치조골 골수 유래 성체 줄기세포의 골아세포 분화 방법{Method of osteoblastic differentiation of alveolar bone marrow-derived adult stem cell}

도 1a는 세포 표면 항원을 FACS caliber flow cytometer로 분석한 그림이고, 도 1b는 세포의 형태학적 특징을 파악하기 위해 광학 현미경으로 형태를 관찰한 그림이고,

도 2는 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 덱사메타손(dexametasone:이하DEX)과 속단 디클로로메탄 분획물을 처리했을 때의 염기성 인산화분해효소 활성을 측정한 수치와 그래프이고,

도 3a는 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 처리했을 때의 칼슘 축적을 나타내는 플레이트 그림이고,

도 3b는 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 처리했을 때의 칼슘 축적을 측정한 수치와 그래프이고,

도 4는 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 처리했을 때의 BSP와 OC의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 그림이고,

도 5는 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때의 세포증식을 측정한 수치와 그래프이고,

도 6은 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때의 교원질 합 성을 측정한 수치와 그래프이고,

도 7은 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때의 염기성 인산분해효소 활성을 측정한 수치와 그래프이고,

도 8은 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때의 BSP와 OC의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 그림이다.

본 발명은 치조골 골수 유래 성체 줄기세포의 골아세포 분화 방법으로, 보다 상세하게는 치조골 골수에서 분리한 성체 줄기세포에 속단 디클로로메탄 분획물 또는 마이크로-마크로 구조의 이상성 인산 칼슘염(micro-macro biphasic calcium phosphate:MBCP)을 처리하는 골아세포 분화 방법에 관한 것이다.

인체에 존재하는 경조직(hard tissue)은 크게 뼈와 치아로 분류되며, 치아에 문제가 생겨 발생하는 질환으로는 치주질환이 있다. 치주질환이란, 치주조직의 파괴가 수반되는 만성염증의 감염 질환으로, 이 질환으로 인한 치조골의 상실은 치아지지조직의 감소로 이어져 성인에게 있어서 발치의 가장 큰 원인이 된다. 따라서 상기 질환의 원인이 되는 치태나 치석의 여러 가지 세균을 제거하고, 소실된 치아지지조직을 재생시키는 것이 치주 치료의 목적이라고 할 수 있다(Page RC, J Periodontol ., 64:744,753, 1993). 상기 질환의 치료로는 일반적인 치주 치료 외에 여러 가지 골 재료를 이용한 치조골 이식술이 선호되고 있다.

골 이식술에 사용되는 재료를 공급원에 따라 분류하면, 자가골, 동종골, 이종골, 및 합성골 등으로 나눌 수 있다.

첫째, 자가골 이식은 환자 자신의 몸에서 골을 채득하여 이식하는 것으로, 가장 이상적인 이식재이나 골 채득량의 한계, 골 채득을 위한 부가적인 수술, 골 채취시 공여 부위의 손상 및 시술 후 합병증 발생가능성 등의 단점이 있다.

둘째, 동종골은 뇌사자로부터 장기(뼈)를 기증받아 조직은행에서 만드는 것으로, 자가골의 단점을 보완하고 있으나, 기증자로부터의 질병 전염 가능성과 면역거부반응 등이 문제가 될 수 있다.

셋째, 이종골은 종이 다른 개체로부터 채취되어 사용되는데, 조직 내에서 극소량의 흡수가 일어나며, 오랜 기간 잔존할 수 있으나 골유도능력은 동종골보다 떨어져 논란이 계속되고 있다.

넷째, 합성골은 동졸골과 이종골을 대신할 수 있는 생체 친화성 물질로서 개발되었다. 합성골 이식재는 치주영역에서는 네츄럴 코랄(natural coral), 삼인산 칼슘염(tricalcium phosphate), 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등이 사용되어져 왔다(Barney VC et al ., J Periodontol , 57(12):764-770, 1986). 이 중 비흡수성 합성골인 하이드록시아파타이트는 조밀성 하이드록시아파타이트와 다공성 하이드록시아파타이트로 구별되는데, 조밀성 하이드록시아파타이트의 경우 이식 후 대대분 긴 접합상피로 치유되며 골유도나 신생백악질의 형성이 없는 반면(Foroum GM ,et al , J Periodontol . , 53(12):719-725, 1982; Moskow BS, et al , J. Peridontol , 54(8):455-462, 1983), 다공성 하이드록시아파타이트는 골조직과 유사한 공간을 가지고 있어 그 공간 내로 세포의 유입 성장이 가능하다(Roy DN, et al, Nature , 247(438):220-222, 1974). 이상성 인산 칼슘염(Biphasic calcium phosphate:BCP)은 하이드록시아파타이트와 β-3인산 칼슘염(β-tricalcium phosphate)이 함께 존재하는 이식재로 개발되었다(Gauthier O., et al , Bionaterials , 19:133-139,1998). 임상에서는 세포유착을 위한 접촉면을 형성하기 위한 공간을 이식재에 부여한, 마이크로-마크로 구조의 이상성 인산 칼슘염(micro-macro biphasic calcium phosphate: 이하 MBCP)이 최근 개발되어 널리 사용되고 있다. MBCP는 안정적인 형태의 하이드록시아파타이트와 높은 용해성을 지닌 β-3인산 칼슘염을 60:40으로 혼합한 화학구조를 가지는 다공성 이식재이다. 상기 이식재가 가지고 있는 화학적 특징으로 인해 하이드록시아파타이트는 신생골 조직이 구조적으로 안정성을 유지할 때까지 지지대의 역할을 제공하고, β-3인산 칼슘염은 빠른 용해를 통해 이온교환으로 신생 골아세포가 이식재 사이의 공간으로 잘 확산되도록 한다. 또한, 이식재 내의 무수한 다공질은 이온교환을 가능하게 하며 골결정체의 침전을 통한 세포유착을 위한 새로운 접촉면을 형성하고, 혈관 형성 및 신생골의 리모델링과 성장 등에 도움을 준다. 상기 이식재가 골결손부에 이식되면 이식재와 생체재료간의 상호작용이 일어난다(Iwasaki Y. et al . , Biomaterials , 23:3421-4327,2002)고 알려져 있으나, 골분화 과정을 촉진시킨다는 보고는 아직 없다.

골이식술의 가장 이상적인 치유양상은 이식재의 완전한 숙주골화이다. 그러나 이식재의 기원이나 처리과정에 따라 치조골의 치유 양상이 다른 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 치주조직 재생과정에서 생체 내 이식 후 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있는 능력이 있고, 또한 본래 세포 특성과 다르게 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 성체 줄기세포의 이용에 관심이 모아지고 있다.

줄기세포(Stem cell)는 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기가 성장하는 일종의 모세포로, 간세포라 불리기도 한다. 줄기세포에는 사람의 배아를 이용해 만들 수 있는 배아줄기세포(Embryonic stem cell)와 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체 줄기세포(Adult stem cell)가 있다. 배아줄기세포는 인체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있지만 윤리적인 이유로 사용이 제한되어 있는 반면, 성체 줄기세포는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수와 혈액 등에서 추출한 것으로, 간엽 줄기세포와 조혈 줄기세포로 존재한다. 성체 줄기세포는 생체 내 이식 후에 특정 조직 및 장기 특이적으로 분화할 수 있고, 본래 세포의 특성과는 다른 타 조직의 세포로 전이 분화할 수 있는 분화 유연성을 가지는 세포로서, 윤리적인 제한 없어 조직공학에 널리 사용되고 있다.

이미 인간과 동물을 대상으로 한 연구에서 성체 줄기세포 중 골수 유래 줄기세포가 골형성 세포로 분화되는 것이 확인되었고(Friedenstein AJ et al ., Transplantation ., 6:230-247, 1968), 최근 연구에서는 골수로부터 분리한 줄기세포를 배양하여 골아세포로 분화 증식시키는 방법에 진전이 있으며 이를 통한 임상적용의 가능성이 높아지고 있다(Ohgushi H. et al ., J Biomed Mater Res ., 48:913-927, 1999).

그 동안 성체 줄기세포는 장골(ilaic bone)과 경골(tibia) 등에서 채취하여 연구되어져 왔으나, 이차적인 창상의 형상과 수술 후 통증이 수반되며, 그 채취 부위가 악골과는 멀리 떨어진 부위였기 때문에 치주 수술시에 보다 쉽게 성체 줄기세포를 얻을 수 있는 대체 방법이 요구되고 있다. 최근 들어 치조골 유래 성체 줄기세포가 장골 유래 성체 줄기세포보다 골형성능이 높은 것으로 나타났다(Matsubara T., et al ., J bone Miner Res . , 20(3):399-409, 2005).

한편, 성체 줄기세포를 골아세포로 분화시키기 위해서는 통상적으로 덱사메타손(Dexamethasone:이하 DEX)을 주로 사용하였다(Shigeyuki K. et al ., Artif Organ . , 28:72-82, 2004). 그러나 DEX는 장기간 신체 투여시 면역 반응의 장애 등 부작용이 있는 것으로 알려서 있어서(Carlsten H. et al ., Inflamm Res . , 45:26-30,1996; Yaube M. et al ., Inflamm Res ., 49:548-552,2000), 세포에 장기간 작용을 하여 임상적으로 사용할 때 예기치 않은 부작용이 우려된다. 이러한 부작용을 줄이기 위해서는 성체 줄기세포를 골아세포로 분화시킬 때 지금까지 사용했던 방법 외의 대체 방법이 필요하다.

최근 들어, 동양의학에서 많이 사용되는 생약제제들이 과학적인 연구방법에 의해 인체의 안정성 및 유효성이 밝혀지고 있다(Hisha H., et al ., Blood , 90(3):1022-1030, 1997). 이중 대표적인 생약제제로는 홍화씨, 안젤리카, 및 속단 등이 있다.

홍화씨는 골절, 파골, 쇄골은 물론 각종 골질환과 연약한 뼈의 강화에 좋은 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있으며 홍화씨 추출물이 골모세포의 세포 증식과 염기성 인산분해효소의 활성을 증가시키고, 신생골 형성과 성숙을 촉진시켜 골의 형성과 재생 및 치유과정에 우수한 효과가 있음이 보고되었고(윤동환 등, 대한치주과학회지, 28(4):769-786, 1998), 안젤리카( angelica sinensis )는 골아세포의 증식과 분화를 증가시키는 것으로 나타났다(Yang Q., et al ., Clinica Chimica Acta ., 71(1):88-94, 2002).

속단(續斷, Phlomis umbrosa )은 동양의학에서 많이 사용되는 생약제제들 중 하나로 간과 신장의 기능을 강화해주고 혈액의 흐름을 원활히 하여 근과 골을 이어주는 효능이 있다고 알려져 있다. 또한 속단 분획물이 골세포의 활성과 분화에 영향을 미칠 수 있어서 치주질환으로 파괴된 골조직의 재생제로 이용 가능성이 있다고 보고하였고(이영준 등., 대한치주학회지 , 33:259-269, 2003), 속단의 생리활성물질이 세포 수의 증가, 염기성 인산분해효소 활성의 증가, 골단백질 발현 증가, 및 두개골 재생효과 등이 있음이 보고되었다(한상헌, 속단활성성분이 일차 배양한 치조골모세포의 골 형성에 미치는 영향, 원광대학교 박사논문, 2003; 박상기, 속단의 골 형성 촉진 유도성분에 관한 실험실적 연구, 원광대학교 박사논문, 2003).

이에 본 발명자는 사람의 치조골의 골수에서 성체 줄기세포를 분리하고 속단 분획물 또는 MBCP를 처리한 결과 세포의 독성없이, 치조골 골수 유래 성체 줄기세포가 골아세포로 분화되는 과정을 촉진함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 치조골 골수에서 유래한 성체 줄기세포에 골분화 유도제 처리를 통한 골아세포 분화 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 치조골의 골수로부터 성체 줄기세포를 분리하는 단계; ⅱ) 상기 줄기세포를 배양하는 단계; 및 ⅲ)상기 줄기세포에 골분화 유도제를 처리하는 단계를 포함하는 치조골 유래 성체 줄기세포를 골아세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 MBCP를 유효성분으로 하는 골분화 유도제를 제공한다.

또한, 본 발명은 속단 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 하는 골분화 유도제를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 치조골의 골수로부터 성체 줄기세포를 분리하여, 상기 줄기세포에 속단 디클로로메탄 분획물과 MBCP를 처리하여 골아세포로 분화하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에서 성체 줄기세포는 치조골 골수에서 채취한 성체 줄기세포를 사 용하는 것이 바람직하며, 치조골 골수는 인간을 포함한 모든 포유동물로부터 채취할 수 있다.

환자의 치조골 골수에서 추출한 0.1 ~ 3㎖의 양으로도 골재생을 위한 충분한 수의 상기 성체 줄기세포를 배양할 수 있는데, 장골에서 골수를 채취하는 기존 방법을 위한 부가적인 수술이 필요하지 않으며, 다른 치아를 발치하는 경우 또는 치주 치료를 받기 위한 수술를 하는 기간 내에 그 부위에서 골수를 채취하여 미래에 사용할 자가 유래 성체 줄기세포를 미리 준비할 수 있게 한다.

본 발명에서 바람직한 실시예로서 상기 성체 줄기세포는 세포를 분리한 후 3,6,9 계대 배양한 세포를 사용한다.

본 발명에서는 상기 성체 줄기세포가 장골에서 유래한 성체 줄기세포(Kotobuki N., al ., Artif Organ ., 28(1):33-39, 2004)와 동일한 성체 줄기세포를 제공하였음을 세포 표면 항원(cell surface antigen) 및 세포 형태 측정 방법을 사용하여 확인하였다. 본 발명의 실시예의 결과 치조골 골수에서 유래한 성체 줄기세포와 장골에서 유래한 성체 줄기세포가 동일함을 확인하였다.

본 발명에서 사용한 속단 분획물은 속단의 메탄올 추출물을 n-헥산, 디클로로메탄 및 n-부탄올을 이용해 순차적으로 분배하여 각각의 분획물을 얻었으며, 이중 디클로로메탄 분획물을 본 발명의 속단 분획물로 사용했다. 디클로로메탄 분획물은 본 발명자들에 의해 선출원된 대한민국 특허출원 제 2004-57670호에서, 사람태아골모세포의 골형성 유도효과를 가지고 있음을 밝힌 바 있으나, 성체 줄기세포에서 골아세포로의 분화를 유도함은 아직 밝혀진 바 없다.

속단 디클로로메탄 분획물을 상기 성체 줄기세포의 각각 3,6,9계대에 처리하며 골분화 과정을 조사하였다. 대조군으로 사용된 DEX는 기존의 골아세포의 분화방법에 사용되는 물질로서 장기간 사용시 면역 반응의 장애 등 부작용을 일으켜 문제가 있음이 알려져 있다. 성체줄기세포에 속단 디클로로메탄 분획물의 처리는 0.5~100ng/㎖의 농도로 속단 디클로로메탄 분획물을 첨가하는 것을 의미하며, 10ng/㎖의 농도가 가장 바람직하다.

먼저 염기성 인산분해효소의 활성을 측정하므로 상기 성체 줄기세포가 골아세포로 분화되는 과정이 시작되는지의 여부를 조사하였다. 염기성 인산분해효소는 160kDa의 골세포 표식자로서 골아세포, 전골아세포, 골세포, 골육종세포 등에서 발현된다. 이 효소는 골세포 분화단계 초기에 관여하며, 국소적으로 인산이온 농도를 증가시켜 단백질은 인단백으로 전환시키고 이것이 칼슘결합 성향을 가지면서 골 광물화의 핵 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 골 형성 능력을 가진 세포에서는 이 효소의 활성이 높은 반면, 골 형성 능력이 없는 세포에서는 활성이 낮다고 보고되어, 이 효소가 골 형성 능력을 가진 세포에 대한 표식자로 유용함이 보고된 바 있다(Wlodarski KH, et al ., Calcif Tissue int ., 39:382-385, 1986). 본 발명의 실시예 결과 속단 디클로로메탄 분획물을 처리했을 때, DEX보다는 유의성이 약간 떨어지지만, 대조군에 비교했을 때 염기성 인산분해효소 활성이 충분히 유의성있게 증가함이 측정되었다(도 2 참조). 따라서 생약제제인 속단 디클로로메탄 분획물을 투여하여도 상기 성체 줄기세포가 골아세포로 분화되는 과정이 시작됨을 알 수 있었다.

또한 속단 디클로로메탄 분획물을 계대배양된 성체 줄기세포에 투여하여 골 형성과 밀접한 연관이 있는 칼슘 축적을 측정하였다. 본 실시예에서는 칼슘 축적 농도를 알아보기 위한 염색법인 알리자린 레드 설페이트(alizarin red-sulfate:이하 AR-S) 염색법을 사용하였는데, AR-S 염색법은 칼슘염에 특이한 반응을 보여 칼슘간의 붉은 착물을 형성하여 측정하는데 유효하다. 실시예 결과 속단 디클로로메탄 분획물을 처리할 경우 칼슘 축적이 충분히 유의성있게 증가함이 측정되었다(도 3 참조).

또한 본 발명에서는 Bone Sialoprotein(이하 BSP)와 오스테오칼신(osteocalcin; 이하 OC)의 발현을 웨스턴 블롯으로 측정하였다. BSP는 골의 총 비교원성 단백질 중에서 15%를 차지하고 있으며, 골석회화 및 재형성과 관련이 있다. 또한 상기 단백질은 파골세포가 골기질에 부착되는 것과 관련되어 있어 골석회화 및 골흡수와 상아질, 백악질의 초기 석회화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이 특성을 이용하여 무기질 결정 형성을 조절할 수 있는 골석회화와 분화에 대한 측정 지표로 사용할 수 있다(Shimizu-sasaki E., et al , J Biol Chem ., 276(5459-5466, 2001). BSP는 골아세포 분화 과정 중 후기에 관여한다. 한편, OC는 비타민 K 의존성 단백으로 골아세포에서 생성되어 골 기질 내 비교원 단백질의 약 10-20%를 차지한다. 상기 단백질은 칼슘과 결합력이 높고 골아세포에서 생성되어 골 흡수와 골형성에 중요한 기능을 하며, 골 구조에서는 하이드록시아파타이트 및 칼슘과 단단하게 결합된다. 골아세포 활성이 증가하게 되면 골아세포에서 OC의 발현이 증가된다.이 특성을 이용하여 OC의 발현의 측정을 통해 골형성시 골아세포의 활성도를 측정하는 지표로 사용할 수 있으며(Marazuela. M., et al ., Calcif Tissue Int ., 52(6):419-421, 1993), OC 또한 골아세포 분화 과정 중 후기에 관여한다. 본 발명의 실시예 결과에서 BSP와 OC의 발현이 증가하는 것이 측정되므로 속단 디클로로메탄 분획물이 골아세포 분화 과정의 후기에도 영향을 미쳐서 상기 성체 줄기세포가 골아세포로 완전히 분화하도록 기능함을 알 수 있었다(도 4 참조). 상기 결과로부터 상기 성체 줄기세포의 골분화제로 속단 디클로로메탄 분획물을 투여한 경우, 충분한 유의성있는 증가를 나타냄을 알 수 있으며, 속단 디클로로메탄 분획물을 투여하여도 다른 골분화 촉진물질과 마찬가지로 치조골 골수 유래 줄기세포는 골아세포로 분화가 진행됨을 알 수 있었다.

본 발명은 치조골 골수에서 유래한 성체 줄기세포를 분리하여 상기 줄기세포에 MBCP를 처리하여 골분화 유도제를 제공한다. 이 때 처리라 함은 MBCP 위에 상기성체 줄기세포를 배양하거나, MBCP를 분쇄 또는 분절하여 상기 성체 줄기세포에 가하는 것을 말한다. 치조골 골수 유래 성체 줄기세포에 MBCP를 처리하여 세포 증식을 측정한 결과, 세포 증식에 영향을 주지 않음이 측정됨으로(도 5 참조), MBCP를 유효성분으로 하는 골분화 유도제가 어떠한 세포독성도 없음이 확인되었다.

본 발명에서는, 상기 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때의 교원질 합성을 측정하였다. 골은 광학된 특수 결합조직으로 33%가 유기질로 되어 있으며, 이중 28%는 제 1형 교원질, 나머지 5%는 soteonectin, 오스테오칼신 등과 같은 비교원성 골기질 단백질로 되어 있으며, 이중 교원질은 골형성에서 중요한 기능을 수행한다. 제 1형 교원질은 골아세포에서 형성되며, 이 교원섬유 내와 주위에 무기질이 침착 되어 골조직이 형성되므로 교원질 합성량 측정으로 골형성의 유효성에 대해 확인할 수 있다. 본 발명의 실시예의 결과에서는 MBCP를 상기 성체 줄기세포에 처리했을 때, 대조군보다 약 7배 정도 증가함이 측정되었다(도 6 참조). 교원질은 주로 골아세포에서 형성되며 골조직 형성에 중요한 역할을 하므로 MBCP를 유효성분으로 하는 골분화 유도제가 골형성에 긍정적인 효과가 있음이 입증되었다.

또한 상기 성체 줄기세포에 MBCP를 처리했을 때, 대조군보다 염기성 인산분해효소 활성이 약 5배 증가하였다(도 7 참조). 그에 더하여, BSP와 OC의 발현이 유의성있게 현저하게 증가됨이 측정되었다(도 8 참조). 이를 통해 MBCP가 상기 성체 줄기세포에 조골작용을 촉진시킨다는 것을 알 수 있다.

또한 본 발명은 MBCP 또는 속단 디클로로메탄 분획물을 유효성분으로 함유하는 골분화 유도제를 제공한다. 본 발명의 조성물은, 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 폴리락틴산과 폴리글리콜릭산 등의 고분자 화합물, 콜라겐, 하알루론산, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 치조골 골수 유래 성체 줄기세포로부터 분화된 골아세포는 여러 가지 질환 등으로 손실된 골조직 재생을 위한 세포치료제로 사용될 수 있다. 치과영역에서의 골 손실은 주로 치주질환에 의해 발생하여 골 이식술을 통해 치료해 왔으나, 본 발명의 방법에 의해 성체 줄기세포를 외부에서 골아세포로 분화시킨 후 이식함으로서 상기 골 이식술을 대체하거나 보완할 수 있다. 또한 외상 및 사고로 인한 골절 및 골 결손, 질환으로 인한 골 결손 시에도 세포 치료를 적절하게 사용할 수 있으며, 치주질환 등으로 발치를 한 후 임플란트 등의 시술을 하기 위한 골 재생 및 이식술 시에도 매우 효과적으로 사용할 수 있다.

본 발명의 골분화 유도제를 이용하여 분화된 골아세포를 치료에 적용할 경우 투여하는 세포 수는 2×10 ⁶ ~2×10 ⁷ 개 정도이며 골 재생을 위한 수술시 1회 투여한다. 세포 치료 단독으로도 사용할 수 있으며, 다른 골치료제 1종 이상과 함께 사용할 수 있으며, 골이식재를 사용한 골재생술시 골 이식과 함께 사용할 수 있다. 골 이식과 함께 사용하는 경우, 세포는 적절한 뼈대에서 배양하여 바이오 구성체를 만들도록 한다. 뼈대로는 현재 임상적으로 사용가능한 합성골 제품(MBCP 등), 동종골(ICB 등) 또는 PLGA(innopol) 등을 사용할 수 있으며, 그 외 젤타입의 atelocollagen, hyaluronic acid, alginate 등을 고려할 수 있다. 인체 투여시 배양액은 첨가되지 않으며, 바이오 구성체를 PBS 등으로 깨끗하게 세착한 후 투여할 수 있다.

본 발명의 골분화 유도제는 치주질환시 골재생 치료 및 골 결손시 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기와 같이, 치조골 골수에서 유래한 성체 줄기세포에 속단 디클로로메탄 분획물 또는 MBCP를 처리하면 골아세포로의 분화가 촉진됨을 알 수 있고 기존의 골분화 유도물질보다 안정성이 높아 임상 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 치조골 골수 유래 성인 줄기세포( Alveolar bone marrow - derived adult stem cell :이하 AMASC )의 배양

환자의 치조골 골수에서 0.1 ~ 3㎖의 혈액을 채취하여, 상기 혈액을 20% FBS와 항생제가 포함된 α-MEM 9㎖에 혼합하여 37℃, 5% CO ₂ , 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 5일간 배양한 후에 FBS가 함유되지 않은 α-MEM으로 이물질과 혈액을 제거하였다. 20% FBS가 포함된 α-MEM으로 세포의 충분한 증식이 명확히 나타날 때까지 2일 간격으로 배지를 교환하였고, 본 실시예에서는 3,6,9계대 배양한 세포를 사용하였다.

따라서, 기존의 장골에서 성체 줄기세포를 채취하는 방법과는 달리 치조골 골수에서 성체 줄기세포를 분리할 때 채취양이 적으며, 적은 양으로도 골재생을 위한 충분한 수의 성체 줄기세포를 배양하여 치료시 자가 유래 성체 줄기세포를 사용할 수 있음이 확인되었다.

< 실시예 2> 세포 표면 항원( Cell surface antigen ) 및 세포 형태 측정

세포 표면 항원(Cell surface antigen)을 분석하기 위해, AMASC를 1 ×10 ⁵ 개 세포로 배양한 후, 0.05% 트립신(trypsin)으로 분리하고 PBS로 재현탁했다. 세포 현탁액(cell suspension) 중 50㎕의 상층액을 형광 표지 항CD 항체(flurochrome-conjugated anti-CD antibody)와 30분 동안 암실에서 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하고, FACS calibur flow cytometer(Beckton Dickinson, CA, USA)로 분석하였다. 본 발명에서 사용한 항체는 CD-29-FITC(Serotec, Oxford, UK), CD 44-FITC(Serotec, Oxford, UK), 및 CD 34-PE(Dinona, Seoul, Korea) 등이며, isotype 대조군(control)은 항-인간 마우스 IgG 항체(anti-human mouse IgG antibody,Dinona, Seoul, Korea)이다. 그 후 이를 사용하여 AMASC의 형태학적 특징을 파악하기 위해 형태를 관찰하였다.

도 1a에서 나타난 바와 같이, 간엽 줄기세포에 음성을 나타내면서 조혈줄기세포에 양성 항원인 CD 34에 대하여 대부분의 세포가 음성 반응을 보였으며, 간엽 줄기세포의 양성 표지자인 CD 29와 CD 44에 대해서는 양성 반응을 나타내었다. 도 1b에서 세포 형태는 방추 모양(spindle shape)의 섬유아세포의 형태(fibroblast-like morphology)를나타냈다.

이상의 결과들로 치조골에서 채취하여 배양한 상기 성체 줄기세포가 장골 유래 성체 줄기세포와 동일한 세포임을 확인하였다.

< 실시예 3> 속단으로부터 분획물 추출

속단으로부터의 분획물 추출은 대한민국 특허출원 제 2004-57670호에 기재되어 있는 방법을 사용하였다. 대한민국 익산시에서 구입한 속단을 깨끗이 세척하고 건조한 후 세절하였다. 세절한 속단 1.2㎏을 5ℓ의 메탄올로 2시간 동안 2회 반복 추출하여 여과하고, 여액을 감압 농축하여 메탄올 추출물 196g을 얻었다. 얻어진 메탄올 추출물은 60% 메탄올 수용액에 용해시키고 n-헥산, 디클로로메탄을 사용하여 순차적으로 분배하였다. 60% 메탄올 수용액 분획은 다시 감압농축하고 얻어진 잔류물을 증류수에 용해시킨 다음 n-부탄올을 이용하여 분배하였다. 각 용매 분획은 감압농축기를 사용하여 용매를 제거하였으며, n-헥산, 디클로로메탄 및 n-부탄올 분획물이 각각 4.5g, 6.7g, 56.0g 얻어졌다. 상기 분획물 중 디클로로메탄 분획물이 사람태아골모세포의 골형성 유도결과 시험에서 유의한 효과를 나타냈음으로 본 발명에서 상기 성체 줄기세포 처리에 사용하였다.

< 실시예 4> 속단 디클로로메탄 분획물 처리에 따른 AMASC 의 염기성 인산분해효소( Alkalinee Phosphateas , ALP ) 활성 측정

AMASC를 골아세포로 분화시키기 위해 6-웰 플레이트에 1×10 ⁵ 개 세포가 되도록 분주한 후, 37℃, 5% CO ₂ , 95% 공기 및 100% 습도의 혼합 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 실험군은 10㎍/㎖ 인슐린(insuline), 10mM β-글리세로인산(glycerophosphate), 50㎍/㎖ 비타민 C(ascorbic acid)와 속단 디클로로메탄 분획물 10ng/㎖를 처리하였고, 양성대조군에는 10㎍/㎖ 인슐린, 10mM β-글리세로인산, 50㎍/㎖ 비타민 C, 100nM DEX를 첨가하여 3,6,9계대군을 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 제거하고, 트립신-EDTA로 세포를 분리 후, 1,500rpm에서 6분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 0.2㎖의 증류수를 첨가하여 초음파 분쇄기로 현탁하였다. 각 세포 현탁액 0.1㎖에 0.1M 글리신(glycine) NAOH 버퍼(pH 10.4) 0.2㎖, 15mM p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenly phosphate:pNPP, Sigma) 0.1㎖, 0.1% 트립톤 X-100/살린(triton X- 100/saline) 0.1㎖과 증류수 0.1㎖을 혼합한 후 37℃에서 30분간 배양하였다. 0.1N NaOH를 0.6㎖ 첨가하여 반응을 중단하였다. 배양된 세포는 96-웰 플레이트에 옮기고, p-NPP의 가수분해 정도는 410nm 파장의 ELISA reader기에서 확인하였으며, p-니트로페놀(nitrophenol;p-NP, Sigma)을 기준값으로 이용하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 정량 제제(protein assay reagent, Pierce, USA)를 사용하여 측정하였고, ALP 활성도는 nM/30min/mg of protein 으로 표시하였다. 본 실시예는 3회 반복하였다.

실시예의 분석은 SPSS 10.0 버전을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하였으며, 사 후 검정은 Turkey법을 사용하였다(P<0.05).

도 2와 표 1에서 나타낸 바와 같이, 치조골 골수 유래 성체 줄기세포 3계대군의 염기성 인산분해효소 활성은 대조군 0.037±0.008, DEX 0.353±0.033, 속단 디클로로메탄 분획물 0.317±0.015으로 대조군에 비해 모두 유의한 증가를 보였으며, 속단 디클로로메탄 분획물을 투여한 경우 DEX를 투여한 경우보다 낮게 나타났으나 유의한 차이는 없었다. 6계대군의 염기성 인산분해효소 활성은 대조군 0.015±0.008, DEX 0.473±0.025, 속단 디클로로메탄 분획물 0.396±0.015으로 3계대군과 마찬가지고 대조군에 비해 두 실험군 모두 유의한 차이를 보이며 크게 증가하였다(P〈0.05). 또한 DEX를 투여한 경우와 속단 디클로로메탄 분획물을 투여한 경우에 상호간에 유의한 차이를 보였다. 9계대군의 염기성 인산분해효소 활성은 대조군 0.033±0.005, DEX 0.163±0.021, 속단 디클로로메탄 분획물 0.212±0.020이였으며 대조군에 비해 두 실험군 모두 유의한 증가를 나타냈다. 두 실험군 간에 다른 계대와는 달리 오히려 속단 디클로로메탄 분획물을 투여시 염기성 인산화효소 활성이 증가되는 경향을 보였지만 통계학적 유의성은 없었다. 그리고, 9계대군에서는 전체적으로 3,6계대군에 비해 염기성 인산화효소 활성이 감소하였으며, 특히 DEX의 골분화 유도 능력이 많이 저하됨을 확인할 수 있었다.

따라서 염기성 인산분해효소 활성의 측정 결과를 통해 생약제제인 속단 디클로로메탄 분획물을 투여하여도, DEX에 미치지는 못하지만, 상기 성체 줄기세포가 골아세포로 분화되는 과정이 확실히 진행됨을 알 수 있었다.

< 실시예 5> 속단 디클로로메탄 분획물 처리에 따른 AMASC 의 칼슘 축적 측정

6-웰 플레이트에 1×10 ⁵ 개의 세포가 들어가도록 분주한 후 배양하였다. 실험군과 양성대조군은 상기 실시예 3과 같은 조건으로 첨가하여 배양하였다. 세포외 기질의 광물화를 유도하기 위해 4mM/L NaHPO ₄ 를 23일째 되는 날에 첨가하였고, 25일째 되는 날에 배지를 제거하고 PBS로 세척하였다. 얼음으로 냉각시킨 70% 에탄올로 한 시간 동안 4℃에서 고정하고 에탄올을 제거한 후 40mM/L 알리자린 레드 설페이트(alizarin red-sulfate:이하 AR-S, Sigma)로 실온에서 10분 동안 염색하였다. 염색된 부분을 육안으로 비교, 관찰하기 위하여 디지털 카메라(Nikin E995, Micon Corporation, Japan)로 촬영한 후, 이를 계량적으로 비교하기 위하여 10mM/L 소디움 포스페이트(sodium phosphate, pH 7.0)에 10%(w/v) 세틸피리디니움 클로라이드(cetylpyridinium chloride)가 녹아있는 용액을 이용하여 염색부위를 녹여 AR-S의 농도를 562 nm의 흡광도에서 읽었으며 AR-S 검량선(standard curve)은 같은 용액을 사용하였다. 본 실시예는 3회 반복하였다.

실시예의 분석은 SPSS 10.0 버전을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하였으며, 사후 검정은 Turkey법을 사용하였다(P<0.05).

도 3a에서 나타낸 바와 같이, DEX와 속단 디클로로메탄 분획물 모두에서 대조군에 비해 뚜렸하게 증가된 석회화 결절이 나타났다. 속단 디클로로메탄 분획물의 경우 전체적인 배양기간 동안 DEX에는 미치지 못하지만 칼슘 축적을 많이 일으키는 것을 알 수 있었다. 3,6,9계대군에서 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우 모두에서 결절 형성이 뚜렸하게 일어났다. 속단 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우 DEX보다는 결절 크기가 크지는 않았지만 DEX와 같은 기전 작용에 의해 결절이 형성되는 것을 확인하였다. 6계대군에서는 3계대군와 같이 커다란 결절을 볼 수는 없었지만 두 실험군 모두에서 전체적으로 매우 진하게 염색된 양상을 보였으며, 수많은 소결절들이 보였다. 즉 계대가 늘어나면서 3계대군에서와 같이 매우 활발한 칼슘 축적 능력을 나타내지는 못하였지만, 만약 6계대군에서 배양 기간을 더 늘렸다면 아마도 3계대군에서와 같은 커다란 결절을 형성할 수 있을 것으로 사료된다. 9계대군에서는 6계대군에 비해 칼슘 형성 능력이 전체적으로 조금 감소되었음을 알 수 있었으며, 속단 디클로로메탄 분획물보다 DEX를 처리한 경우 칼슘 축적 형성이 더 많이 일어났다. 도 3b와 표 2에서 나타낸 바와 같이, 치조골 골수 유래 성체 줄기세포 3계대군의 칼슘 축적량은 대조군 114.225±6.275, DEX 833.630±21.615, 속단 디클로로메탄 분획물 718.315±17.915로 대조군에 의해 각각 약 7배 및 약 6배 증가하였다. 6계대군의 칼슘 축적양은 대조군 84.310±14.990, DEX 671.175±28.175, 속단 디클로로메탄 분획물 631.095±17.915으로 대조군에 비해 약 7배씩 증가하였다. 9계대군의 칼슘 축적양은 대조군 112.560±12.560, DEX 589.360±11.940, 속단 디클로로메탄 분획물 449.100±27.100으로 대조군에 비해 각각 약 5배 및 약 3배 증가하였다. 이 실험예에서 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우 모두 유의성 있게, 크게 증가하였다.

따라서 속단 디클로로메탄 분획물을 치조골 유래 성체 줄기세포에 첨가하면 기존의 골분화 유도물질인 DEX와 같은 기전작용을 함이 확인되었고, 골조직 재생에 있어서 중요한 골결절 형성에 영향을 미쳐 파괴된 골조직 재생제로 이용 가능성이 있을 것으로 생각된다.

< 실시예 6> 속단 디클로로메탄 분획물 처리에 따른 AMASC 의 웨스턴 블롯

실험군과 양성 대조군은 상기 실시예 3과 같은 조건으로 처리하여 배양하였다. 25일 동안 분화시킨 AMASC를 0.25% 트립신-EDTA로 분리하였다. 분리한 AMASC를 PBS로 세척 후, 용해 버퍼(lysis buffer)[10mM Na ₂ HPO ₄ (pH7.2), 0.9% NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.2% sodium azide, 0.004% sodium fluoride]로 세포 단백질을 추출하였고, BCA 용액(Sigma)에 Copper(Ⅱ)sulfate(Sigma)를 50:1로 혼합하여 단백질 농도를 측정하였다. 대조군과 실험군에서 추출된 단백질 50㎍를 사용하여 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 시행한 후 PVDF 막(Millipore Corp., Bedford, MA, USA)에 이동시켰다. 비특이 항체의 결합을 막기 위하여 실온 상태에서 PVDF막을 각각의 차단 용액(Zymed, USA)에 1시간 동안 처리하였다. 그 후에 오스테오칼신(Osteocalcin)(Biogenesis, Kingston, NH, USA)과 Bone Sialoprotein(BSP)(Chemicon, Temecula, CA, USA)의 1차 항체와 90분 동안 반응시켰다. 1차 항체로 반응시킨 후 PBS로 1회 세척하고, 2차 항체와 결합된 항-마우스 또는 항-레빗 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 60분간 처리하였다. 그 후 다시 PBS로 7분 동안 2회 세척하였고, ECL kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshir, UK)로 1분 동안 반응시켜 Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, Bukinghamshir, UK)에 노출시켰다.

도 4에서 나타낸 바와 같이, 골분화의 대표적인 발현 단백질인 BSP와 OC는 전체 계대군에 걸쳐서 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물을 투여한 경우 모두 증가하였다. 3계대군에서는 DEX와 속단 디클로로메탄 분획물의 발현 정도는 서로 비슷한 양상을 보이며 증가하였다. 6계대군에서는 BSP와 OC의 발현이 DEX를 처리한 경우에 속단 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우보다 조금 더 증가하는 양상을 보였다. 9계대군에서는 3,6계대군과는 다르게, DEX를 처리한 경우에 비해 속단 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우의 발현이 상대적으로 많이 감소하였다. 9계대군에서 속단 디클로로메탄 분획물을 투여하여 OC와 BSP의 발현이 DEX에 비해 감소한 것은, 칼슘 축적이 3,6 계대군과 비교하여 9계대군에서 크게 감소한 경우와 유사한 양상이다.

따라서 속단 디클로로메탄 분획물이 치조골 유래 성체 줄기세포가 골아세포로 분화되는 과정의 후기에까지 영향을 미친다는 것을 확인하였다.

< 실시예 7> MBCP 처리에 따른 AMASC 의 세포 증식 측정

배양한 AMASC을 0.25% 트립신-EDTA로 분리하여 배양액으로 현탁하고 ,실험군에는 10 mm×5mm의 MBCP 표면에 1 ×10 ⁴ 개의 세포가 들어가도록 분주하였고, 대조군은 실험군과 같은 공간을 확보한 후 MBCP 없는 상태에서 1 ×10 ⁴ 개의 세포가 되도록 분주하였다. 세포가 부착할 수 있도록 24시간 동안 37℃, 5% CO ₂ , 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 배양한 후 부착되지 않은 세포들은 배지로 제거하였다. 1,3,5일 동안 각각 배양한 후 혈구계수기를 이용하여 세포의 수를 계산하였으며 3회 반복하였다.

실시예의 분석은 SPSS 10.0 버전을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하였으며, 사후 검정은 Turkey법을 사용하였다(P<0.05).

도 5와 표 3에서 나타낸 바와 같이, 1,3,5일군 모두에서 실험군과 대조군간의 세포 증식에 있어 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 5일간의 배양에서 세포 증식이 있었으나 MBCP에 의한 것이라고 보기에는 어려웠다.

따라서 MBCP는 어떠한 세포독성도 가지고 있지 않음을 확인하였다.

< 실시예 8> MBCP 처리에 따른 AMASC 의 교원질 합성량 측정

실험군에는 10mm ×5mm 의 MBCP에 1×10 ⁶ 개의 세포가 들어갈 수 있도록 분주하고, 대조군에는 실험군과 같은 공간을 확보한 후 MBCP 없는 상태에서 1×10 ⁶ 개의 세포가 되도록 분주한 후 각각 20% FBS, 50㎍/㎖ 비타민 C, 10mM 소디움 β-글리세로인산 포함된 α-MEM를 2일 간격으로 교환하면서 배양하였다. 5, 7일동안 배양한 후 배지와 구분하여 세포만을 수거하였고, 죽은 세포를 제거하기 위해 1,500rpm에서 5분간 원심 분리한 후 10N HCl 3㎖을 첨가하고, 각 세포는 트립신-EDTA로 분리시켜 원심 분리한 후 상층액은 제거하고 3㎖ 6N HCl을 첨가하였다. 110℃에서 10-24시간 가수분해시킨 다음 각 시료를 여과하였다. 시료는 둘로 나누어 100㎕씩 첨가하였다. 완전히 건조시킨 다음 메탄올 50㎕를 가하여 남아있는 염산이 제거될 때까지 60℃에서 반응시켰다. 1.2㎖ 50% 이소프로판올을 넣어 남은 침전물을 용해하고 200㎕ 클로라민-T(chloramin-T) 용액과 섞어 10분간 반응시켰다. 1.2㎖ Ehrlich 반응 시약을 넣어 섞은 후, 50℃에서 90분간 배양한 다음 상온에서 냉각시켰다. 교원질 합성 측량은 검량선(standard curve)를 표준 지표로 하여 558nm에서 흡광도를 분광광도계(Spectrophotometer, Beckman, DU-550, USA)로 측정하였다. 본 실시예는 3회 반복하였다.

실시예의 분석은 SPSS 10.0 버전을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하였으며, 사후 검정은 Turkey법을 사용하였다(P<0.05).

도 6와 표 4에서 나타낸 바와 같이, MBCP를 처리한 5일군에서 대조군 0.300±0.018, 실험군 2.300±0.247으로 실험군에서 약 7배 높게 교원질 합성 증가가 유의성있게 측정되었으며, 7일군에서는 대조군 0.446±0.019, 실험군 3.330±0.257으로 역시 교원질 합성이 약 7배 유의하게 증가하는 것이 측정되었다.

따라서 MBCP가 상기 성체 줄기세포의 교원질 합성을 촉진하여, 골아세포로의 분화 과정을 촉진함을 알 수 있었다.

< 실시예 9> MBCP 처리에 따른 AMASC 의 염기성 인산분해효소 활성 측정

실험군은 AMASC를 10mm ×5 mm의 MBCP에 1 ×10 ⁶ 개가 되도록 분주하였고, 대조군은 실험군과 같은 공간을 확보한 후 MBCP 없는 상태에서 1×10 ⁶ 개의 세포가 되도록 분주한 후 각각 20% FBS, 50㎍/㎖ 비타민 C, 10mM 소디움 β-글리세로인산이 포함된 α-MEM과 혼합하여 37℃, 5% CO ₂ , 95% 공기 및 100% 습도의 혼합배양기에서 배양하였다. 5, 7일 동안 배양 후 배지를 제거하고, 트립신-EDTA로 세포를 분리한 후, 1,500rpm에서 6분간 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고, 0.2㎖의 증류수를 첨가하여 초음파 분쇄기로 현탁하였다. 각 세포 현탁액 0.1㎖에 0.1M 글리신 NAOH 버퍼(pH 10.4) 0.2㎖, 15mM p-니트로페닐 포스페이트(p-nitrophenly phosphate:pNPP, Sigma) 0.1㎖, 0.1% 트립톤 X-100/살린(triton X- 100/saline) 0.1㎖과 증류수 0.1㎖을 혼합한 후 37℃에서 30분간 배양하였다. 0.1N NaOH를 0.6㎖ 첨가하여 반응을 중지시켰다. 배양된 세포는 96-웰 플레이트에 옮기고, p-NPP의 가수분해 정도는 410nm 파장의 ELISA reader에서 확인하였으며, p-니트로페놀(nitrophenol;p-NP, Sigma)을 기준값으로 이용하였다. 단백질 농도는 BCA 단백질 정량 제제(protein assay reagent, Pierce, USA)를 사용하여 측정하였고, 염기성 인산화분해효소 활성도는 nM/30min/mg of protein 으로 표시하였다. 본 실시예는 3회 반복하였다.

실시예의 분석은 SPSS 10.0 버전을 사용하여 평균과 표준오차를 구하고, 이들의 통계학적 유의성은 일원분산분석법(ANOVA)을 이용하여 사전 검정하였으며, 사후 검정은 Turkey법을 사용하였다(P<0.05).

도 7와 표 5에서 나타낸 바와 같이, MBCP를 처리한 5일군의 대조군 0.040±0.009, 실험군 0.198±0.028으로 약 5배 정도 증가하였으며, 7일군에서도 대조군 0.034±0.012, 실험군 0.189±0.019으로 약 5배 정도 높게 염기성 인산분해효소 활성이 측정되었다.

따라서 MBCP를 처리하였을 때 치조골 골수 유래 성체 줄기세포는 골아세포로 분화되는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 10> MBCP 처리에 따른 AMASC 의 웨스턴 블롯

실험군은 MBCP 표면에 25일 동안 배양된 AMASC를 0.25% 트립신-EDTA로 분리하여 사용하였고, 대조군은 MBCP가 없는 환경에서 배양된 AMASC를 분리하여 사용하였다. 분리한 AMASC를 PBS로 세척 후, 용해 버퍼(lysis buffer)[10mM Na ₂ HPO ₄ (pH 7.2), 0.9% NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 0.2% sodium azide, 0.004% sodium fluoride]로 세포 단백질을 추출하였고, BCA 용액(Sigma)에 Copper(Ⅱ)sulfate(Sigma)를 50:1로 혼합하여 단백질 농도를 측정하였다. 대조군과 실험군에서 추출된 단백질 50㎍을 사용하여 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)을 시행한 후 PVDF 막(Millipore Corp., Bedford, MA, USA)에 이동시켰다. 비특이 항체의 결합을 막기 위하여 실온 상태에서 PVDF막을 각각의 차단 용액(Zymed, USA)에 1시간 동안 처리하였다. 그 후에 오스테오칼신(Osteocalcin)(Biogenesis, Kingston, NH, USA)와 Bone Sialoprotein(BSP)(Chemicon, Temecula, CA, USA)의 1차 항체를 90분 동안 반응시켰다. 1차 항체로 반응시킨 후 PBS로 1회 세척하고, 2차 항체와 결합된 항-마우스 또는 항-레빗 IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 60분간 처리하였다. 그 후 다시 PBS로 7분 동안 2회 세척하였고, ECL kit(Amersham Biosciences, Buckinghamshir, UK)로 1분 동안 반응시켜 Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, Bukinghamshir, UK)에 노출시켰다.

도 8에서 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 MBCP를 첨가한 실험군에서 OC와 BSP의 발현이 증가하는 경향을 보였다.

따라서 MBCP가 골아세포 분화의 후기에까지 영향을 미친다는 것을 확인하였다 .

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 치조골 유래의 성체 줄기세포를 추출한 후 골분화유도제로서 속단 디클로로메탄 분획물 또는 MBCP를 처리하여 골아세포로 분화하는 방법은 치조골 골수에서부터 적은 양을 채취하여 소량의 성체 줄기세포를 가지고 다량의 골아세포를 배양하는 것이 가능하고, 세포 독성 및 면역계의 부작용을 극복하여 분화 과정을 유의적으로 촉진시키는 효과를 나타내며, 상기 방법에 의해 분화된 골아세포는 치주질환 치료 및 외상 및 사고로 인한 골절 및 질환으로 인한 골 결손시 손상된 골조직 재생을 위한 세포치료제로 임상에서 안전하고 유용하게 사용될 수 있다.