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一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用

阅读：969发布：2024-01-13

专利汇可以提供一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。本发明多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。，下面是一种刚地弓形虫泛素激活酶1（TgUba1）多克隆抗体及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。
2.如权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴弓形虫速殖子的收集
复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心
10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；
⑵目的基因片段的扩增
收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行TgUba1210-750编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1μl，10nmol/L上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物12.5μl，加去离子水至25μl；反应条件为：95℃ 1min；95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min，共35个循环；72℃ 7min；扩增产物行
1％琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；
⑶原核表达质粒的构建和鉴定
用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经
1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；
⑷TgUba1210-750蛋白诱导表达与鉴定
将测序正确的质粒pET28b-TgUba1210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37℃振荡培养24h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，
1:1000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；
⑸蛋白纯化和免疫
将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，于－80℃保存。
3.根据权利要求2所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。
4.根据权利要求2所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中弓形虫为RH株。
5.根据权利要求2至4任一项所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷中感受态细胞为Rosatte(D E3)感受态细胞。
6.如权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白中的应用。
7.根据权利要求5所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白中的应用，其特征在于：所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。
8.如权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究TgUba1的蛋白功能方面中的应用。
9.如权利要求1所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究与TgUba1相互作用的相关蛋白的功能方面中的应用。

说明书全文

一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体及其制备

方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，尤其是一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 刚地弓形虫是一种世界范围内广泛分布的机会性致病原虫。目前对弓形虫病的治疗仍以药物为主，但均存在副作用强、治疗时间长、根治率低等缺陷。因此，寻找调控虫体生长发育关键的靶蛋白将为虫体致病机制研究、药物靶点研发提供理论依据。

[0003] 蛋白质的泛素化是一个或多个泛素分子与靶蛋白共价连接，这一反应共有3种泛素酶参与，即泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)与泛素连接酶(E3)。其中，E1将泛素分子激活后，泛素途径得以启动，泛素再依次经E2与E3的相互作用，最终被转运至待降解靶蛋白残基上，从而形成泛素链标记的蛋白质底物，此过程即为蛋白泛素化修饰。

[0004] 蛋白质泛素化是蛋白翻译后修饰的一种常见形式，在真核生物中，泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用，同时它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。

[0005] 已经证实泛素化-蛋白酶体介导的蛋白质降解在弓形虫细胞分裂周期中具有重要作用，因为蛋白酶体的抑制严重破坏了复制的多个阶段，最近发布的弓形虫泛素组也揭示了许多泛素化蛋白质以周期依赖性的方式在转录水平受到调节。前期研究中，通过生物信息学分析，本申请人发现弓形虫基因组中有一个注释为泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme,E1或Uba1)，本申请人曾采用同源重组方法试图敲除该基因，但并未成功，表明该蛋白是虫体生长发育过程中的关键基因。

[0006] 因此，为了在后续研究中观察该蛋白的定位与功能，本发明以逆转录PCR(RT-PCR)扩增获得编码弓形虫Uba1(TgUba1)蛋白第210至750位氨基酸的编码基因片段，构建原核表达质粒，并利用表达的重组蛋白制备特异性兔抗TgUba1多克隆抗体。

[0007] 通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体及其制备方法和应用，该多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

[0009] 本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

[0010] 一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。

[0011] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

[0012] ⑴弓形虫速殖子的收集

[0013] 复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；

[0014] ⑵目的基因片段的扩增

[0015] 收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进210-750
行TgUba1 编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1μl，10nmol/L上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物12.5μl，加去离子水至25μl；反应条件为：95℃1min；95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共35个循环；72℃7min；扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；

[0016] ⑶原核表达质粒的构建和鉴定

[0017] 用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；

[0018] ⑷TgUba1210-750蛋白诱导表达与鉴定

[0019] 将测序正确的质粒pET28b-TgUba1210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37℃振荡培养24h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，1:1000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；

[0020] ⑸蛋白纯化和免疫

[0021] 将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，于－80℃保存。

[0022] 而且，所述步骤⑴中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

[0023] 而且，所述步骤⑴中弓形虫为RH株。

[0024] 而且，所述步骤⑷中感受态细胞为Rosatte(D E3)感受态细胞。

[0025] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白中的应用。

[0026] 而且，所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。

[0027] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究TgUba1的蛋白功能方面中的应用。

[0028] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在研究与TgUba1相互作用的相关蛋白的功能方面中的应用。

[0029] 本发明取得的优点和积极效果是：

[0030] 1、通过对该抗体的一系列效价及特异性检测证明，本发明多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Westernblot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

[0031] 2、本发明方法利用重组TgUba1210-750蛋白作为抗原，成功制备了兔抗TgUba1多克隆抗体。

[0032] 由于TgUba1全长包括1092个氨基酸残基，其编码基因序列共有3279bp。因此在PCR扩增中存在一定难度。通过生物信息学分析发现该蛋白无信号肽，无跨膜区域，其中第39～40、160～169与927～933位氨基酸处疏水性较强，因此，本发明方法通过表达210～750位氨基酸作为抗原进行免疫。通过常规分子生物学与免疫程序，证实所表达的蛋白可以诱导动物产生高滴度的多克隆抗体。最关键的是，本发明证实该多克隆抗体可特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白，其中IFA实验表明，即使全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，该抗体也能识别。因此，可以利用该多克隆抗体可以进行免疫共沉淀结合质谱分析，免疫电镜、IFA以及Western blot等实验，进一步研究TgUba1的蛋白功能，探寻与TgUba1相互作用的一系列蛋白等。
附图说明

[0033] 图1为本发明中TgUba1210-750基因编码序列(即SEQ NO.1)的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析检测结果图；其中A为从弓形虫cDNA样本中扩增TgUba1210-750基因PCR结果图；B为重组质粒pET28b-TgUba1210-750PCR鉴定结果图；

[0034] 图2为本发明中抗重组TgUba1210-750的多克隆抗体(即本发明刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体)制备结果图；其中，A为纯化后重组TgUba1210-750蛋白SDS-PAGE结果图；B为免疫4次后兔血清间接ELISA检测结果图；C.为两个多克隆抗体纯化后间接ELISA检测结果图；D为两个纯化后多克隆抗体Western blot检测结果图；

[0035] 图3为本发明中抗TgUba1210-750多克隆抗体(即本发明刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体)识别弓形虫天然TgUba1蛋白的鉴定结果图；其中，A为Western blot分析结果图，B为IFA鉴定结果图。

具体实施方式

[0036] 下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

[0037] 本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

[0038] 一种刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，所述多克隆抗体的编码序列为SEQ NO.1。

[0039] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

[0040] ⑴弓形虫速殖子的收集

[0041] 复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为所需速殖子；

[0042] ⑵目的基因片段的扩增

[0043] 收集速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取RNA逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行TgUba1210-750编码序列，即SEQ NO.2的PCR扩增；反应体系为：cDNA 1μl，10nmol/L上、下游引物即SEQ NO.3和SEQ NO.4各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物12.5μl，加去离子水至25μl；反应条件为：95℃1min；95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共35个循环；72℃7min；扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳，观察到有明显的、大小正确的目的条带后表明扩增成功，利用切胶回收获得PCR产物；

[0044] ⑶原核表达质粒的构建和鉴定

[0045] 用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物，酶切完全的载体和目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜；经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，筛选阳性克隆，提取质粒；重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液测序；

[0046] ⑷TgUba1210-750蛋白诱导表达与鉴定

[0047] 将测序正确的质粒pET28b-TgUba1210-750热激法转化感受态细胞后，涂板于含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上，挑取阳性克隆，自含50μg/ml卡那霉素的诱导培养基中37℃振荡培养24h；将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃、12000×g离心10min，取上清行质量百分数为10％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗，1:1000，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，1:50000；待鉴定出有明显预期目标大小的目的条带后进行下一步实验；

[0048] ⑸蛋白纯化和免疫

[0049] 将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1210-750蛋白，以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫；免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测；待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清进行抗体纯化，即得刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体，于－80℃保存。

[0050] 较优地，所述步骤⑴中病症为精神萎靡、闭目和毛发竖起。

[0051] 较优地，所述步骤⑴中弓形虫为RH株。

[0052] 较优地，所述步骤⑷中感受态细胞为Rosatte(D E3)感受态细胞。

[0053] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体在特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白中的应用。

[0054] 较优地，所述天然全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，所述多克隆抗体也能识别。

[0055] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体能够应用在研究TgUba1的蛋白功能方面中。

[0056] 如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体能够应用在研究与TgUba1相互作用的相关蛋白的功能方面中。

[0057] 更具体地，如上所述的刚地弓形虫泛素激活酶1(TgUba1)多克隆抗体的制备方法，步骤如下：

[0058] 1材料和方法

[0059] 1.1材料

[0060] 1.1.1虫株、载体、菌株和实验动物刚地弓形虫RH株、原核表达载体pET28b、大肠埃希菌(E.coli)DH5α和Rosatte均为常规市售产品。日本大耳白兔购自温州医科大学实验动物中心。

[0061] 1.1.2RT-PCR引物的设计与合成根据ToxoDB中TgUba1基因编码序列(登录号为TGGT1_290290)用Primer Premier 5.0 软件设计引物，上、下游引物分别为：TgUba1210-750-F:5’-CGCTCTAGAATGCCTTTCCAGGACGGCGA-3’(即SEQ NO.3)和TgUba1210-750-R:5’-CGCAAGCTTATGGCCTTCTGAAGTGCGGTGG-3’(即SEQ NO.4)。下划线部分分别为限制性内切酶XbaⅠ和HindⅢ的酶切位点。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

[0062] 1.2方法

[0063] 1.2.1弓形虫速殖子的收集复苏弓形虫速殖子，腹腔接种ICR小鼠，待小鼠出现精神萎靡、闭目和毛发竖起等病症后，处死，抽腹水传代接种新一批健康小鼠，转种3代后，收集小鼠腹腔液，3.0μm孔径滤膜过滤液体，室温1000×g离心10min，去上清，沉淀即为实验所需速殖子。

[0064] 1.2.2目的基因片段的扩增收集RH株速殖子，Trizol法提取弓形虫总RNA，取0.5μg RNA按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板进行TgUba1210-750编码序列的PCR扩增。反应体系为：cDNA 1μl，上、下游引物(10nmol/L)各0.5μl，2×Ex Taq酶混合物12.5μl，加去离子水至25μl。反应条件为：95℃1min；95℃30s，60℃30s，72℃1.5min，共35个循环；72℃
7min。扩增产物行1％琼脂糖凝胶电泳。

[0065] 1.2.3原核表达质粒的构建和鉴定用XbaⅠ和HindⅢ酶分别双酶切pET-28b载体和PCR产物。酶切完全的载体和目的片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收酶切产物，再将回收到的目的片段与载体在16℃条件下连接过夜。经热激转化法将连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂板于LB固体培养基(含卡那霉素50μg/ml)，筛选阳性克隆，提取质粒。重组质粒进行PCR鉴定，阳性菌液送上海英骏生物技术有限公司测序。

[0066] 1.2.4TgUba1210-750蛋白诱导表达与鉴定将测序正确的质粒pET28b-TgUba1210-750热激法转化Rosatte感受态细胞后，涂板于LB固体培养基(含卡那霉素50μg/ml)，挑取阳性克隆，自诱导培养基(含卡那霉素50μg/ml)37℃振荡培养24h。将诱导后产物离心收集菌体，超声裂解后4℃12000×g离心10min，取上清行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，待电泳结束后，一块凝胶进行考马斯亮蓝R-250染色检测，另一块进行Western blot分析，以小鼠抗His单克隆抗体作为一抗(1:1000)，羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗(1:50000)。

[0067] 1.2.5蛋白纯化和免疫将阳性菌株常规诱导表达后超声裂解，常规镍柱纯化TgUba1210-750蛋白。以纯化后蛋白免疫2只健康雄性日本大耳白兔，背部皮下多点注射，每隔2周免疫一次，共免疫4次，第一次以1mg/只剂量的免疫原与完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫，其后三次均以0.5mg/只剂量的免疫原与不完全弗氏佐剂按体积比1:1的比例融合后进行免疫。免疫3次后取兔血，以间接ELISA法进行抗体效价检测。待血清效价大于1:32000后，常规心脏取血，收集血清按常规方法进行抗体纯化，于－80℃保存备用。

[0068] 1.2.6间接ELISA检测抗体效价以重组TgUba1210-750蛋白5μg/ml、100μl/孔，包被酶标板(37℃，2h)，洗涤后以300μl/孔的3％BSA-PBS于4℃封闭过夜；以300μl/孔的PBST洗涤3次后，按100μl/孔加入倍比稀释的血清样品(1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，37℃孵育1h；洗涤后按100μl/孔加入HRP标记的羊抗兔二抗(1:10000)，37℃孵育0.5h；洗涤后加入TMB显色液，于37℃孵育5min，最后加入50μl/孔的2M HCl终止反应，于OD450 波长下读数。

[0069] 1.2.7多抗识别天然TgUba1

[0070] (1)Western blot检测：收集弓形虫RH株速殖子，超声裂解虫体后，取上清经10％SDS-PAGE电泳、15V转膜25min、5％脱脂奶粉封闭2h后，以免疫前血清作为阴性对照，以纯化后兔抗TgUba1多克隆抗体(1:2000)作为一抗孵育过夜，羊抗兔HRP-IgG(1:100000)作为二抗孵育45min，电化学发光试剂(ECL)显色，观察结果。

[0071] (2)间接免疫荧光法(IFA)检测：收集弓形虫虫株进行IFA检测，兔抗TgUba1多克隆抗体(1:1000)作为一抗孵育过夜，荧光染料FITC标记的羊抗兔抗体IgG(1:5000)作为二抗孵育45min，DAPI染色5min，反应结束后，以50％甘油封片，荧光显微镜下观察。免疫前兔血清作为阴性对照。

[0072] 2结果

[0073] 2.1TgUba1210-750编码基因的PCR扩增结果TgUba1210-750基因编码序列的理论大小为1623bp，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条清晰、单一、大小约1600bp的特异性扩增条带，与预计片段大小相符(图1A)。挑取3个单克隆菌落提质粒，重组质粒经PCR鉴定，其中1号克隆菌在约1600bp处有单一目的条带(图1B)。将1号克隆菌送公司测序，证实其测序结果与TgUba1210-750编码序列完全一致。

[0074] 2.2抗重组TgUba1210-750的多克隆抗体制备鉴定正确的阳性菌经自诱导培养基诱导后以镍柱进行蛋白纯化，SDS-PAGE分析结果显示，纯化后在理论位置可见大量条带较单一的目的蛋白，其分子量约60kDa，与预期结果吻合(图2A)。将其作为免疫原免疫动物4次后取血清进行抗体效价检测，结果表明两只兔的血清中均产生了高滴度的多克隆抗体(图2B)，将抗体纯化后再次进行间接ELISA检测，证实纯化后抗体效价可达1:64000以上(图
2C)。最后，将两个抗体与免疫原进行Westernblot检测，证实两个抗体即使在1:32000也能在60kDa处产生特异性条带(图2D)。

[0075] 2.3多抗识别天然TgUba1Western blot实验结果表明，以免疫前血清作为阴性对照，制备的2株抗重组TgUba1210-750的多克隆抗体可见一特异性条带，表明均能特异性识别弓形虫RH株的TgUba1蛋白(见图3A)。选取1号多抗进行IFA验证，进一步证明该多克隆抗体能特异性识别天然的TgUba1蛋白。不仅如此，经DAPI染核后对比发现，TgUba1蛋白多分布于虫体胞浆内(图3B)。

[0076] 相关讨论：

[0077] 本发明利用重组TgUba1210-750蛋白作为抗原，成功制备了兔抗TgUba1多克隆抗体。通过对该抗体的一系列效价及特异性检测证明，所制备的多克隆抗体效价高、特异性强。随后的Western blot实验以及IFA实验均证实，该多抗能特异性识别内源性TgUba1蛋白，这有利于TgUba1蛋白功能的进一步研究。不仅如此，以DAPI染核作为参照发现，TgUba1蛋白分布于胞质中。

[0078] 由于TgUba1全长包括1092个氨基酸残基，其编码基因序列共有3279bp。因此在PCR扩增中存在一定难度。通过生物信息学分析发现该蛋白无信号肽，无跨膜区域，其中第39～40、160～169与927～933位氨基酸处疏水性较强，因此，本发明方法通过表达210～750位氨基酸作为抗原进行免疫。通过常规分子生物学与免疫程序，证实所表达的蛋白可以诱导动物产生高滴度的多克隆抗体。最关键的是，本发明证实该多克隆抗体可特异性识别弓形虫体内的天然全长TgUba1蛋白，其中IFA实验表明，即使全长TgUba1蛋白呈现天然构象时，该抗体也能识别。因此，可以利用该多克隆抗体可以进行免疫共沉淀结合质谱分析，免疫电镜、IFA以及Western blot等实验，进一步研究TgUba1的蛋白功能，探寻与TgUba1相互作用的一系列蛋白等。

[0079] Uba1免疫原蛋白(210-750AAs)编码序列(SEQ NO.1)：

[0080] cctttccaggacggcgacttcgtcgtcttccgcgaagtccagggcatggagatcaacgacttgcaacccatgcagatccgtgtgacgggtaagcacagcttccagatcggagacaccaccgcgttctccccgtacgtctccggaggcatcgcgcgacaggtgaagatgccccagacgatccgcttcaagtcctacgaggcatcgtgtcgcgctcccgtggctgcgggtgaagcgatgctgatcgtcccggacctgggcaagttcggacagtcggagcagcttcacctggccttccaagcggtcttgaatttccgcgaccggaacggcggaaacgcccatgcgcttcctccccacccgctcgacgcggctcgcgcaggcagccagcaggcagctgtggctgcgtgcgttgcggaggcgcagcgcctgaatggggaggcgaagcagctggcggaacgaggcgaacagggagtggttttcgtcgatcaggtcgacgagaagctcgtcgcgaacgtcgccgcctacgcccagtgccagatctcgccgatggctgcgttcgtcggcggcgtgcttgctcaagaagtcgtcaagttcactggaaaattctcgccgctgcgcggcttcctctacatggacgccttcgaggcgctcctctctccggaggcaaaggccgcattgggagagacaggaaaacaccgagaaaagtacagcatcgacagtcgctacgcagatcaagttgcactcttcggatccgagttccaacatgctctcggacgcacgcatgcctttgttgtcggtgccggcgcgctcggctgtgagctcctcaaaagtctcgctctcatgggctgcgggtgcggacctgaaaaagaaggaaaagtcactgtcacagacatggatcgaatcgaagtctccaacctcaatcgacagttcctctttcgcagagaacatgtcgggaaggccaagagcgtcactgccgccgcttctgtgcaaaccatgaatcctgaccttcagatcgtggctctcgaagaccgcgtcggagtcgagacagaggcaaccgtcttcactgacgacttctggcgaagccagcacatcatcgtcaatgctctggacaacattcaggcgcgacaatatgtcgatggtcgctgcgtctggttcggcttgcctctgctcgaaagtggaactcttggaaccaagggaaatgttcaggtggtgctacccttcatgacgcaatgttactccgacagcgcagatcctcccgaggagtcgattcctctctgcacgcttcgccatttcccgcatgcaattgagcataccatcgagtgggctcgagattgcttccagggtgtcttttgcgacgccgtcagcgagccgaacaagtttcgagaaaacccacaaaagtacctcgaacgcctccgaggagaaggcattctctcagtgcagaaggaccgactggagaagattcgggacctggtctctcagtggcaggacaaagagacgaaggcgttttctccgccctcgttcgaacgctgcgtagagaaggccgtttttctctttcaagatttattcttcaatcaaatctctcaacttctctactccttcccgctggaccaccgcacttcagaaggc

[0081] SEQ NO.2：Uba1氨基酸序列，其中红色标记处为所表达蛋白的氨基酸序列(210-750)

[0082] MATPQESSGAAAHIDTDLYSRQIGAFGLETMGKLITLRVLISGMRGVGAECAKNLILAGPNTVVLHDPAPCEMRDLGSNFCLTEEHVKKGVSRAEASKNYLAELNQYVTVDVLPDEKLTQEVVSRFDVVIVTEAGNEELKKINAFCRSASKPVGFIAANVFGLAASVFVDLGERFVCLDSDGEEPREVIVAGITHERAATVHTHTDKLLPFQDGDFVVFREVQGMEINDLQPMQIRVTGKHSFQIGDTTAFSPYVSGGIARQVKMPQTIRFKSYEASCRAPVAAGEAMLIVPDLGKFGQSEQLHLAFQAVLNFRDRNGGNAHALPPHPLDAARAGSQQAAVAACVAEAQRLNGEAKQLAERGEQGVVFVDQVDEKLVANVAAYAQCQISPMAAFVGGVLAQEVVKFTGKFSPLRGFLYMDAFEALLSPEAKAALGETGKHREKYSIDSRYADQVALFGSEFQHALGRTHAFVVGAGALGCELLKSLALMGCGCGPEKEGKVTVTDMDRIEVSNLNRQFLFRREHVGKAKSVTAAASVQTMNPDLQIVALEDRVGVETEATVFTDDFWRSQHIIVNALDNIQARQYVDGRCVWFGLPLLESGTLGTKGNVQVVLPFMTQCYSDSADPPEESIPLCTLRHFPHAIEHTIEWARDCFQGVFCDAVSEPNKFRENPQKYLERLRGEGILSVQKDRLEKIRDLVSQWQDKETKAFSPPSFERCVEKAVFLFQDLFFNQISQLLYSFPLDHRTSEGTLFWAPPKRPPTPISFDANDPASLDFVVAASNLFAFNFGLPAVRDVSKIQAIAARVAIPQFTPKRLHINTDDAEKPNGSGPPGASFAAPHPSLSLSAEAEEEVVAGLEKHLLATADLEKMVFVPVEFEKDDDTNFHIDLVHAASTLRAMNYKIPCCDRNKTKIIAGRIIPAIATTTAMITGLVSLELLKTVTYKQRKLEDFKNAFANLALPLWLFSEPMPPNRVVDKDFDPVACGPIRAMPKGFSCWDKIQVDIPGCTVQQLCEFLEEKFDVEVNILSVGNFCLYNSFLPVHKQQRFKRSIVELIEEVTKTSGQKSVAVESSCSAKSDGVDVLLPTICVLNK

[0083] 尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

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