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一种基于甲 氧基聚乙二醇－聚乳酸的三元复合纳米体系及其应用

阅读：0发布：2021-03-20

专利汇可以提供一种基于甲氧基聚乙二醇－聚乳酸的三元复合纳米体系及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E 琥珀酸酯及其衍生物 /泊洛沙姆三元复合纳米体系，该纳米体系具有多样化结构，用于单载或多药共载各种类型疏水性及亲水性药物，粒径为50～100nm，载药量及包封率高。作为纳米体系通过EPR效应被动靶向而内吞入细胞，可以避免多药耐药蛋白对药物的外排，同时聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物与泊洛沙姆本身具有不同机制的抗多药耐药作用，因此，该纳米体系可实现多种不同的抗多药耐药机制互相补充，具有更好的抗多药耐药效果。，下面是一种基于甲氧基聚乙二醇－聚乳酸的三元复合纳米体系及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系的制备和应用，其特征在于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物和泊洛沙姆作为载体形成三元复合纳米体系，用于单载或多药共载各种类型疏水性及亲水性药物，将难溶性药物载于疏水双分子层或疏水内核，亲水性药物载于亲水内核。
2.根据权利要求书1所述的基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系，其特征在于聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物与泊洛沙姆的多药耐药机制互相补充，包载易被多药耐药蛋白排出的药物后可以实现更好的抗多药耐药效果。
3.根据权利要求书1所述的基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系的制备，其特征包括如下步骤：
工艺I：分别将甲氧基聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物、泊洛沙姆与水按重量比3～50∶1000的比例溶解，药物与溶剂按重量比1～50∶1000的比例溶解，药物与载体的重量比为1∶1～20，将药物溶液缓慢滴加到三元复合体系中，室温搅拌0.5～
2h，超声20～40min，透析8～72h，0.8μm微孔滤膜过滤，冻干得到基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系；
工艺II：分别将甲氧基聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物、泊洛沙姆与各自适宜的溶剂按重量比3～50∶1000的比例溶解，药物与溶剂按重量比1～50∶1000的比例溶解，药物与载体的重量比为1∶1～20，将药物溶液缓慢滴加到三元复合体系中，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥12～24h，加水剧烈搅拌2～4h，超声0.5～
2h后再搅拌2～4h，再超声清洗仪超声0.5～2h，0.8μm微孔滤膜过滤，冻干得到基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系。
4.根据权利要求书3所述的各自适宜的溶剂，其特征在于：对于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸选自二甲基甲酰胺、甲醇、二甲基亚砜和丙酮中的一种或者几种的混合溶剂，对于聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物选自甲醇和乙醇中的一种或者几种的混合溶剂，对于泊洛沙姆选自甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺中的一种或者几种的混合溶剂。
5.根据权利要求书1所述的基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系，其特征在于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物与泊洛沙姆的重量比为1～10∶1～5∶1～5。
6.根据权利要求书1所述的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸，其特征为亲水链甲氧基聚乙二醇占10％～40％及45％～70％的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸。
7.根据权利要求书1所述的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物，其特征为亲水链聚乙二醇占60％～90％的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物，选自聚乙二醇维生素E琥珀酸酯、乳糖酸共轭的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯、甘草次酸修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯与四臂聚乙二醇修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯。
8.根据权利要求书1所述的泊洛沙姆，其特征为亲水链聚氧乙烯占10％～80％的泊洛沙姆。
9.据权利要求书2所述的易被多药耐药蛋白排出的药物，其特征为难溶性药物包括：诺氟沙星、灯盏花素、小檗碱、野黄芩苷、氢氯噻嗪、地高辛、替米沙坦、乌苯美司、双环醇、西替利嗪、田蓟苷、兰索拉唑、阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、达卡巴嗪、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、7-羟基香豆素、补骨脂素、蛇床子素、鬼臼毒素、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、拓扑替康、伊立替康及其活性代谢物SN-38、紫杉醇、多西他赛、阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布、罗非昔布、姜黄素；水溶性药物包括：奥曲肽、龙胆苦苷、巴戟甲素、吉西他滨、奥沙利铂、盐酸阿霉素、盐酸博来霉素、盐酸伊立替康、盐酸阿糖胞苷。
10.根据权利要求书1所述的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸/聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物/泊洛沙姆三元复合纳米体系，其特征在于可应用于注射、口服和外用，剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、糖浆剂、颗粒剂、口服溶液剂、注射剂和软膏剂。

说明书全文

一种基于甲 氧基聚乙二醇-聚乳酸的三元复合纳米体系及其

应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物制剂领域，涉及一种基于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸的三元复合纳米体系及其应用。

背景技术

[0002] 多药耐药(Multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对此种化疗药物产生耐药性，而且可对其他结构和功能不同的多种化疗药物产生交叉耐药性。目前，多药耐药的发生不局限于肿瘤化疗药物，抗感染药物及多种口服药物同样存在MDR现象，这极大地降低了药物疗效。MDR产生的原因极为复杂，其中ABC(Adenosine triphosphate-binding cassette，ABC)膜转运泵的过表达是MDR产生的最重要原因，与MDR有关的ABC家族有48个成员，为了达到人类基因命名的标准，他们被细分为7个家族(A-G)，每个家族都被标记为ABC，然后是家族字母和数字，其中P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp/MDR1/ABCB1)、多药耐药相关蛋白家族(Multidrug Resistance-Associated Protein，MRPs/ABCC1)和乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein，BCRP/MXR/ABCP/ABCG2)因具有临床意义而最为重要，这些蛋白质的序列和功能具有同源性，均属于ATP结合盒蛋白质超家族，三者作为药物排出泵，通过膜包埋药物转运体增加药物外排，严重降低了细胞内化疗药物的浓度，使得药物达不到治疗剂量，从而使得细胞对多种药物产生耐药。

[0003] 克服MDR的常用方法是应用小分子抑制剂(如维拉帕米、右尼古地平和环丙基二苯并环庚烷类等)逆转，但由于其毒性较强及疗效低等原因，仅有少量可以用于临床试验，由于体内环境的多样性以及操作的复杂性，目前用于逆转MDR的免疫或基因等方法不能用于临床试验。研究表明，通过利用1～100nm的纳米药物递送系统改变细胞摄取的模式能够有效克服MDR，对于抗肿瘤药物而言，低分子量药物(＜1nm)通过易受药物排出泵影响的被动扩散方式而被内化到细胞内，易被药物外排泵排出，而纳米药物的分子量比低分子量药物大1～2个数量级，可以通过实体瘤的高通透性和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect，EPR)和内吞进入细胞，以此绕开药物外排泵，所以纳米药物的内吞和瘤内滞留不受肿瘤细胞MDR蛋白过度表达的负面影响。除此之外，某些类型的纳米载体，特别是普朗尼克(Pluronics)，具有固有的抗MDR性质，使其成为治疗肿瘤多药耐药的非常有前景的材料。对于口服药物而言，粒径小于100nm的纳米粒可以通过肠道细胞的内吞作用穿过黏液层并以完整的形式吸收入血，从而大大增加了药物的口服吸收效率。通过改变ABC转运蛋白引起的药物摄取和排出之间的平衡，使用纳米载体将提高药物疗效。为了增加药物的循环半衰期，纳米制剂通常用亲水性聚合物例如聚乙二醇包被，其减弱了网状内皮系统(Reticular endothelial system，RES)中巨噬细胞和单核细胞对纳米粒的摄取，从而进一步提高了肿瘤的有效靶向性。

[0004] 纳米制剂作为一种新型药物递送系统，可利用其独特的结构特征包载各种类型药物，如可实现对难溶性药物的增溶或对水溶性药物的高效荷载，亦可同时包载多种药物，有助于发挥多药协同作用；借助纳米粒内核包载不稳定药物，可以保护药物不被快速代谢为活性降低甚至失活的化合物，增加药物在体内的稳定性；与被动转运、主动转运和受体介导内吞等相比，纳米粒介导的内吞作用更高效、更具普适性；纳米制剂的纳米尺度使其具有不易被肾脏清除及RES消除的优势，可以实现长循环。粒子尺度对于药效具有重要影响，如口服吸收对粒径大小有一定要求，粒径小于100nm的纳米粒可以通过黏液层或以完整的形式通过肠道细胞的内吞作用被吸收。对于抗肿瘤药物而言，粒径小于10nm的颗粒比较容易被肾脏排泄，体内循环时间短，粒径＞100nm的颗粒会在肝脏积累，易导致肝毒性，且稳定性较差，药物释放速率较快，细胞内化能力较弱，体内循环时间短，肿瘤内穿透能力弱，所以粒径在10～100nm之间的纳米粒更易于借助EPR效应实现肿瘤被动靶向，提高抗癌药物在肿瘤部位的分布与滞留，进而增强抗肿瘤效果。此外，虽然亲水性药物不存在溶解性差的问题，但依然存在速释、全身毒性、靶向性差等问题，而纳米制剂也有望改善亲水性药物存在的这些问题。然而，一般纳米粒存在许多缺陷，如脂质体靶向性不足、载药量低、包封率低、稳定性低、制备工艺复杂；树枝状大分子的末端官能团反应不完全会导致下一级产物产生缺陷，而且随着分子的增大这种现象出现的机会也就越大；无机纳米材料存在稳定性差和生物相容性差的缺点。相对而言，聚合物纳米粒临界胶束浓度低、载药量高、包封率高且稳定性好，具有更好的应用前景。

[0005] 甲氧基聚乙二醇-聚乳酸(Methylol poly(ethylene glycol)-poly(lactide)，MPP)是一种可生物降解、生物相容性良好的两亲性嵌段聚合物，可通过自组装形成聚合物纳米粒，用于难溶性或水溶性药物的载体。MPP在溶液中可以自发形成胶束，亦可形成聚合物囊泡，其中决定性因素是亲水段在分子中所占的重量比(fOE)。当fOE为45％～70％时，易聚集成疏水核心而成实体球形聚合物胶束，可荷载难溶性药物；当fOE为10％～40％时，可形成壳型结构，即聚合物囊泡，可同时荷载水溶性和难溶性药物，应用非常广泛。另外，mPEG(Methylol poly(ethylene glycol))是亲水性、生物相容性、无毒性的，同时不产生免疫原反应。mPEG亲水外壳可以与水分子作用形成亲水性壳并在胶束之间提供足够的空间稳定性，提高药物在水中的溶解度，提高治疗效果。PEG(Poly(ethylene glycol))链有效阻止了调理素和细胞的相互作用，使他们不能被肝脾中RES识别和清除，从而避免被调理素吸附及被RES清除。PLA(Poly(lactide))为疏水端，其相对分子质量越大，聚集能力越强，临界胶束浓度越低，通过自组装形成的纳米粒的粒径越稳定。难溶性药物包载于疏水端PLA内核中，能够保护药物在血液循环中不被破坏，避免药物在血清中快速代谢，有助于增强药物的稳定性，延长血液循环时间。PLA在体内代谢为二氧化碳和水，已被美国FDA批准为控释型载体的疏水嵌段。然而，由一种聚合物组成的纳米粒存在稳定性差、粒径过大或过小、包封率及载药量较低等问题，且MPP单独使用不能有效抑制P-gp药物外排导致的多药耐药，从而使得药物治疗效果不佳，若增大给药剂量将导致更为严重的全身毒性。为了进一步改善上述问题，复合纳米体系应运而生。复合纳米体系是由两种及两种以上聚合物通过自组装形成的体系，很多研究者将MPP与另一种聚合物联合形成基于MPP的二元复合纳米体系用以解决MPP一元纳米体系存在的问题。然而，基于MPP的二元复合纳米体系存在以下局限性：(1)粒径过大。粒径过大的纳米粒易被肝脾截留，从而使得药效降低。对于口服药物而言，纳米粒粒径过大阻碍了肠道细胞对于纳米粒的内吞；对于抗肿瘤药物而言，纳米粒粒径过大难以通过EPR效应被动靶向于肿瘤部位，均不利于药物发挥其治疗效果。(2)药物速释。在MPP二元体系中，由于MPP与另一种聚合物之间的相互作用力往往较弱，使得纳米体系较为疏松，在制备过程及血液循环中载体中的药物容易释放，不利于其到达病灶处发挥治疗作用。(3)载药量和包封率不高。在MPP二元体系中，MPP与另一种聚合物之间较弱的作用力使得纳米体系较为疏松，同时，MPP和另一种聚合物与药物之间的作用力不强，使得MPP二元体系不能有效地包载药物。(4)抗多药耐药作用较弱。由于多药耐药机制复杂，仅利用一种聚合物的抗多药耐药机制往往无法高效抑制多药耐药问题，改善药物治疗效果的作用有限。(5)稳定性不高。由于组成MPP二元体系的聚合物之间的分子间作用力较弱，药物与载体之间的分子间作用力也较弱，使得载药后的MPP二元体系不够稳定，在储存过程及血液循环中容易发生解聚或聚集行为。

[0006] 因此，我们构建了基于MPP的三元复合纳米体系以解决上述问题，通过三元体系之间增强的分子间作用力，得到了粒径为50～100nm的纳米粒，提高了载药量与包封率，实现了药物控释，同时，通过三元复合纳米体系中聚合物之间不同抗多药耐药机制的相互补充，实现了理想的抗多药耐药效果。

[0007] 聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(Tocopheryl polyethylene glycol succinate，TPGS)是一种维生素E的水溶性衍生物，通过维生素E琥珀酸和聚乙二醇的酯化而成，具有亲脂性烷基尾部和亲水性极性头部组成的两亲性结构，被《美国药典》收载为药用辅料。而基于不同目的设计的TPGS衍生物在保留其原有功能的同时，还可赋予其增强或增加的更多功能，例如具有主动靶向作用的乳糖酸共轭的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(Lactobionic acid-conjugated D-α-Tocopheryl polyethylene glycol succinate，TLA)和甘草次酸修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(Glycyrrhetinic acid-modified D-α-tocopheryl polyethylene glycol succinate(TPGS)polymeric micelles(TGA PMs)，TGA)，以及能够改善纳米药物物理化学性质的四臂聚乙二醇修饰的聚乙二醇维生素E琥珀酸酯(Four arm polyethylene glycol-modified D-α-tocopheryl polyethylene glycol succinate，4-arm-PEG-TPGS)等。研究显示，TPGS及其衍生物(TPGS and its derivatives，TPGS-D)可以作用于线粒体，影响线粒体形态，干扰线粒体功能，抑制线粒体有氧呼吸，阻断P-gp外排泵的能量来源，使得ATP依赖的P-gp外排转运受到抑制。同时，TPGS-D可以通过抑制ATP酶活性抑制P-gp作用，逆转多药耐药。此外，TPGS-D能够通过调节细胞膜的流动性来抑制P-gp的功能，干扰质膜的微观环境，间接影响P-gp的外排作用，可以显著增加被包载药物的细胞粘附与细胞摄取，还可以提高溶解度及口服生物利用度。TPGS-D还可以作为复合纳米体系的一部分，具有自乳化功能，可以提高脂溶性药物的包封率，其生育酚酯的结构具有较好的抗氧化性，更有助于增加制剂的稳定性。此外，药物可以高效包载于含TPGS-D的复合纳米体系中，避免肾脏清除与RES消除。

[0008] 泊洛沙姆(Poloxamer，POL)为聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，这是一类新型的高分子非离子表面活性剂。POL可以耗竭细胞内ATP，抑制ATP与P-gp位点的结合，同时可以降低细胞膜微观黏度，干扰质膜的微观环境，间接影响P-gp的外排作用。此外，POL可以有效抑制MRPs与BCRP对药物的外排，增加药物在耐药细胞的摄取。然而，由于其自身较高的临界胶束浓度，由其自组装形成的胶束稳定性不足，且其对很多难溶性药物的增溶作用有限。

[0009] 针对上述问题，本发明结合以上三种聚合物各自的优势，采用透析法或薄膜水化法，通过多种复合机制组装得到基于MPP/TPGS-D/POL的三元复合纳米体系，用于单载或多药共载各种类型疏水性及亲水性药物。其优势在于：

[0010] (1)MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系具有多样化结构，解决了药物水溶性差及一般纳米粒只能荷载疏水性药物的问题。当fOE为45％～70％时，复合纳米体系易聚集成疏水核心而成实体球形聚合物胶束；当fOE为10％～40％时，复合纳米体系可形成壳型结构，即聚合物囊泡。因此，可通过调节fOE制备复合聚合物胶束，用于荷载疏水性药物，MPP/TPGS-D/POL能够将难溶性药物包载于疏水层，增加了难溶性药物的水溶性；或者制备复合聚合物囊泡用于包裹亲水性药物，亦可借助复合聚合物囊泡结构，将难溶性药物和亲水性药物分别包载于疏水层和亲水层，同时荷载亲水性和疏水性药物，实现不同性质药物高效共载，与一般纳米粒载药相比，分别在纳米粒不同部位载药，载药量更高，同时，共载药物可实现对同一靶部位的共递送，进而显著提高治疗效果，减少用药剂量。

[0011] (2)本发明将MPP与具有抑制多药耐药功能的TPGS-D和POL联合，使得复合纳米体系增加了抑制多药耐药的功能，增加药物的细胞粘附与细胞摄取。且TPGS-D和POL抑制多药耐药的机制不同：TPGS-D可以阻断P-gp外排泵的能量来源，抑制ATP酶活性，使得ATP依赖的P-gp外排转运受到抑制，还可以通过调节细胞膜的流动性来抑制P-gp的功能，干扰质膜的微观环境，间接影响P-gp的外排作用；POL可以耗竭细胞内ATP，同时可以降低细胞膜微观黏度，干扰质膜的微观环境，间接影响P-gp的外排作用，此外，POL还可以有效抑制MRPs与BCRP的外排作用，两者可以互为补充。对于口服吸收而言，纳米药物在肠细胞中的内吞机制是以能量依赖的小窝蛋白介导的内吞和非网格蛋白及非小窝蛋白介导的内吞作用，肠腔外排转运体P-gp是限制药物口服生物利用度的主要因素，通过联合TPGS-D和POL以增加药物的小肠渗透性对于提高药物的口服生物利用度具有重要意义。MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系能够抑制药物的释放，且可以避免药物被识别，降低与P-gp的相互作用，增加药物的膜渗透性。多药耐药是抗感染药物治疗和肿瘤化疗失败的主要原因，这一结合有助于增强药物疗效，同时可以降低给药剂量及给药次数，从而降低药物产生的全身毒性。

[0012] (3)MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的载药量高，包封率特别高。TPGS-D与药物分子间具有π-π作用，POL与药物分子间具有氢键作用，MPP、TPGS-D和POL与药物分子间具有疏水作用及范德华力作用，因此，三种聚合物与药物分子间的作用力能够互为补充，从而产生更强的作用力，显著增加纳米粒的载药量。TPGS-D作为复合纳米体系的一部分，具有自乳化功能，可以提高脂溶性药物的包封率，有利于纳米粒发挥更好的治疗效果。此外，相对于MPP一元或二元体系，MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系分子间增强的作用力有利于降低纳米粒的粒径，得到粒径为50～100nm的复合纳米体系。粒径尺度对于药效具有重要影响，粒径小于100nm的纳米粒可以通过黏液层或以完整的形式通过肠道细胞的内吞作用被吸收，从而有利于口服吸收。对于抗肿瘤药物而言，粒径在10～100nm之间的纳米粒易于通过EPR效应实现肿瘤被动靶向，其体内循环时间长，肿瘤内穿透能力强，从而降低药物对正常组织和器官的毒性。

[0013] (4)MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系可以实现药物控释。在mPEG分子量一定时，MPP分子量越高，纳米粒的疏水性越强，降解速率减小，释药速率相应变慢。TPGS-D作为载体基质可以调控释药速率，由于形成的纳米粒粒径小且TPGS-D更加亲水，TPGS-D在水溶液中更易溶解，纳米粒降解更快，故纳米粒释药速率较MPP纳米粒快，这可改善MPP纳米粒释药速率慢以致不能达到治疗血药浓度的缺点。POL作为亲水性添加剂，依靠其亲水性、可溶性和聚合物发生交互作用，从而引起药物释放机理的显著改变，达到增加药物释放的目的，且释放速率较恒定，具有明显的控释效果。因此，可以通过控制三种聚合物的比例实现药物控释。

[0014] (5)本发明解决了药物水溶性差及稳定性差等问题。MPP/TPGS-D/POL能够将难溶性药物包载于疏水层，增加了难溶性药物的水溶性。MPP的PEG链有效阻止了胶束与调理素的相互作用，使他们不能被肝脾中RES识别和清除，从而避免被调理素吸附及被RES清除。同时，包载于聚合物胶束或聚合物囊泡中的治疗药物在血液循环中不被代谢为活性降低或失活的化合物，能够很好地保持药物的稳定性。尽管亲水性药物不存在溶解性差的问题，但全身毒性、速释、靶向性差等问题依然存在。复合聚合物囊泡可以保护水溶性药物在血液循环中不被代谢为活性降低或失活的化合物，同时不被调理素吸附及肝脾中RES识别清除，从而保持药物的稳定性。

[0015] (6)本发明通过采用透析法或薄膜水化法制备三元复合纳米体系，避免了化学反应带来的药物失活等问题，能够保护载体及药物原有的结构及功能。同时，本发明给药时避免了有机溶剂的使用，可以避免过敏反应的发生。此外，本发明制备工艺简单，重现性好，适合工业化生产。

[0016] (7)本发明得到的三元复合体系可用作注射、口服、外用等多种给药剂型，具有很好的应用前景。

发明内容

[0017] 本发明的目的之一是以MPP聚合物纳米粒为基础，联合TPGS-D和POL，得到粒径为50～100nm、分布均匀、载药量及包封率高的三元复合纳米体系，其可包载疏水性或亲水性药物，实现多种药物的共同给药。当fOE为45％～70％时，复合纳米体系为聚合物胶束，可同时包载多种疏水性药物；当fOE为10％～40％时，复合纳米体系为聚合物囊泡，可同时包载多种亲水性及疏水性药物。

[0018] 本发明还有一个目的是以MPP聚合物纳米粒为基础，联合TPGS-D和POL，得到基于MPP/TPGS-D/POL的三元复合纳米体系。TPGS-D和POL能够通过不同机制联合抑制P-gp介导的多药耐药，显著增加被包载药物的细胞粘附与细胞摄取。由于三者之间较强的分子间作用力，可以优化纳米粒的粒径，提高纳米粒的载药量及包封率，使其更利于口服吸收及肿瘤被动靶向，并实现药物控释。MPP能够使被包载药物不被调理素吸附及被RES清除，同时不被血清代谢清除，保护药物在血液循环中的稳定性。由于一种疾病可能涉及多条信号通路，MPP/TPGS-D/POL同时对多种药物的包载可以实现疾病多机制治疗，发挥协同作用，从而达到更好的治疗效果。

[0019] 本发明还有一目的是提供上述MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的制备方法。

[0020] 本发明的最后一个目的是提供上述MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系在疾病治疗中的应用。

[0021] 为了达到上述目的，本发明提供了一种基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。通过透析法或薄膜水化法，装载疏水性及亲水性治疗药物，形成集多机制于一体的纳米复合体系；装载不同机制治疗药物的纳米复合体系之间还能灵活组合，实现多种药物在疾病治疗中的逐级联用策略，以实现更好的抗多药耐药效果。MPP/TPGS-D/POL纳米复合体系制备工艺简单，重现性高。粒径大小适宜，具有较长的体内循环时间，对于抗肿瘤药物而言，肿瘤组织渗透能力较好，能够充分利用EPR效应蓄积于肿瘤组织，提高抗肿瘤疗效；对于口服吸收而言，粒径小于100nm的纳米粒可以通过黏液层或以完整的形式通过肠道细胞的内吞作用，从而有利于口服吸收。药物和载体之间借助多种分子间作用力紧密结合，可以有效包载疏水及亲水性药物，载药量高，包封率特别高，从而可以减少用药剂量，减轻药物对正常组织的毒副作用。

[0022] 该基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的制备方法有两种：(1)可先将MPP、TPGS-D和POL分别与水按一定比例混合，再加入疏水及亲水性药物溶液，充分混合，经超声处理，透析法除去有机溶剂，即制得基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。(2)分别将MPP、TPGS-D和POL与各自适宜的溶剂按一定比例混合，再加入疏水及亲水性药物溶液，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥，加水剧烈搅拌，超声后再搅拌，再超声后过膜，即制得基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。

[0023] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，其中MPP为亲水链mPEG占10％～40％及45％～70％的MPP。

[0024] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，其中TPGS-D为亲水链PEG占60％～90％的TPGS-D，选自TPGS、TLA、TGA和4-arm-PEG-TPGS。

[0025] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，其中POL为亲水链聚氧乙烯占10％～80％的POL。

[0026] 所述的MPP、TPGS-D和POL按照重量比为1～10∶1～5∶1～5的比例混合。

[0027] 所述的各自适宜的溶剂，对于甲氧基聚乙二醇-聚乳酸选自二甲基甲酰胺、甲醇、二甲基亚砜和丙酮中的一种或者几种的混合溶剂，对于聚乙二醇维生素E琥珀酸酯及其衍生物选自甲醇和乙醇中的一种或者几种的混合溶剂，对于泊洛沙姆选自甲醇、乙醇和二甲基甲酰胺中的一种或者几种的混合溶剂。

[0028] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，其中亲水性药物选自奥曲肽、龙胆苦苷、巴戟甲素、吉西他滨、奥沙利铂、盐酸阿霉素、盐酸博来霉素、盐酸伊立替康、盐酸阿糖胞苷。

[0029] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，其中疏水性药物选自诺氟沙星、灯盏花素、小檗碱、野黄芩苷、氢氯噻嗪、地高辛、替米沙坦、乌苯美司、双环醇、西替利嗪、田蓟苷、兰索拉唑、阿霉素、表阿霉素、米托蒽醌、达卡巴嗪、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、7-羟基香豆素、补骨脂素、蛇床子素、鬼臼毒素、喜树碱、羟基喜树碱、依托泊苷、拓扑替康、伊立替康及其活性代谢物SN-38、紫杉醇、多西他赛、阿司匹林、双氯芬酸、吲哚美辛、萘普生、布洛芬、美洛昔康、塞来昔布、罗非昔布、姜黄素。

[0030] 具体方案如下：

[0031] 将MPP、TPGS-D和POL以及疏水性及亲水性药物通过透析法或薄膜水化法制得基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。该基于MPP/TPGS-D/POL纳米复合体系的粒径为50～100nm，具有较长的体内循环时间，对于抗肿瘤药物而言，肿瘤组织渗透能力较好，能够充分利用EPR效应蓄积于肿瘤组织，提高抗肿瘤疗效；对于口服吸收而言，粒径小于100nm的纳米粒可以通过黏液层或以完整的形式通过肠道细胞的内吞作用被吸收。MPP/TPGS-D/POL表面光滑，均匀度好，再分散性好。药物和载体之间借助多种分子间作用力紧密结合，可以有效包载疏水及亲水性药物，载药量高，包封率特别高，可达到95％以上，从而可以减少用药剂量，减轻药物对正常组织的毒副作用，增加药物疗效。由mPEG与水分子作用形成的亲水性壳可以提高难溶性药物在水中的溶解度。PEG链有效阻止了胶束与调理素的相互作用，使他们不能被肝脾中RES识别和清除，从而避免被调理素吸附及被RES清除，延长药物体内循环时间，增加药物在治疗部位的蓄积。难溶性药物包载于疏水端PLA内核中，能够保护药物在血液循环中不被破坏，避免药物在血清中快速代谢，有助于增强药物的稳定性，避免药物降解失活，延长血液循环时间。TPGS-D和POL可以通过不同机制联合抑制P-gp介导的多药耐药，能够增强药物在细胞膜的通透性，增强药物吸收，从而显著增加被包载药物的细胞粘附与细胞摄取。MPP/TPGS-D/POL可通过控制MPP、TPGS-D与POL的比例来控制药物释放速率，实现药物控释。该基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系单独或与药剂学可接受辅料配伍用于注射、口服、外用等。

[0032] 所述的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的具体制备方法如下：

[0033] 工艺I：分别将MPP、TPGS-D、POL与水按重量比3～50∶1000的比例溶解，药物与溶剂按重量比1～50∶1000的比例溶解，药物与MPP/TPGS-D/POL重量比为1∶1～20，将药物溶液缓慢滴加到MPP/TPGS-D/POL溶液中，室温搅拌0.5～2h，超声20～40min，透析8～72h，0.8μm微孔滤膜过滤，即得基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。

[0034] 工艺II：分别将MPP、TPGS-D、POL与各自适宜的溶剂按重量比3～50∶1000的比例溶解，药物与溶剂按重量比1～50∶1000的比例溶解，药物与MPP/TPGS-D/POL重量比为1∶1～20，将药物溶液缓慢滴加到MPP/TPGS-D/POL溶液中，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥12～24h，加水剧烈搅拌2～4h，超声0.5～2h后再搅拌2～4h，再超声清洗仪超声0.5～2h，0.8μm微孔滤膜过滤，即制得基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系。

[0035] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0036] (1)MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系结构具有多样性，fOE为45％～70％时，易聚集成疏水核心而成实体球形聚合物胶束，同时包载多种疏水性药物，fOE为10％～40％时，可形成聚合物囊泡，同时包载多种疏水性及亲水性药物，用于联合治疗，发挥协同作用，提高药物疗效。

[0037] (2)TPGS-D和POL可以阻断P-gp外排泵的能量来源，使得ATP依赖的P-gp外排转运受到抑制，还可以通过调节细胞膜的流动性来抑制P-gp的功能，干扰质膜的微观环境，间接影响P-gp的外排作用。同时，TPGS-D可以通过抑制ATP酶活性抑制P-gp的外排作用，POL可以有效抑制MRPs与BCRP的外排作用，两者可以通过不同机制联合抑制P-gp介导的多药耐药，从而显著增加被包载药物的细胞粘附与细胞摄取。

[0038] (3)本发明针对现有纳米制剂普遍存在的粒径不适宜、载药量低及包封率低的问题，采用与TPGS-D和POL联合组装的方法，通过多种分子间作用力优化纳米粒粒径，得到粒径为50～100nm的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，同时可提高载药量。TPGS-D作为复合纳米体系的一部分，具有自乳化功能，可以提高脂溶性药物的包封率至95％以上，从而可以降低给药剂量，减轻药物毒副作用，提高药物疗效。

[0039] (4)PEG链有效阻止了胶束与调理素的相互作用，从而避免被RES清除，延长药物体内循环时间，增加药物在治疗部位的蓄积。疏水端PLA内核能够保护药物在血液循环中不被破坏，有助于增强药物的稳定性，延长血液循环时间。

[0040] (5)本发明因形成三元复合纳米体系，解决了体内分布性及药物毒性问题。如抗肿瘤药物包载于粒径50～100nm的复合纳米体系中，可以借助EPR效应靶向肿瘤部位，降低药物对正常组织和器官的毒性，同时增加药物疗效；粒径小于100nm的纳米粒可以通过黏液层或以完整的形式通过肠道细胞的内吞作用，增加口服吸收，从而增加药物的生物利用度。

[0041] (6)本发明可通过控制MPP、TPGS-D与POL的比例来控制药物释放速率，实现药物控释。在mPEG分子量一定时，MPP分子量越高，释药速率越慢；由TPGS-D形成的纳米粒粒径小且TPGS-D更加亲水，纳米粒降解更快，因此释药速度快；POL作为亲水性添加剂，依靠其亲水性、可溶性和聚合物发生交互作用，能够达到增加药物释放的目的。因此，可以通过调节三种聚合物的比例实现药物控释作用。

[0042] (7)本发明提供的基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系，具有良好的生物相容性和生物可降解性，大大降低了载体本身对于患者的毒性作用，提高了用药安全性。同时，因亲水性纳米复合体系给药时不需采用有机溶剂，降低了毒性且不易引起过敏反应，从而增加了患者依从性。

[0043] (8)该基于MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系单独或与药剂学可接受辅料配伍用于注射、口服、外用，具有良好的应用前景。

具体实施方式

[0044] 下面通过实施例对本发明加以进一步的说明，但下述实施例并不限制本专利的权利范围。

[0045] 实施例1：MPP/TPGS/POL124三元复合纳米体系的制备

[0046] 工艺I：称取适量MPP、TPGS、POL124分别溶于水，MPP、TPGS与POL124总重量与水重量的比为3∶1000，MPP、TPGS与POL124的重量比为2∶1∶1，搅拌1h，超声30min，透析24h，0.8μm微孔滤膜过滤，即得基于MPP/TPGS/POL124三元复合纳米体系。

[0047] 工艺II：称取适量MPP、TPGS、POL124分别溶于丙酮、甲醇与甲醇，MPP与丙酮的重量比为6∶1000，TPGS与甲醇的重量比为3∶1000，POL124与甲醇的重量比为3∶1000，MPP、TPGS与POL124的重量比为2∶1∶1，旋转蒸发除去丙酮与甲醇，成膜后真空干燥12h，加水剧烈搅拌2h，超声0.5h后再搅拌2h，再超声清洗仪超声0.5h，0.8μm微孔滤膜过滤，即制得基于MPP/TPGS/POL124三元复合纳米体系。

[0048] 实施例2：载吲哚美辛的MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185三元复合纳米体系的制备[0049] 工艺I：称取适量MPP、4-arm-PEG-TPGS、POL185分别溶于水，MPP、4-arm-PEG-TPGS和POL185总重量与水重量的比为30∶1000，MPP、4-arm-PEG-TPGS与POL185的重量比为5∶2∶1，称取适量吲哚美辛溶于乙醇，吲哚美辛与乙醇的重量比为15∶1000，吲哚美辛与MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185的重量比为3∶20，将吲哚美辛溶液缓慢滴加到MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185溶液中，室温搅拌2h，超声30min，透析24h，0.8μm微孔滤膜过滤，即得载吲哚美辛的MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185三元复合纳米体系。

[0050] 工艺II：称取适量MPP、4-arm-PEG-TPGS、POL185分别溶于二甲基甲酰胺、乙醇与乙醇，MPP与二甲基甲酰胺的重量比为10∶1000，4-arm-PEG-TPGS与乙醇的重量比为5∶1000，POL185与乙醇的重量比为15∶1000，MPP、4-arm-PEG-TPGS与POL185的重量比为5∶2∶1，称取适量吲哚美辛溶于乙醇，吲哚美辛与乙醇的重量比为15∶1000，吲哚美辛与MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185的质量比为3∶20，将吲哚美辛溶液缓慢滴加到MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185溶液中，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥24h，加水剧烈搅拌2h，超声1h后再搅拌2h，再超声清洗仪超声1h，0.8μm微孔滤膜过滤，即制得载吲哚美辛的MPP/4-arm-PEG-TPGS/POL185三元复合纳米体系。

[0051] 实施例3：载兰索拉唑、奥曲肽的MPP/TLA/POL238三元复合纳米体系的制备[0052] 工艺I：称取适量MPP、TLA、POL238分别溶于水，MPP、TLA和POL238总重量与水重量的比为50∶1000，MPP、TLA与POL238的重量比为10∶3∶4，称取适量兰索拉唑溶于二甲基甲酰胺，称取适量奥曲肽溶于水，兰索拉唑与二甲基甲酰胺的重量比为20∶1000，奥曲肽与水的重量比为15∶1000，兰索拉唑与奥曲肽的重量比为1∶1，兰索拉唑和奥曲肽的总重量与MPP/TLA/POL238的重量比为1∶3，将兰索拉唑、奥曲肽溶液缓慢滴加到MPP/TLA/POL238溶液中，室温搅拌2h，超声40min，透析12h，0.8μm微孔滤膜过滤，即得载兰索拉唑与奥曲肽的MPP/TLA/POL238纳米复合体系。

[0053] 工艺II：称取适量MPP、TLA、POL238分别溶于甲醇、乙醇与二甲基甲酰胺，MPP与甲醇的重量比为20∶1000，TLA与乙醇的重量比为10∶1000，POL238与二甲基甲酰胺的重量比为20∶1000，MPP、TLA与POL238的重量比为2∶1∶2，称取适量兰索拉唑溶于二甲基甲酰胺，称取适量奥曲肽溶于水，兰索拉唑与二甲基甲酰胺的重量比为20∶1000，奥曲肽与水的重量比为
15∶1000，兰索拉唑与奥曲肽的重量比为1∶1，兰索拉唑和奥曲肽与MPP/TLA/POL238的质量比为1∶3，将兰索拉唑、奥曲肽溶液缓慢滴加到MPP/TLA/POL238溶液中，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥12h，加水剧烈搅拌2h，超声1h后再搅拌2h，再超声清洗仪超声0.5h，0.8μm微孔滤膜过滤，即制得载兰索拉唑与奥曲肽的MPP/TLA/POL238三元复合纳米体系。

[0054] 实施例4：载氢氯噻嗪、地高辛与替米沙坦的MPP/TGA/POL407三元复合纳米体系的制备

[0055] 工艺I：称取适量MPP、TGA、POL407分别溶于水，MPP、TGA和POL407总重量与水重量的比为20∶1000，MPP、TGA与POL407的重量比为15∶10∶9，称取适量氢氯噻嗪溶于丙酮，称取适量地高辛溶于乙醇，称取适量替米沙坦溶于二甲基甲酰胺，氢氯噻嗪与丙酮的重量比为10∶1000，地高辛与乙醇的重量比为15∶1000，替米沙坦与二甲基甲酰胺的重量比为10∶
1000，氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的重量比为2∶3∶2，氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的总重量与MPP/TGA/POL407的重量比为5∶9，将氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦溶液缓慢滴加到MPP/TGA/POL407溶液中，室温搅拌2h，超声20min，透析12h，0.8μm微孔滤膜过滤，即得载氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的MPP/TGA/POL407纳米复合体系。

[0056] 工艺II：称取适量MPP、TGA、POL407分别溶于二甲基亚砜、甲醇与乙醇，MPP与二甲基亚砜的重量比为10∶1000，TGA与甲醇的重量比为10∶1000，POL407与乙醇的重量比为10∶1000，MPP、TGA与POL407的重量比为15∶10∶9，称取适量氢氯噻嗪溶于丙酮，称取适量地高辛溶于乙醇，称取适量替米沙坦溶于二甲基甲酰胺，氢氯噻嗪与丙酮的重量比为10∶1000，地高辛与乙醇的重量比为10∶1000，替米沙坦与二甲基甲酰胺的重量比为10∶1000，氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的重量比为2∶3∶2，氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的总重量与MPP/TGA/POL407的重量比为5∶9，将氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦溶液缓慢滴加到MPP/TGA/POL407溶液中，充分混合，旋转蒸发除去有机溶剂，成膜后真空干燥12h，加水剧烈搅拌3h，超声0.5h后再搅拌3h，再超声清洗仪超声1h，0.8μm微孔滤膜过滤，即制得载氢氯噻嗪、地高辛和替米沙坦的MPP/TGA/POL407三元复合纳米体系。

[0057] 实施例5：载阿霉素的MPP、MPP/TLA与MPP/TLA/POL183纳米粒体外释药研究[0058] 将一定量的载阿霉素的MPP、MPP/TLA与MPP/TLA/POL183纳米粒溶于3mL PBS后置于透析袋(MWCO＝3500)中，置于盛有20mL PBS缓冲液的烧杯中，37℃、3000rpm恒速搅拌，定时从烧杯中取样3mL，同时补加相同体积的PBS缓冲液，以PBS缓冲液为参比，通过HPLC检测阿霉素的浓度，根据标准曲线计算不同时间点取样的药物浓度，再根据公式(1)计算出10h累积释药百分率。

[0059]

[0060] 表1 10h时不同体系中阿霉素累积释放情况

[0061]

[0062] 结果表明，载阿霉素的MPP/TLA/POL183组释放最为缓慢，载阿霉素的MPP/TLA组次之，载阿霉素的MPP组释放最快。

[0063] 实施例6：载药的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的放置稳定性

[0064] 分别制备包载西替利嗪、兰索拉唑与奥曲肽、姜黄素与紫杉醇的MPP/TLA/POL235、MPP/TGA/POL335、MPP/TPGS/POL333三元复合纳米体系，复溶使成浓度为1mg/mL的纳米药物溶液，室温密闭放置，于0、24h测定聚合物纳米药物溶液的粒径和多分散系数(PDI)，以此评价载药后的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系在溶液状态下的放置稳定性。载药后的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系在室温下保存的稳定性良好。

[0065] 表2载药后的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的放置稳定性

[0066]

[0067] 实施例7：载紫杉醇、吉西他滨的纳米体系的放置稳定性

[0068] 分别制备包载紫杉醇、吉西他滨的MPP、MPP/TLA、MPP/TLA/POL288的纳米体系，复溶使成浓度为1mg/mL的纳米药物溶液，室温密闭放置，于0、24h测定聚合物纳米药物溶液的粒径和多分散系数(PDI)，以此评价载药后的纳米体系在溶液状态下的放置稳定性。载药后的MPP/TLA/POL288纳米体系在室温下保存的稳定性最好。

[0069] 表3载紫杉醇和吉西他滨后的纳米体系的放置稳定性

[0070]

[0071] 实施例8：MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的载药量和包封率

[0072] 载药量检测方法：采用高效液相色谱法，对含有共轭结构的治疗药物在其最大吸收波长处绘制峰面积对浓度的标准曲线。对载药后的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系在上述最大吸收波长处测得峰面积，再按照标准曲线计算浓度，并以公式(2)计算载药量，以公式(3)计算包封率。

[0073]

[0074]

[0075] 表4 MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的载药量和包封率

[0076]

[0077] 实施例9：MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的溶解度

[0078] 考察溶解度的方法：分别称取1mg治疗药物和装载了治疗药物的三元复合体系，溶解在1mL水中。室温下每隔5min振荡30s，观察30min内是否能完全溶解。将治疗药物包载入三元复合体系之后，其在水中的溶解性显著改善。

[0079] 表5药物及载药的MPP/TPGS-D/POL三元复合纳米体系的溶解度

[0080]

[0081] 注：“-”几乎不溶，“++”易溶。

[0082] 实施例10：MTT法检测不同体系对HepG2/ADR细胞的抑制作用

[0083] 取HepG2/ADR以1.5×103/孔接种于96孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入含不同浓度的奥沙利铂、载奥沙利铂的MPP、载奥沙利铂的MPP/TPGS及载奥沙利铂的MPP/TPGS/POL184溶液200μL，37℃孵育48h后，加入20μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，2.5mg/mL)，继续孵育4h，吸去各孔培养基，加入150μL二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解，自动酶标仪上于570nm测定各孔的光吸收值(OD值)。并以相同方法测定空白组OD值以及对照组OD值，n＝6。按公式(4)计算受试细胞存活率，并以存活率结果计算不同体系对HepG2/ADR细胞的半数抑制率IC50。

[0084]

[0085] 表6不同体系对HepG2/ADR细胞的抑制活性

[0086]

[0087] 结果表明，载奥沙利铂的MPP/TPGS/POL184组对肿瘤有最强的肿瘤抑制作用，载奥沙利铂的MPP/TPGS组次之。游离奥沙利铂组肿瘤抑制作用最弱。由于多药耐药蛋白对药物的外排作用使得游离奥沙利铂组对肿瘤细胞的抑制作用最弱。

[0088] 实施例11：MTT法检测不同体系对人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR细胞的抑制作用

[0089] 取MCF-7/ADR以1.5×103/孔接种于96孔板中，37℃孵育24h，吸去培养液，分别加入含不同浓度的阿霉素、载阿霉素的MPP、载阿霉素的MPP/TLA及载阿霉素的MPP/TLA/POL188溶液200μL，37℃孵育48h后，加入20μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，2.5mg/mL)，继续孵育4h；吸去各孔培养基，加入150μL二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解，自动酶标仪上于
570nm测定各孔的光吸收值(OD值)。并以相同方法测定空白组OD值以及对照组OD值，n＝6。
按公式(5)计算受试细胞存活率，并以存活率结果计算不同体系对MCF-7/ADR细胞的半数抑制率IC50。

[0090]

[0091] 表7不同体系对MCF-7/ADR细胞的抑制活性

[0092]

[0093] 结果表明，载阿霉素的MPP/TLA/POL188组对肿瘤有最强的肿瘤抑制作用，载阿霉素的MPP/TLA组次之。游离阿霉素组抑制作用最弱。

[0094] 实施例12：MTT法检测不同体系抗多药耐药效果

[0095] 取对数生长期的MCF-7/ADR，胰酶消化后制成单细胞悬液，计数并调节细胞密度为1.5×103/孔接种于96孔板中，37℃孵育过夜，吸去培养液，分别加入6种不同浓度的MPP、MPP/TPGS与MPP/TPGS/POL407、MPP/TPGS/POL338水溶液200μL，37℃、5％CO2的条件下培养
72h，每个剂量组设6个复孔。72h后取出，细胞洗3次后，每孔加20μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，
2.5mg/mL)，继续培养4h，加入150μL二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解，自动酶标仪上于570nm测定各孔的光吸收值(OD值)。并以相同方法测定空白组OD值以及对照组OD值。实验重复三次。

[0096] 分别选定对MCF-7/ADR没有明显地杀伤作用的MPP、MPP/TPGS与MPP/TPGS/POL407、MPP/TPGS/POL338的浓度作为逆转其多药耐药研究的浓度，将MCF-7/ADR细胞悬液按密度为1.5×103/mL接种于96孔板中，贴壁后一组分别加入不同浓度的阿霉素溶液和选定的MPP、MPP/TPGS与MPP/TPGS/POL407纳米粒，另一组分别加入不同浓度的紫杉醇溶液和选定的MPP、MPP/TPGS与MPP/TPGS/POL338纳米粒，每孔终体积为200μL。设阴性对照孔(细胞+培养基)、空白对照孔(只有培养基)和实验孔。放入37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养72h后取出，细胞洗涤3次后，每孔加入20μL四甲基偶氮唑蓝(MTT，2.5mg/mL)，继续培养4h，加入150μL二甲基亚砜，振摇10min使结晶充分溶解，自动酶标仪上于570nm测定各孔的光吸收值(OD值)。实验重复三次。

[0097]

[0098] 表8不同体系对MCF-7/ADR细胞的逆转倍数

[0099]

[0100] 结果表明，第一组中载阿霉素的MPP/TPGS/POL407组相对于游离阿霉素组的逆转倍数最大，载阿霉素的MPP/TPGS组次之，载阿霉素的MPP组的逆转倍数最小。第二组中载紫杉醇的MPP/TPGS/POL338组相对于游离紫杉醇组的逆转倍数最大，载紫杉醇的MPP/TPGS组次之，载紫杉醇的MPP组的逆转倍数最小。

[0101] 实施例13：流式细胞术观察MCF-7/ADR细胞内阿霉素含量的变化

[0102] 取对数生长期的MCF-7/ADR细胞接种于小皿中，培养12h贴壁后分别加入3种不同浓度的阿霉素溶液于耐药细胞株MCF-7/ADR中孵育24h，对照组细胞中分别加入相应浓度的载阿霉素的MPP、载阿霉素的MPP/TLA、载阿霉素的MPP/TLA/POL184共同于MCF-7/ADR中孵育，37℃、5％CO2的条件下培养24h后终止摄取，采用流式细胞仪测定细胞内阿霉素的红色荧光强度，从而了解载阿霉素的MPP、载阿霉素的MPP/TLA、载阿霉素的MPP/TLA/POL184纳米粒对MCF-7/ADR摄取阿霉素的影响。

[0103] 表9 MCF-7/ADR细胞中的阿霉素荧光强度

[0104]

[0105] 结果表明，载阿霉素的MPP/TLA/POL184组孵育的MCF-7/ADR中阿霉素含量最高，载阿霉素的MPP/TLA组次之，游离阿霉素组通过被动扩散方式而被内化到细胞内，易被药物排出泵泵出细胞外。

[0106] 实施例14：细胞摄取观察奥沙利铂耐药细胞系SW480/L-OHP细胞内奥沙利铂含量的变化

[0107] 将SW480/L-OHP细胞(3×105/mL)提前铺于12孔板中，细胞贴壁后，除去培养基，分别向各孔中加入10μg/mL的游离奥沙利铂、载奥沙利铂的MPP、载奥沙利铂的MPP/TGA和载奥沙利铂的MPP/TGA/POL237培养液，培养1h，PBS洗三次，4％PFA固定10min，PBS洗三次，加入0.2％Triton X-100室温处理20min，PBS洗三次，将盖玻片移至载玻片上后封片，采用共聚焦显微镜观察，采用HPLC定量。

[0108] 表10 SW480/L-OHP细胞中的奥沙利铂浓度

[0109]

[0110] 结果表明，载奥沙利铂的MPP/TGA/POL237组孵育的MCF-7/ADR中奥沙利铂含量最高，载奥沙利铂的MPP/TGA组次之，游离奥沙利铂组通过被动扩散方式而被内化到细胞内，易被药物排出泵泵出细胞外。

[0111] 实施例15：Western blotting方法检测多药耐药蛋白的表达

[0112] 1.蛋白提取

[0113] 将人结肠癌羟基喜树碱耐药细胞株SW1116/HCPT分别按不同的细胞密度接种到培养皿中，以相同浓度(以纳米粒的浓度计算)的羟基喜树碱、载羟基喜树碱的MPP、载羟基喜树碱的MPP/TGA与载羟基喜树碱的MPP/TGA/POL188纳米粒处理SW1116/HCPT细胞2天、5天和7天，收集细胞后1000rpm离心5min，洗涤后加入EBC细胞裂解液，冰上超声破碎后移入4℃预冷的离心管中，14000rpm离心10min，取出上清，-20℃保存备用，即得所提的全细胞蛋白。

[0114] 2.蛋白定量

[0115] 将BCA 试剂中按照比例为50∶1配制适量BCA工作液，每孔加入1mL。完全溶解蛋白标准品(5mg/mL)，并依次稀释成6种不同浓度加入每孔中。待测样品分别取10μL加入到每孔工作液中，放入37℃温箱中，200rpm摇30min。酶标仪测定吸光值，制备标准曲线。对照标准曲线计算待测蛋白质样品浓度。

[0116] 3.SDS-PAGE蛋白质电泳

[0117] 取蛋白100g，加入等量的2×SDS-PAGE上样缓冲液，水浴煮沸5min，冰浴冷却后备用。安装电泳装置，灌注分离胶，待分离胶凝固后，制备浓缩胶，加入TEMED后立即快速混匀并灌注浓缩胶，插上干净的Teflon梳子，待浓缩胶凝固后，拔出梳子，用电泳缓冲液清洗加样槽以除去未聚合的丙烯酞胺，在上样孔中小心加入样品及蛋白Maker，在不用的加样孔中加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液。加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，排尽凝胶底部两玻璃板间的气泡，接通电源进行电泳。

[0118] 4.蛋白质的电转移与NC膜的染色

[0119] 在干净的电泳夹板中依次放上垫板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、垫板，在转膜缓冲液中用玻璃棒赶走气泡。以120V恒压电泳转膜90min，转膜过程中加冰制冷，使转膜过程的温度不超过10℃。转膜结束后，取出NC膜，用Fast-Green浸泡NC膜，放摇床上室温缓慢摇动1～2min，回收染色液，用蒸馏水浸泡NC膜进行脱色，缓慢摇动5min，期间更换脱色液3～4次。

[0120] 5.封闭及抗原抗体反应

[0121] 将转有蛋白的膜浸于含5％脱脂奶粉的1×PBST中封闭，结束后倾去封闭液，加入兔抗多克隆一抗，MDR1(1∶200)和β-actin(1∶400)(一抗用1×PBST稀释)，一抗作用结束后，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗兔多克隆二抗(1∶5000)。

[0122] 6.显影

[0123] 配制显色液(ECLA液∶B液＝1∶1，V/V)加在膜上，室温反应1min，剪取适当大小的X光片覆盖于膜上，曝光适当时间后，取出X光片，放入显影液中，再放入定影液中定影2～5min。

[0124] 表11 SW1116/HCPT细胞中P-gp的相对表达量

[0125]

[0126] 通过蛋白定量技术检测耐药细胞株SW1116/HCPT的P-gp的表达强度。结果表明，载羟基喜树碱的MPP/TGA/POL188组中SW1116/HCPT中的P-gp的表达强度最低，载羟基喜树碱的MPP/TGA组次之。

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