调节止血的组合物及其用途
阅读：658发布：2024-02-12
专利汇可以提供调节止血的组合物及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了蛇毒FV多肽在用于防止或减少出血事件中的血液流失或出血的方法和组合物中的用途。，下面是调节止血的组合物及其用途专利的具体信息内容。
1.一种治疗或预防个体中的出血事件或凝固紊乱的方法，该方法包括向个体给予有效量的抑制出血的蛇毒FV多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含：(a)与SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12任一项所示的序列具有至少50％序列相似性的氨基酸序列；或(b)与SEQ ID NO：1，
3，5，7，9或11任一项所示的序列具有至少50％序列相似性的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列；或(c)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11任一项所示的序列在至少低度严谨条件下杂交的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列，其中，(a)、(b)或(c)的氨基酸序列具有选自下列的一个或多个活性：抑制出血的活性、减少凝固时间的活性；增强止血的活性；延长凝块溶解时间的活性或增强凝块强度的活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽以包含药学上可接受的载体的组合物的形式给药。
4.根据权利要求3所述的方法，其中组合物配制为通过局部给药或静脉内给药。
5.根据权利要求3所述的方法，其中组合物不包括FVII和/或FVIIa。
6.根据权利要求3所述的方法，其中组合物不包括蛇毒FXa。
7.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含轻链和重链结构域，如图7所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其中激活肽被置于轻链和重链结构域之间，如图7所示。
9.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽不具有激活肽。
10.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV包括一个或多个：(a)位于重链区域内的多铜氧化酶结构域；(b)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构域；和(c)位于轻链区域内的膜结合结构域。
11.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV包括一个或多个：(1)铜氧化还原蛋白结构域，如在European Bioinformatics Institute(EBI)数据库InterPro标志IPR008972和超家族条目SSF49503中所定义；(2)多铜_氧化酶1型结构域，如在EBI InterPro数据库中在InterPro标志IPR002355和Prosite条目PS00079中所定义；(3)铜氧化酶_2结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR011706和Pfam条目PF07731中所定义；(4)FA58C结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和SMART登录号SM00231中所定义；(5)FA58C_3结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS50022中所定义；(6)F5_F8_型_C结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Pfam条目PF00754中所定义；(7)Gal_结合_样结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR008979和超家族条目SSF49785中所定义；(8)FA58C_1结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01285中所定义；(9)FA58C_2结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01286中所定义；和(10)因子_V结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR0014693和ProteinInformation Resource条目PIRSF5000150中所定义；或其生物活性片段。
12.根据权利要求11所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含：(1)至少一个铜氧化还原蛋白结构域；(2)至少一个多铜_氧化酶1结构域；(3)铜氧化酶_2结构域；(4)至少一个FA58C结构域；(5)至少一个FA58C_3结构域；(6)至少一个F5_F8_型_C结构域；(7)至少一个Gal_结合_样结构域；(8)至少一个FA58C_1结构域；(9)至少一个FA58C_2结构域；
和(10)因子_V结构域。
13.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域。
14.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包括一个或多个：(a)A1结构域；(b)A2结构域；(c)B结构域；(d)A3结构域；(e)C1结构域；和(f)C2结构域，其中：A1、A2和A3结构域是多铜氧化酶结构域的不同版本，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR001117中所定义；B结构域在激活过程中被除去；C1和C2是促进膜结合的结构域，如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421中所定义。
15.根据权利要求14所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含A1、A2和A3结构域以及C1和C2结构域。
16.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含一个或多个以下的结构域(编号是指图7中的共有编号)：
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-772所定义的重链结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基773-817所定义的激活结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基818-1461所定义的轻链结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-208，209-337，351-530，500-682，823-997和963-1153所定义的任意一个铜氧化还原结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基307-327，662-681和1120-1138所定义的任意一个多铜_氧化酶1结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基581-687所定义的铜_氧化酶_2结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1298和1303-1457所定义的任意一个Gal_结合_样结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1146-1296和1302-1455所定义的任意一个FA58C结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1296和1303-1455所定义的任意一个FA58C_3结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1141-1455所定义的FA58C_2结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1187-1215和1347-1374所定义的任意一个FA58C_1结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1162-1293和1318-1452所定义的任意一个F5_F8_型_C结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域。
17.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含以下一个或多个结构域(编号是指图7中的共有编号)：
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-348所定义的A1结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基349-691所定义的A2结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基772-817所定义的B结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基819-1148所定义的A3结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1149-1299所定义的C1结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域；
—与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1300-1461所定义的C2结构域具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的结构域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中蛇毒FV多肽缺少激活肽或B结构域。
19.根据权利要求17所述的方法，其中重链包含以下序列：
20.AQLREYX1X2AAQLEDWDYNPQPEELSRLSESX3LTFKKIVYREYELDFKQEX4X5RDX6LSGLLGPTLRGEVGDX7LIIYFKNFATQPVSIHPQSAVYNKWSEGSSYSDGTSDVERLDDAVPPGQSFKYVWNITAEIGPKKADPPCLTYAYYSHVNMVRDFNSGLIGALLICKEGSLNAX8GX9QKFFNREYVLX10FSVFDESKNWYRKPSLQYTINGFANGTLPDVQACAYDHISWHLIGMSSSPEIFSVHFNGQTLEQNHYKVSTIX11X12VGGASVTAX13MSVSRTGKWLISSLVAKHLQAGMYGYLNIKDCGX14PX15TLTRKLSFREX16X17X18IX19X20WEYFIAAEEITWDYX21PEIPSSVDRRYKAQYLDNFSNFIGKKYKKAVFRQYEDX22NFTKPTYAIWPKERGILGPVIKAKVRDTVTIVFKNLASRPYSIYVHGVSVSKDAEGAX2
3YPSDPKENITHGKAVEPGQVYTYKWTVLDTDEPTVKDSECITKLYHSAVDMTRDIASGLIGPLLX24CKX25KALSX26X27GVQNKADVEQHAVFAVFDENKSWYLEDNIKKYCSNPSX28VKKDDPKFYKSNVMYTLNGYASDRTEVX29X30FHQSEVVX31WHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLFPMSGESATVTMDNLGTWLLSSWGSCEMSNGMRLRFLDANYDDEDEGNEEEEEDDGDIFADIFX32PX33EVVX34KKEEVPVNFVPDPESDALAKELGLX35DDEX36NPX37X38QX39RX40EQTEDDEEQLMX41ASX42LGLR[SEQ ID NO：15]，
其中：
X1选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或His，或其修饰的形式)；
X2选自疏水性氨基酸残基；
X3选自酸性氨基酸残基(例如Glu或Asp，或其修饰的形式)；
X4选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；
X5选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式)；
X6选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；
X7选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；
X8选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；
X9选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)；
X10选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Met或Val，或其修饰的形式)；
X11选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
X12选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；
X13选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；
X14选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
X15选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；
X16选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；
X17选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；
X18选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；
X19选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；
X20选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；
X21选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；
X22选自小的氨基酸残基(例如Gly或Ser，或其修饰的形式)；
X23选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其修饰的形式)；
X24选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；
X25选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg或His其修饰的形式)；
X26选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其修饰的形式)；
X27选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；
X28选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)；
X29选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；
X30选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；
X31选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Glu，或其修饰的形式)；
X32选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
X33选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ser，或其修饰的形式)；
X34选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
X35选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu或Ile，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe，或其修饰的形式)；
X36选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
X37不存在或选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
X38选自任意氨基酸残基(例如带电的氨基酸残基，包括碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，和酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
X39选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)；
X40选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
X41选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；和X42选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val，或其修饰的形式，或具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)。
21.根据权利要求7所述的方法，其中激活肽包含以下序列：
SFKGSVAEEELKHTALALEEDAHASDPRIDSNSAX43NX44DDIAGRYL[SEQID NO：16]，其中：
X43选自碱性氨基酸残基(例如Arg或His，或其修饰的形式)；和
X44选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)。
22.根据权利要求7所述的方法，其中轻链包含以下序列：
RTIX45RX46NKRRYYIAAEEVLWDYSPIX47KSQVRSX48X49AKTTFKKAIFRSYLDDTFQTPSTGGEYEKHLGILGPIIRAEVDDVX50EX51QFX52NLASRPYSLHAHGLLYEKSSEGRSYDDX53SPELFKKDDAIMPNGTYTYVWQVPPRSGPTDNTEKCKSWAYYSGVNPEKDIHSGLIGPILICQKGMIDKYNRTIDIREFVLFFMVFDEEKSWYFPKSDKSTCEEKLIGVQX54SX55HTFPAINGIPYQLQGLX56MYKDENVHWHLLNMGGPKDX57HVVNFHGQTFTEEGREDNQLGVLPLLPGTFASIKMKPSKIGTWLLETEVGENQERGX58QALFTVIDKX59CKLPMGLASGIIQDSQISASGHVX60YWEPKLARLNNTGX61X62NAWSIIKKEHEHPWIQIDLQRQVVITGIQTQGTVX63LLX64HSYTVEYFVTYSX65DGQNWITFKGRHSX66TQMHFEGNSDGTTVKENHIDPPIIARYIRLHPTKFYNX67PTFRIELLGCEVEGCSVPLGMESGAIKX68SEITASSYKKTWWSSWEPX69LARLNLX70GX71TNAWQPX72VNNKDQWLQIDLQHLTKITSIITQGATSMTTX73MYVKTFSIHYTDDNSTWX74PYLDVRTSMEKVFTGNINX75DGHVKHFFX76PPILSRFIRIIPKTWNQYIALRIELFGCEVF[SEQ ID NO：17]，
其中：
X45选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如Tyr，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
X46选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
X47选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
X48选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
X49选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；
X50选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基或其修饰的形式，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
X51选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val或Ile，或其修饰的形式)；
X52选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或Lys，或其修饰的形式)；
X53选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
X54不存在或选自小的氨基酸残基(例如Ser或其修饰的形式)；
X55选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg或His，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；
X56选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)；
X57选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
X58选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
X59选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
X60选自选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
X61选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
X62选自疏水性氨基酸残基(例如具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe或Tyr，或其修饰的形式)；
X63选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；
X64选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)，或中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；
X65选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；
X66选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
X67选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
X68选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；
X69选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如Phe，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；
X70选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
X71选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
X72选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
X73选自小的氨基酸残基(例如Ala或Ser，或其修饰的形式)；
X74选自选自碱性氨基酸残基(例如Lys或Arg，或其修饰的形式)；
X75选自小的氨基酸残基(例如Ser或Gly，或其修饰的形式)；
X76选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)。
23.根据权利要求1所述的方法，其中蛇毒FV多肽包含：(1)与SEQ ID NO：15所示的序列具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的氨基酸序列；
和(2)与SEQ ID NO：17所示的序列具有至少70％序列相似性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的氨基酸序列。
24.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含序列MGRYSVSPVPKCLLLMFLGWSGLKYYQ。
25.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含与SEQ ID NO：2，SEQ IDNO：4，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：12任一项所示的序列具有至少70％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过20个氨基酸残基的差异的序列。
26.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域和激活肽(或B)结构域中的至少一个。
27.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含FXa结合位点、凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点中的一个或多个。
28.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含至少一个Fxa结合位点，凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点。
29.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽包含以下任意一个或多个：
(1)在大约残基338-379的FXa结合位点；
(2)在大约残基524-537的FXa结合位点；
(3)在大约残基703-707的凝血酶原结合位点；
(4)在大约残基772-773的凝血酶切割位点；
其中，编号是指图7中的共有编号。
30.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽在相对于图7的共有编号的残基
818-819和/或537-538上包含APC位点。
31.根据权利要求1所述方法，其中蛇毒FV多肽的激活的蛋白C(APC)位点比野生型哺乳动物的FV少一个或多个。
32.一种药物组合物，其基本上由权利要求1定义的蛇毒FV多肽和药学上可接受的载体或稀释剂组成。
33.根据权利要求32所述的组合物，其配制为局部给予。
34.根据权利要求32所述的组合物，其不包括FVII和/或FVIIa。
35.根据权利要求32所述的组合物，其不包括蛇毒FXa。
36.权利要求1定义的蛇毒FV多肽在制备用于治疗血液流失或凝固紊乱的药物中的用途。
37.根据权利要求36所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为注射或局部应用，以防止或减少个体中的从个体的身体上或身体内的出血位点的血液流失。
38.根据权利要求36所述的用途，其中药物不包括FVII和/或FVIIa。
39.根据权利要求36所述的用途，其中药物不包括蛇毒FXa。
40.权利要求1定义的蛇毒FV多肽在制备用于防止或减少血液流失或凝固紊乱的试剂盒中的用途。
41.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒包括任意一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂；一种或多种用于制备蛇毒FV多肽以向个体给药的容器；一种或多种其它试剂和/或其它治疗剂；用于向患者给予蛇毒FV多肽的设备或其它材料；和给予试剂盒以治疗个体中的血液流失的说明书。
42.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒不包括FVII和/或FVIIa。
43.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒不包括蛇毒FXa。
44.根据权利要求40所述的用途，其中试剂盒用于以下一项或多项：减少获得完全止血所需的时间；减少维持止血所需的时间；减少凝固的时间；延长凝块溶解的时间；和增加出血位点凝块的强度。
45.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制成用于有效获得以下一项或多项的量来给予：(1)抑制出血；(2)减少凝固时间；(3)增强止血；(4)延长凝块溶解时间；
和(5)增强凝块强度。
46.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为由个体之外的人员给药。
47.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为自己给药。
48.根据权利要求40所述的用途，其中蛇毒FV多肽配制为在需要使用其之前向个体提供。
调节止血的组合物及其用途
技术领域
背景技术
[0002] 针对血管损伤发生血液凝固对于生物的持续生存是至关重要的。鉴于在手术或损伤或外伤之后控制血液流失的重要性，鉴别促进血液凝固或抑制凝块分解的调节剂(例
如通过纤维蛋白水解性纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶酶原途径；Royston等人，1990，Blood
Coagul.Fibrinol.1：53；Orchard等人，1993，Br.J.Haematol.85：596)已经成为非常感兴趣的领域。
如通过纤维蛋白水解性纤维蛋白溶酶/纤维蛋白溶酶原途径；Royston等人，1990，Blood
Coagul.Fibrinol.1：53；Orchard等人，1993，Br.J.Haematol.85：596)已经成为非常感兴趣的领域。
[0003] 凝固过程由各种血液成分或因子的复杂相互作用所介导，最终形成纤维蛋白凝块。一般地，参与被称作凝固“级联”的血液成分是原酶(proenzyme)或酶原(zymogen)，其为酶学上无活性的蛋白，通过激活剂的作用被转化为蛋白水解酶，所述激活剂本身是激活
的凝固因子。经过这样的转化的凝固因子一般被称作“活性因子”，通过添加小写的“a”后缀加以指明(例如，因子VIIa)。
的凝固因子。经过这样的转化的凝固因子一般被称作“活性因子”，通过添加小写的“a”后缀加以指明(例如，因子VIIa)。
[0004] 凝固级联中的关键步骤之一是凝血酶原被凝血酶原酶复合物(FXa联合FVa)转化为凝血酶，参见Suttie，J.W和Jackson，C.M，1977，Physiol Rev，57：1-70。存在两个促进因子X(FX)激活的系统或途径。“内在途径”是指那些通过利用只存在于血浆中的因子
而引起凝血酶形成的反应。一系列的蛋白酶介导的激活最终产生因子IXa(FIXa)，其与因
2+
子VIIIa(FVIIIa)联合在存在Ca 和磷脂的情况下将FX切割为FXa。在血液凝固的“外部
途径”中，因子VIIa(FVIIa)及其辅因子、组织因子实施相同的蛋白水解。组织因子是与膜结合的蛋白，通常不在血浆中循环。但是，在血管被破坏之后，它可以与FVIIa形成复合物
2+
以催化存在Ca 和磷脂的情况下FX的激活或因子IX(FIX)的激活(Nemerson和Gentry，
1986，Biochem.25：4020-4033)。虽然两种凝固途径在止血中的相对重要性是不明确的，但是近年来发现FVII和组织因子在调节血液凝固中发挥重要作用。
而引起凝血酶形成的反应。一系列的蛋白酶介导的激活最终产生因子IXa(FIXa)，其与因
2+
子VIIIa(FVIIIa)联合在存在Ca 和磷脂的情况下将FX切割为FXa。在血液凝固的“外部
途径”中，因子VIIa(FVIIa)及其辅因子、组织因子实施相同的蛋白水解。组织因子是与膜结合的蛋白，通常不在血浆中循环。但是，在血管被破坏之后，它可以与FVIIa形成复合物
2+
以催化存在Ca 和磷脂的情况下FX的激活或因子IX(FIX)的激活(Nemerson和Gentry，
1986，Biochem.25：4020-4033)。虽然两种凝固途径在止血中的相对重要性是不明确的，但是近年来发现FVII和组织因子在调节血液凝固中发挥重要作用。
[0005] 因子VII是痕量血浆糖蛋白，其在血液中作为单链酶原循环。酶原是催化上无活性的(Williams等人，J.Biol.Chem.264：7536-7543(1989)；Rao等人，1988，Proc.Natl.
Acad.Sci.USA.85：6687-6691)。单链FVII可以在体外被FXa、FXIIa、FIXa或凝血酶转化
为双链的FVIIa。相信FXa是FVII的主要生理激活剂。与其它几个参与止血的血浆蛋白类
似，FVII的活性依赖于维生素K，其活性对于蛋白的氨基端成簇的多个谷氨酸残基的γ-羧
基化是必需的。这些γ-羧基化的谷氨酸对于金属相关的FVII与磷脂的相互作用是必需
的。
Acad.Sci.USA.85：6687-6691)。单链FVII可以在体外被FXa、FXIIa、FIXa或凝血酶转化
为双链的FVIIa。相信FXa是FVII的主要生理激活剂。与其它几个参与止血的血浆蛋白类
似，FVII的活性依赖于维生素K，其活性对于蛋白的氨基端成簇的多个谷氨酸残基的γ-羧
基化是必需的。这些γ-羧基化的谷氨酸对于金属相关的FVII与磷脂的相互作用是必需
的。
[0006] 因子V(FV)是作为单链分子合成的大的糖蛋白，在哺乳动物血液中作为丝氨酸蛋白酶激活的FX的无活性辅因子而循环。当损伤或外伤过程中需要它时，FV被凝血酶或FXa
通过蛋白水解激活。在激活过程中，B结构域被释放并产生激活的FVa。FVa具有两条链，
2+
一条重链(含有A1-A2结构域)和一条轻链(含有A3-C1-C2结构域)，这两条链通过Ca
依赖性非共价相互作用被连接在一起。
通过蛋白水解激活。在激活过程中，B结构域被释放并产生激活的FVa。FVa具有两条链，
2+
一条重链(含有A1-A2结构域)和一条轻链(含有A3-C1-C2结构域)，这两条链通过Ca
依赖性非共价相互作用被连接在一起。
[0007] 激活的蛋白C(APC)通过蛋白水解将人类FVa灭活，这提供了维持止血平衡的有效调控机制。APC(其为维生素K依赖性的丝氨酸蛋白酶)在氨基酸位置334、534和679切割
人类FVa，将人类FVa转化为无活性的FV，因此使凝血酶原酶复合物变得不稳定并且降低凝
血酶的产生速率。
人类FVa，将人类FVa转化为无活性的FV，因此使凝血酶原酶复合物变得不稳定并且降低凝
血酶的产生速率。
[0008] 为了使凝血酶原的激活以生理相关的速率进行，FXa必须在Ca2+离子存在的情况下在磷脂膜上与FVa组装以形成凝血酶原酶复合物(Suttie和Jackson，1977，Physiol.
Rev.57：1)。与单独使用FXa进行催化相比，该复合物的形成能够将凝血酶原的激活增强
5
10 倍。
Rev.57：1)。与单独使用FXa进行催化相比，该复合物的形成能够将凝血酶原的激活增强
5
10 倍。
[0009] 澳洲棕蛇(pseudonaja textilis及相关种)和两种太攀蛇(Oxyuranusscutellus(海岸太攀蛇)和Oxyuranus microlepidotus(内陆太攀蛇))在生产它们的蛇
毒上是独一无二的，所述蛇毒是强促凝血剂毒素，由FXa样蛋白酶联合FVa样因子构成，类
似于人类凝血酶原酶复合物(Masci等人，1988，Biochem Int，17：825-835)。澳洲棕蛇的FVa样蛋白酶在334和534位点缺少APC切割，因此在与人类FVa相同的速率时不被转化为
它的无活性形式，因为它只有一个切割位点。
毒上是独一无二的，所述蛇毒是强促凝血剂毒素，由FXa样蛋白酶联合FVa样因子构成，类
似于人类凝血酶原酶复合物(Masci等人，1988，Biochem Int，17：825-835)。澳洲棕蛇的FVa样蛋白酶在334和534位点缺少APC切割，因此在与人类FVa相同的速率时不被转化为
它的无活性形式，因为它只有一个切割位点。
[0010] 美国专利号7,125,846公开了通过联合给予人类FV多肽和人类FVII多肽(同时或依次)而治疗出血事件和凝固紊乱的方法。公开了这种给药相对于单独给予FVIIa或FV
时的凝固时间、凝块的结实程度和抗性提供了缩短的凝块时间、更坚固的凝块并增加了对
纤维蛋白溶解的抗性。
时的凝固时间、凝块的结实程度和抗性提供了缩短的凝块时间、更坚固的凝块并增加了对
纤维蛋白溶解的抗性。
[0011] 本发明部分基于以下发现进行预测：蛇毒FVa蛋白(例如澳洲棕蛇的FVa蛋白)单独与人类FXa形成复合物以有效使血液凝固。该发现是高度有利的，因为蛇毒FVa蛋白
只在FXa存在的情况下形成凝血酶原酶复合物(并且使血液凝固)，FXa在人类中被限制
在损伤位点，这允许向个体注射蛇毒FVa蛋白而不在不想要的位点引起血液凝固。蛇毒FV
多肽的示例性例子包括以下优点：(1)从凝血酶原产生最大量的凝血酶所需的蛇毒FV蛋白
的量在nM浓度范围内；(2)来自蛇毒的FV仅需要FXa以使血液凝固，而FVIIa需要组织因
2+
子、Ca 和磷脂；(3)蛇毒FV蛋白非常稳定，不容易被APC降解，因为蛇毒FV氨基酸序列的
APC切割位点比人类FV序列少；(4)可以通过加入蛇毒FV使限速的凝血酶原酶的浓度达到
比加入FVIIa可以达到的浓度高得多的浓度，因为内源性FV是有限的；和(5)不需要蛇毒
FXa的活性。不希望被任一个理论或操作模式所限，推测由于哺乳动物血液中FVa的浓度通
常非常低并且形成FVa的FV的浓度也非常低，所以给予蛇毒FVa将增加总的FVa浓度并因
此增加凝血酶原酶复合物的浓度。这继而将显著增加在损伤位点有需要之时形成凝块的速
率。
只在FXa存在的情况下形成凝血酶原酶复合物(并且使血液凝固)，FXa在人类中被限制
在损伤位点，这允许向个体注射蛇毒FVa蛋白而不在不想要的位点引起血液凝固。蛇毒FV
多肽的示例性例子包括以下优点：(1)从凝血酶原产生最大量的凝血酶所需的蛇毒FV蛋白
的量在nM浓度范围内；(2)来自蛇毒的FV仅需要FXa以使血液凝固，而FVIIa需要组织因
2+
子、Ca 和磷脂；(3)蛇毒FV蛋白非常稳定，不容易被APC降解，因为蛇毒FV氨基酸序列的
APC切割位点比人类FV序列少；(4)可以通过加入蛇毒FV使限速的凝血酶原酶的浓度达到
比加入FVIIa可以达到的浓度高得多的浓度，因为内源性FV是有限的；和(5)不需要蛇毒
FXa的活性。不希望被任一个理论或操作模式所限，推测由于哺乳动物血液中FVa的浓度通
常非常低并且形成FVa的FV的浓度也非常低，所以给予蛇毒FVa将增加总的FVa浓度并因
此增加凝血酶原酶复合物的浓度。这继而将显著增加在损伤位点有需要之时形成凝块的速
率。
发明内容
[0012] 因此，在一个方面，本发明提供了治疗或预防个体中出血事件或凝固紊乱的方法。这些方法一般包括向个体给予抑制出血的有效量的蛇毒FV多肽。在一些具体实施方式中，
蛇毒FV多肽包含：(a)与SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12任一项所示的序列具有至少50％
(以及至少51％至至少99％和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的氨基酸
序列；或(b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11任一项所示的序列具有至少50％(以及至少
51％至至少99％和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的核苷酸序列或其
互补物所编码的氨基酸序列；或(c)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11任一项所示的序列在至少低度、中度或高度严谨条件下杂交的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列，其中，(a)、(b)或(c)的氨基酸序列具有选自下列的一个或多个活性：抑制出血的活性、减少凝固时间的活性；增强止血的活性；延长凝块溶解时间的活性或增强凝块强度的活性。适宜地，以包含药学上可接受载体的组合物的形式给予蛇毒FV多肽。
蛇毒FV多肽包含：(a)与SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12任一项所示的序列具有至少50％
(以及至少51％至至少99％和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的氨基酸
序列；或(b)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11任一项所示的序列具有至少50％(以及至少
51％至至少99％和其中所有的整数百分数)序列相似性或序列同一性的核苷酸序列或其
互补物所编码的氨基酸序列；或(c)与SEQ ID NO：1，3，5，7，9或11任一项所示的序列在至少低度、中度或高度严谨条件下杂交的核苷酸序列或其互补物所编码的氨基酸序列，其中，(a)、(b)或(c)的氨基酸序列具有选自下列的一个或多个活性：抑制出血的活性、减少凝固时间的活性；增强止血的活性；延长凝块溶解时间的活性或增强凝块强度的活性。适宜地，以包含药学上可接受载体的组合物的形式给予蛇毒FV多肽。
[0013] 在相关的方面，本发明提供了包含或实质上由如本文广泛定义的蛇毒FV多肽和药学上可接受载体组成的药物组合物。适宜地，组合物配制为全身或局部给药(例如局部
或静脉内给药)。在一些具体实施方式中，组合物不包括FVII和/或FVIIa。在一些具体
实施方式中，组合物不包括蛇毒FXa。
或静脉内给药)。在一些具体实施方式中，组合物不包括FVII和/或FVIIa。在一些具体
实施方式中，组合物不包括蛇毒FXa。
[0014] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包含轻链和重链结构域，例如在图7中所示。适宜地，激活肽被置于轻链和重链结构域之间，例如在图7中所示。但是，在特别的具体实施方式中，蛇毒FV多肽中不存在激活肽。
[0015] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包括一个或多个：(a)位于重链区域内的多铜氧化酶结构域；(b)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构域；和(c)通常位于轻链区域内的
C-末端膜结合结构域。在这种类型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包括：(i)至少一个(例
如2个)位于重链区域内的多铜氧化酶结构域；(ii)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构
域；和(c)至少一个(例如2个)位于轻链区域内的膜结合结构域。
C-末端膜结合结构域。在这种类型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包括：(i)至少一个(例
如2个)位于重链区域内的多铜氧化酶结构域；(ii)位于轻链区域内的多铜氧化酶结构
域；和(c)至少一个(例如2个)位于轻链区域内的膜结合结构域。
[0016] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包括一个或多个：(1)铜氧化还原蛋白(cupredoxin)结构域，例如在European Bioinformatics Institute(EBI)数据库
InterPro标志IPR008972和超家族条目SSF49503中所定义；(2)多铜氧化酶1型(铜结
合位点)结构域(本文中也称作多铜_氧化酶1结构域)，例如在EBI InterPro数据库中
在InterPro标志IPR002355和Prosite条目PS00079中所定义；(3)多铜氧化酶2型结构
域(本文中也称作铜氧化酶_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR011706
和Pfam条目PF07731中所定义；(4)凝固因子5/8型C结构域(本文中也称作FA58C结构
域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和SMART登录号SM00231中所定义；
(5)凝固因子5/8C-末端结构域(本文中也称作FA58C_3结构域)，例如在EBI数据库中在
InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS50022中所定义；(6)凝固因子5/8型C结构
域(本文中也称作F5_F8_型_C结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421
和Pfam条目PF00754中所定义；(7)半乳糖结合样结构域(本文中也称作Gal_结合_样
结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR008979和超家族条目SSF49785中所定
义；(8)凝固因子5/8型C标志1结构域(本文中也称作FA58C_1结构域)，例如在EBI数据
库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01285中所定义；(9)凝固因子5/8型
C标志2结构域(本文中也称作FA58C_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志
IPR000421和Prosite条目PS01286中所定义；和(10)凝固因子V结构域(本文中也称作因
子_V结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR0014693和Protein Information
Resource条目PIRSF5000150中所定义；或其生物活性片段。在这种类型的示例性例子中，
蛇毒FV多肽包含：(1)至少一个铜氧化还原蛋白结构域(例如1、2、3、4、5或6个结构域)；
(2)至少一个多铜_氧化酶1结构域(例如1、2或3个结构域)；(3)铜氧化酶_2结构域；
(4)至少一个FA58C结构域(例如1或2个结构域)；(5)至少一个FA58C_3结构域(例如
1或2个结构域)；(6)至少一个F5_F8_型_C结构域(例如1或2个结构域)；(7)至少
一个Gal_结合_样结构域(例如1或2个结构域)；(8)至少一个FA58C_1结构域(例如
1或2个结构域)；(9)至少一个FA58C_2结构域(例如1或2个结构域)；和(10)因子_
V结构域。在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包括信号肽结构域。在其它具体实施方式
中，其缺少信号肽结构域。
InterPro标志IPR008972和超家族条目SSF49503中所定义；(2)多铜氧化酶1型(铜结
合位点)结构域(本文中也称作多铜_氧化酶1结构域)，例如在EBI InterPro数据库中
在InterPro标志IPR002355和Prosite条目PS00079中所定义；(3)多铜氧化酶2型结构
域(本文中也称作铜氧化酶_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR011706
和Pfam条目PF07731中所定义；(4)凝固因子5/8型C结构域(本文中也称作FA58C结构
域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421和SMART登录号SM00231中所定义；
(5)凝固因子5/8C-末端结构域(本文中也称作FA58C_3结构域)，例如在EBI数据库中在
InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS50022中所定义；(6)凝固因子5/8型C结构
域(本文中也称作F5_F8_型_C结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421
和Pfam条目PF00754中所定义；(7)半乳糖结合样结构域(本文中也称作Gal_结合_样
结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR008979和超家族条目SSF49785中所定
义；(8)凝固因子5/8型C标志1结构域(本文中也称作FA58C_1结构域)，例如在EBI数据
库中在InterPro标志IPR000421和Prosite条目PS01285中所定义；(9)凝固因子5/8型
C标志2结构域(本文中也称作FA58C_2结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志
IPR000421和Prosite条目PS01286中所定义；和(10)凝固因子V结构域(本文中也称作因
子_V结构域)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR0014693和Protein Information
Resource条目PIRSF5000150中所定义；或其生物活性片段。在这种类型的示例性例子中，
蛇毒FV多肽包含：(1)至少一个铜氧化还原蛋白结构域(例如1、2、3、4、5或6个结构域)；
(2)至少一个多铜_氧化酶1结构域(例如1、2或3个结构域)；(3)铜氧化酶_2结构域；
(4)至少一个FA58C结构域(例如1或2个结构域)；(5)至少一个FA58C_3结构域(例如
1或2个结构域)；(6)至少一个F5_F8_型_C结构域(例如1或2个结构域)；(7)至少
一个Gal_结合_样结构域(例如1或2个结构域)；(8)至少一个FA58C_1结构域(例如
1或2个结构域)；(9)至少一个FA58C_2结构域(例如1或2个结构域)；和(10)因子_
V结构域。在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包括信号肽结构域。在其它具体实施方式
中，其缺少信号肽结构域。
[0017] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包括一个或多个：(a)A1结构域；(b)A2结构域；(c)B结构域，也替换地称作激活结构域；(d)A3结构域；(e)C1结构域；和(f)C2结构域，其中：A1、A2和A3结构域是多铜氧化酶结构域的不同版本(diverged version)，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR001117中所定义；B结构域在激活过程中被除去；C1和C2是
促进膜结合结构域，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421中所定义。在这种类
型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包含A1、A2和A3结构域以及C1和C2结构域。
促进膜结合结构域，例如在EBI数据库中在InterPro标志IPR000421中所定义。在这种类
型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包含A1、A2和A3结构域以及C1和C2结构域。
[0018] 代表性的结构域与天然产生的物种的结构域的长度是相同或非常相似的(具有例如1，2，3，4，5乃至10个残基的差异)。在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包含一个或多个(在一些情况下包含所有的)以下的结构域(编号是指图7中的共有编号)：
[0019] —与例如图7所示的任意蛇毒FV多肽(本文中也称作“蛇毒FV”)的残基31-772所定义的重链结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0020] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基773-817所定义的激活结构域(也替换地称作B结构域)具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0021] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基818-1461所定义的轻链结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0022] ——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-208，209-337，351-530，500-682，823-997和963-1153所定义的任意一个铜氧化还原结构域具有至少70，80，85，90，91，92，
93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0023] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基307-327，662-681和1120-1138所定义的任意一个多铜_氧化酶1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差
异的结构域；
异的结构域；
[0024] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基581-687所定义的铜_氧化酶_2结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0025] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1298和1303-1457所定义的任意一个Gal_结合_样结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构
域；
域；
[0026] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1146-1296和1302-1455所定义的任意一个FA58C结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0027] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1147-1296和1303-1455所定义的任意一个FA58C_3结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0028] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1141-1455所定义的FA58C_2结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0029] ——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1187-1215和1347-1374所定义的任意一个FA58C_1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
和
和
[0030] ——与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1162-1293和1318-1452所定义的任意一个F5_F8_型_C结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结
构域。
构域。
[0031] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包含一个或多个(在一些情况下包含所有的)以下的结构域(编号是指图7中的共有编号)：
[0032] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基31-348所定义的A1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，
2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0033] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基349-691所定义的A2结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0034] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基772-817所定义的B结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，
2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0035] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基819-1148所定义的A3结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0036] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1149-1299所定义的C1结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域；
[0037] —与例如图7所示的任意蛇毒FV的残基1300-1461所定义的C2结构域具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域。
1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基的差异的结构域。
[0038] 在一些具体实施方式中，激活或B结构域不存在。
[0039] 在特别的具体实施方式中，重链包含以下序列：
[0040] AQLREYX1X2AAQLEDWDYNPQPEELSRLSESX3LTFKKIVYREYELDFKQEX4X5RDX6LSGLLGPTLRGEVGDX7LIIYFKNFATQPVSIHPQSAVYNKWSEGSSYSDGTSDVERLDDAVPPGQSFKYVWNITAEIGPKKADPPCLTYAYYSHVNMVRDFNSGLIGALLICKEGSLNAX8GX9QKFFNREYVLX10FSVFDESKNWYRKPSLQYTINGFANGTLPDVQACAYDHISWHLIGMSSSPEIFSVHFNGQTLEQNHYKVSTIX11X12VGGASVTAX13MSVSRTGKWLISSLVAKHLQAGMYGYLNIKDCGX14PX15TLTRKLSFREX16X17X18IX19X20WEYFIAAEEITWDYX21PEIPSSVDRRYKAQYLDNFSNFIGKKYKKAVFRQYEDX22NFTKPTYAIWPKERGILGPVIKAKVRDTVTIVFKNLASRPYSIYVHGVSVSKDAEGAX
23YPSDPKENITHGKAVEPGQVYTYKWTVLDTDEPTVKDSECITKLYHSAVDMTRDIASGLIGPLLX24CKX25KALSX2
6X27GVQNKADVEQHAVFAVFDENKSWYLEDNIKKYCSNPSX28VKKDDPKFYKSNVMYTLNGYASDRTEVX29X30FHQSEVVX31WHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLFPMSGESATVTMDNLGTWLLSSWGSCEMSNGMRLRFLD
ANYDDEDEGNEEEEEDDGDIFADIFX32PX33EVVX34KKEEVPVNFVPDPESDALAKELGLX35DDEX36NPX37X38QX39RX40EQTEDDEEQLMX41ASX42LGLR[SEQ ID NO：15]，
23YPSDPKENITHGKAVEPGQVYTYKWTVLDTDEPTVKDSECITKLYHSAVDMTRDIASGLIGPLLX24CKX25KALSX2
6X27GVQNKADVEQHAVFAVFDENKSWYLEDNIKKYCSNPSX28VKKDDPKFYKSNVMYTLNGYASDRTEVX29X30FHQSEVVX31WHLTSVGTVDEIVPVHLSGHTFLSKGKHQDILNLFPMSGESATVTMDNLGTWLLSSWGSCEMSNGMRLRFLD
ANYDDEDEGNEEEEEDDGDIFADIFX32PX33EVVX34KKEEVPVNFVPDPESDALAKELGLX35DDEX36NPX37X38QX39RX40EQTEDDEEQLMX41ASX42LGLR[SEQ ID NO：15]，
[0041] 其中：
[0042] X1选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或His，或其修饰的形式)；
[0043] X2选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Leu，或其修饰的形式)；
[0044] X3选自酸性氨基酸残基(例如Glu或Asp，或其修饰的形式)；
[0045] X4选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；
[0046] X5选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式)；
[0047] X6选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；
[0048] X7选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；
[0049] X8选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；
[0050] X9选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)；
[0051] X10选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Met或Val，或其修饰的形式)；
[0052] X11选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
[0053] X12选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Pro，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；
[0054] X13选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；
[0055] X14选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
[0056] X15选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Asp，或其修饰的形式)；
[0057] X16选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；
[0058] X17选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；
[0059] X18选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；
[0060] X19选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；
[0061] X20选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Lys，或其修饰的形式)；
[0062] X21选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；
[0063] X22选自小的氨基酸残基(例如Gly或Ser，或其修饰的形式)；
[0064] X23选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其修饰的形式)；
[0065] X24选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ala，或其修饰的形式)；
[0066] X25选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg或His，或其修饰的形式)；
[0067] X26选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Ile或Val，或其修饰的形式)；
[0068] X27选自碱性氨基酸残基(例如Arg或Lys，或其修饰的形式)；
[0069] X28选自小的氨基酸残基(例如Ser或Ala，或其修饰的形式)；
[0070] X29选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Trp，或其修饰的形式)；
[0071] X30选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基例如Arg，或其修饰的形式)；
[0072] X31选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基例如Glu，或其修饰的形式)；
[0073] X32选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
[0074] X33选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ser，或其修饰的形式)；
[0075] X34选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
[0076] X35选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Leu或Ile，或其修饰的形式，或具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe，或其修饰的形式)；
[0077] X36选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
[0078] X37不存在或选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
[0079] X38选自任意氨基酸残基(例如带电的氨基酸残基，包括碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，和酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式)；
[0080] X39选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)；
[0081] X40选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
[0082] X41选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；和
[0083] X42选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val，或其修饰的形式，或具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)。
[0084] 激活肽的代表性具体实施方式包含以下序列：
[0085] SFKGSVAEEELKHTALALEEDAHASDPRIDSNSAX43NX44DDIAGRYL[SEQID NO：16]，
[0086] 其中：
[0087] X43选自碱性氨基酸残基(例如Arg或His，或其修饰的形式)；和
[0088] X44选自小的氨基酸残基(例如Ser或Pro，或其修饰的形式)。
[0089] 在一些具体实施方式中，轻链包含以下序列：
[0090] RTIX45RX46NKRRYYIAAEEVLWDYSPIX47KSQVRSX48X49AKTTFKKAIFRSYLDDTFQTPSTGGEYEKHLGILGPIIRAEVDDVX50EX51QFX52NLASRPYSLHAHGLLYEKSSEGRSYDDX53SPELFKKDDAIMPNGTYTYVWQVPPRSGPTDNTEKCKSWAYYSGVNPEKDIHSGLIGPILICQKGMIDKYNRTIDIREFVLFFMVFDEEKSWYFPKSDKSTCEEKLIGVQX54SX55HTFPAINGIPYQLQGLX56MYKDENVHWHLLNMGGPKDX57HVVNFHGQTFTEEGREDNQLGVLPLLPGTFASIKMKPSKIGTWLLETEVGENQERGX58QALFTVIDKX59CKLPMGLASGIIQDSQISASGHVX60YWEPKLARLNNTGX61X62NAWSIIKKEHEHPWIQIDLQRQVVITGIQTQGTVX63LLX64HSYTVEYFVTYSX65DGQNWITFKGRHSX66TQMHFEGNSDGTTVKENHIDPPIIARYIRLHPTKFYNX67PTFRIELLGCEVEGCSVPLGMESGAIKX68SEITASSYKKTWWSSWEPX69LARLNLX70GX71TNAWQPX72VNNKDQWLQIDLQHLTKITSIITQGATSMTTX73MYVKTFSIHYTDDNSTWX74PYLDVRTSMEKVFTGNINX75DGHVKHFFX76PPILSRFIRIIPKTWNQYIALRIELFGCEVF[SEQ ID NO：17]，
[0091] 其中：
[0092] X45选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如Tyr，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)；
[0093] X46选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
[0094] X47选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
[0095] X48选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
[0096] X49选自小的氨基酸残基(例如Pro或Ala，或其修饰的形式)；
[0097] X50选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基或其修饰的形式，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
[0098] X51选自疏水性氨基酸残基(例如具有脂肪族侧链的氨基酸残基，例如Val或Ile，或其修饰的形式)；
[0099] X52选自碱性氨基酸残基(例如，Arg或Lys，或其修饰的形式)；
[0100] X53选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
[0101] X54不存在或选自小的氨基酸残基(例如Ser或其修饰的形式)；
[0102] X55选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Arg或His，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Leu，或其修饰的形式)；
[0103] X56选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式)；
[0104] X57选自任意氨基酸残基(包括疏水性氨基酸残基，包括具有脂肪族侧链的残基，例如Ile，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
[0105] X58选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式)；
[0106] X59选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
[0107] X60选自选自任意氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式)；
[0108] X61选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有含硫侧链的残基，例如Met，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
[0109] X62选自疏水性氨基酸残基(例如具有芳香族侧链的氨基酸残基，例如Phe或Tyr，或其修饰的形式)；
[0110] X63选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如His，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Gln，或其修饰的形式)；
[0111] X64选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)，或中性/极性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；
[0112] X65选自带电的氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式)；
[0113] X66选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
[0114] X67选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Thr，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
[0115] X68选自任意氨基酸残基(例如中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式，或酸性氨基酸残基，例如Asp，或其修饰的形式)；
[0116] X69选自任意氨基酸残基(例如疏水性氨基酸残基，包括具有芳香族侧链的残基，例如Phe，或其修饰的形式，或小的氨基酸残基，例如Ser，或其修饰的形式)；
[0117] X70选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
[0118] X71选自任意氨基酸残基(例如小的氨基酸残基，例如Gly，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Arg，或其修饰的形式)；
[0119] X72选自带电的氨基酸残基(例如酸性氨基酸残基，例如Glu，或其修饰的形式，或碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式)；
[0120] X73选自小的氨基酸残基(例如Ala或Ser，或其修饰的形式)；
[0121] X74选自选自碱性氨基酸残基(例如Lys或Arg，或其修饰的形式)；
[0122] X75选自小的氨基酸残基(例如Ser或Gly，或其修饰的形式)；
[0123] X76选自任意氨基酸残基(例如碱性氨基酸残基，例如Lys，或其修饰的形式，或中性/极性氨基酸残基，例如Asn，或其修饰的形式)。
[0124] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包含信号肽，其适宜地包括序列MGRYSVSPVPKCLLLMFLGWSGLKYYQ(SEQ ID NO：18)。
[0125] 蛇毒FV多肽适宜地包括这样的多肽序列：其包含与SEQ ID NO：15，16和17任一项所示的序列具有至少70，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至10，15或20个氨基酸残基差异的氨基酸序列。
[0126] 代表性的蛇毒FV多肽包含与SEQ ID NO：2和4(棕蛇)、SEQ ID NO：6和8(内陆太攀蛇)和SEQ ID NO：10和12(海岸太攀蛇)任一项所示的序列具有至少70，80，85，90，
91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至
10，15或20个氨基酸残基差异的序列。适宜地，蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域和激活肽
(或B)结构域中的至少一个。
91，92，93，94，95，96，97或98％序列相似性或序列同一性或与之具有不超过1，2，3，5乃至
10，15或20个氨基酸残基差异的序列。适宜地，蛇毒FV多肽缺少信号肽结构域和激活肽
(或B)结构域中的至少一个。
[0127] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽包含以下的任意一个或多个：FXa结合位点、凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点。在这种类型的示例性例子中，蛇毒FV多肽包含至少一个Fxa结合位点(例如，1个或2个)，凝血酶原结合位点和凝血酶切割位点。代表性的
蛇毒FV多肽包含以下任意一个或多个：
蛇毒FV多肽包含以下任意一个或多个：
[0128] (1)在大约残基338-379的FXa结合位点；
[0129] (2)在大约残基524-537的FXa结合位点；
[0130] (3)在大约残基703-707的凝血酶原结合位点；和
[0131] (4)在大约残基772-773的凝血酶切割位点；
[0132] 其中，编号是指图7中的共有编号。
[0133] 适宜地，蛇毒FV多肽在相对于图7的共有编号的残基818-819和/或残基537-538上包含APC位点。在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽的激活的蛋白C(APC)位点比野生
型哺乳动物(例如人)的FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5)。
型哺乳动物(例如人)的FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5)。
[0134] 在一些具体实施方式中，以包含药学上可接受载体或稀释剂的组合物的形式给予蛇毒FV多肽。组合物可以通过注射(全身)给药或通过局部应用以阻止或减少个体中从
出血位点或个体体内的血液流失。
出血位点或个体体内的血液流失。
[0135] 组合物可用于治疗由于医学或手术干预、有害的外伤或其它形式的组织损害而经历出血事件的个体，其示例性的例子包括：凝血病，包括多次输血个体中的凝血病；先天性或获得性凝血或出血紊乱，包括肝功能降低(“肝脏疾病”)；血小板功能缺陷或血小板数量减少；必需的凝固“化合物”(例如血小板或vonWillebrand因子蛋白)缺少或异常；纤维
蛋白溶解增加；抗凝血剂治疗或溶栓治疗；给予降低个体形成或维持血液凝块的能力的药
物；和干细胞移植。
蛋白溶解增加；抗凝血剂治疗或溶栓治疗；给予降低个体形成或维持血液凝块的能力的药
物；和干细胞移植。
[0137] 在其它具体实施方式中，出血事件是与个体中的手术或外伤相连的出血，所述个体具有维持或形成血液凝块能力的缺陷，例如由于急性关节血肿(关节出血)、慢性血友
病性关节炎、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、其它组织中的出血、血尿症(肾道出血)、大脑出血、手术(例如肝切除术)、拔牙和胃肠道出血(例如UGI出血)。此外，组合物
可用于治疗个体中由于例如外伤或手术或血小板数目或活性低下而发生的出血事件。
病性关节炎、血肿(例如肌肉、腹膜后、舌下和咽后)、其它组织中的出血、血尿症(肾道出血)、大脑出血、手术(例如肝切除术)、拔牙和胃肠道出血(例如UGI出血)。此外，组合物
可用于治疗个体中由于例如外伤或手术或血小板数目或活性低下而发生的出血事件。
[0138] 在另一个方面，本发明涉及以上广泛定义的蛇毒FV多肽在制备用于防止或减少个体中的血液流失或出血的药物或试剂盒中的用途。在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽
配制成局部给药。试剂盒可以包括例如一个或多个：组合物形式的FV多肽和药学上可接受
的载体；一个或多个用于制备蛇毒FV多肽以向个体给药的容器；一个或多个其它试剂和/
或其它治疗剂；用于向患者给予蛇毒FV多肽的设备或其它材料；和给予试剂盒以治疗个体
中的血液流失的说明书。在一些具体实施方式中，试剂盒不包括FVII和FVIIa。在一些具
体实施方式中，试剂盒不包括蛇毒FXa。
配制成局部给药。试剂盒可以包括例如一个或多个：组合物形式的FV多肽和药学上可接受
的载体；一个或多个用于制备蛇毒FV多肽以向个体给药的容器；一个或多个其它试剂和/
或其它治疗剂；用于向患者给予蛇毒FV多肽的设备或其它材料；和给予试剂盒以治疗个体
中的血液流失的说明书。在一些具体实施方式中，试剂盒不包括FVII和FVIIa。在一些具
体实施方式中，试剂盒不包括蛇毒FXa。
[0139] 适宜地，试剂盒用于减少获得完全止血所需的时间；减少维持止血所需的时间；减少凝固时间；延长凝块溶解的时间；和增加出血位点凝块的强度。
[0140] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽配制成用获得以下一项或多项的有效量来给予：(1)抑制出血(即抑制出血的有效量)；(2)减少凝固时间(即减少凝固时间的有效
量)；(3)增强止血(即，增强止血的有效量)；(4)延长凝块溶解时间(即，延长凝块溶解时
间的有效量)；和(5)增强凝块强度(即增强凝块强度的有效量)。
量)；(3)增强止血(即，增强止血的有效量)；(4)延长凝块溶解时间(即，延长凝块溶解时
间的有效量)；和(5)增强凝块强度(即增强凝块强度的有效量)。
[0141] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽配制为由个体之外的人员给药。或者，蛇毒FV多肽配制为自己给药。
[0145] 图3的代表图示显示了两个小组(每组5只小鼠)的血液流失的时间过程。一个小组按照在第[0256]段中描述的“小鼠尾部切除出血模型”以盐水在切下的尾巴上进行局
部处理。第二个小组按照相同的方式处理，不同的是使用盐水中的FVa溶液。在10分钟的
时间间隔内测定每只动物的血液流失，也测定处理溶液中的血液流失。
部处理。第二个小组按照相同的方式处理，不同的是使用盐水中的FVa溶液。在10分钟的
时间间隔内测定每只动物的血液流失，也测定处理溶液中的血液流失。
[0146] 图4是使用来自图3的数据的代表图示，其显示了：(a)每个测试组内的合计血液流失，每组共5只动物(见上端的图)；和(b)每个测试组中每20g小鼠的合计平均血液流
失，每组共5只动物(见下端的图)。
失，每组共5只动物(见下端的图)。
[0147] 图5是静脉内注射100μl盐水中的500nmol/L FVa(■)；100μl盐水(对照)(●)；和100μl盐水中的抑肽酶(110μmol/l)(▲)之后进行的小鼠尾部切除实验的代
表图示。每组n＝10。
表图示。每组n＝10。
[0148] 图6是(a)考马斯染色的凝胶(凝胶1)和(b)Western印迹(凝胶2)的代表性图像，其证明：用抗-蛋白酶重链抗体(针对含有澳洲棕蛇FXa样蛋白酶重链的重组GST融
合蛋白的绵羊抗血清)似乎去除了亲和纯化的FV制备物的因子Xa。凝胶(a)和(b)的泳
道1包含澳洲棕蛇蛇毒FV蛋白；泳道2包含澳洲棕蛇FXa样蛋白酶；泳道3包含FV(Dardak
和Xa亲和去除之后)。
合蛋白的绵羊抗血清)似乎去除了亲和纯化的FV制备物的因子Xa。凝胶(a)和(b)的泳
道1包含澳洲棕蛇蛇毒FV蛋白；泳道2包含澳洲棕蛇FXa样蛋白酶；泳道3包含FV(Dardak
和Xa亲和去除之后)。
[0149] 图7例示了分离的蛇毒FV之间的序列比对。显示了源自以下蛇的蛇毒FV的氨基酸序列：澳洲棕蛇(棕蛇)(SEQ ID NO：2)、O.microlepidotus(内陆太攀蛇)(SEQ ID NO：
6和8)和O.scutellatus(海岸太攀蛇)(SEQ ID NO：10和12)。
6和8)和O.scutellatus(海岸太攀蛇)(SEQ ID NO：10和12)。
[0150] 表A
[0151] 序列简要描述
[0152]序列编号 序列 长度
SEQ ID NO：1 对应于来自澳洲棕蛇毒腺的FV样基因 4383nt
(AY168281)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：1的编码区编码的FV样多肽 1460aa
SEQ ID NO：3 对应于来自澳洲棕蛇肝脏的FV样基因 4737nt
(AY576416)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：5 对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因 4383nt
(AY940210)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5的编码区编码的FV样多肽 1460aa
SEQ ID NO：7 对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和 4380nt
非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：7的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：9 对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因 4380nt
(AY940209)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：9的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：11 对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和 4675nt
非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：11的编码区编码的FV样多肽 1458aa
SEQ ID NO：13 对应于人类FV基因的编码区和非编码区的核苷酸 9179nt
序列
SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：13的编码区编码的人类FV多肽 2224aa
SEQ ID NO：15 蛇毒FV重链 742aa
SEQ ID NO：16 蛇毒FV激活肽 45aa
SEQ ID NO：17 蛇毒FV轻链 644aa
SEQ ID NO：18 蛇毒FV信号肽 27aa
SEQ ID NO：1 对应于来自澳洲棕蛇毒腺的FV样基因 4383nt
(AY168281)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：2 SEQ ID NO：1的编码区编码的FV样多肽 1460aa
SEQ ID NO：3 对应于来自澳洲棕蛇肝脏的FV样基因 4737nt
(AY576416)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：5 对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因 4383nt
(AY940210)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5的编码区编码的FV样多肽 1460aa
SEQ ID NO：7 对应于来自内陆太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和 4380nt
非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：7的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：9 对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因 4380nt
(AY940209)的编码和非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：9的编码区编码的FV样多肽 1459aa
SEQ ID NO：11 对应于来自海岸太攀蛇毒腺的FV样基因的编码和 4675nt
非编码区的核苷酸序列
SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：11的编码区编码的FV样多肽 1458aa
SEQ ID NO：13 对应于人类FV基因的编码区和非编码区的核苷酸 9179nt
序列
SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：13的编码区编码的人类FV多肽 2224aa
SEQ ID NO：15 蛇毒FV重链 742aa
SEQ ID NO：16 蛇毒FV激活肽 45aa
SEQ ID NO：17 蛇毒FV轻链 644aa
SEQ ID NO：18 蛇毒FV信号肽 27aa
具体实施方式
[0153] 1.定义
[0154] 除非另有指明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的相似或等同的任何方法和材料均可用于实
施或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下定义了下述术
语。
施或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，以下定义了下述术
语。
[0155] 本文使用的冠词“a”和“an”是指一个或多个(即，至少一个)该冠词的语法客体。举例来讲，“an元件”意思是一个元件或多个元件。
[0156] “大约”意思是数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度比参考数量、水平、数值、数字、频率、百分率、尺寸、大小、量、重量或长度改变30，25，20，25，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1％。
[0157] 用于参考或全长多核苷酸或多肽序列的片段的术语“生物活性片段”是指具有参考序列的至少大约0.1，0.5，1，2，5，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，35，40，45，50，
55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99％的活性的片段。本发明范围内包括长度为至少大约18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，
160，180，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000个核苷酸或残基的生物活性片段，其包含或编码参考多核苷酸或多肽的活性。代表性的生物活性片段一般参与
相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或
酶的相互作用。分子间相互作用可以是蛇毒FV分子和FXa分子间的。蛇毒FV蛋白的生物
活性部分包括：包含与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的蛇毒FV的氨基酸序列具有足够相似性或同一性或源于其中的氨基酸序列的肽。
55，60，65，70，75，80，85，90，95，96，97，98，99％的活性的片段。本发明范围内包括长度为至少大约18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，40，50，60，70，80，90，100，120，140，
160，180，200，250，300，400，500，600，700，800，900，1000，1500，2000个核苷酸或残基的生物活性片段，其包含或编码参考多核苷酸或多肽的活性。代表性的生物活性片段一般参与
相互作用，例如分子内或分子间相互作用。分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或
酶的相互作用。分子间相互作用可以是蛇毒FV分子和FXa分子间的。蛇毒FV蛋白的生物
活性部分包括：包含与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的蛇毒FV的氨基酸序列具有足够相似性或同一性或源于其中的氨基酸序列的肽。
[0158] 本文使用的术语“出血紊乱”是指在出血事件中表现的任何先天性的、获得性的或诱导的，细胞或分子来源的缺陷。出血紊乱的例子包括但不限于，凝固因子缺陷、凝固因子抑制剂、血小板功能缺陷、血小板减少症、血管性假性血友病(von Willebrand disease)和例如由于出血和/或输血引起的凝固蛋白稀释、纤维蛋白溶解增加和血小板数目减少引起的凝血病。
[0159] 本文使用的术语“出血事件”是指与手术、外伤和其它形式的组织损害相联的有害的、非控制的和经常性的过量出血，以及具有如上定义的出血紊乱的个体中的有害的出血。
[0160] 本文使用的术语“凝块溶解时间”、“凝块强度”和“凝固时间”是指用于检测个体的止血系统状态的临床参数。可以在适宜的间隔从个体获取血液样品并通过一些方式例如Meh等人，(2001，Blood Coagulation and Fibrinolysis，12：627-637)；Vig等人，(2001，Hematology，6(3)：205-213)；Vig 等 人，(2001，Blood Coagulation andFibrinolysis，
12(7)：555-561)；Glidden等人，(2000，Clinical and AppliedThrombosis/Hemostasis，
6(4)：226-233；McKenzie 等 人，(1999，Cardiology，92(4)：240-247)和 Davies 等 人，(1995，Journal of the American Society of Nephrology，6(4)：1250-1255)描述的凝血弹性描记法检测一个或多个参数。可以按照例如Carr等人，(1991，Am J Med，302：13-8)的描述检测凝块强度。
12(7)：555-561)；Glidden等人，(2000，Clinical and AppliedThrombosis/Hemostasis，
6(4)：226-233；McKenzie 等 人，(1999，Cardiology，92(4)：240-247)和 Davies 等 人，(1995，Journal of the American Society of Nephrology，6(4)：1250-1255)描述的凝血弹性描记法检测一个或多个参数。可以按照例如Carr等人，(1991，Am J Med，302：13-8)的描述检测凝块强度。
[0161] 本文使用的术语“凝固紊乱”是指破坏身体控制血液凝固能力的紊乱。最经常为人所知的凝固紊乱是血友病，在该病症中患者持续出血很长一段时间直至凝固。还有其它
的多种原因引起的凝固紊乱，其非限制性例子包括：血友病B、血友病C、消耗性凝血病、血小板减少症、血管性假性血友病(Von Willebrand disease)和低凝血酶原血症。
的多种原因引起的凝固紊乱，其非限制性例子包括：血友病B、血友病C、消耗性凝血病、血小板减少症、血管性假性血友病(Von Willebrand disease)和低凝血酶原血症。
[0162] “编码序列”是指对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不对基因的多肽产物的编码做出贡献的任何核酸序列。
[0163] 贯穿本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包括(comprise)”、“包括(comprises)”“包括(comprising)”将被理解为暗示包括所述的步骤或元素或步骤或
元素的组，但不排除任何其它的步骤或元素或步骤或元素的组。因此，使用术语“包括
(comprising)”等是指所列的元素是需要的或强制性的，但是其它元素是可选的并且可以
存在或不存在。“由……组成”意思是包括并且局限于词组“由……组成”之后跟随的任意词。因此，词组“由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的并且不存在其它任何元素。“基本上由……组成”意思是包括该词组后所列的任何元素，并且局限于不干扰本公开中的所列元素的活性或作用或对其无贡献的其它元素，因此，词组“基本上由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的，但是所述其它元素是可选的并且可以存在或不存在，
这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。
元素的组，但不排除任何其它的步骤或元素或步骤或元素的组。因此，使用术语“包括
(comprising)”等是指所列的元素是需要的或强制性的，但是其它元素是可选的并且可以
存在或不存在。“由……组成”意思是包括并且局限于词组“由……组成”之后跟随的任意词。因此，词组“由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的并且不存在其它任何元素。“基本上由……组成”意思是包括该词组后所列的任何元素，并且局限于不干扰本公开中的所列元素的活性或作用或对其无贡献的其它元素，因此，词组“基本上由……组成”是指所列的元素是需要的或强制性的，但是所述其它元素是可选的并且可以存在或不存在，
这取决于它们是否影响所列元素的活性或作用。
[0164] 术语“互补的”和“互补性”是指碱基配对规则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列“A-G-T”与序列“T-C-A”是互补的。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸碱基是根据碱基配对规则匹配的。或者，在核酸之间可以有“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间的杂交的效率和强度具有显著影响。
[0165] “对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意思是：(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或部分实质上相同或互补的核苷酸序列，或编码与肽或蛋白中的氨基酸序列相同的氨基酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白中的氨基酸序列
实质上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
实质上相同的氨基酸序列的肽或多肽。
[0166] 在治疗或预防病症的上下文中“有效量”是指向有此治疗或预防需要的个体给予的(单一剂量或作为系列的部分)有效治疗或预防该病症的活性剂的量。有效量将根据待
治疗的个体的健康或身体条件、待治疗个体的分类组、组合物的配制、医疗状况的评价和其它相关因子而变化。预期该量将落在相对宽的范围内，可以通过常规试验加以确定。
治疗的个体的健康或身体条件、待治疗个体的分类组、组合物的配制、医疗状况的评价和其它相关因子而变化。预期该量将落在相对宽的范围内，可以通过常规试验加以确定。
[0167] 本文使用的术语“功能”和“功能性的”等是指生物学、酶学或治疗上的功能。
[0168] 本文使用的术语“FV多肽”包括但不限于蛇毒FV多肽，并且预期包括但不限于，具有与SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12任一项所示的序列以及源自其它物种(例如，如，牛、猪、狗、小鼠、大鼠和鲑鱼)的野生型(天然产生的)FV具有至少50％(以及至少51％至至少99％和其中所有的整数百分数)序列同一性的氨基酸序列的多肽。它还包括可能存在于或
产生于个体与个体之间的FV的天然等位基因变种。同样，糖基化和其它翻译后修饰的程度
和位置可以根据所选的宿主和宿主细胞环境的性质而改变。术语“FV”还预期包括酶原形
式的FV多肽，以及那些经过处理以产生其各自生物活性形式的多肽。它还包括这样的FV
多肽：经过相对于参考或天然产生的蛇毒FV的化学修饰，和/或相对于参考或天然产生的
蛇毒FV的氨基酸序列含有一个或多个改变，和/或相对于参考或天然产生的全长或前体蛇
毒FV含有截短的氨基酸序列。因此，例如，蛇毒FV多肽包括天然产生的或参考全长或前体
蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，FVa多肽。可替代的，或除此之外，蛇毒FV多肽可以显示出相对于参考或天然产生的蛇毒FV不同的性质，包括稳定性、磷脂结合性、改变的
特异性活性等。术语“FV多肽”还包括具有稍微修饰的氨基酸序列的多肽，例如，具有修饰的N-末端(包括N-末端氨基酸删除或添加)的多肽，和/或经过相对于参考或天然产生
的蛇毒FV的化学修饰的多肽。FV多肽还包括这样的多肽：显示出与参考或天然产生的FV
实质上相同或更优的生物活性，或者可替代地，相对于参考或天然产生的FV显示出实质上
改变的或降低的生物活性。它们还包括但不限于这样的多肽：通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸而具有不同于参考或天然产生的FV的序列的氨基酸序列，示例性的例子包括
显示出至少大约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％和130％的参考或天然产生的FV(在相同的细胞中产生的)的特异性活性的多肽。具有与
参考或天然产生的FV实质上相同或改进的生物活性的FV多肽包括显示出至少大约25％，
50％，75％，100％，110％，120％或130％的参考或天然产生的FV(在相同的细胞类型中产生的)的特异性生物活性的多肽。为了本发明的目的，FV生物活性可以通过例如测定制备
物使血浆凝固能力(如Thorelli等人，1998，Thromb Haemost，80：92所描述)而进行定量。
相反，相对于参考或天然产生的FV具有实质上降低的生物活性的FV多肽是那些显示出大
约25％，10％，5％或1％以下的参考或天然产生的FV(在相同的细胞类型中产生的)的特
异性活性的多肽。
产生于个体与个体之间的FV的天然等位基因变种。同样，糖基化和其它翻译后修饰的程度
和位置可以根据所选的宿主和宿主细胞环境的性质而改变。术语“FV”还预期包括酶原形
式的FV多肽，以及那些经过处理以产生其各自生物活性形式的多肽。它还包括这样的FV
多肽：经过相对于参考或天然产生的蛇毒FV的化学修饰，和/或相对于参考或天然产生的
蛇毒FV的氨基酸序列含有一个或多个改变，和/或相对于参考或天然产生的全长或前体蛇
毒FV含有截短的氨基酸序列。因此，例如，蛇毒FV多肽包括天然产生的或参考全长或前体
蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，FVa多肽。可替代的，或除此之外，蛇毒FV多肽可以显示出相对于参考或天然产生的蛇毒FV不同的性质，包括稳定性、磷脂结合性、改变的
特异性活性等。术语“FV多肽”还包括具有稍微修饰的氨基酸序列的多肽，例如，具有修饰的N-末端(包括N-末端氨基酸删除或添加)的多肽，和/或经过相对于参考或天然产生
的蛇毒FV的化学修饰的多肽。FV多肽还包括这样的多肽：显示出与参考或天然产生的FV
实质上相同或更优的生物活性，或者可替代地，相对于参考或天然产生的FV显示出实质上
改变的或降低的生物活性。它们还包括但不限于这样的多肽：通过插入、删除或取代一个或多个氨基酸而具有不同于参考或天然产生的FV的序列的氨基酸序列，示例性的例子包括
显示出至少大约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％和130％的参考或天然产生的FV(在相同的细胞中产生的)的特异性活性的多肽。具有与
参考或天然产生的FV实质上相同或改进的生物活性的FV多肽包括显示出至少大约25％，
50％，75％，100％，110％，120％或130％的参考或天然产生的FV(在相同的细胞类型中产生的)的特异性生物活性的多肽。为了本发明的目的，FV生物活性可以通过例如测定制备
物使血浆凝固能力(如Thorelli等人，1998，Thromb Haemost，80：92所描述)而进行定量。
相反，相对于参考或天然产生的FV具有实质上降低的生物活性的FV多肽是那些显示出大
约25％，10％，5％或1％以下的参考或天然产生的FV(在相同的细胞类型中产生的)的特
异性活性的多肽。
[0169] 术语“基因”是指遗传单位，其在染色体上占有特定的基因座并且由转录和/或翻译调控序列和/编码区和/或非翻译序列(即，内含子、5’和3’非翻译序列)组成。
[0170] 本文使用的术语“止血”是指在损伤位点形成稳定的和固体的纤维蛋白凝块或栓塞，其有效地阻止出血并且不会被纤维蛋白水解系统容易地分解。
[0171] “同源性”是指相同或组成型保守替换的核酸或氨基酸的百分比数目。可以使用序列比对程序例如GAP(Deveraux等人，1984，Nucleic Acids Research 12，387-395)(通过引用并入本文)确定同源性。按照这个方式，可以通过将空隙插入比对中而进行与本文所
列的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法
确定。
列的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法
确定。
[0172] 术语“宿主细胞”包括这样的个体细胞或细胞培养物：其可以是或已经是本发明任意的重组载体或分离的多核苷酸的受体。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，由于天然、偶然或人为的突变和/或改变，该子代不一定与最初的母代细胞完全相同(形态学或总DNA互补)。宿主细胞包括在体内或体外经过本发明的重组载体或多核苷酸转染或感染的细胞。
包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
包含本发明的重组载体的宿主细胞是重组宿主细胞。
[0173] 本文使用的术语“杂交”是指互补性核苷酸序列的配对以产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体。互补性碱基序列是根据碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T
配对；C与G配对。在RNA中，U与A配对；C与G配对。在这个意义上，本文使用的术语“匹
配”和“错配”是指互补性核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交，例如如上所述的经典的A-T和G-C碱基对。错配是其它的那些不有效杂交的核苷酸组合。
配对；C与G配对。在RNA中，U与A配对；C与G配对。在这个意义上，本文使用的术语“匹
配”和“错配”是指互补性核酸链中配对的核苷酸的杂交潜力。匹配的核苷酸有效地杂交，例如如上所述的经典的A-T和G-C碱基对。错配是其它的那些不有效杂交的核苷酸组合。
[0174] “分离的”是指实质上或基本上不含在其天然状态中通常具有的成分的材料。例如，本文使用的“分离的多核苷酸”是指从天然产生状态的其两侧序列中纯化而来的多核苷酸，例如，从通常临近片段的序列中除掉的DNA片段。或者，本文使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指在体外从天然细胞环境或从与细胞的其它成分的结合中分离和/或纯化
的肽或多肽分子，即，其不与体内物质结合。
的肽或多肽分子，即，其不与体内物质结合。
[0175] “从……获得”是指这样的样品，例如，如，从特定的个体来源分离而来或衍生而来的多核苷酸提取物或多肽提取物。例如，提取物可以获自直接从个体分离的组织或生物液体。
[0176] 本文使用的术语“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接的多个核苷酸残基(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关的结构变体或合成类似物)组成的聚合物(或其相关
的结构变体或合成类似物)。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中的核苷酸残基和残基之间的键是天然产生的核苷酸聚合物，但是应该理解，该术语范围内还包括各种类似物，包括但不限于，肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、甲基磷酸酯、
2-O-甲基核糖核酸等等。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸通常长
短很短，一般是大约10至30个核苷酸残基，但是该术语可以指任意长度的分子，虽然术语
“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
的结构变体或合成类似物)。因此，虽然术语“寡核苷酸”通常是指其中的核苷酸残基和残基之间的键是天然产生的核苷酸聚合物，但是应该理解，该术语范围内还包括各种类似物，包括但不限于，肽核酸(PNA)、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioates)、甲基磷酸酯、
2-O-甲基核糖核酸等等。分子的精确大小可以根据特定的应用而变化。寡核苷酸通常长
短很短，一般是大约10至30个核苷酸残基，但是该术语可以指任意长度的分子，虽然术语
“多核苷酸”或“核酸”通常用于大的寡核苷酸。
[0177] 本文使用的术语“可操作连接”是指将结构基因置于启动子的调控控制之下，然后启动子控制基因的转录和可选的翻译。在构建异源启动子/结构基因组合时，一般优选使遗传序列或启动子与基因转录起始点的距离大体上等于遗传序列或启动子与天然环境中
该遗传序列或启动子控制的基因之间的距离，即该遗传序列或启动子所源自的基因。本领
域中已知该距离的一些变化可以被适应而不丧失功能。类似地，调控序列元件相对于其控
制的异源基因的优选位置由天然环境中元件的位置决定，即该元件所源自的基因。
该遗传序列或启动子控制的基因之间的距离，即该遗传序列或启动子所源自的基因。本领
域中已知该距离的一些变化可以被适应而不丧失功能。类似地，调控序列元件相对于其控
制的异源基因的优选位置由天然环境中元件的位置决定，即该元件所源自的基因。
[0178] 术语“患者”和“个体”相互交换地使用，是指人类或其它哺乳动物患者和个体，包括任何需要使用本发明的方法检查或治疗的个体。但是，应该理解“患者”不意味着存在症状。落入本发明范围的合适的哺乳动物包括但不限于，灵长类、家畜动物(例如，绵羊、牛、马、驴、猪)、实验室测试动物(例如，兔子、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如，猫、狗)和被捕获的野生动物(例如，狐狸、鹿、澳洲野狗(dingo))。
[0179] “药学上可接受的载体”是指可以用于安全地向动物(优选哺乳动物，包括人类)局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。
[0180] 本文使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。该术语通常指长度为至少10个碱基的核苷酸的聚合物形式，不论是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
[0181] 术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指显示出与参考多核苷酸序列实质上序列同一性的多核苷酸，或与参考序列在下文定义的严谨条件下杂交的多核苷酸。这些术语还
包括通过添加、删除或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术
语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或删除或被不同核苷酸
取代的多核苷酸。在这个意义上，本领域中广泛理解的是可以对参考多核苷酸进行某些改
变(包括突变、添加、删除和替换)而改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活
性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然产生的等位基因变体。
包括通过添加、删除或替换至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术
语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸被添加或删除或被不同核苷酸
取代的多核苷酸。在这个意义上，本领域中广泛理解的是可以对参考多核苷酸进行某些改
变(包括突变、添加、删除和替换)而改变的多核苷酸保留参考多核苷酸的生物学功能或活
性。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然产生的等位基因变体。
[0182] “多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中相互替换使用，是指氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然产生的氨基酸(例如相应的天然产生的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物以及天然产生的
氨基酸聚合物。
氨基酸聚合物。
[0183] 术语“多肽变体”是指通过添加、删除或替换至少一个氨基酸残基而与参考多肽不同的多肽。在一些具体实施方式中，多肽变体相对于参考多肽具有一个或多个替换，其可以是保守性或非保守性的。在一些具体实施方式中，多肽变体包括保守性替换，在此意义上，本领域广泛理解的是一些氨基酸可以改变为其它具有广泛相似性质的氨基酸而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸被添加或删除或被不同氨基酸残基
替换的多肽。
替换的多肽。
[0184] “引物”是指这样的寡核苷酸：当与DNA的一条链配对时，在存在合适的聚合剂的情况下，能够启动引物延伸产物的合成。引物优选是单链的以获得最大扩增效率，但也可以是双链的。引物必须足够长以在存在聚合剂的情况下启动延伸产物的合成。引物的长度取决于很多因素，包括应用、要使用的温度、模板反应条件、其它试剂和引物来源。例如，取决于靶序列的复杂程度，寡核苷酸引物通常包含15至35个或更多个核苷酸残基，虽然其可以
包括更少的核苷酸残基。引物可以是大的多核苷酸，例如大约200个核苷酸残基至几千个
碱基或更多。可以将引物选择为与该引物设计用于杂交的模板上的序列“实质上互补”，并且作为合成的起始位点。“实质上互补”意思是引物互补性足以与靶多核苷酸杂交。优选
地，引物不含有相对于该引物设计用于杂交的模板的错配，但这不是必须的。例如，非互补性核苷酸残基可以与引物的5’末端连接，引物序列的其余部分与模板是互补的。或者，非互补性核苷酸残基或非互补性核苷酸残基延伸可以散布于引物内，只要引物序列与其要杂
交的模板序列具有足够的互补性，从而形成用于合成引物的延伸产物的模板。
包括更少的核苷酸残基。引物可以是大的多核苷酸，例如大约200个核苷酸残基至几千个
碱基或更多。可以将引物选择为与该引物设计用于杂交的模板上的序列“实质上互补”，并且作为合成的起始位点。“实质上互补”意思是引物互补性足以与靶多核苷酸杂交。优选
地，引物不含有相对于该引物设计用于杂交的模板的错配，但这不是必须的。例如，非互补性核苷酸残基可以与引物的5’末端连接，引物序列的其余部分与模板是互补的。或者，非互补性核苷酸残基或非互补性核苷酸残基延伸可以散布于引物内，只要引物序列与其要杂
交的模板序列具有足够的互补性，从而形成用于合成引物的延伸产物的模板。
[0185] “探针”是指与特定序列或亚序列或另一个分子的其它部分结合的分子。除非另有指明，否则术语“探针”通常是指通过互补性碱基配对与另一个多核苷酸(通常称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。探针可以与缺少与探针完全序列互补性的靶多核苷酸结合，这取决于杂交条件的严谨度。探针可以进行直接或间接标记。
[0186] “调控元件”或“调控序列”意思是在特定宿主细胞中表达可操作连接的编码序列所必需的核酸序列(例如DNA)。例如，适合于原核细胞的调控序列包括启动子和可选的顺式作用序列，例如操纵子序列和核糖体结合位点。适合于真核细胞的控制序列包括启动子、多腺苷化信号、转录增强子、翻译增强子、调节mRNA稳定性的引导或尾随序列，以及将转录的多核苷酸编码的产物靶向细胞中的细胞内腔室或细胞外环境的定向序列。
[0187] 本文使用的术语“序列同一性”是指在比较窗口中序列基于一个核苷酸一个核苷酸或基于一个氨基酸一个氨基酸的相同程度。因此，“序列同一性百分率”这样计算：在比较窗口比较两个最佳比对的序列，确定两个序列中产生相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数目以生成匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中总的位置数目(即窗口大小)，并且将结果乘以100以产生序列同一性百分
率。本发明考虑到在本发明的方法和系统中全长蛇毒FV序列及其生物活性片段的用途。通
常来讲，全长蛇毒FV的生物活性片段可能参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。
分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶的相互作用(例如相互作用可以是瞬间
的，产生或打破共价键)。全长蛇毒FV的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇
毒FV的氨基酸序列具有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽。通常
来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV的至少一个活性的结构域或基序，并且可以包括
A1、A2、B、A3、C1或C2结构域中的一个或多个(在一些情况下全部包括)。全长蛇毒FV的
生物活性片段可以是例如长度为30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400或500个氨基酸残基的多肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的约1％、10％、
25％、50％的活性。
率。本发明考虑到在本发明的方法和系统中全长蛇毒FV序列及其生物活性片段的用途。通
常来讲，全长蛇毒FV的生物活性片段可能参与相互作用，例如，分子内或分子间相互作用。
分子间相互作用可以是特异性结合相互作用或酶的相互作用(例如相互作用可以是瞬间
的，产生或打破共价键)。全长蛇毒FV的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇
毒FV的氨基酸序列具有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽。通常
来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV的至少一个活性的结构域或基序，并且可以包括
A1、A2、B、A3、C1或C2结构域中的一个或多个(在一些情况下全部包括)。全长蛇毒FV的
生物活性片段可以是例如长度为30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400或500个氨基酸残基的多肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的约1％、10％、
25％、50％的活性。
[0188] “相似性”是指相同或以下表C中定义的组成型保守替换的氨基酸数目的百分率。可以使用序列比对程序例如GAP(Deveraux等人1984，Nucleic AcidsResearch 12：
387-395)来确定相似性。按照这个方式，可以通过将空隙插入比对中而进行与本文所列
的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法确
定。
387-395)来确定相似性。按照这个方式，可以通过将空隙插入比对中而进行与本文所列
的序列相似或实质上不同长度的序列的比较，这样的空隙通过例如GAP所用的比较算法确
定。
[0189] 用于描述两个或两个以上多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分率”和“实质上相同”。“参考序列”的长度为至少12个但通常为15-18个，常常为至少25个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。
因为两个多核苷酸每个可以包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅仅全部多核
苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以，两个(或两个以上)
多核苷酸之间的序列比较通常这样进行：将两个多核苷酸的序列与“比较窗口”进行比较以鉴别并比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指概念上的至少6个连续位置的片段，经常为大约50至大约100个，更经常为大约100至大约150个，其中，在将两个序列优化
比对之后，将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比较窗口相对于参考
序列(参考序列不包含添加或删除)可以包含大约20％或20％以下的添加或删除(即空
隙)，以进行两个序列的优化比对。可以通过算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)的计算机化应用或通过所选的不同方法中的任意一个所产生
的检验和最佳比对(即，在对比窗口产生最高的同源性百分率)来进行用于比对对比窗口
的序列的优化比对。还可以参考例如由Altschul等人，1997，Nucl.Acids Res.25：3389公开的BLAST程序家族。可以在Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章的单元19.3中找到序列分析的详细讨论。
因为两个多核苷酸每个可以包含(1)在两个多核苷酸之间相似的序列(即，仅仅全部多核
苷酸序列的一部分)，和(2)在两个多核苷酸之间不同的序列，所以，两个(或两个以上)
多核苷酸之间的序列比较通常这样进行：将两个多核苷酸的序列与“比较窗口”进行比较以鉴别并比较序列相似性的局部区域。“比较窗口”是指概念上的至少6个连续位置的片段，经常为大约50至大约100个，更经常为大约100至大约150个，其中，在将两个序列优化
比对之后，将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比较窗口相对于参考
序列(参考序列不包含添加或删除)可以包含大约20％或20％以下的添加或删除(即空
隙)，以进行两个序列的优化比对。可以通过算法(Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Drive Madison，WI，USA中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA)的计算机化应用或通过所选的不同方法中的任意一个所产生
的检验和最佳比对(即，在对比窗口产生最高的同源性百分率)来进行用于比对对比窗口
的序列的优化比对。还可以参考例如由Altschul等人，1997，Nucl.Acids Res.25：3389公开的BLAST程序家族。可以在Ausubel等人，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons Inc，1994-1998，第15章的单元19.3中找到序列分析的详细讨论。
[0190] 本文使用的“严谨度”是指杂交和洗涤程序中的温度和离子强度条件、存在或不存在某些有机溶剂。严谨度越高，固定的靶核苷酸序列和洗涤之后保持与靶向杂交的标记的探针多核苷酸序列之间的互补性越高。术语“高度严谨”是指只有那些具有高频互补性碱
基的核苷酸序列才杂交的温度和离子条件。所需的严谨度依赖于核苷酸序列并取决于杂交
过程中存在的各种成分。一般地，将严谨条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下
的热熔解温度(Tm)低大约10-20℃。Tm是50％的靶序列与互补性探针杂交时的温度(在
确定的离子强度和pH下)。
基的核苷酸序列才杂交的温度和离子条件。所需的严谨度依赖于核苷酸序列并取决于杂交
过程中存在的各种成分。一般地，将严谨条件选择为比特定序列在确定的离子强度和pH下
的热熔解温度(Tm)低大约10-20℃。Tm是50％的靶序列与互补性探针杂交时的温度(在
确定的离子强度和pH下)。
[0192] 本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得想要的药理学和/或生理学效应。该效应可以是预防性的—完全或部分防止疾病或其症状；和/或可以是治疗性的—部分或全部治愈疾病和/或该疾病的有害影响。本文使用的“治疗”涵盖
哺乳动物(特别是人)的疾病的任意治疗，包括：(a)防止易于患上某疾病但尚未被诊断患
有该疾病的个体发生该疾病；(b)抑制疾病，即使其发展停滞；和(c)缓解疾病，即使疾病倒退。
哺乳动物(特别是人)的疾病的任意治疗，包括：(a)防止易于患上某疾病但尚未被诊断患
有该疾病的个体发生该疾病；(b)抑制疾病，即使其发展停滞；和(c)缓解疾病，即使疾病倒退。
[0193] “载体”是指这样的多核苷酸分子，优选为源自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，其中可以插入或克隆入多核苷酸。载体优选含有一个或多个独特的限制性位点，并且能够在确定的宿主细胞(包括靶细胞或组织或其前体细胞或组织)中自主复制，或可以整合进入确定的宿主基因组中，从而克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复
制的载体，即以额外染色体实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线性或闭合环状质粒、额外染色体元件、微小染色体或人工染色体。载体可以包含任意确保自我复制
的方式。或者，载体可以是：当被引入宿主细胞时，其整合进入基因组中并且与其所整合
进入的基因组一起复制。载体系统可以包含单一载体或质粒、两个或两个以上载体或质粒
(其一起包含需要导入宿主细胞基因组的总DNA)或转位子。载体的选择通常取决于载体
与该载体要引入的宿主细胞的兼容性。在本例中，载体优选是病毒或源自病毒的载体，其
在动物和优选在哺乳动物细胞中是可操作的有功能的。这样的载体可以源自痘病毒、腺病
毒或酵母。载体还可以包括选择性标记物，例如抗生素抗性基因，其可用于选择合适的转
化子。这样的抗性基因的例子对于本领域技术人员是已知的，包括赋予抗生素卡那霉素和
G418(Geneticin )抗性的nptII基因和赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
制的载体，即以额外染色体实体存在的载体，其复制独立于染色体的复制，例如线性或闭合环状质粒、额外染色体元件、微小染色体或人工染色体。载体可以包含任意确保自我复制
的方式。或者，载体可以是：当被引入宿主细胞时，其整合进入基因组中并且与其所整合
进入的基因组一起复制。载体系统可以包含单一载体或质粒、两个或两个以上载体或质粒
(其一起包含需要导入宿主细胞基因组的总DNA)或转位子。载体的选择通常取决于载体
与该载体要引入的宿主细胞的兼容性。在本例中，载体优选是病毒或源自病毒的载体，其
在动物和优选在哺乳动物细胞中是可操作的有功能的。这样的载体可以源自痘病毒、腺病
毒或酵母。载体还可以包括选择性标记物，例如抗生素抗性基因，其可用于选择合适的转
化子。这样的抗性基因的例子对于本领域技术人员是已知的，包括赋予抗生素卡那霉素和
G418(Geneticin )抗性的nptII基因和赋予对抗生素潮霉素B抗性的hph基因。
[0194] 术语“野生型”和“天然产生的”相互替换地使用，是指具有从天然产生的来源分离出来的基因或基因产物的特性的基因或基因产物。野生型基因或基因产物(例如多肽)是在群体中最常见到的，因此被人为地指定为该基因的“正常的”或“野生型”形式。
[0195] 2.本发明的FV分子
[0196] 本发明部分基于以下确定：当在不存在其它凝固因子例如因子Xa和/或因子VIIa的情况下向个体给予蛇毒FV多肽可以实质性增强人类血浆和全血的凝固。本发明
人令人惊奇地发现：单独加入低浓度(例如纳摩尔范围的)的来自澳洲棕蛇Pseudonaja
textilis的FV多肽可以引起柠檬酸化的血浆凝固速率的显著提高。因此，本发明人考虑
蛇毒FV多肽可用于治疗或预防手术损伤或外伤后自伤口的血液流失以及血液中内在因子
V水平较低的个体(例如，患有副血友病或Owren副血友病的个体中，其症状可能包括以下
任意一种或多种：出血进入皮肤、过度瘀伤、流鼻血、牙龈出血、过量月经出血、手术或外伤的延长出血或过量出血，以及脐带残端出血)中的血液流失。
人令人惊奇地发现：单独加入低浓度(例如纳摩尔范围的)的来自澳洲棕蛇Pseudonaja
textilis的FV多肽可以引起柠檬酸化的血浆凝固速率的显著提高。因此，本发明人考虑
蛇毒FV多肽可用于治疗或预防手术损伤或外伤后自伤口的血液流失以及血液中内在因子
V水平较低的个体(例如，患有副血友病或Owren副血友病的个体中，其症状可能包括以下
任意一种或多种：出血进入皮肤、过度瘀伤、流鼻血、牙龈出血、过量月经出血、手术或外伤的延长出血或过量出血，以及脐带残端出血)中的血液流失。
[0197] 因此，本发明提供了防止或减少个体中的血液流失或出血的方法，其中以组合物的形式给予FV多肽，所述组合物可选地包含药学上可接受的载体或稀释剂。可以通
过注射或局部给予组合物以防止或减少个体中的血液流失。可以从中获得蛇毒多肽的
蛇的非限制性例子包括澳洲常见的棕蛇Pseudonaja textilis、海岸太攀蛇(Oxyuranus
scutellatus)、内陆太攀蛇(Oxyuranus microlepidotus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus，澳东蛇(Tropidechis carinatus)和红腹伊澳蛇(Pseudechisporphyriacus)以其它及来
自眼镜蛇(Elapidae)属的蛇。可以使用标准的蛋白纯化技术从蛇毒或从其它来源(包括
产生蛇毒FV的细胞和组织)分离蛇毒FV多肽。在一些具体实施方式中，从眼镜蛇属的澳
洲蛇(例如以上所列的任意一种澳洲蛇)的毒腺分离蛇毒FV。或者，可以通过重组DNA技
术或通过化学合成产生蛇毒FV蛋白或其片段。
过注射或局部给予组合物以防止或减少个体中的血液流失。可以从中获得蛇毒多肽的
蛇的非限制性例子包括澳洲常见的棕蛇Pseudonaja textilis、海岸太攀蛇(Oxyuranus
scutellatus)、内陆太攀蛇(Oxyuranus microlepidotus)、大陆虎蛇(Notechis scutatus，澳东蛇(Tropidechis carinatus)和红腹伊澳蛇(Pseudechisporphyriacus)以其它及来
自眼镜蛇(Elapidae)属的蛇。可以使用标准的蛋白纯化技术从蛇毒或从其它来源(包括
产生蛇毒FV的细胞和组织)分离蛇毒FV多肽。在一些具体实施方式中，从眼镜蛇属的澳
洲蛇(例如以上所列的任意一种澳洲蛇)的毒腺分离蛇毒FV。或者，可以通过重组DNA技
术或通过化学合成产生蛇毒FV蛋白或其片段。
[0198] 本发明的多肽包括那些作为可选择性翻译和翻译后事件的存在结果而产生的多肽。多肽可以在这样的系统中表达：例如培养的细胞，相对于在原态细胞中表达多肽时存
在的翻译后修饰，其产生实质上相同的翻译后修饰；或者可以在这样的系统中表达：相对
于在原态细胞中表达时存在的翻译后修饰，其产生翻译后修饰的改变或没有该翻译后修饰
(例如糖基化或切割)。
在的翻译后修饰，其产生实质上相同的翻译后修饰；或者可以在这样的系统中表达：相对
于在原态细胞中表达时存在的翻译后修饰，其产生翻译后修饰的改变或没有该翻译后修饰
(例如糖基化或切割)。
[0199] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽具有下列一个或多个特征：
[0200] 当FXa(例如哺乳动物FXa如但不限于人类FXa)存在时，它具有使血液凝固的能力；
[0201] 它具有至少一个多铜氧化酶结构域(例如，A1、A2、A3结构域)；
[0202] 它具有至少一个膜结合结构域(例如C1、C2结构域)；
[0203] 它具有轻链和重链。
[0204] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽是单一多肽链的形式，如Bos等人(2007，Blood ASH Annual Meeting Abstracts 110：Abstract 1765)所描述。
[0205] 本发明考虑到在本发明方法中全长蛇毒FV多肽及其生物活性片段的的用途。通常来讲，全长蛇毒FV多肽的生物活性片段可能参与相互作用，例如，分子内或分子间相互
作用。这样的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇毒FV多肽的氨基酸序列具
有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽，例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12所示的氨基酸序列，所述片段包括的氨基酸少于全长蛇毒FV多肽并且表现出该多肽
的至少一个活性。通常来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV多肽的至少一个活性的结
构域或基序，并且可以包括一个或多个以下结构域(在一些情况下全部包括)：多铜氧化酶
结构域(例如1型和2型)、膜结合结构域、铜氧化还原蛋白结构域、凝固因子5/8型结构
域(例如FA58C、FA58C_3、F5_F8_型_C、FA58C_2、FA58C_1)、半乳糖结合样结构域、FXa结合位点、凝血酶原结合位点、凝血酶切割位点。在一些具体实施方式中，生物活性片段包含一个或多个APC切割位点，例如相对于图7的共有编号的残基818-819和/或残基537-538
上。全长蛇毒FV多肽的生物活性片段可以是例如长度为30，40，50，60，70，80，90，100，120，
150，300，400or 500，600，800，900，1000，1100，1200，1300，1400或更多个氨基酸残基的多肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的至少1％、10％、25％、50％的活性。
作用。这样的生物活性片段包括那些包含与(推导的)全长蛇毒FV多肽的氨基酸序列具
有足够相似性的氨基酸序列的或源于其中的氨基酸序列的肽，例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10或12所示的氨基酸序列，所述片段包括的氨基酸少于全长蛇毒FV多肽并且表现出该多肽
的至少一个活性。通常来讲，生物活性片段包含具有全长蛇毒FV多肽的至少一个活性的结
构域或基序，并且可以包括一个或多个以下结构域(在一些情况下全部包括)：多铜氧化酶
结构域(例如1型和2型)、膜结合结构域、铜氧化还原蛋白结构域、凝固因子5/8型结构
域(例如FA58C、FA58C_3、F5_F8_型_C、FA58C_2、FA58C_1)、半乳糖结合样结构域、FXa结合位点、凝血酶原结合位点、凝血酶切割位点。在一些具体实施方式中，生物活性片段包含一个或多个APC切割位点，例如相对于图7的共有编号的残基818-819和/或残基537-538
上。全长蛇毒FV多肽的生物活性片段可以是例如长度为30，40，50，60，70，80，90，100，120，
150，300，400or 500，600，800，900，1000，1100，1200，1300，1400或更多个氨基酸残基的多肽。适宜地，生物活性片段具有不低于其所源自的全长多肽的至少1％、10％、25％、50％的活性。
[0206] 本发明还考虑到是野生型或天然产生的蛇毒FV的变体的蛇毒FV多肽。这样的“变体”多肽包括：通过在原态蛋白的N-末端和/或C-末端删除(所谓的截短)或添加一
个或多个氨基酸、通过在原态蛋白的一个或多个位点删除或添加一个或多个氨基酸或通过
在原态蛋白的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸而从该原态蛋白衍生的蛋白。这样的
FV变体多肽的非限制性例子包括全长或前体蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，从酶
原或前体形式中除去了信号肽结构域和激活肽(或B)结构域的FVa多肽。在一些具体实
施方式中，变体多肽比野生型哺乳动物(例如人)FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5个)
的激活的蛋白C(APC)位点。
个或多个氨基酸、通过在原态蛋白的一个或多个位点删除或添加一个或多个氨基酸或通过
在原态蛋白的一个或多个位点替换一个或多个氨基酸而从该原态蛋白衍生的蛋白。这样的
FV变体多肽的非限制性例子包括全长或前体蛇毒FV的经处理的形式，包括但不限于，从酶
原或前体形式中除去了信号肽结构域和激活肽(或B)结构域的FVa多肽。在一些具体实
施方式中，变体多肽比野生型哺乳动物(例如人)FV少一个或多个(例如1，2，3，4或5个)
的激活的蛋白C(APC)位点。
[0207] 本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，即，它们持续具有想要的原态蛋白的生物活性。这样的变体可以来自，例如，遗传多态性或来自人类操作。原态或野生型蛇毒FV
的生物活性变体与原态蛋白的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％，一般为至少
75％、80％、85％，经常为大约90％至95％或更多，通常为大约98％或更多的序列相似性或同一性，如本文其它地方描述的序列比对程序(使用缺省参数)所测定。落入变体多肽范围
内的野生型蛇毒FV多肽的生物活性变体可以通常与蛋白具有多达200、100、50或20个氨
基酸残基的差异或者适宜地，仅有1-15个氨基酸残基、仅有1-10个氨基酸残基、例如6-10
个、仅5个、仅4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的差异。在一些具体实施方式中，变体多肽与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的相应序列具有至少一个但是15、10或5个氨基酸残基
以下的差异。在其它具体实施方式中，它与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的相应序列具有
20％、15％、10％或5％以下的残基差异。
的生物活性变体与原态蛋白的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％，一般为至少
75％、80％、85％，经常为大约90％至95％或更多，通常为大约98％或更多的序列相似性或同一性，如本文其它地方描述的序列比对程序(使用缺省参数)所测定。落入变体多肽范围
内的野生型蛇毒FV多肽的生物活性变体可以通常与蛋白具有多达200、100、50或20个氨
基酸残基的差异或者适宜地，仅有1-15个氨基酸残基、仅有1-10个氨基酸残基、例如6-10
个、仅5个、仅4、3、2个或甚至1个氨基酸残基的差异。在一些具体实施方式中，变体多肽与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的相应序列具有至少一个但是15、10或5个氨基酸残基
以下的差异。在其它具体实施方式中，它与SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的相应序列具有
20％、15％、10％或5％以下的残基差异。
[0208] 可以以各种方式改变蛇毒FV多肽，包括氨基酸替换、删除、截短和插入。这样的操作的方法在本领域中一般是已知的。例如，可以通过DNA突变来制备FV多肽的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如Kunkel(1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82：488-492)，Kunkel等人，(1987，Methods in Enzymol，154：367-382)，美国专利号4,873,192，Watson，J.D.等人，(“Molecular Biology of the Gene”，Fourth Edition，Benjamin/Cummings，Menlo Park，Calif.，1987)及其中引用的参考文献。可以在Dayhoff等人，(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.
Found.，Washington，D.C.)的模型中找到合适的不影响目标蛋白生物学活性的氨基酸替换的指导。筛选通过点突变或截短而制备的组合文库的基因产物的方法以及筛选cDNA文库
以获取具有选定的特征的基因产物的方法在本领域是已知的。这样的方法可适用于迅速
筛选通过FV多肽的组合诱变产生的基因文库。Recursive ensemble mutagenesis(REM)
是一种增强文库中功能性突变体频率的技术，其可与筛选检验组合用于鉴别FV多肽变体
(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人，(1993)Protein Engineering，6：327-331)。保守性替换，例如将一个氨基酸替换为另一个具有相似性质的氨基酸可能是需要的，如下文更详细讨论的。
Found.，Washington，D.C.)的模型中找到合适的不影响目标蛋白生物学活性的氨基酸替换的指导。筛选通过点突变或截短而制备的组合文库的基因产物的方法以及筛选cDNA文库
以获取具有选定的特征的基因产物的方法在本领域是已知的。这样的方法可适用于迅速
筛选通过FV多肽的组合诱变产生的基因文库。Recursive ensemble mutagenesis(REM)
是一种增强文库中功能性突变体频率的技术，其可与筛选检验组合用于鉴别FV多肽变体
(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等人，(1993)Protein Engineering，6：327-331)。保守性替换，例如将一个氨基酸替换为另一个具有相似性质的氨基酸可能是需要的，如下文更详细讨论的。
[0209] 变体FV多肽可以在其序列相对于亲代(例如天然产生的或参考的)FV氨基酸序列的不同位置上包含保守性氨基酸替换。“保守性氨基酸替换”是指：其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域中已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族，其
一般可以次级分类如下：
一般可以次级分类如下：
[0210] 酸性的：残基由于在生理pH时丧失H离子而带有负电荷，当肽处于生理pH的水性介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含该残基的肽的构象中的表面位置。具有酸性侧
链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
链的氨基酸包括谷氨酸和天冬氨酸。
[0211] 碱性的：残基由于在生理pH或其一个或两个pH单位之内(例如组氨酸)与H离子结合而带有正电荷，当肽处于生理pH的水性介质中时，残基被水溶液吸引从而寻找包含
该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
该残基的肽的构象中的表面位置。具有碱性侧链的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
[0212] 带电的：残基在生理pH时是带电的，因此，包括具有酸性或碱性侧链的氨基酸(即，谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸和组氨酸)。
[0213] 疏水性的：残基在生理pH时是不带电的，当肽处于水性介质中时，残基被水溶液排斥从而寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有疏水性侧链的氨基酸包括酪氨
酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。
[0214] 中性的/极性的：残基在生理pH时是不带电的；但是，当肽处于水性介质中时，残基不被水溶液足够地排斥从而它将寻找包含该残基的肽的构象中的内部位置。具有中性/极性侧链的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
[0215] 本说明书还将某些氨基酸描述为“小的”，因为它们的侧链不够大(即使缺少极性基团)，不能赋予疏水性。除了脯氨酸之外，“小的”氨基酸是指：当至少一个极性基团位于侧链时，具有四个或四个以下碳的氨基酸；当侧链上无极性基团时，具有三个或三个以下碳的氨基酸。具有小的侧链的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸。基因编码的二级氨基酸脯氨酸是特殊情况，因为已知其影响肽链的二级构象。脯氨酸的结构与所有其它天然产生的氨基酸的不同之处在于其侧链与α-氨基基团的氮以及α-碳结合。但是，几个氨基
酸相似性矩阵(例如，由例如Dayhoff等人，(1978)，A model of evolutionary change in proteins.Matrices fordetermining distance relationships In M.O.Dayhoff，(ed.)，Atlas of protein sequenceand structure，Vol.5，pp.345-358，National Biomedical Research Foundation，Washington DC 和 Gonnet 等 人，(1992)，Science，256(5062)：
14430-1445公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨
酸包括在相同的组中。因此，为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小的”氨基酸。
酸相似性矩阵(例如，由例如Dayhoff等人，(1978)，A model of evolutionary change in proteins.Matrices fordetermining distance relationships In M.O.Dayhoff，(ed.)，Atlas of protein sequenceand structure，Vol.5，pp.345-358，National Biomedical Research Foundation，Washington DC 和 Gonnet 等 人，(1992)，Science，256(5062)：
14430-1445公开的PAM120矩阵和PAM250矩阵)将脯氨酸与甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨
酸包括在相同的组中。因此，为了本发明的目的，脯氨酸被分类为“小的”氨基酸。
[0216] 分类为极性或非极性所需的吸引或排斥程度是人为设定的，因此，本发明特别考虑到的氨基酸被分类为一类或另一类。多数没有经过特别命名的氨基酸可以基于其已知行
为进行分类。
为进行分类。
[0217] 氨基酸残基可以进一步被次级分成环形或非环形的、以及芳香族或非芳香族的(一看即知是根据残基的侧链取代基团进行的分类)以及小的或大的。如果残基含有总共
4个或4个以下碳原子(包括羧基碳)则认为该残基是小的，只要存在另一个极性取代基；
如果不存在，则为3个或3个以下。当然，小的残基一定是非芳香族的。取决于其结构特征，氨基酸残基可以被分成两类或更多类。对于天然产生的蛋白氨基酸，根据该方案进行的次
级分类显示于表B。
4个或4个以下碳原子(包括羧基碳)则认为该残基是小的，只要存在另一个极性取代基；
如果不存在，则为3个或3个以下。当然，小的残基一定是非芳香族的。取决于其结构特征，氨基酸残基可以被分成两类或更多类。对于天然产生的蛋白氨基酸，根据该方案进行的次
级分类显示于表B。
[0218] 表B
[0219] 氨基酸次级分类
[0220]次级类别 氨基酸
酸性的 天冬氨酸、谷氨酸
碱性的 非环形的：精氨酸、赖氨酸；环形的：组氨酸
带电的 天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸
小的 甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸
极性的/中性的 天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸
极性的/大的 天冬酰胺、谷氨酰胺
疏水性的 酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、
色氨酸
芳香族的 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸
影响侧链方向的残基 甘氨酸和脯氨酸
酸性的 天冬氨酸、谷氨酸
碱性的 非环形的：精氨酸、赖氨酸；环形的：组氨酸
带电的 天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸
小的 甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸
极性的/中性的 天冬酰胺、组氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸
极性的/大的 天冬酰胺、谷氨酰胺
疏水性的 酪氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、
色氨酸
芳香族的 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸
影响侧链方向的残基 甘氨酸和脯氨酸
[0221] 保守性氨基酸替换还包括基于侧链的基团。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的
一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理预计以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、以谷氨酰胺取代天冬酰胺、以丝氨酸取代苏氨酸，或者以结构相关的氨基酸类似地取代某氨基酸将不会对产生的变体多肽的性质产生重要影响。可以通过检验
其活性而容易地确定某氨基酸是否引起功能性FV多肽的变化。在表C中的示例性和优选
取代表头下面列出显示了保守性取代。一般来讲，落入本发明范围内的氨基酸取代是通过
选择那些对于维持(a)取代区域的肽骨架结构，(b)靶位点分子的电荷或疏水性或(c)侧
链的大小的效应没有显著差异的取代进行的。引入取代物之后，筛选变体的生物学活性。
一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。例如，可以合理预计以异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、以谷氨酰胺取代天冬酰胺、以丝氨酸取代苏氨酸，或者以结构相关的氨基酸类似地取代某氨基酸将不会对产生的变体多肽的性质产生重要影响。可以通过检验
其活性而容易地确定某氨基酸是否引起功能性FV多肽的变化。在表C中的示例性和优选
取代表头下面列出显示了保守性取代。一般来讲，落入本发明范围内的氨基酸取代是通过
选择那些对于维持(a)取代区域的肽骨架结构，(b)靶位点分子的电荷或疏水性或(c)侧
链的大小的效应没有显著差异的取代进行的。引入取代物之后，筛选变体的生物学活性。
[0222] 表C
[0223] 示例性的和优选的氨基酸取代
[0224]最初的残基 示例性的取代 优选的取代
Ala Val，Leu，Ile Val
Arg Lys，Gln，Asn Lys
Asn Gln，His，Lys，Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn，His，Lys， Asn
Glu Asp，Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile Leu，Val，Met，Ala，Phe，Norleu Leu
Leu Norleu，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys Arg，Gln，Asn Arg
Met Leu，Ile，Phe Leu
Phe Leu，Val，Ile，Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val Ile，Leu，Met，Phe，Ala，Norleu Leu
Ala Val，Leu，Ile Val
Arg Lys，Gln，Asn Lys
Asn Gln，His，Lys，Arg Gln
Asp Glu Glu
Cys Ser Ser
Gln Asn，His，Lys， Asn
Glu Asp，Lys Asp
Gly Pro Pro
His Asn，Gln，Lys，Arg Arg
Ile Leu，Val，Met，Ala，Phe，Norleu Leu
Leu Norleu，Ile，Val，Met，Ala，Phe Ile
Lys Arg，Gln，Asn Arg
Met Leu，Ile，Phe Leu
Phe Leu，Val，Ile，Ala Leu
Pro Gly Gly
Ser Thr Thr
Thr Ser Ser
Trp Tyr Tyr
Tyr Trp，Phe，Thr，Ser Phe
Val Ile，Leu，Met，Phe，Ala，Norleu Leu
[0225] 或者，用于进行保守性取代的类似氨基酸可以基于侧链的属性归为三类。第一组包括谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、赖氨酸、组氨酸，其均具有带电侧链；第二组包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺；第三组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸，如Zubay，G.，Biochemistry，第三版，Wm.C.Brown Publishers(1993)所描述的。
[0226] 因此，通常以另一个来自相同侧链家族的氨基酸残基替换蛇毒FV多肽中预测为非必需的氨基酸残基。或者，可以通过例如饱和诱变沿着全部或部分蛇毒FV基因编码序
列随机引入突变，可以筛选所产生的突变体的亲代多肽活性以鉴别那些保持该活性的突变
体。对编码序列进行诱变之后，可以通过重组表达所编码的肽并且可以测定肽的活性。“非必需”氨基酸残基是可以从具体多肽的野生型序列加以改变而不消除或实质上改变其一个
或多个活性的残基。适宜地，所述改变不实质上改变这些活性中的一个，例如，活性至少是野生型的20％、40％、60％、70％或80％。示例性的非必需氨基酸残基包括在图7所示的野生型蛇毒FV多肽之间相同位置(例如，如上文定义的残基X1-X66)上不同的一个或多个氨
基酸残基的任一个。“必需”氨基酸残基是指这样的残基：当从参考FV多肽的野生型序列进行改变时，引起亲代分子的活性的消除，例如存在20％以下的野生型活性。例如，这样的必需氨基酸残基包括在不同物种的FV多肽中保守的残基，例如，在人类、小鼠、牛、鸡、棕蛇、内陆太攀蛇和海岸太攀蛇的FV多肽的FXa结合位点上保守的W(N/D)Y(A/P)P，所述结合位
点例如由图7所示的残基338-379所定义。
列随机引入突变，可以筛选所产生的突变体的亲代多肽活性以鉴别那些保持该活性的突变
体。对编码序列进行诱变之后，可以通过重组表达所编码的肽并且可以测定肽的活性。“非必需”氨基酸残基是可以从具体多肽的野生型序列加以改变而不消除或实质上改变其一个
或多个活性的残基。适宜地，所述改变不实质上改变这些活性中的一个，例如，活性至少是野生型的20％、40％、60％、70％或80％。示例性的非必需氨基酸残基包括在图7所示的野生型蛇毒FV多肽之间相同位置(例如，如上文定义的残基X1-X66)上不同的一个或多个氨
基酸残基的任一个。“必需”氨基酸残基是指这样的残基：当从参考FV多肽的野生型序列进行改变时，引起亲代分子的活性的消除，例如存在20％以下的野生型活性。例如，这样的必需氨基酸残基包括在不同物种的FV多肽中保守的残基，例如，在人类、小鼠、牛、鸡、棕蛇、内陆太攀蛇和海岸太攀蛇的FV多肽的FXa结合位点上保守的W(N/D)Y(A/P)P，所述结合位
点例如由图7所示的残基338-379所定义。
[0227] 因此，本发明还考虑到FV多肽、天然产生的FV多肽序列或其生物活性片段的变体，其中所述变体通过添加、删除或替换一个或多个氨基酸残基而与天然产生的序列相区
别。一般地，变体将显示出相对于例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12所示的亲代或参考FV多肽序列的至少大约30，40，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的相似性。优选地，变体将显示出相对于例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12所示的亲代FV多肽序列的至少30，40，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的序列同一性。此外，还考虑到通过添加、删除或替换1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，
15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100个或更多个氨基酸而与原态或亲代序列相区别但是保留亲代FV多肽性质的序列。FV多肽还包括在本文定义的严谨条件下(特别
是高度严谨条件下)与编码FV的多核苷酸序列或其非编码链(如下所述)杂交的多核苷
酸所编码的多肽。示例性的蛇毒FV多肽序列如SEQ ID NO：1，3，5，7，9和11所示。
别。一般地，变体将显示出相对于例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12所示的亲代或参考FV多肽序列的至少大约30，40，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的相似性。优选地，变体将显示出相对于例如SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12所示的亲代FV多肽序列的至少30，40，50，55，60，65，70，75，80，85，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99％的序列同一性。此外，还考虑到通过添加、删除或替换1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，
15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100个或更多个氨基酸而与原态或亲代序列相区别但是保留亲代FV多肽性质的序列。FV多肽还包括在本文定义的严谨条件下(特别
是高度严谨条件下)与编码FV的多核苷酸序列或其非编码链(如下所述)杂交的多核苷
酸所编码的多肽。示例性的蛇毒FV多肽序列如SEQ ID NO：1，3，5，7，9和11所示。
[0228] 在一些具体实施方式中，变体多肽相对于参考FV序列具有至少但在50，40，30，20，15，10，8，6，5，4，3或2个以下氨基酸残基的差异。在其它具体实施方式中，变体多肽相对于SEQ ID NO：2，4，6，8，10和12的相应序列具有至少1％但在20％，15％，10％或5％以下的残基的差异。(如果这种比较需要比对，则需要将序列按照最大相似性进行比对。由于删除或插入或错配而被“圈出”的序列被认为是差异)。适宜地，差异是非必需残基或保守性替换的差异或改变。
[0229] 在其它具体实施方式中，变体多肽包括这样的氨基酸序列：其相对于例如SEQIDNO：2，4，6，8，10和12所示的FV多肽的相应序列具有至少大约50％，55％，60％，65％，
70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或更多的相似性并且具有蛇毒FV多肽的活性。
70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％95％，96％，97％，98％或更多的相似性并且具有蛇毒FV多肽的活性。
[0230] 序列之间的序列相似性或序列同一性(这些术语在本文中相互替换地使用)的计算按照如下所述进行：
[0231] 为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分率，将序列进行比对以实现最佳比较的目的(例如，可以在第一个或第二个氨基酸中或同时在两个氨基酸中或核酸
序列中引入空隙以进行最佳比对，可以为了比较的目的忽略掉非同源序列)。在优选的具体实施方式中，为了比较的目的而比对的参考序列的长度至少是参考序列长度的30％，优选
至少40％，更优选至少50％、60％，更优选至少70％，80％，90％，100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的某个位置被第二个序列
中的对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置上分子是相同的。
序列中引入空隙以进行最佳比对，可以为了比较的目的忽略掉非同源序列)。在优选的具体实施方式中，为了比较的目的而比对的参考序列的长度至少是参考序列长度的30％，优选
至少40％，更优选至少50％、60％，更优选至少70％，80％，90％，100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的某个位置被第二个序列
中的对应位置的相同氨基酸残基或核苷酸占据时，则在该位置上分子是相同的。
[0232] 两个序列之间的同一性百分率是序列具有的相同位置数目的函数—考虑到需要被引入以进行两个序列的最佳比对的空隙的数目和每个空隙的长度。
[0233] 可以使用数学算法进行序列比较和两个序列之间的同一性百分率的测定。在一些具体实施方式中，使用Needleman和Wunsch(1970，J.Mol.Biol.48：444-453)算法(已经整
合到GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中)，使用Blossum 62
矩阵或PAM250矩阵，和16，14，12，10，8，6或4的空隙权重(gapweight)和1，2，3，4，5或6的长度权重(length weight)，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分率。在特异性具
体实施方式中，使用GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序，使用
NWSgapdna.CMP矩阵和40，50，60，70或80的空隙权重和1，2，3，4，5或6的长度权重，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分率。非限制性的参数系列(以及除非另有指明否则应
该使用的)包括Blossum 62评分矩阵(其中空隙罚分为12，空隙延伸罚分为4，移框空隙
罚分为5)。
合到GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序中)，使用Blossum 62
矩阵或PAM250矩阵，和16，14，12，10，8，6或4的空隙权重(gapweight)和1，2，3，4，5或6的长度权重(length weight)，来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分率。在特异性具
体实施方式中，使用GCG软件包(可以从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序，使用
NWSgapdna.CMP矩阵和40，50，60，70或80的空隙权重和1，2，3，4，5或6的长度权重，来确定两个核苷酸序列之间的同一性百分率。非限制性的参数系列(以及除非另有指明否则应
该使用的)包括Blossum 62评分矩阵(其中空隙罚分为12，空隙延伸罚分为4，移框空隙
罚分为5)。
[0234] 可以使用E.Meyers和W.Miller(1989，Cabios，4：11-17)(已经整合到ALIGN程序(2.0版本)中)，使用PAM120重量残余表、空隙长度罚分为12和空隙罚分为4来测定两个
氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分率。
氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分率。
[0235] 本文描述的核酸和蛋白序列可用作“询问序列”以进行针对公共数据库的搜索，从而例如鉴别其它的家族成员或相关的序列。可以使用Altschul等人(1990，J.Mol.Biol，215：403-10)的NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)进行这样的搜索。可以使用NBLAST程序
(得分＝100，单词长度＝12)进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的53010核酸分子同
源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(得分＝50，单词长度＝3)进行BLAST蛋白搜索以
获得与本发明的53010蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的比对以进行比较，
可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res，25：3389-3402)所描述的。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)
的缺省参数。
(得分＝100，单词长度＝12)进行BLAST核苷酸搜索以获得与本发明的53010核酸分子同
源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序(得分＝50，单词长度＝3)进行BLAST蛋白搜索以
获得与本发明的53010蛋白分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的比对以进行比较，
可以使用Gapped BLAST，如Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res，25：3389-3402)所描述的。当使用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)
的缺省参数。
[0236] 可以通过筛选突变体(例如蛇毒FV蛋白的截短的突变体)的组合文库来鉴别蛇毒FV蛋白的变体。编码蛇毒蛋白酶蛋白的序列的文库或片段(例如N末端的、C末端的或
内部的片段)可用于产生片段的多样化群体以筛选然后选择蛇毒FV蛋白的变体。
内部的片段)可用于产生片段的多样化群体以筛选然后选择蛇毒FV蛋白的变体。
[0237] 筛选通过点突变或截短而制备的组合文库的基因产物的方法以及筛选cDNA文库以获取具有选定的特征的基因产物的方法在本领域是已知的。这样的方法可适用于迅速筛
选通过蛇毒FV蛋白的组合诱变产生的基因文库。
选通过蛇毒FV蛋白的组合诱变产生的基因文库。
[0238] 可以通过本领域技术人员已知的任何合适的程序制备本发明的FV多肽。例如，可以通过任何常规方法(例如从天然产生的库(其中包含蛇毒和血清)中纯化多肽)来
产生FV多肽。纯化方法包括凝集素(例如小麦种子凝集素)亲和色谱或分离。通过例如
SDS-聚丙烯酰胺电泳或色谱(例如高效液相色谱(HPLC))来确定衍生FV的属性和纯度。
或者，可以通过化学合成来合成FV多肽，例如使用溶液合成或固相合成，例如在Atherton
和Shephard(见上文)第九章和Roberge等人(1995，Science，269：202)中描述的那样。
产生FV多肽。纯化方法包括凝集素(例如小麦种子凝集素)亲和色谱或分离。通过例如
SDS-聚丙烯酰胺电泳或色谱(例如高效液相色谱(HPLC))来确定衍生FV的属性和纯度。
或者，可以通过化学合成来合成FV多肽，例如使用溶液合成或固相合成，例如在Atherton
和Shephard(见上文)第九章和Roberge等人(1995，Science，269：202)中描述的那样。
[0239] 或者，可以通过重组技术制备FV多肽。例如，可以通过包括以下步骤的程序制备本发明的FV多肽：(a)制备包含编码FV多肽并且与调控元件可操作连接的多核苷酸序列
的构建体；(b)将构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达FV多肽；和(d)从宿主细
胞中分离FV多肽。在示例性的实施例中，核苷酸序列编码SEQ IDNO：2，4，6，8，10和12所示的序列的至少一个生物活性部分或其变体。可以使用标准规程方便地制备重组FV多肽，
例如在Sambrook等人(1989，见上文)，特别是第16和17部分；Ausubel等人(1994，见上
文)，特别是第10和16章；和Coligan等人，Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons，Inc.1995-1997)，特别是第1、5和6章中描述的程序。
的构建体；(b)将构建体引入宿主细胞；(c)培养宿主细胞以表达FV多肽；和(d)从宿主细
胞中分离FV多肽。在示例性的实施例中，核苷酸序列编码SEQ IDNO：2，4，6，8，10和12所示的序列的至少一个生物活性部分或其变体。可以使用标准规程方便地制备重组FV多肽，
例如在Sambrook等人(1989，见上文)，特别是第16和17部分；Ausubel等人(1994，见上
文)，特别是第10和16章；和Coligan等人，Current Protocols in Protein Science(John Wiley & Sons，Inc.1995-1997)，特别是第1、5和6章中描述的程序。
[0240] 示例性的编码本发明的FV多肽的核苷酸序列包括全长蛇毒FV基因以及蛇毒FV基因的全长或实质上全长核苷酸序列的部分，或其转录本或这些转录本的DNA拷贝。蛇毒
FV核苷酸序列的部分可以编码保留原态多肽的生物活性的多肽部分或片段。编码蛇毒FV
多肽的生物活性片段的蛇毒FV核苷酸序列的部分可以编码至少大约20，21，22，23，24，25，
30，40，50，60，70，80，90，100，120，150，300或400个连续氨基酸残基，或几乎达到全长蛇毒FV多肽中存在的氨基酸的全部数目。
FV核苷酸序列的部分可以编码保留原态多肽的生物活性的多肽部分或片段。编码蛇毒FV
多肽的生物活性片段的蛇毒FV核苷酸序列的部分可以编码至少大约20，21，22，23，24，25，
30，40，50，60，70，80，90，100，120，150，300或400个连续氨基酸残基，或几乎达到全长蛇毒FV多肽中存在的氨基酸的全部数目。
[0241] 本发明还考虑到蛇毒FV核苷酸序列的变体。核酸变体可以是天然产生的，例如等位基因变体(相同的基因座)、同源物(不同的基因座)和直系同源物(不同的生物)，或
者可以是非天然产生的。天然产生的变体(例如这些)可以通过使用熟知的分子生物学技
术(例如本领域已知的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)加以鉴别。非天然产生的变体可
以通过诱变技术制备，包括那些适用于多核苷酸、细胞或生物的诱变技术。变体可以包含核苷酸替换、删除、倒置和插入。变异可以发生在编码区和非编码区中的一个或同时发生于二者中。变异可以同时产生保守性和非保守性氨基酸替换(与编码产物中相比)。对于核苷
酸序列，保守性变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码参考蛇毒FV多肽的氨基酸序
列的序列。变体核苷酸序列还包括通过合成衍生的核苷酸序列，例如那些通过例如使用定
点诱变而产生但仍然编码蛇毒FV多肽的核苷酸序列。一般地，特定的蛇毒FV核苷酸序列
的变体将与该特定核苷酸序列具有至少大约30％，40％50％，55％，60％，65％，70％，一般为至少大约75％，80％，85％，优选为大约90％至95％或更高，更适宜地为大约98％或更高的序列同一性，如本文其它地方描述的序列比对程序所测定(使用缺省参数)。
者可以是非天然产生的。天然产生的变体(例如这些)可以通过使用熟知的分子生物学技
术(例如本领域已知的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术)加以鉴别。非天然产生的变体可
以通过诱变技术制备，包括那些适用于多核苷酸、细胞或生物的诱变技术。变体可以包含核苷酸替换、删除、倒置和插入。变异可以发生在编码区和非编码区中的一个或同时发生于二者中。变异可以同时产生保守性和非保守性氨基酸替换(与编码产物中相比)。对于核苷
酸序列，保守性变体包括那些由于遗传密码的简并性而编码参考蛇毒FV多肽的氨基酸序
列的序列。变体核苷酸序列还包括通过合成衍生的核苷酸序列，例如那些通过例如使用定
点诱变而产生但仍然编码蛇毒FV多肽的核苷酸序列。一般地，特定的蛇毒FV核苷酸序列
的变体将与该特定核苷酸序列具有至少大约30％，40％50％，55％，60％，65％，70％，一般为至少大约75％，80％，85％，优选为大约90％至95％或更高，更适宜地为大约98％或更高的序列同一性，如本文其它地方描述的序列比对程序所测定(使用缺省参数)。
[0242] 蛇毒FV核苷酸序列可用于从其它生物(特别是其它蛇类)分离相应的序列和等位基因。可以在本领域中容易地获得用于核酸序列杂交的方法。可以根据熟知的技术基于
其序列与本文所示的编码序列的同一性分离来自其它生物的编码序列。在这些技术中，已
知的编码序列的全部或一部分用作探针，其与来自选定生物(例如蛇)的克隆的基因组DNA
片段或cDNA片段的群体(即基因组或cDNA的文库)中存在的其它编码蛇毒FV的序列选
择性杂交。因此，本发明还考虑到与参考蛇毒FV核苷酸序列或与其互补物在以下描述的严
谨条件下杂交的多核苷酸。本文使用的术语“在低度严谨、中度严谨、高度严谨或非常高度严谨的条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。可以在Ausubel等人(1998，见上文)，
6.3.1-6.3.6部分中找到进行杂交反应的指导。在该参考文献中描述了水性和非水性的方
法，每个都可以使用。本文中提及的低度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约1％v/
v至至少大约15％v/v甲酰胺和至少大约1M至至少大约2M的盐进行杂交，在42℃以至少
大约1M至至少大约2M的盐进行洗涤。低度严谨条件还可以包括在65℃以1％牛血清白蛋
白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS进行杂交，和在室温以(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS进行洗涤。低度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约45℃以6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)进行杂交，然后在至
少50℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤两次(对于低度严谨条件洗涤温度可以升高至55℃)。
中度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约16％v/v至至少大约30％v/v甲酰胺和至
少大约0.5M至至少大约0.9M的盐进行杂交，在55℃以至少大约0.1M至至少大约0.2M的
盐进行洗涤。中度严谨条件还可以包括在65℃以1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS进行杂交，和在60-65℃以(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％
BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS进行洗涤。中度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约45℃以6x SSC进行杂交，然后在60℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或
多次。高度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约31％v/v至至少大约50％v/v甲酰
胺和大约0.01M至大约0.15M的盐进行杂交，在55℃以大约0.01M至大约0.02M的盐进行
洗涤。高度严谨条件还可以包括在65℃以1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS进行杂交，和在65℃以上的温度以(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、
40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS进行洗涤。高度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约
45℃以6x SSC进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。
其序列与本文所示的编码序列的同一性分离来自其它生物的编码序列。在这些技术中，已
知的编码序列的全部或一部分用作探针，其与来自选定生物(例如蛇)的克隆的基因组DNA
片段或cDNA片段的群体(即基因组或cDNA的文库)中存在的其它编码蛇毒FV的序列选
择性杂交。因此，本发明还考虑到与参考蛇毒FV核苷酸序列或与其互补物在以下描述的严
谨条件下杂交的多核苷酸。本文使用的术语“在低度严谨、中度严谨、高度严谨或非常高度严谨的条件下杂交”描述了用于杂交和洗涤的条件。可以在Ausubel等人(1998，见上文)，
6.3.1-6.3.6部分中找到进行杂交反应的指导。在该参考文献中描述了水性和非水性的方
法，每个都可以使用。本文中提及的低度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约1％v/
v至至少大约15％v/v甲酰胺和至少大约1M至至少大约2M的盐进行杂交，在42℃以至少
大约1M至至少大约2M的盐进行洗涤。低度严谨条件还可以包括在65℃以1％牛血清白蛋
白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS进行杂交，和在室温以(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS进行洗涤。低度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约45℃以6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)进行杂交，然后在至
少50℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤两次(对于低度严谨条件洗涤温度可以升高至55℃)。
中度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约16％v/v至至少大约30％v/v甲酰胺和至
少大约0.5M至至少大约0.9M的盐进行杂交，在55℃以至少大约0.1M至至少大约0.2M的
盐进行洗涤。中度严谨条件还可以包括在65℃以1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS进行杂交，和在60-65℃以(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％
BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS进行洗涤。中度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约45℃以6x SSC进行杂交，然后在60℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或
多次。高度严谨条件包括并包含：在42℃以至少大约31％v/v至至少大约50％v/v甲酰
胺和大约0.01M至大约0.15M的盐进行杂交，在55℃以大约0.01M至大约0.02M的盐进行
洗涤。高度严谨条件还可以包括在65℃以1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS进行杂交，和在65℃以上的温度以(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、
40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS进行洗涤。高度严谨条件的一个具体实施方式包括：在大约
45℃以6x SSC进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次。
[0243] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽由在非常高度严谨的条件下与公开的核苷酸序列杂交的多核苷酸所编码。非常高度严谨的条件的一个具体实施方式包括：在65℃以
0.5M磷酸钠、7％SDS进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
0.5M磷酸钠、7％SDS进行杂交，然后在65℃以0.2×SSC、1％SDS洗涤一次或多次。
[0244] 其它的严谨条件在本领域是熟知的，技术人员将认识到可以操作各种因素以使杂交的特异性优化。最终洗涤的严谨度的优化可用于确保高程度的杂交。对于具体的例子，
参见上文提及的Ausubel等人，第2.10.1页至2.10.16页，和Sambrook等人(1989，见上
文)1.101至1.104部分。
参见上文提及的Ausubel等人，第2.10.1页至2.10.16页，和Sambrook等人(1989，见上
文)1.101至1.104部分。
[0245] 虽然严谨洗涤通常是在大约42℃至68℃的温度进行，但是本领域技术人员将意识到其它温度可以适合于严谨条件。最大杂交速率通常发生于形成DNA-DNA杂交体的Tm
之下大约20℃至25℃。本领域广为人知的是，Tm是熔解温度，或两个互补性多核苷酸序列
解离的温度。评估Tm的方法在本领域是熟知的(参见上文提及的Ausubel等人，第2.10.8
页)。一般地，完全匹配的DNA双链的Tm可以根据以下公式近似地预测：
之下大约20℃至25℃。本领域广为人知的是，Tm是熔解温度，或两个互补性多核苷酸序列
解离的温度。评估Tm的方法在本领域是熟知的(参见上文提及的Ausubel等人，第2.10.8
页)。一般地，完全匹配的DNA双链的Tm可以根据以下公式近似地预测：
[0246] Tm＝81.5+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.63(％甲酰胺)-(600/长度)。
[0247] 其中：M是Na+的浓度，优选在0.01摩尔至0.4摩尔的范围内；％G+C是鸟苷和胞苷碱基之和占碱基总数目的百分率，其中范围介于30％至75％G+C；％甲酰胺是甲酰胺的
体积百分浓度；长度是DNA双链中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每升高1％，双链
DNA的Tm大约降低1℃。对于高度严谨，一般在Tm-15℃进行洗涤，对于中度严谨为Tm-30℃。
体积百分浓度；长度是DNA双链中碱基对的数目。随机错配的碱基对数目每升高1％，双链
DNA的Tm大约降低1℃。对于高度严谨，一般在Tm-15℃进行洗涤，对于中度严谨为Tm-30℃。
[0248] 在杂交过程的一个例子中，在42℃将含有固定的DNA的膜(例如硝酸纤维素膜或尼龙膜)在含有标记探针的杂交缓冲液(50％去离子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt’s
溶液(0.1％菲可(ficoll)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)，0.1％SDS和
200mg/mL变性的鲑鱼精DNA)中杂交过夜。然后将膜依次进行两次中度严谨的洗涤(即，
在45℃2×SSC，0.1％SDS洗涤15分钟，然后在50℃2×SSC、1％SDS洗涤15分钟)，然
后依次进行两次较高严谨的洗涤(即，在55℃0.2×SSC、0.1％SDS洗涤12分钟，然后在
65-68℃0.2×SSC和0.1％SDS溶液中洗涤12分钟)。
溶液(0.1％菲可(ficoll)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％牛血清白蛋白)，0.1％SDS和
200mg/mL变性的鲑鱼精DNA)中杂交过夜。然后将膜依次进行两次中度严谨的洗涤(即，
在45℃2×SSC，0.1％SDS洗涤15分钟，然后在50℃2×SSC、1％SDS洗涤15分钟)，然
后依次进行两次较高严谨的洗涤(即，在55℃0.2×SSC、0.1％SDS洗涤12分钟，然后在
65-68℃0.2×SSC和0.1％SDS溶液中洗涤12分钟)。
[0249] 本发明还考虑到蛇毒FV嵌合或融合蛋白用于治疗出血事件或凝固紊乱的用途。本文使用的蛇毒FV“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非蛇毒FV多肽连接的蛇毒FV多肽。
“非蛇毒FV多肽”是指具有这样的氨基酸序列的多肽：所述氨基酸序列对应于不同于蛇毒
FV蛋白的蛋白并且来源于相同或不同的生物。融合蛋白的蛇毒FV多肽可以对应于全部或
部分的例如本文描述的蛇毒FV氨基酸序列的片段。在优选的具体实施方式中，蛇毒FV融
合蛋白包括蛇毒FV蛋白的至少一个(或两个)生物活性部分。非蛇毒FV多肽可以与蛇毒
FV多肽的N-末端或C-末端融合。
“非蛇毒FV多肽”是指具有这样的氨基酸序列的多肽：所述氨基酸序列对应于不同于蛇毒
FV蛋白的蛋白并且来源于相同或不同的生物。融合蛋白的蛇毒FV多肽可以对应于全部或
部分的例如本文描述的蛇毒FV氨基酸序列的片段。在优选的具体实施方式中，蛇毒FV融
合蛋白包括蛇毒FV蛋白的至少一个(或两个)生物活性部分。非蛇毒FV多肽可以与蛇毒
FV多肽的N-末端或C-末端融合。
[0250] 融合蛋白可以包括针对配体具有高度亲和性的部分(moiety)。例如，融合蛋白可以是GST-蛇毒FV融合蛋白，其中蛇毒FV序列与GST序列的C-末端融合。这样的融合蛋
白可以促进重组蛇毒FV的纯化。或者，融合蛋白可以是在其N-末端含有异源信号序列的
蛇毒FV蛋白。在一些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列
增加蛇毒FV的表达和/或分泌。在一些具体实施方式中，融合蛋白可以包括全部或部分的
血清蛋白，例如IgG恒定区，或人类血清白蛋白。
白可以促进重组蛇毒FV的纯化。或者，融合蛋白可以是在其N-末端含有异源信号序列的
蛇毒FV蛋白。在一些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列
增加蛇毒FV的表达和/或分泌。在一些具体实施方式中，融合蛋白可以包括全部或部分的
血清蛋白，例如IgG恒定区，或人类血清白蛋白。
[0251] 本发明的蛇毒FV融合蛋白可以整合到药物组合物中并在体内向个体给药。蛇毒FV融合蛋白可用于影响蛇毒FV底物的生物可利用度。
[0252] 3.FV药物组合物及其用途
[0253] 本发明还考虑到本文描述的蛇毒FV多肽在组合物和治疗出血事件或凝固紊乱的方法中的用途。因此，本发明的FV多肽适宜地在药物组合物中给药，所述药物组合物包含
药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以选自以下非限制性组，其中包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、云母、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、聚乙二醇及其不同的分子量、等渗盐水和盐(例如矿物酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐；有机酸，例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)和无致热原的水。可以使用众多水性载体，例如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。还可以使用非水性载体配制本发明的组合物，例如，如，以凝胶或脂质体的制备物的形式输送或靶向损伤位点。脂质体制备物一般可以参见例如美国专利号4837028、4501728和4975282的描述。
药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以选自以下非限制性组，其中包括糖、淀粉、纤维素及其衍生物、麦芽、明胶、云母、硫酸钙、植物油、合成油、多元醇、褐藻酸、磷酸盐缓冲液、乳化剂、聚乙二醇及其不同的分子量、等渗盐水和盐(例如矿物酸盐，包括盐酸盐、溴化物和硫酸盐；有机酸，例如乙酸盐、丙酸盐和丙二酸盐)和无致热原的水。可以使用众多水性载体，例如水、缓冲的水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。还可以使用非水性载体配制本发明的组合物，例如，如，以凝胶或脂质体的制备物的形式输送或靶向损伤位点。脂质体制备物一般可以参见例如美国专利号4837028、4501728和4975282的描述。
[0254] 描述药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的有用的参考文献是Remington’sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.N.J.USA，1991)，通过引用并入本文。也可以将补充性的活性化合物整合到组合物中。
[0255] 本发明的药物组合物还可以用于促进或辅助血液凝固。用途的例子包括向出血伤口(例如手术过程中或损伤或外伤之后)给药。
[0256] 在一些具体实施方式中，蛇毒FV多肽是药物组合物中存在的仅有的血液凝固成分。在此意义上，非发明人发现：包含本发明的各个具体实施方式的蛇毒FV多肽(例如，包含SEQ ID NO：2所示序列的多肽或其加工形式)的药物组合物无需多个成分(例如辅因
子、蛇毒FXa或其它血液凝固因子，例如FVII或FVIIa)的顺序或组合作用即可迅速使血液
凝固。
子、蛇毒FXa或其它血液凝固因子，例如FVII或FVIIa)的顺序或组合作用即可迅速使血液
凝固。
[0258] 可以将药物组合物配制为促进蛇毒FV多肽的稳定性，例如减少蛇毒FV的消化，例如自身消化。可以通过例如制备和/或提供pH为大约5至9或大约6.5至7的蛇毒FV的
药物组合物而促进蛇毒FV的稳定性。还可以通过提供进一步包括例如稳定剂(例如多元
醇)的蛇毒FV的药物组合物而稳定蛇毒FV的稳定性。在这样的具体实施方式中，药物组
合物可以包括大约5％、10％、20％或更多的多元醇(或多个多元醇)。可用于药物组合物
中的多元醇的例子是甘油。在其它方面，可以通过以晶体化、冷冻干燥的或冻干的形式提供蛇毒FV而增加蛇毒FV的稳定性。如果组合物是冷冻的，则应该在使用之前将组合物解冻。
在另一个具体实施方式中，本发明特征在于一种包括蛇毒FV(例如本文描述的蛇毒FV)的
组合物，其pH为大约5至9，或大约6.5至7。本发明的特征还在于一种包括蛇毒FV(例如
本文描述的蛇毒FV)和稳定剂(例如多元醇，例如甘油)的组合物。存在的甘油可以是大
约例如5％、10％或20％。
药物组合物而促进蛇毒FV的稳定性。还可以通过提供进一步包括例如稳定剂(例如多元
醇)的蛇毒FV的药物组合物而稳定蛇毒FV的稳定性。在这样的具体实施方式中，药物组
合物可以包括大约5％、10％、20％或更多的多元醇(或多个多元醇)。可用于药物组合物
中的多元醇的例子是甘油。在其它方面，可以通过以晶体化、冷冻干燥的或冻干的形式提供蛇毒FV而增加蛇毒FV的稳定性。如果组合物是冷冻的，则应该在使用之前将组合物解冻。
在另一个具体实施方式中，本发明特征在于一种包括蛇毒FV(例如本文描述的蛇毒FV)的
组合物，其pH为大约5至9，或大约6.5至7。本发明的特征还在于一种包括蛇毒FV(例如
本文描述的蛇毒FV)和稳定剂(例如多元醇，例如甘油)的组合物。存在的甘油可以是大
约例如5％、10％或20％。
[0259] 包含本发明的FV多肽的组合物的剂量取决于该多肽的特定用途，但是剂量应该是组合物实现其设想用途的有效量。从细胞培养检验和动物研究获得的数据可用于配置用
于人类的一系列剂量水平。一般地，对于水溶液形式的包含蛇毒FV多肽的组合物来讲，相
信大约1至100mM的这样的组合物足以提高纤维蛋白凝块的形成。但是，取决于组合物的
用途，剂量可以介于大约20nM至5μM的范围。例如，如果静脉内给药，一般以至少大约0.1至大约1mg/kg的剂量适宜地向个体(例如人或非人的哺乳动物，例如家养动物)给予本发
明的FV多肽，虽然其它剂量可以提供有益结果。
于人类的一系列剂量水平。一般地，对于水溶液形式的包含蛇毒FV多肽的组合物来讲，相
信大约1至100mM的这样的组合物足以提高纤维蛋白凝块的形成。但是，取决于组合物的
用途，剂量可以介于大约20nM至5μM的范围。例如，如果静脉内给药，一般以至少大约0.1至大约1mg/kg的剂量适宜地向个体(例如人或非人的哺乳动物，例如家养动物)给予本发
明的FV多肽，虽然其它剂量可以提供有益结果。
[0260] 在一些具体实施方式中，本发明的药物组合物通过局部向伤口、手术切口或其它要防止血液流失的位置给药。为此目的，可以将绷带、贴布、纱布、手术带、棉签或其它吸附性材料或支持性基质与包括本发明的蛇毒FV的组合物进行包被、浸渍或化学结合，以进行
局部给药。在这些应用中局部给药是需要的。此外，可以使用以包括蛇毒FV的组合物包被
或化学结合的缝合线或钉。
局部给药。在这些应用中局部给药是需要的。此外，可以使用以包括蛇毒FV的组合物包被
或化学结合的缝合线或钉。
[0261] 在内部出血或全身性出血的情况下，可以通过静脉内、皮下、真皮内或肌肉内注射组合物，并且可以作为单剂或多剂给药。治疗中给予的特定剂量可以由医生确定，并且取决于给药途径和个体的重量和状况。
[0262] 药物组合物可以与给药说明书一起包括在容器、包或分配器中。因此，本发明还考虑到用于防止或减少个体中血液流失或出血的试剂盒。这些试剂盒一般包括本文广泛描述的蛇毒FV多肽和一种或多种其它成分，例如，如：使用说明书；其它试剂和/或其它治疗剂(例如以下的一种或多种：抗微生物剂(例如抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗炎剂、抗组胺、抗纤维溶解剂、止痛剂和生长因子)；稀释剂；设备(例如容器，例如无菌容器或其它用于制备蛇毒FV以给药的材料)；药学上可接受的载体(例如稳定剂)；和用于向个
体给药的设备或其它材料(例如注射器、涂药器、绷带、喷雾器或气雾剂设备)。说明书可以包括用于例如具有外部和/或内部出血的个体中的治疗性应用的说明书，包括建议的剂量
和/或给药的模式。在其它应用中，蛇毒FV可以与其它成分联合给药，试剂盒可以包括蛇
毒FV和其它成分的数量、剂量和给药时间的说明书。
体给药的设备或其它材料(例如注射器、涂药器、绷带、喷雾器或气雾剂设备)。说明书可以包括用于例如具有外部和/或内部出血的个体中的治疗性应用的说明书，包括建议的剂量
和/或给药的模式。在其它应用中，蛇毒FV可以与其它成分联合给药，试剂盒可以包括蛇
毒FV和其它成分的数量、剂量和给药时间的说明书。
[0263] 在一些具体实施方式中，可以以冻干或冷冻干燥的形式供应蛇毒FV。在这样的具体实施方式中，试剂盒可以包括以下一种或多种：用于解冻和/或水解的说明书，和药学上可接受的载体或稀释剂。在一些具体实施方式中，试剂盒可以包括用于稀释剂或预先测定
数量的稀释剂的说明书。
数量的稀释剂的说明书。
[0264] 本发明还包括防止或减少个体中血液流失或出血的方法。该方法包括：以促进或增加血液凝块形成从而增加凝固和/或减少血液或液体流失的有效量向个体中的所需位
点给予蛇毒FV多肽。可以向伤口、其它组织或其它所需位点直接给予组合物。通常来讲，
对于外部伤口，可以通过任意方式(包括喷洒伤口)直接应用组合物。还可以内部应用组
合物，例如在手术过程中，或通过注射应用。
点给予蛇毒FV多肽。可以向伤口、其它组织或其它所需位点直接给予组合物。通常来讲，
对于外部伤口，可以通过任意方式(包括喷洒伤口)直接应用组合物。还可以内部应用组
合物，例如在手术过程中，或通过注射应用。
[0266] 本发明的方法、试剂盒或药物组合物可用于例如停止或减少出血、防止或抑制出血、治愈伤口和/或使伤口封闭。本发明的方法、试剂盒或药物组合物可用于各种手术环
境，包括：神经系统的手术；鼻子、口或咽的手术；呼吸系统的手术；心血管系统的手术；血液或淋巴系统的手术；消化系统的手术；泌尿系统的手术；生殖系统的手术；肌肉骨骼系
统的手术；外皮系统的手术；整形手术；整形外科手术和移植手术。例如，蛇毒FV可用于
血管手术中，包括为下列提供止血：冠状动脉远端吻合术的缝合孔出血；左心室缝合线；
主动脉切开术和插管位点；再手术时见到的弥散性心肌心外膜外出血(epimyocardial
bleeding)；和从静脉出血位点(例如心房、腔静脉或右心室水平)的渗出。本发明还可用
于移植前涤纶动脉移植物(dacron artery grafts)的闭合，体外组织的闭合，阻止从受损
的脾(从而挽救器官)、肝和其它薄壁器官出血；闭合气管和支气管吻合和肺的空气泄漏或
裂伤，闭合支气管残端、支气管瘘管和食道瘘管；以及用于无缝无疤愈合(“Zipper”技术)。
本发明还可用于提供角膜移植、流鼻血、扁桃腺切除术之后、拔牙和其它应用中的止血。参见G.F.Gestring和R.Lermer，Vascular Surgery，294-304，September/October 1983。同样，本发明的药物组合物特别适合于具有凝固缺陷(例如，如血友病，例如血友病A和血友
病B)的个体。
境，包括：神经系统的手术；鼻子、口或咽的手术；呼吸系统的手术；心血管系统的手术；血液或淋巴系统的手术；消化系统的手术；泌尿系统的手术；生殖系统的手术；肌肉骨骼系
统的手术；外皮系统的手术；整形手术；整形外科手术和移植手术。例如，蛇毒FV可用于
血管手术中，包括为下列提供止血：冠状动脉远端吻合术的缝合孔出血；左心室缝合线；
主动脉切开术和插管位点；再手术时见到的弥散性心肌心外膜外出血(epimyocardial
bleeding)；和从静脉出血位点(例如心房、腔静脉或右心室水平)的渗出。本发明还可用
于移植前涤纶动脉移植物(dacron artery grafts)的闭合，体外组织的闭合，阻止从受损
的脾(从而挽救器官)、肝和其它薄壁器官出血；闭合气管和支气管吻合和肺的空气泄漏或
裂伤，闭合支气管残端、支气管瘘管和食道瘘管；以及用于无缝无疤愈合(“Zipper”技术)。
本发明还可用于提供角膜移植、流鼻血、扁桃腺切除术之后、拔牙和其它应用中的止血。参见G.F.Gestring和R.Lermer，Vascular Surgery，294-304，September/October 1983。同样，本发明的药物组合物特别适合于具有凝固缺陷(例如，如血友病，例如血友病A和血友
病B)的个体。
[0267] 如以上所讨论，蛇毒FV多肽可配制为伤口敷料、绷带、贴布、纱布、手术带、棉签或其它吸附性材料或支持性基质的一部分。敷料和绷带是即用型的，无需事先的技术知识或操作技能。它们还可以是自我给药型的，作为紧急情况下的急救措施。这样的伤口敷料和
绷带可用于各种领域的应用，例如士兵、救援人员、救护车/护理组、救火队员的外伤包，以及医院和临床上的急救室人员的初步外伤和急救处理，特别是在灾难性的情况下。这样的
敷料还可应用在一般公众或医务人员使用的急救工具盒中。含有蛇毒FV的伤口敷料或绷
带还可以包括一种或多种稳定剂，或其它化合物或试剂，如本文描述的那些。例如，伤口敷料或绷带还可以包括：止痛剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗炎剂、抗组胺、抗纤维溶解剂和生长因子。
绷带可用于各种领域的应用，例如士兵、救援人员、救护车/护理组、救火队员的外伤包，以及医院和临床上的急救室人员的初步外伤和急救处理，特别是在灾难性的情况下。这样的
敷料还可应用在一般公众或医务人员使用的急救工具盒中。含有蛇毒FV的伤口敷料或绷
带还可以包括一种或多种稳定剂，或其它化合物或试剂，如本文描述的那些。例如，伤口敷料或绷带还可以包括：止痛剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗炎剂、抗组胺、抗纤维溶解剂和生长因子。
[0268] 除了蛇毒FV多肽之外，可以向组合物中添加一种以上的化合物，以同时释放，或者可以按照预先确定时间的释放模式单个释放。可以按照有效发挥其想要的目的的浓度向
组合物中添加另外的化合物(或多种化合物)，例如，抗生素将抑制微生物的生长，止痛剂
将缓解疼痛等。在一些具体实施方式中，敷料或绷带可以包括吸附层和/或衬层。敷料或
绷带的衬底可以是常规的非再吸收材料，例如硅树脂贴布或塑料材料；或者可以是生物兼
容性的可吸收材料，例如几丁质或其衍生物。
组合物中添加另外的化合物(或多种化合物)，例如，抗生素将抑制微生物的生长，止痛剂
将缓解疼痛等。在一些具体实施方式中，敷料或绷带可以包括吸附层和/或衬层。敷料或
绷带的衬底可以是常规的非再吸收材料，例如硅树脂贴布或塑料材料；或者可以是生物兼
容性的可吸收材料，例如几丁质或其衍生物。
[0269] 对于其它应用，如用于手术或作为内部凝固因子，可以将蛇毒FV配制成通过注射或者一些内部应用的形式给药。
[0270] 虽然组合物形成凝块的速率可能在某种程度上由应用来控制，例如对于动脉伤口和失血组织损伤为快速设定，对于多骨组织的伤口治疗为慢速设定。在特定的具体实施方
式中，当局部给予试剂时，应用之后1分钟内明显出现凝固；当静脉内注射试剂时则为5分
钟内。后一个时间允许血液中的平衡。
式中，当局部给予试剂时，应用之后1分钟内明显出现凝固；当静脉内注射试剂时则为5分
钟内。后一个时间允许血液中的平衡。
[0271] 在其它具体实施方式中，可以单独使用蛇毒FV多肽或者与其它试剂联合使用以在体外产生血清。
[0272] 为了更好地理解本发明并将之付诸实际效果，现在将通过以下非限制性实施例的描述特别优选的具体实施方式。
[0273] 实施例
[0274] 实施例1
[0275] 从蛇毒中分离澳洲棕蛇FV
[0276] 按照本发明人以前的工作Masci等人，(1988，Biochem Int，17：825-835)(通过引用并入本文)的描述从澳洲棕蛇蛇毒中分离凝血酶原激活剂复合物。将4mg/mL凝血酶原激活剂在-20℃储存于50％的甘油中。Sephacryl S-300获自AmershamPharmacia Biotech.，
Uppsala，Sweden，合成的发色底物S-2222获自Chromogenex，Stockholm，Sweden。陈旧
的柠檬酸化的血浆获自正常的经过病毒筛选的志愿者，由Princess Alexandra Hospital
Blood Bank获得。Hampton 1和2筛选试剂盒获自Hampton Research，United States of
America。Wizard 1和2筛选试剂盒获自EmeraldBiostructures，United Kingdom。
Uppsala，Sweden，合成的发色底物S-2222获自Chromogenex，Stockholm，Sweden。陈旧
的柠檬酸化的血浆获自正常的经过病毒筛选的志愿者，由Princess Alexandra Hospital
Blood Bank获得。Hampton 1和2筛选试剂盒获自Hampton Research，United States of
America。Wizard 1和2筛选试剂盒获自EmeraldBiostructures，United Kingdom。
[0277] 纯化澳洲棕蛇蛇毒FV的第一个步骤是从粗制蛇毒中分离棕蛇蛇毒蛋白酶复合物，如Masci等人(1988，见上文)的描述。将ConA-琼脂糖凝胶4B装入2.5x 16cm的柱，
按照生产商的推荐洗涤并以起始缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.4)平衡。将澳洲棕蛇蛇毒
(233mg干重)在10ml起始缓冲液中复原并置于37℃水浴中直至溶解。将样品装入柱中并
以柱缓冲液洗涤，直至基准恢复至0。将洗脱缓冲液(0.02M甲基α-D吡喃甘露糖苷处于
0.05M Tris-HCl中)装入柱中以将结合的蛋白(棕蛇蛇毒蛋白酶复合物)从Con A琼脂糖
凝胶4B上洗脱下来。柱子的流速是52ml/小时。将UV双波长检测器设定为280mm，衰减为
0.32，满量程吸光度单位(AUFS)为0.64。将具有S-2222水解活性的组分汇集并在Amicon
浓缩器(型号为405，具有YM3膜)中浓缩，流速为48mL/小时。将纯化的棕蛇蛇毒蛋白酶
复合物在-20℃储存于50％的甘油中。
按照生产商的推荐洗涤并以起始缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH 7.4)平衡。将澳洲棕蛇蛇毒
(233mg干重)在10ml起始缓冲液中复原并置于37℃水浴中直至溶解。将样品装入柱中并
以柱缓冲液洗涤，直至基准恢复至0。将洗脱缓冲液(0.02M甲基α-D吡喃甘露糖苷处于
0.05M Tris-HCl中)装入柱中以将结合的蛋白(棕蛇蛇毒蛋白酶复合物)从Con A琼脂糖
凝胶4B上洗脱下来。柱子的流速是52ml/小时。将UV双波长检测器设定为280mm，衰减为
0.32，满量程吸光度单位(AUFS)为0.64。将具有S-2222水解活性的组分汇集并在Amicon
浓缩器(型号为405，具有YM3膜)中浓缩，流速为48mL/小时。将纯化的棕蛇蛇毒蛋白酶
复合物在-20℃储存于50％的甘油中。
[0278] 以异硫氰酸钠处理使复合物解离，允许通过凝胶色谱在Superdex 75上分离FV样的成分。然后以不可逆的FXa抑制剂DDACK(参见Speijer等人，1986，J BiolChem，
13258-13267)处理FV样的成分以抑制可能存在于纯化的蛇毒FV中的痕量的FXa活性。通
过使用FXa发色底物S-2222检验以及通过血浆凝固检验来确认完全的抑制。
13258-13267)处理FV样的成分以抑制可能存在于纯化的蛇毒FV中的痕量的FXa活性。通
过使用FXa发色底物S-2222检验以及通过血浆凝固检验来确认完全的抑制。
[0279] 通过在琼脂糖凝胶珠子(以针对蛇FXa重链的多克隆抗体进行衍生)上进行亲和吸附除去残余的蛇FXa蛋白。
[0280] 实施例2
[0281] 以澳洲棕蛇蛇毒FV使柠檬酸化的血浆凝固
[0282] 在存在和不存在蛇毒FV的情况下测定重新钙化的柠檬酸化的血浆的凝固时间，其中，即使在低的纳摩尔浓度也实现了柠檬酸化血浆的凝固速率的大幅提高。该效应的简
单解释是在添加的蛇毒FV和人类FXa之间形成了有高度活性的杂合凝血酶原酶复合物。以
下的表1显示了使用Hyland-Clotek仪器在37℃测定的柠檬酸化血浆的凝固时间。反应
混合物(体积为350μL)由100μL柠檬酸化血浆；100μL tris缓冲盐水；50μL 0.2M的
钙；50μL platelin LS(磷脂)和50μL蛇毒FV制备物或缓冲剂组成。第59页的表2证
明：在存在钙(Ca)、磷脂(PL)和澳洲棕蛇蛇毒FV的情况下，柠檬酸化的血浆发生凝固，图
1提供的图的例子显示了在存在磷脂和澳洲棕蛇蛇毒FV的情况下，重新钙化的柠檬酸化的
血浆的凝固时间。
单解释是在添加的蛇毒FV和人类FXa之间形成了有高度活性的杂合凝血酶原酶复合物。以
下的表1显示了使用Hyland-Clotek仪器在37℃测定的柠檬酸化血浆的凝固时间。反应
混合物(体积为350μL)由100μL柠檬酸化血浆；100μL tris缓冲盐水；50μL 0.2M的
钙；50μL platelin LS(磷脂)和50μL蛇毒FV制备物或缓冲剂组成。第59页的表2证
明：在存在钙(Ca)、磷脂(PL)和澳洲棕蛇蛇毒FV的情况下，柠檬酸化的血浆发生凝固，图
1提供的图的例子显示了在存在磷脂和澳洲棕蛇蛇毒FV的情况下，重新钙化的柠檬酸化的
血浆的凝固时间。
[0283] 表1
[0284]FV(nM) 柠檬酸化的血浆的凝固时间(秒)
0 151
700 13
70 18
7 32
0.7 69
0 151
700 13
70 18
7 32
0.7 69
[0285] 实施例3
[0286] 整个伤口的凝固
[0287] 使用Hemoscope凝血弹性描记法(TEG)测定添加的蛇毒FV对于重新钙化的柠檬酸化的人类血液的凝固的效应(见图2)。图1确认了添加的少量的蛇毒FV引起的结固的
大规模增强与血浆凝固的结果一样，与杂合的蛇毒FVa-人类FXa复合物的形成是一致的。
大规模增强与血浆凝固的结果一样，与杂合的蛇毒FVa-人类FXa复合物的形成是一致的。
[0288] 表2
[0289]# 柠檬酸 缓 FVa PL Ca 凝固时 凝固时 CT
化的血 冲 A280 Platelin (0.2M) 间(秒) 间(秒) (ave)
浆 液 LS (1) (2) (秒)
＝1.080
1 100 150 0 50 50 152.1 150.5 150.3
2 100 150 50 50 0 ＞300 ＞300 ＞300
3 100 150 50 0 50 54.1 54.5 54.3
4 100 150 50(1/10) 0 50 68.9 67.0 67.5
5 100 150 50 0 50 84.3 97.4 90.8
(1/100)
6 100 150 50 0 50 ＞300 ＞300 ＞300
(1/1000)
7 100 100 50 50 50 12.6 12.8 12.7
8 100 125 25 50 50 13.3 13.8 13.6
9 100 140 10 50 50 15.2 14.8 15.0
10 100 100 50(1/10) 50 50 18.3 17.6 18.0
11 100 125 25(1/10) 50 50 19.6 19.8 19.7
12 100 140 10(1/10) 50 50 24.1 23.4 23.7
13 100 100 50 50 50 32.3 31.0 31.6
(1/100)
14 100 125 25 50 50 39.5 42.5 41.0
(1/100)
15 100 140 10 50 50 53.3 56.0 54.7
(1/100)
16 100 100 50 50 50 69.7 67.7 68.7
(1/1000)
化的血 冲 A280 Platelin (0.2M) 间(秒) 间(秒) (ave)
浆 液 LS (1) (2) (秒)
＝1.080
1 100 150 0 50 50 152.1 150.5 150.3
2 100 150 50 50 0 ＞300 ＞300 ＞300
3 100 150 50 0 50 54.1 54.5 54.3
4 100 150 50(1/10) 0 50 68.9 67.0 67.5
5 100 150 50 0 50 84.3 97.4 90.8
(1/100)
6 100 150 50 0 50 ＞300 ＞300 ＞300
(1/1000)
7 100 100 50 50 50 12.6 12.8 12.7
8 100 125 25 50 50 13.3 13.8 13.6
9 100 140 10 50 50 15.2 14.8 15.0
10 100 100 50(1/10) 50 50 18.3 17.6 18.0
11 100 125 25(1/10) 50 50 19.6 19.8 19.7
12 100 140 10(1/10) 50 50 24.1 23.4 23.7
13 100 100 50 50 50 32.3 31.0 31.6
(1/100)
14 100 125 25 50 50 39.5 42.5 41.0
(1/100)
15 100 140 10 50 50 53.3 56.0 54.7
(1/100)
16 100 100 50 50 50 69.7 67.7 68.7
(1/1000)
[0290] 在凝块混合物(用于重新钙化的柠檬酸化的全血的凝固)中加入20nM的APC将凝2
固时间从505秒提高至1333秒并且将凝块的强度从12减弱至7kdyn/cm。同时加入280nM
的蛇毒FV和APC产生127秒的凝固时间并恢复了凝块强度。如果杂合的蛇-人类复合物
比人类Va-Xa复合物相对于APC切割更加稳定的话，则可以容易地解释这些结果。
固时间从505秒提高至1333秒并且将凝块的强度从12减弱至7kdyn/cm。同时加入280nM
的蛇毒FV和APC产生127秒的凝固时间并恢复了凝块强度。如果杂合的蛇-人类复合物
比人类Va-Xa复合物相对于APC切割更加稳定的话，则可以容易地解释这些结果。
[0291] 实施例4
[0292] 小鼠尾部切除出血模型
[0293] 使用的规程改编自Tanabe等人，(1999，Thromb Haemos，8：828-836)(通过引用并入本文)。将成年B57/BL小鼠(20-30g)麻醉(异氟烷，2.5％，1.5L/分钟)，使用无菌
刀片将最末10mm的尾巴进行手术切除。立即将最近的尾巴表面浸没于含有或不含有澳
洲棕蛇FV(50nmol/L)的盐水(100mL)中1分钟。然后将从切割表面流失的血液吸附至
滤纸(Whatman No.54滤纸)屑(直径1cm)，纸屑以1分钟的间隔替换。通过Shaw等人，
(1972，Contracept，5：497-513)的方法测定纸屑和最初的盐水溶液中的血色素。图3和
图4提供了使用小鼠切除出血模型获得的血液流失测试的示例性的例子。从Animal Care
Committee of the Queensland Instituteof Medical Research和the University of
Queensland Animals Ethics Committees获取伦理学批准，规程符合NHMRC AEEC的规定。
刀片将最末10mm的尾巴进行手术切除。立即将最近的尾巴表面浸没于含有或不含有澳
洲棕蛇FV(50nmol/L)的盐水(100mL)中1分钟。然后将从切割表面流失的血液吸附至
滤纸(Whatman No.54滤纸)屑(直径1cm)，纸屑以1分钟的间隔替换。通过Shaw等人，
(1972，Contracept，5：497-513)的方法测定纸屑和最初的盐水溶液中的血色素。图3和
图4提供了使用小鼠切除出血模型获得的血液流失测试的示例性的例子。从Animal Care
Committee of the Queensland Instituteof Medical Research和the University of
Queensland Animals Ethics Committees获取伦理学批准，规程符合NHMRC AEEC的规定。
[0294] WESTERN印迹
[0295] 从澳洲棕蛇蛇毒分离的凝血酶原激活剂复合物的还原的和非还原的制备物、来自澳洲棕蛇的分离的FXa样蛋白酶和从澳洲棕蛇蛇毒分离的FVa的SDS PAGE和Western印
迹分析的结果证明：使用抗蛋白酶重链抗体(针对含有澳洲棕蛇FXa样蛋白酶重链的重组
GST融合蛋白的绵羊抗血清)显现FV制备物中去除了FXa(见图6)。图6中左手边显示的
凝胶是考马斯染色的结果，右手边的图是来自相同凝胶的Western印迹。
迹分析的结果证明：使用抗蛋白酶重链抗体(针对含有澳洲棕蛇FXa样蛋白酶重链的重组
GST融合蛋白的绵羊抗血清)显现FV制备物中去除了FXa(见图6)。图6中左手边显示的
凝胶是考马斯染色的结果，右手边的图是来自相同凝胶的Western印迹。
[0296] 实施例5
[0297] 静脉内出血的数据
[0298] 使用的规程类似于第[0269]段描述的小鼠尾部切除出血模型。将成年B57/BL小鼠(20-30g)麻醉(异氟烷，2.5％，1.5L/分钟)，静脉内注射100μL 500nmol/L盐水中的
FV；100μL盐水(对照)；或100μL盐水中的抑肽酶(110μmol/L)。每组有10只动物。
静脉内注射的溶液在血流中平衡3分钟之后，使用无菌刀片将最末10mm的尾巴进行手术切
除。将从切割表面流失的血液吸附至滤纸(Whatman No.54滤纸)屑(直径1cm)，纸屑以
1分钟的间隔替换。通过Shaw等人，(1972，Contracept，5：497-513)的方法测定纸屑上的血色素。图5提供了使用静脉内小鼠切除出血模型获得的血液流失测试的示例性的例子。
从Animal Care Committee of theQueensland Institute of Medical Research和the
University of Queensland AnimalsEthics Committees获取伦理学批准，规程符合NHMRC AEEC的规定。
FV；100μL盐水(对照)；或100μL盐水中的抑肽酶(110μmol/L)。每组有10只动物。
静脉内注射的溶液在血流中平衡3分钟之后，使用无菌刀片将最末10mm的尾巴进行手术切
除。将从切割表面流失的血液吸附至滤纸(Whatman No.54滤纸)屑(直径1cm)，纸屑以
1分钟的间隔替换。通过Shaw等人，(1972，Contracept，5：497-513)的方法测定纸屑上的血色素。图5提供了使用静脉内小鼠切除出血模型获得的血液流失测试的示例性的例子。
从Animal Care Committee of theQueensland Institute of Medical Research和the
University of Queensland AnimalsEthics Committees获取伦理学批准，规程符合NHMRC AEEC的规定。
[0299] 使用ANOVA对结果进行的统计学分析证明了处理组和时间(分钟)之间的相互作用(p＝0.041)。这在图5中显示：其中FV的线和抑肽酶的线在第5分钟的时间点交汇。
存在处理效应(p＜0.0001)和时间效应(p＜0.0001)的强烈证据。多重比较显示：与对
照相比，两个实验组(FV和抑肽酶)均具有较低的平均血液流失(p＜0.05)。与对照组相
比，抑肽酶组的平均血液流失低58％(95％置信区间：47％至66％)；与对照组相比，FV组
的平均血液流失低56％(95％置信区间：45％至65％)。相对于第1分钟时的血液流失，所
有随后的时间点的平均血液流失均降低(p＜0.05)。以下的表3显示了每个处理组中随着
时间(分钟)的平均血液流失和相对于Wilcoxon 2-样品检验的P值。
存在处理效应(p＜0.0001)和时间效应(p＜0.0001)的强烈证据。多重比较显示：与对
照相比，两个实验组(FV和抑肽酶)均具有较低的平均血液流失(p＜0.05)。与对照组相
比，抑肽酶组的平均血液流失低58％(95％置信区间：47％至66％)；与对照组相比，FV组
的平均血液流失低56％(95％置信区间：45％至65％)。相对于第1分钟时的血液流失，所
有随后的时间点的平均血液流失均降低(p＜0.05)。以下的表3显示了每个处理组中随着
时间(分钟)的平均血液流失和相对于Wilcoxon 2-样品检验的P值。
[0300] 表3
[0301]
[0302]合计 360.15 148.32 145.40 59.06 203.78 77.87
[0303] 本文引用的每篇专利、专利申请和公开物的公开内容通过引用全文并入本文。
[0305] 本说明书通篇旨在描述本发明的优选具体实施方式而不将本发明限制为任意一个具体实施方式或特征的特异性集合。因此本领域技术人员将意识到，根据本公开，可以不脱离本发明的范围对于例举的特定具体实施方式进行各种修饰和改变。所有这样的修饰和
改变均应该包括在随附的权利要求书的范围内。
改变均应该包括在随附的权利要求书的范围内。
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