SEQ ID NO:2，即5’-GCAATGTATGGAGTGACGGAC-3’。
[0040] 如上所述的喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的特异性引物在检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数方面中的应用。
[0041] 利用如上所述的特异性引物快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法，所述方法中使用到微滴数字PCR、待测样品DNA和引物。
[0042] 较优地，所述方法包括如下步骤：
[0043] ⑴样品的采集及处理；
[0044] ⑵提取样品DNA的提取；
[0045] ⑶微滴数字PCR：使用微滴数字PCR进行PCR扩增，分别以提取的待检样品DNA和ddH2O为模板，与ddPCR Supermix、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀，将反应混合液加入微滴发生器，然后进行微滴数字PCR，检测荧光信号；
[0046] ⑷结果的判断：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，记录每个样品里阳性微滴的比例，最后分析数据，并以多种方式显示检测结果；
[0047] 其中，每次检测均设立阴性对照，阴性对照模板为ddH2O。
[0048] 较优地，所述步骤⑷中使用Quantasoft分析软件(美国Bio-Rad公司)记录每个样品里阳性微滴的比例，使用Quantasoft软件自动分析数据。
[0049] 较优地，所述步骤⑶中微滴数字PCR的扩增反应体系总体积为20μL，具体为：
[0050] 10μL 2×ddPCR Supermix，0.2μM SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O余量；
[0051] 反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；40个循环；72℃，5s；4℃，5min；90℃，5min；4℃，Hold。升降温速率均为2℃/s。
[0052] 具体地，相关制备实施例可以如下：
[0053] 实施例1：用于快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的引物设计[0054] 从NCBI中下载aac(6’)-ib-cr型喹诺酮类抗生素抗性基因序列，利用DNAMAN 8软件进行多序列比对，选择保守区域，并用Primer Premier5软件设计引物，序列如下：
[0055] F1：SEQ ID NO:1，即5’-GCTCTATGAGTGGCTAAATCGATC-3’；
[0056] R1：SEQ ID NO:2，即5’-GCAATGTATGGAGTGACGGAC-3’。
[0057] 实施例2：特异性分析
[0058] 分别以待测样品DNA(含aac(6’)-ib-cr基因的质粒)和样本DNA(含aac(6’)-ib-cr基因的混合基因样本)为模板，用实施例1中设计的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行定性PCR扩增。
[0059] 定性PCR反应体系总体积为20μL，包括模板3μL，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各1.5μL，Es Taq 10μL，ddH2O余量。反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；35个循环；72℃，5s；72℃，1min；4℃，Hold。
[0060] 扩增结束后，取4μL进行琼脂糖凝胶
电泳检测。在凝胶成像仪下观察凝胶上条带的情况，以已知的PCR产物标准DNA分子条带大小为基准，检测目的基因aac(6’)-ib-cr的存在，结果见图1。并将PCR产物进行测序，测序结果与目的基因在NCBI中进行比对，比对结果显示PCR产物与aac(6’)-ib-cr基因序列同源性为100％。
[0061] 实施例3：用于快速检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的ddPCR定量方法的建立
[0062] 本发明用于快速检测喹诺酮类检测抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法是一种基于ddPCR的方法，其中扩增反应体系总体积为20μL，包括：10μL 2×ddPCR Supermix，0.2μM SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O余量。
[0063] 反应程序为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；40个循环；72℃，5s；4℃，5min；90℃，5min；4℃，Hold。升降温速率均为2℃/s。
[0064] 实施例4：一种基于ddPCR技术对喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr的检测方法
[0065] (1)样品的采集及处理
[0066] (2)提取样品DNA：运用FastDNA Spin Kit for Soil
试剂盒提取
[0067] (3)ddPCR：利用上述检测喹诺酮类抗生素抗基因aac(6’)-ib-cr的方法，进行PCR扩增，分别以提取的待检样品DNA和ddH2O为模板，与ddPCR Supermix、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和ddH2O充分混匀至20μL，将反应混合液加入微滴发生器，然后进行微滴数字PCR，检测荧光信号。
[0068] (4)结果的判断：有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性，Quantasoft分析软件(美国Bio-Rad公司)记录每个样品里阳性微滴的比例，最后Quantasoft软件自动分析数据，并以多种方式显示检测结果。
[0069] 实施例5：灵敏度检测
[0070] 采用QX200型微滴式数字PCR系统，利用实施例1中的引物、实施例3、4中的方法对待测样品DNA进行检测，将待测样品DNA按照10倍浓度依次稀释，取梯度为10-4-10-10的基因序列进行检测，每个梯度设置三个重复，每个检测样本的微滴数均在10000以上。
[0071] 结果显示：待测样品DNA模板在稀释梯度为10-4-10-10的情况下，ddPCR反应都能有效地进行。根据微滴的生成数和有效微滴数和重复性结果显示，在DNA模板稀释梯度为10-6-10-10范围内，ddPCR的检测结果最佳。它们的拷贝数分别为2570copies/μL、295copies/μL、
55copies/μL、31copies/μL、21copies/μL。结果如图2至图7所示。
[0072] 本发明是一种基于ddPCR技术定量检测喹诺酮类抗生素抗性基因aac(6’)-ib-cr拷贝数的方法，其灵敏度高，重复性好，同时具有高效性。
[0073] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附
权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和
修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
