共轭聚合物及其使用方法
阅读：959发布：2020-05-11
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1.式I或式II的大分子单体：
其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自以下组中：氢、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C1-C18烷氧基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C4-C18酰基、任选取代的C4-C18酰氧基、NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地为氢或低级烷基，水溶性基团、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷低聚物甲基醚；
或者，R1和R2和/或R3和R4与它们所连接的碳一起结合形成任选取代的4、5或6元环；
每个R5独立地选自以下组中：卤素、烷基、烷氧基、氨基、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷低聚物甲基醚；
每个p是0-3的值；
m是选自1-10,000的值；
A和B各自可以存在或不存在并且各自可以相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π-缀合主链；
1、2和3各自可以存在或不存在并且可以各自相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π-缀合主链；
n和o各自独立地为选自0-10,000的值，其中m、n和o内的单体可以相同或不同；
E1和E2各自独立地选自以下组中：氢、卤素、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素、取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的芴和被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，所述侧链被以下基团封端：i)选自以下的官能团：
胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其保护基团，用于与分子或生物分子缀合；或ii)缀合有机染料或生物分子；以及
其中式I或II的大分子单体可以是E1和E2之间的交替共聚物、嵌段共聚物、无规共聚物或接枝共聚物。
2.权利要求1的大分子单体，其中所述大分子单体具有式I-a或式II-a：
3.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物具有以下式：
4.权利要求1-3之一的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
5.权利要求1-4之一的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6是环氧乙烷低聚物甲基醚。
6.权利要求1-5之一的大分子单体，其中所述环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。
7.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物具有以下式：
8.权利要求1或7的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
9.权利要求1或7的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
10.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6独立地是水增溶基团。
11.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6独立地是水增溶基团。
12.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6是水增溶基团；以及
m、n和o各自独立地是1-50的值。
13.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6是水增溶基团；以及
m、n和o各自独立地是1-50的值。
14.权利要求10-13之一的大分子单体，其中每个R6是在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间的环氧乙烷低聚物甲基醚，包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。
15.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
16.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
17.权利要求15或16的大分子单体，其中所述Boc基团被转化为胺。
18.权利要求1或2的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6是环氧乙烷低聚物甲基醚。
19.权利要求18的大分子单体，其中所述环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。
20.权利要求1或7的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
其中每个R6是环氧乙烷低聚物甲基醚。
21.权利要求20的大分子单体，其中所述环氧乙烷低聚物甲基醚是-O-PEG11-OCH3或-O-PEG550-OCH3。
22.权利要求1-3之一的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
23.权利要求1或2的大分子单体，其中如果存在，A和B各自是选自以下组中的二价取代基：苯、萘、蒽、苯并二噻唑基、芴、茚并芴、噻吩、噻吩并噻吩、二噻吩并噻吩、3,4-亚乙二氧基噻吩、呋喃、吡啶、吡咯、稠合吡咯、四氢芘和噁二唑，其中上述基团各自是任选被取代的。
24.权利要求1-3之一的大分子单体，其中所述化合物为以下式者：
25.一种用于检测样品中的分析物的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与权利要求1-24之一的大分子单体合并；
(b)用光激发所述大分子单体；以及
(c)检测来自所述大分子单体的荧光，从而检测所述分析物。
26.用于检测样品中的目标生物分子的方法，所述方法包括：
提供怀疑含有目标分析物的样品；
提供权利要求1-24之一的大分子单体；
与捕获分子缀合，其中所述捕获分子能够与所述目标分析物相互作用；
在所述捕获分子能够与如果存在的所述目标分析物结合的条件下，使所述样品与所述捕获分子和所述缀合的大分子单体接触；
向所述样品施加激发所述缀合的大分子单体的光源；以及检测光是否从所述缀合的大分子单体中发射。
27.权利要求26的方法，其中所述方法是在活体内进行。
28.权利要求26的方法，其中所述样品包含活细胞。
29.权利要求26的方法，其中所述分析物是相对于对照核酸包含遗传点突变、缺失或插入的核酸。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸的检测表明在所述样品中存在癌症。
共轭聚合物及其使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0003] 发明背景
[0004] 诸如Pacific BlueTM、 488和Cy5的常见染料具有高量子产率，但消光系数有限。诸如藻胆蛋白的替代报道分子提供更大的吸收截面、产生更明亮的信号，但受限于快速的光漂白和对固定的敏感性。
[0005] 荧光团在各种生物测定形式中均很重要。事实上，荧光是生物分析和生物检测的常用方法，而荧光标记在这些应用中很重要。一些测定依赖于使用两个荧光团的荧光共振
能量转移(FRET)机制。在这些测定中，如果两个荧光团彼此紧邻，则能量在供体荧光团和受体荧光团之间转移。如果两个荧光团在给定的邻近范围内，则能量源(例如UV光)对“供体”的激发会产生能量转移至“受体”。反过来，受体发射其特征波长的光。为了使FRET发生，供体分子的荧光发射光谱必须与受体发色团的吸收或激发光谱重叠。
能量转移(FRET)机制。在这些测定中，如果两个荧光团彼此紧邻，则能量在供体荧光团和受体荧光团之间转移。如果两个荧光团在给定的邻近范围内，则能量源(例如UV光)对“供体”的激发会产生能量转移至“受体”。反过来，受体发射其特征波长的光。为了使FRET发生，供体分子的荧光发射光谱必须与受体发色团的吸收或激发光谱重叠。
[0006] 聚茚芴聚合物或大分子单体具有定义明确的结构、独特的光学性质且是稳定的。由于大分子单体的消光系数与聚合度(或重复单元数)成正比，因此设计大分子单体来改善
亮度。此外，由于这些材料衍生自普通的合成有机和聚合物化学技术，因此可以制造在尺
寸、结合位点、物理性质和光学性质方面更明确和可再现的试剂。
亮度。此外，由于这些材料衍生自普通的合成有机和聚合物化学技术，因此可以制造在尺
寸、结合位点、物理性质和光学性质方面更明确和可再现的试剂。
[0007] 与所述量子点不同，共轭大分子单体具有离散的激发光谱，类似于有机染料的激发光谱，这最大程度地减少了交叉束补偿的潜在问题。
[0008] 鉴于以上所述，在本领域中需要水溶性的并且比目前可获得的技术更亮的新的聚茚芴大分子单体。本公开满足这些和其他需求。
发明内容
[0009] 在一个实施方案中，本公开提供式I或II的大分子单体：
[0010]
[0011] 其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C1-C18烷氧基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C4-C18酰基、任选取代的C4-C18酰氧基、NRaRb(其中a bR和R 各自独立地为氢或低级烷基)、水溶性基团、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷低聚物甲基
醚；
醚；
[0013] 每个R5独立地选自卤素、烷基、烷氧基、氨基、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷低聚物甲基醚；
[0014] 每个p是0-3的值；
[0015] m是选自1-10,000的值；
[0016] A和B各自可以存在或不存在并且各自可以相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π-缀合主链；
[0017] 1、2和3各自可以存在或不存在并且可以各自相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π-缀合主链；
[0018] n和o各自独立地为选自0-10,000的值，其中m、n和o内的单体可以相同或不同；
[0019] E1和E2各自独立地选自氢、卤素、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素、取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的芴和被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，所述侧链被以下基团封端：i)选自以下的官能团：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其保护基团，用于与分子或生物分子缀合；或ii)缀合有机染料或生物分子；以及
[0020] 其中式I或II的大分子单体可以是E1和E2之间的交替共聚物、嵌段共聚物、无规共聚物或接枝共聚物(graph copolymer)。
[0021] 在另一个实施方案中，本公开提供一种用于检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
[0022] (a)将样品与式I或式II的大分子单体合并；
[0023] (b)用光激发大分子单体；以及
[0024] (c)检测来自大分子单体的荧光，从而检测分析物。
[0026] 在又一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中的目标生物分子的方法，所述方法包括：
[0027] 提供怀疑含有目标分析物的样品；
[0028] 提供与捕获分子缀合的式I或II的大分子单体，其中所述捕获分子能够与所述目标分析物相互作用；
[0030] 检测光是否从所述缀合大分子单体中发射。
[0031] 在某些方面，该方法在体内或可选地在体外进行。在某些方面，所述样品含有活细胞。在某些方面，所述分析物是相对于对照核酸包含遗传点突变、缺失或插入的核酸。该对照核酸可以含有基因突变。在某些方面，该核酸的检测表明样品中存在癌症。
附图说明
[0033] 图1示出本公开的实施方案，其中用染料标记的抗体与本公开的大分子单体反应。
[0034] 图2示出本公开的一个实施方案的生物缀合的大分子单体的示意图。
[0035] 图3A-D示出分别与抗体(图3A)、抗生物素蛋白(图3B)、核酸(图3C)、和染料(图3D)缀合的示例性大分子单体。
[0036] 图4A-D示出本公开的实施方案；图4A示出用染料和根据本公开的大分子单体标记的抗体；图4B示出用染料标记并用根据本公开的大分子单体标记的链霉抗生物素蛋白；图
4C示出用与本公开的大分子单体缀合的猝灭剂分子标记的核酸探针序列；以及图4D示出用
猝灭剂分子和根据本公开的大分子单体标记的核酸探针序列。
4C示出用与本公开的大分子单体缀合的猝灭剂分子标记的核酸探针序列；以及图4D示出用
猝灭剂分子和根据本公开的大分子单体标记的核酸探针序列。
[0037] 图5A-D示出描绘分析目标生物分子或分析物的各种方法的示意图；图5A显示与第一抗体连接的大分子单体并用染料与第二抗体结合；图5B示出大分子单体和染料标记的抗
体识别共同目标；图5C示出具有连接的染料和生物素的抗体以及链霉抗生物素蛋白与附着
于其上的大分子单体的第二生物缀合物；图5D示出具有结合于其上的染料和生物素的核酸
以及具有与其缀合的链霉抗生物素蛋白的大分子单体。
体识别共同目标；图5C示出具有连接的染料和生物素的抗体以及链霉抗生物素蛋白与附着
于其上的大分子单体的第二生物缀合物；图5D示出具有结合于其上的染料和生物素的核酸
以及具有与其缀合的链霉抗生物素蛋白的大分子单体。
[0038] 图6示出根据本公开的示意图。
[0039] 图7A-C示出本公开的各种示意图；图7A描述具有连接的染料和生物分子的大分子单体，其产生能量转移；图7B示出具有缀合链霉抗生物素蛋白和连接的染料的大分子单体；
图7C示出与核酸和染料缀合的大分子单体。
图7C示出与核酸和染料缀合的大分子单体。
[0040] 图8A-F示出描绘与连接至生物分子的大分子单体间接联合的示意图；图8A显示与大分子单体的共价缀合物相互作用的生物素化抗体；图8B显示与具有连接的染料的大分子
单体连接的部分结合的生物素化抗体；图8C显示与大分子单体的共价部分相互作用的生物
素化核酸；图8D显示与具有连接的染料的大分子单体的连接部分结合的生物素化核酸；图
8E显示具有与大分子单体801的共价连接的抗体相互作用的洋地黄毒苷部分的核酸；以及
图8F显示具有洋地黄毒苷部分和共价抗体的核酸，该共价抗体连接至大分子单体染料串联
复合物上。
单体连接的部分结合的生物素化抗体；图8C显示与大分子单体的共价部分相互作用的生物
素化核酸；图8D显示与具有连接的染料的大分子单体的连接部分结合的生物素化核酸；图
8E显示具有与大分子单体801的共价连接的抗体相互作用的洋地黄毒苷部分的核酸；以及
图8F显示具有洋地黄毒苷部分和共价抗体的核酸，该共价抗体连接至大分子单体染料串联
复合物上。
[0041] 图9A-B显示本公开的试验实施方案；图9A显示与分析物结合的一抗905，其中加入了附加有大分子单体的二抗；图9B显示用连接的大分子单体与一抗结合的目标分析物。
[0042] 图10A-B显示夹层型复合物实施方案；图10A显示结合分析物的一抗，然后加入具有生物素的二抗，之后加入具有链霉抗生物素蛋白的大分子单体以产生夹心型复合物；图
10B显示结合有分析物的生物素标记的一抗，然后加入与大分子单体连接的链霉抗生物素
蛋白。
10B显示结合有分析物的生物素标记的一抗，然后加入与大分子单体连接的链霉抗生物素
蛋白。
[0043] 图11A-C显示在淋巴细胞上门控的溶解的洗涤血液(LWB)的CD3染色：0.5μg；图11A显示UCHT1太平洋蓝(克隆：UCHT1；缀合物：Pacific BlueTM；信噪比：60；染色指数：10；抗体浓度：μg)；图11B显示P43(克隆：UCHT1；缀合物：P43；信噪比：507；染色指数：71；抗体浓度：0.5μg)；图11C显示P100(克隆：UCHT1；缀合物：P100；信噪比：517；染色指数：76；抗体浓度：
0.5μg)。
0.5μg)。
[0044] 图12A-C显示在淋巴细胞上门控的外周血单核细胞(PBMC)的穿孔素染色：图12A显示太平洋蓝(克隆：dG9；结合物：Pacific BlueTM；信噪比：33；染色指数：9；抗体浓度：0.25μg)；图12B显示P43(克隆：dG9；缀合物：P43；信噪比：46；染色指数：17；抗体浓度：0.25μg；图
12C显示P100(克隆：dG9；缀合物：P100；信噪比：41；染色指数：15；抗体浓度：0.25μg)。
12C显示P100(克隆：dG9；缀合物：P100；信噪比：41；染色指数：15；抗体浓度：0.25μg)。
[0045] 图13显示本公开的大分子单体(L18)的吸收曲线。
[0046] 图14显示本公开的大分子单体(P100)的吸收曲线。
具体实施方式
[0047] I.定义
[0048] 本文使用的术语“一”、“一个”或“该(所述)”不仅包括具有一个成员的方面，还包括具有多于一个成员的方面。
[0049] 本文中用于修饰数值的术语“约”表示该值附近的限定范围。如果“X”是该值，则“约X”表示0.9X-1.1X的值，更优选0.95X-1.05X的值。对“约X”的任何引用具体地表示至少是X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X和1.05X的值。因此，“约X”旨在教导和提供对例如“0.98X”的权利要求限制的书面描述支持。
[0050] 当使用修饰语“约”来描述数值范围的起始时，其适用于该范围的两端。因此，“约500至850nm”相当于“约500nm至约850nm”。当应用“约”来描述一组值中的第一个值时，它应用于该组中的所有值。因此，“约580、700或850nm”相当于“约580nm、约700nm或约850nm”。然而，当使用修饰语“约”仅描述该范围的末端或仅描述该组值中稍后的值时，其仅适用于该值或该范围的末端。因此，“约2至约10”的范围与“约2至约10”相同，但与“2至约10”的范围不相同。
[0051] 本文所用的“活化酰基”包括-C(O)-LG基团。“离去基团”或“LG”是易于通过亲核酰基取代(即，亲核加成至-C(O)-LG的羰基，随后消除离去基团)置换的基团。代表性的离去基团包括卤素、氰基、叠氮基、羧酸衍生物，例如叔丁基羧基，和碳酸酯衍生物，例如i-BuOC(O)O-。活化酰基还可以是如本文所定义的活化酯或通过碳二亚胺活化以形成酸酐(优选环状)或混合酸酐-OC(O)Ra或-OC(NRa)NHRb(优选环状)的羧酸，其中Ra和Rb独立地选自C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基、C1-C6烷氧基、环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。优选的活化酰基包括活化酯。
[0052] 本文所用的“活化酯”包括比乙酯基(例如NHS酯、磺基-NHS酯、PAM酯或卤代苯基酯)更易于通过亲核加成和消除而置换的羧基衍生物。活化酯的代表性羰基取代基包括琥
珀酰亚胺基氧基(-OC4H4NO2)、磺基琥珀酰亚胺基氧基(-OC4H3NO2SO3H)、-1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基；或任选被吸电子取代基例(例如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合)取代一次或多次的芳氧基(例如五氟苯基氧基、2,3,5,6-四氟苯基氧
基)。优选的活化酯包括琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基和2,3,5,6-四氟苯基氧基酯。
珀酰亚胺基氧基(-OC4H4NO2)、磺基琥珀酰亚胺基氧基(-OC4H3NO2SO3H)、-1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基；或任选被吸电子取代基例(例如硝基、氟、氯、氰基、三氟甲基或其组合)取代一次或多次的芳氧基(例如五氟苯基氧基、2,3,5,6-四氟苯基氧
基)。优选的活化酯包括琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基和2,3,5,6-四氟苯基氧基酯。
[0053] 本文所用的“酰基”包括本文定义的烷酰基、芳酰基、杂环酰基或杂芳酰基。代表性的酰基包括乙酰基、苯甲酰基、烟酰基等。
[0054] 本文所用的“烷酰基”包括烷基-C(O)-基团，其中所述烷基如本文所定义。代表性的烷酰基包括乙酰、乙酰基等。
[0055] 本文所用的“烯基”包括含有至少一个碳-碳双键或叁键的2至约15个碳原子的直链或支链脂族烃基。优选的烯基具有2至约12个碳原子。更优选的烯基含有2至约6个碳原
子。在一个方面，优选含有碳-碳双键的烃基。在第二方面，优选含有碳-碳叁键的烃基(即炔基)。本文所用的“低级烯基”包括2至约6个碳原子的烯基。代表性的烯基包括乙烯基、烯丙基、正丁烯基、2-丁烯基、3-甲基丁烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、癸烯基、丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基等。
子。在一个方面，优选含有碳-碳双键的烃基。在第二方面，优选含有碳-碳叁键的烃基(即炔基)。本文所用的“低级烯基”包括2至约6个碳原子的烯基。代表性的烯基包括乙烯基、烯丙基、正丁烯基、2-丁烯基、3-甲基丁烯基、正戊烯基、庚烯基、辛烯基、癸烯基、丙炔基、2-丁炔基、3-甲基丁炔基、正戊炔基、庚炔基等。
[0056] 烯基可以是未取代的或任选取代的。当任选地被取代时，烯基的一个或多个氢原子(例如1至4、1至2、或1个)可以独立地被选自以下组中的部分替代：氟、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、硫基和烷硫基。
[0057] 本文所用的“亚烯基”包括含有至少一个碳-碳双键或叁键的直链或支链二价烃链。优选的亚烯基在链中包含2至约12个碳，更优选的亚烯基在链中包含2至6个碳。在一个方面，优选含有碳-碳双键的烃基。在第二方面，优选含有碳-碳叁键的烃基。代表性的亚烯基包括-CH＝CH-、-CH2-CH＝CH-、-C(CH3)＝CH-、-CH2CH＝CHCH2-、亚乙炔基、亚丙炔基、亚正丁炔基等。
[0058] 本文所用的“烷氧基”包括烷基-O-基团，其中所述烷基如本文所定义。代表性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、庚氧基等。
[0059] 烷氧基可以是未取代的或任选取代的。当任选被取代时，烷氧基的一个或多个氢原子(例如1-4、1-2、或1个)可以独立地被选自氟、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、硫基和烷硫基的部分替代。
[0060] 本文所用的“烷氧基烷基”包括烷基-O-亚烷基-基团，其中所述烷基和亚烷基如本文所定义。代表性的烷氧基烷基包括甲氧基乙基、乙氧基甲基、正丁氧基甲基和环戊基甲氧基乙基。
[0061] 本文所用的“烷氧基羰基”包括酯基，即烷基-O-CO-基团，其中所述烷基如本文所定义。代表性的烷氧基羰基包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基等。
[0062] 本文所用的“烷氧基羰基烷基”包括烷基-O-CO-亚烷基-基团，其中所述烷基和亚烷基如本文所定义。代表性的烷氧基羰基烷基包括甲氧基羰基甲基、乙氧基羰基甲基、甲氧基羰基乙基等。
[0063] 本文所用的“烷基”包括脂族烃基，其可以是直链或支链的，在链中具有约1至约20个碳原子。优选的烷基在链中具有1至约12个碳原子。更优选的烷基在链中具有1-6个碳原子。本文所用的“支链”包括一个或多个低级烷基，例如甲基、乙基或丙基附着到直链烷基链上。本文所用的“低级烷基”在链中包括1至约6个碳原子，优选5或6个碳原子，其可以是直链或支链的。代表性的烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和3-戊基。
[0064] 烷基可以是未取代的或任选取代的。当任选地被取代时，烷基的一个或多个氢原子(例如1至4、1至2、或1个)可以独立地被选自下组中的部分替代：氟、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、硫基、和烷硫基。
[0065] 本文所用的“亚烷基”包括1至约6个碳原子的直链或支链二价烃链。优选的亚烷基是具有1至约4个碳原子的低级亚烷基。代表性的亚烷基包括亚甲基、亚乙基等。
[0066] 本文所用的“烷硫基”包括烷基-S-基团，其中所述烷基如本文所定义。优选的烷硫基是其中烷基是低级烷基的那些。代表性的烷硫基包括甲硫基、乙硫基、异丙硫基、庚硫基等。
[0067] 本文所用的“烷硫基烷基”包括烷硫基-亚烷基-基团，其中所述烷硫基和亚烷基如本文所定义。代表性的烷硫基烷基包括甲硫基甲基、乙硫基丙基、异丙硫基乙基等。
[0068] 本文所用的“酰胺基”包括式Y1Y2N-C(O)-的基团，其中Y1和Y2独立地是氢、烷基或烯基；或者Y1和Y2与将Y1和Y2连接的氮一起结合形成4元氮杂环基至7元氮杂环基(例如哌啶基)。代表性的酰胺基包括伯酰胺基(H2N-C(O)-)、甲基酰胺基、二甲基酰胺基、二乙基酰胺基等。优选地，“酰胺基”是-C(O)NRR'基团，其中R和R'独立地选自H和烷基。更优选地，R和R'中的至少一个是H。
[0069] 本文所用的“酰胺基烷基”包括酰胺基-亚烷基-基团，其中所述酰胺基和亚烷基如本文所定义。代表性的酰胺基烷基包括酰胺基甲基、酰胺基亚乙基、二甲基酰胺基甲基等。
[0070] 本文所用的“氨基”包括式Y1Y2N-的基团，其中Y1和Y2独立地是氢、酰基或烷基；或者Y1和Y2与将Y1和Y2连接的氮一起结合形成4元氮杂环基至7元氮杂环基(例如哌啶基)。任选地，当Y1和Y2独立地是氢或烷基时，可以向氮中加入另外的取代基，产生季铵离子。代表性的氨基包括伯氨基(H2N-)、甲基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基等。优选地，“氨基”是-NRR'基团，其中R和R'是独立地选自H和烷基的成员。优选地，R和R'中的至少一个是H。
[0071] 本文所用的“氨基烷基”包括氨基-亚烷基-基团，其中所述氨基和亚烷基如本文所定义。代表性的氨基烷基包括氨基甲基、氨基乙基、二甲基氨基甲基等。
[0072] 本文所用的“芳酰基”包括芳基-CO-基团，其中所述芳基如本文所定义。代表性的芳酰基包括苯甲酰基、萘-1-酰基和萘-2-酰基。
[0073] 本文所用的“芳基”包括6至约14个碳原子，优选6至约10个碳原子的芳族单环或多环环系。代表性的芳基包括苯基和萘基。
[0074] 本文所用的“芳环”包括5-12元芳族单环或稠合多环部分，其可包括0-4个选自氧、硫、硒和氮的杂原子。示例性的芳环包括苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪、嘧啶、萘、苯并噻唑啉、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、苯并吲哚、喹啉等。芳环基团可以在一个或多个位置被卤素、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、卤代烷基、氰基、磺酸基、氨基磺酰基、芳基、磺酰基、氨基羰基、羧基、酰基氨基、烷基磺酰基、氨基和取代或未取代的取代基取代。
[0075] 本文所用的“生物分子”包括用于生物系统的天然或合成分子。优选的生物分子包括抗体、抗原、蛋白质、肽、酶底物、激素、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、碳水化合物、碳水化合物衍生物、寡糖、多糖和核酸。更优选的生物分子包括抗体、蛋白质、肽、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素。在某些方面，生物分子包括但不限于蛋白质、肽、亲和配体、抗体、抗体片段、糖、脂质、酶和核酸(作为杂交探针和/或适体)。
[0076] 本文所用的“羧基(Carboxy”和“Carboxyl)”包括HOC(O)-基团(即羧酸)或其盐。
[0077] 本文所用的“羧基烷基”包括HOC(O)-亚烷基-基团，其中所述亚烷基如本文所定义。代表性的羧基烷基包括羧甲基(即HOC(O)CH2-)和羧乙基(即HOC(O)CH2CH2-)。
[0078] 本文所用的“共轭大分子单体”包括含有一系列延长的不饱和键的大分子单体。共轭大分子单体或聚合物的主链可以含有交替的双键和单键。共轭聚合物可以沿其骨架的全长共轭或者可以含有共轭链段和非共轭链段。
[0079] 本文所用的“共轭”包括具有pi电子的相邻原子的不饱和有机体系，其中在插入的σ键上存在p轨道与另一轨道的重叠。在较大的原子中，可以涉及d轨道。原子可以是sp2或sp杂化的碳原子或具有可以杂化到p轨道中的非共享电子对的其他原子。
[0080] 本文所用的“环烷基”包括约3至约10个碳原子，优选约5至约10个碳原子的非芳族单环或多环体系。更优选的环烷基环含有5或6个环原子。环烷基任选地包含至少一个sp2-杂化的碳(例如，引入内环或环外烯烃的环)。代表性的单环环烷基包括环戊基、环己基、环己烯基、环庚基等。代表性的多环环烷基包括1-萘烷、降冰片烷基、金刚烷基等。
[0081] 本文所用的“亚环烷基”包括具有约4至约8个碳原子的二价环烷基。优选的亚环烷基包括1,2-、1,3-或1,4-顺式或反式亚环己基。
[0082] 本文所用的“卤代”或“卤素”包括氟、氯、溴或碘。
[0083] 本文所用的“杂原子”包括碳或氢以外的原子。代表性的杂原子包括O、S和N。杂原子的氮或硫原子任选被氧化成相应的N-氧化物、S-氧化物(亚砜)或S,S-二氧化物(砜)。在优选的方面，杂原子与亚烷基碳原子具有至少两个键(例如，-C1-C9亚烷基-O-C1-C9亚烷
基-)。在一些实施方案中，杂原子进一步被酰基、烷基、芳基、环烷基、杂环基或杂芳基取代(例如-N(Me)-、-N(Ac)-)。
基-)。在一些实施方案中，杂原子进一步被酰基、烷基、芳基、环烷基、杂环基或杂芳基取代(例如-N(Me)-、-N(Ac)-)。
[0084] 本文所用的“杂芳基”是指如下的芳基，其中至少一个芳环中的至少一个碳原子被杂原子(例如氮、氧、硫和磷)替代，使得化合物的芳香性得以保留，并且可以任选地在一个或多个可取代的位置被取代。示例性的杂芳基包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、哒嗪基、吡咯基、N-低级烷基-吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、三唑基、四唑基、咪唑基、联吡啶基、三吡啶基、四吡啶基、吩嗪基、菲咯啉基、嘌呤基、二萘嵌苯、二萘嵌苯二酰亚胺、吡咯并吡咯基、苯并噻二唑、苯并噁二唑、噻吩并吡嗪等。杂芳基的其他实例包括稠环体系，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并吡咯基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、菲咯啉基、咔唑基和氮杂咔唑基。
[0085] 本文所用的“杂芳酰基”包括杂芳基-C(O)-基团，其中所述杂芳基如本文所定义。代表性的杂芳酰基包括噻吩酰基、烟酰基、吡咯-2-基羰基、吡啶酰基等。
[0086] 本文所用的“杂环酰基”包括杂环基-C(O)-基团，其中所述杂环基如本文所定义。代表性的杂环酰基包括N-甲基脯氨酰基、四氢呋喃酰基等。
[0087] 本文所用的“羟基烷基”包括被一个或多个羟基取代的如本文所定义的烷基。优选的羟基烷基含有低级烷基。代表性的羟基烷基包括羟甲基和2-羟基乙基。
[0088] 术语“任选取代的”是指所述取代基可以是取代的或未取代的。例如，烷基(例如1-4、1-2或1个)的氢原子可以独立地被选自氟、羟基、烷氧基、氨基、烷基氨基、酰基氨基、硫基和烷硫基的部分替代。芳环基团可以在一个或多个位置被卤素、烷基、烷氧基、烷氧基羰基、卤代烷基、氰基、磺酸基、氨基磺酰基、芳基、磺酰基、氨基羰基、羧基、酰基氨基、烷基磺酰基、氨基和取代或未取代的取代基取代。以类似的方式，本文提及的每个取代基可类似地被氨基、卤素、羟基、烷氧基、氰基、硝基、烷基氨基、酰基氨基、硫基、烷硫基、烷基、烷氧基羰基、卤代烷基、磺酸基、氨基磺酰基、芳基、磺酰基、氨基羰基、羧基、酰基氨基和烷基磺酰基取代。
[0089] “数均分子量”包括单个大分子分子量的算术平均值或平均值。其是如下确定的：测量n个聚合物分子的分子量，将质量相加，然后除以n。另一方面，在确定对分子量平均值的贡献时，重均分子量(Mw)考虑链的分子量。链越大，链对Mw的贡献越大。Mw通过对分子尺寸敏感而不仅仅是对其数目敏感的方法，例如光散射技术测定。
[0090] 本文所用的“水溶性”包括可溶于水基溶液例如水、水基溶液或缓冲溶液的材料，包括用于生物或分子检测系统的那些。“水溶性”溶液是指含有完全溶解的物质的均匀溶液。本公开的“水溶性”大分子单体以>0.10mg/mL的浓度溶于水基溶液中。将至少一种“水增溶基团”引入到材料中可以增加材料的亲水性并且可以改善材料在水性环境中的溶解度或
分散性。
分散性。
[0091] A.化合物
[0092] 本公开提供聚茚并芴大分子单体、制备大分子单体的方法以及使用大分子单体的方法。在某些方面，式I或式II的大分子单体包括一个或多个水增溶基团。包括一个或多个水溶性基团的水溶性共轭大分子单体使得聚茚并芴大分子单体可溶于水性介质(例如水或
缓冲液)。大分子单体适用于各种类型的生物应用。大分子单体在UV激发时发射明亮的可见光(例如，由紫色激光照射产生)，并且可以表现出高消光系数和量子效率(例如，量子产率>
50％)。
缓冲液)。大分子单体适用于各种类型的生物应用。大分子单体在UV激发时发射明亮的可见光(例如，由紫色激光照射产生)，并且可以表现出高消光系数和量子效率(例如，量子产率>
50％)。
[0093] 因此，在一个实施方案中，本公开提供式I或式II的大分子单体：
[0094]
[0095] 在某些方面，式I和式II的大分子单体可以在E1和E2之间以交替、嵌段、无规或图形共聚物构型组合。有利地，各种连接模式以及第二和第三单体的特性和含量导致具有结构聚合物差异以及光谱性质如吸收、发射和量子产率差异的不同共轭结构。各种共聚物构型
示意性地显示于以下方案I中。在该说明性方案中，以下方案I中的片段A可以表示式I或II
中的片段“m”，而方案I中的片段B可以表示式I或II中的片段“n”，如下所示：
示意性地显示于以下方案I中。在该说明性方案中，以下方案I中的片段A可以表示式I或II
中的片段“m”，而方案I中的片段B可以表示式I或II中的片段“n”，如下所示：
[0096]
[0097] 虽然未显示表示链段“o”的链段，但本领域技术人员将立即认识到来自式I或II的链段o可以结合到如方案I所示的共聚物构型中。
[0098] 术语“共聚物”是本领域已知的术语。它包括包含两种或更多种不同单体单元，例如链段m、n和o(描绘为例如A、B、C)的聚合物，该单体单元在称为共聚的方法中聚合。由于共聚物包含至少两种不同的单体单元，因此可以基于单体如何排列以形成聚合物链来分类共聚物。这些分类包括“交替共聚物”(其中单体单元以规则交替模式重复，例如A-B-A-B-A-B或A-B-C-A-B-C)、“嵌段共聚物”(其中连接两个或更多个均聚物亚单元，例如A-A-A-B-B-B或A-A-A-B-B-B-C-C-C)、“无规共聚物”(其中单体单元以无规顺序连接，例如A-B-A-A-A-B-B-A-B或A-B-A-A-A-B-B-A-B-CCC-A-B)，和“图形共聚物”(其中均聚物接枝至第二聚合物，例如B-B-B接枝至A-A-A-A或C-C-C接枝至A-A-A-A-B-B-B)。本公开的共聚物可以是E1和E2之间的交替共聚物、嵌段共聚物、无规共聚物或接枝共聚物。在某些情况下，共聚物是交替共聚物。在某些情况下，共聚物是无规共聚物。
[0099] 在式I或式II中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自氢、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C1-C18烷氧基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C4-C18酰基、任选取代的C4-C18酰氧基、NRaRb，其中Ra和Rb各自独立地是氢或低级烷基、水溶性基团、环氧乙烷低聚物或环氧乙烷低聚物甲基醚。虚线圆意味着环是可选实施方案。
[0100] 在另一个实施方案中，R1和R2和/或R3和R4与它们所附着的碳一起连接形成任选取代的4元环、5元环或6元环。在某些方面，R1和R2以及R3和R4连接形成任选取代的4元环、5元环或6元环。在其他方面，仅R1和R2连接形成任选取代的4元环、5元环或6元环。在其他方面，
3 4
仅R和R连接形成任选取代的4元环、5元环或6元环。
3 4
仅R和R连接形成任选取代的4元环、5元环或6元环。
[0101] 在某些方面，所述任选取代的4元环、5元环或6元环选自任选取代的C4-C6环烷基和任选取代的C4-C6杂环基。例如，R1和R2和/或R3和R4形成任选取代的C4-环烷基、C5-环烷基或C6-环烷基。在一个方面，R1和R2和/或R3和R4形成任选取代的4元环、5元环或6元环，其产生二环环系(在较大的环系内)，其中两个环通过单个共同原子连接。该连接双环的共同原子通常称为“螺”原子。
[0102] 在式I或式II中，每个R5独立地选自卤素、烷基、烷氧基、氨基、水增溶基团、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷低聚物甲基醚。
[0103] 在某些情况下，R5是环氧乙烷低聚物，例如-(CH2)y-(OCH2CH2)xOCH3基团，其中y是1-20的值，且x是1-50的值。例如，y的值可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19或20。x的值可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49或50。环氧乙烷低聚物增强了大分子单体的水溶性。
16、17、18、19或20。x的值可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49或50。环氧乙烷低聚物增强了大分子单体的水溶性。
[0104] 在某些方面，C4-C6杂环基是选自下组的成员：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基(thietanyl)、吡咯烷基、氧戊环基(oxolanyl)、硫杂环戊烷基(thiolanyl)、哌啶基、氧杂环己烷基(oxanyl)和硫杂环己烷基(thianyl)或任选取代的四氢吡喃基，例如占吨基(xanthenyl)。在某些优选的方面，C4-C6杂环基是任选取代的吡咯烷基或哌啶基。
[0105] 在某些方面，C4-C6杂环基被R5取代。R5可以是至少一种环氧乙烷低聚物，例如-(CH2)y-(OCH2CH2)xOCH3基团，其中y的值为1-20，且x的值为1-50。
[0106] 在一个方面，任选取代的4元环、5元环或6元环是C4-C6杂环基，其选自：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、吡咯烷基、氧杂环戊烷基、硫杂环戊烷基、哌啶基、氧杂环己烷基和硫杂环己烷基或任选取代的四氢吡喃基，例如占吨基。在某些优选的方面，C4-C6杂环基是任选取代的吡咯烷基或哌啶基。
[0107] 在式I或式II中，每个p是0-3的值，例如0、1、2或3。
[0108] 在式I或式II中，m是选自1-10,000的值。在某些方面，m的值为1-10,000，例如1至10、1至20、1至30、1至40、1至50、1至60、1至70、1至80、1至90、1至100、1至200、1至300、1至
400、1至500、1至600、1至700、1至800、1至900、1至1000、1至1至2000、1至3000、1至4000、1至
5000、1至6000、1至7000、1至8000、1至9000或1至10000。
400、1至500、1至600、1至700、1至800、1至900、1至1000、1至1至2000、1至3000、1至4000、1至
5000、1至6000、1至7000、1至8000、1至9000或1至10000。
[0109] 在式I或式II中，n和o各自独立地为选自0-10,000的值，其中m、n和o内的单体可以相同或不同。在某些方面，n和o的值各自独立地为选自0-10,000的值，例如0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、
5000、6000、7000、8000、9000或10000。当n为0时，片段A-2不存在。当o为0时，片段B-3不存在。因此，A-2和B-3各自可以存在或不存在并且各自可以相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π共轭主链。
5000、6000、7000、8000、9000或10000。当n为0时，片段A-2不存在。当o为0时，片段B-3不存在。因此，A-2和B-3各自可以存在或不存在并且各自可以相同或不同，并且各自选自芳香族基团或杂芳香族基团，该基团完成π共轭主链。
[0110] 在某些方面中，在式I或式II中，m是1-50，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、和/或50。
38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、和/或50。
[0111] 在某些方面中，在式I或式II中，n是0-50，例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和/或50。
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和/或50。
[0112] 在某些方面中，在式I或式II中，o是0-50，例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和或50。
37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和或50。
[0113] 在某些情况下，式I或式II的聚茚并芴大分子单体包含至少一个被一个或多个水增溶基团取代的单体残基。在某些情况下，式I或II的聚茚并芴大分子单体的主链包括多个单体残基。大分子单体主链可包括共轭链段。聚合物主链可进一步包括至少一个单体残基，其包含连接到茚并芴单体上的任选取代的芳族或杂芳族基团，该茚并芴单体为A和/或B。
[0114] 在某些方面，式I或式II中的A和B各自可以存在或不存在。如果存在，A和B可以相同或不同。A和B表示二价取代基，其为选自苯、萘、蒽、苯并二噻唑基、芴、茚并芴、噻吩、噻吩并噻吩、二噻吩并噻吩、3,4-亚乙基二氧噻吩、呋喃、吡啶、吡咯、稠合吡咯、四氢芘、喹喔啉、苯并噻二唑、噻吩并[3,4-b]-吡嗪和噁二唑的二价基团。前述基团各自可以任选地被取代。
[0115] 就共聚物而言，这些聚合物可以是交替的、嵌段的和无规的共聚物或它们的组合。荧光性能例如摩尔消光系数、荧光量子产率、吸收和发射最大值以及形状预期是不同的。
[0116] 在某些方面，链段m、n和o还可以具有存在的部分1、2和/或3，其为二价芳基或杂芳基。1、2或3各自可以存在或不存在。部分1、2和3各自独立地选自苯、萘、蒽、苯并二噻唑基、芴、茚并芴、噻吩、噻吩并噻吩、二噻吩并噻吩、3,4-亚乙基二氧噻吩、呋喃、吡啶、吡咯、稠合吡咯、四氢芘和噁二唑。前述基团各自可以任选地被取代。
[0117] 在式I和式II中，E1和E2各自独立地选自氢、卤素、炔基、任选取代的芳基、任选取代的杂芳基、卤素、取代的芳基、硼酸取代的芳基、硼酸酯取代的芳基、硼酸酯、硼酸、任选取代的芴和被一个或多个侧链取代的芳基或杂芳基，该侧链被以下基团封端：i)选自以下的官能团：胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其保护基团，用于缀合与分子或生物分子缀合；或ii)缀合有机染料或生物分子。
[0118] 在一个方面，E1和E2各自独立地选自氢和官能部分，所述官能部分选自胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇、烷基卤及其保护基团，用于与分子或生物分子缀合。
[0119] 生物分子包括但不限于抗体、抗原、蛋白质、肽、酶底物、激素、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、碳水化合物、碳水化合物衍生物、寡糖、多糖和核酸。更优选的生物分子包括抗体、蛋白质、肽、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或生物素。在某些方面，生物分子包括但不限于蛋白质、肽、亲和配体、抗体、抗体片段、糖、脂质、酶和核酸(作为杂交探针和/或适体)。
[0120] 式I和式II的化合物可以使用本领域熟知的缀合化学与生物分子反应。例如，活化酯(NHS酯)可以与伯胺反应以形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺和硫醇可以一起反应并制备
硫醚。烷基卤化物与胺和硫醇反应分别制备烷基胺和硫醚。本文可使用提供可与蛋白质或
生物分子缀合的反应性部分的任何衍生物。
硫醚。烷基卤化物与胺和硫醇反应分别制备烷基胺和硫醚。本文可使用提供可与蛋白质或
生物分子缀合的反应性部分的任何衍生物。
[0121] 在一个实施方案中，式I和式II中不存在1、2和3，其提供式I-a和式II-a：
[0122]
[0123] 在一个方面，A和B不存在(n＝0和o＝0)，并且该化合物具有以下结构：
[0124]
[0125] 其中虚线是指R1和R2以及R3和R4二者可以可选地连接以形成任选取代的4元环、51 2 3 4
元环或6元环，或者仅R 和R连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环，或者仅R 和R 连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环。任选取代的4元环、5元环或6元环选自任选取代的C4-C6环烷基和任选取代的C4-C6杂环基。任选取代的4元环、5元环或6元环都可以不存在。
元环或6元环，或者仅R 和R连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环，或者仅R 和R 连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环。任选取代的4元环、5元环或6元环选自任选取代的C4-C6环烷基和任选取代的C4-C6杂环基。任选取代的4元环、5元环或6元环都可以不存在。
[0126] 在式I或II中，水增溶基团是赋予大分子单体更多亲水性的基团。水增溶基团可以是环氧乙烷低聚物或环氧乙烷聚合物或环氧乙烷低聚物甲基醚。在某些方面，水增溶基团
包括一个或多个环氧烷重复单元。例如，水增溶基团可以含有一个或多个乙二醇单元、-
(OCH2CH2)-。乙二醇低聚物或聚合物在本文中称为“聚乙二醇”(PEG)基团。PEG基团可以是任何长度，然而，通常为1-5000个乙二醇重复单元。在某些实施方案中，使用具有多于20个乙二醇重复单元的PEG基团。在某些方面，环氧乙烷单元可以为11至约550，并包括11和550。
PEG链可以附加到单体上、接枝或偶联到聚合物上以增加水溶性。
包括一个或多个环氧烷重复单元。例如，水增溶基团可以含有一个或多个乙二醇单元、-
(OCH2CH2)-。乙二醇低聚物或聚合物在本文中称为“聚乙二醇”(PEG)基团。PEG基团可以是任何长度，然而，通常为1-5000个乙二醇重复单元。在某些实施方案中，使用具有多于20个乙二醇重复单元的PEG基团。在某些方面，环氧乙烷单元可以为11至约550，并包括11和550。
PEG链可以附加到单体上、接枝或偶联到聚合物上以增加水溶性。
[0127] 在某些方面，PEG550-OCH3具有CH3-(O-CH2-CH2)x-的化学式，具有550的数均分子量和末端甲氧基。聚乙二醇单甲醚、“mPEG”具有通式CH3(OCH2CH2)nOH，平均Mn为550。其他平均值包括但不限于350、750、2000和5000，或者单元的数目可以在11和550之间，并包括11和550。
[0128] 在某些方面，式I-a化合物具有选自以下的式：
[0129]
[0130] 在某些方面，式I-a化合物具有下式：
[0131]
[0132] 在某些方面，R6是水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚。在某些方面，环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-6 6
OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R是-O-PEG11-OCH3。另一方面，R是-O-PEG550-OCH3。
OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R是-O-PEG11-OCH3。另一方面，R是-O-PEG550-OCH3。
[0133] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0134]
[0135] 其中虚线表示R1和R2以及R3和R4二者可以可选地连接以形成任选取代的4元环、51 2 3 4
元环或6元环，或者仅R 和R连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环，或者仅R 和R 连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环。任选取代的4元环、5元环或6元环选自任选取代的C4-C6环烷基和任选取代的C4-C6杂环基。任选取代的4元环、5元环或6元环都可以不存在。
元环或6元环，或者仅R 和R连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环，或者仅R 和R 连接以形成任选取代的4元环、5元环或6元环。任选取代的4元环、5元环或6元环选自任选取代的C4-C6环烷基和任选取代的C4-C6杂环基。任选取代的4元环、5元环或6元环都可以不存在。
[0136] 在某些方面，式II-a化合物具有选自以下的式：
[0137]
[0138] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0139]
[0140] 在某些方面，式II化合物具有下式：
[0141]
[0142] 其中上述式中的“1”具有以下结构：
[0143]
[0144] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0145]
[0146] 在某些方面，每个R6独立地为水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚，例如mPEG550。在某些方面，环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R6是-O-PEG11-OCH3。另一方面，R6是-O-PEG550-OCH3。
[0147] 在某些方面，B表示二价取代基，其为选自苯、萘、蒽、苯并二噻唑基、芴、茚并芴、噻吩、噻吩并噻吩、二噻吩并噻吩、3,4-亚乙基二氧噻吩、呋喃、吡啶、吡咯、稠合吡咯、四氢芘和噁二唑的二价基团。前述基团各自可以任选地被取代。
[0148] 在某些方面，m是1-50，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、
44、45、46、47、48、49和/或50；n是1-50，o是0-50。
44、45、46、47、48、49和/或50；n是1-50，o是0-50。
[0149] 在某些方面，B具有下式：
[0150]
[0151] 其中Ra选自氢、任选取代的C1-C18烷基、任选取代的C1-C18烷氧基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C4-C18酰基、任选取代的C4-C18酰氧基、水增溶基团、环氧乙烷低聚物、环氧乙烷聚合物和用于与分子或生物分子缀合的官能团；
[0152] 其中Rb选自氢、任选取代的C1-C18烷基、任选取代的C1-C18烷氧基、任选取代的C6-C18芳基、任选取代的C4-C18酰基、任选取代的C4-C18酰氧基、水增溶基团、环氧乙烷低聚物、环氧乙烷聚合物或缀合位点；以及
[0153] z是0至4的值，例如0、1、2、3或4。
[0154] 在某些方面，B具有下式：
[0155]
[0156] 其中PEG550具有CH3(-O-CH2-CH2)x的式，数均分子量为550且o为1-50。
[0157] 在某些方面，B具有下式：
[0158]
[0159] 其中o为1-15的值，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或1-30、1-40或1-50。一方面，E2是N-羟基琥珀酰亚胺基。可以除去Boc基团和水增溶基团、环氧乙烷低聚物和环氧乙烷聚合物，或者它可以是缀合位点。水溶性基团的实施例是环氧乙烷低聚物，例
如-(CH2)y-(OCH2CH2)xOCH3基团，其中y是1-20的值、x是1-50的值。例如，y的值可以是1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。x的值可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。用于缀合的位点可以是i)用于缀合分子或生物分子的选自胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其保护基团的官能团；或ii)缀合有机染料或生物分子。在上文中，Ra是取代的酰基-C(O)-CH(NH2)-CH2CH2CH2CH2NH2，其中胺被Boc保护。
如-(CH2)y-(OCH2CH2)xOCH3基团，其中y是1-20的值、x是1-50的值。例如，y的值可以是1、2、3、
4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。x的值可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、
35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。用于缀合的位点可以是i)用于缀合分子或生物分子的选自胺、氨基甲酸酯、羧酸、羧酸酯、马来酰亚胺、活化酯、N-羟基琥珀酰亚胺基、肼、酰肼、腙、叠氮化物、炔、醛、硫醇及其保护基团的官能团；或ii)缀合有机染料或生物分子。在上文中，Ra是取代的酰基-C(O)-CH(NH2)-CH2CH2CH2CH2NH2，其中胺被Boc保护。
[0160] 在某些方面，B具有下式：
[0161]
[0162] 在某些方面，o为1-50的值或o为1-15的值，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15，且x值介于11与550之间。一方面，E2是N-羟基琥珀酰亚胺基。
[0163] 在某些方面，式II化合物具有下式：
[0164]
[0165] 其中“1”具有以下结构：
[0166]
[0167] 在某些方面，式II-a的化合物具有下式：
[0168]
[0169] 在某些方面，m是1-50，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
[0170] 在某些方面，n是0-50，例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
[0171] 在某些方面，o是0-50，例如约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
43、44、45、46、47、48、49和/或50。
[0172] 在某些方面，每个R6独立地为水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚。在某些方面，环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R6是-O-PEG11-OCH3。在另一方面，R6是-O-PEG550-OCH3。
[0173] 在某些方面，NHBoc为保护NH2的叔丁氧羰基且可被移除以产生NH2。
[0174] 在某些方面，式II化合物具有下式：
[0175]
[0176] 其中“1”具有以下结构：
[0177]
[0178] 其中NHBoc基团可以转化为胺用于任选的缀合。
[0179] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0180]
[0181] 其中NHBoc基团可以转化为胺用于任选的缀合。
[0182] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0183]
[0184] 其中R6是水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚。在某些方面，环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R6是-O-PEG11-OCH3。在一个方面，R6是-O-PEG550-OCH3。
[0185] 在某些方面，式II-a化合物具有下式：
[0186]
[0187] 其中R6是水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚。在某些方面，环氧乙烷低聚物甲基醚在-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3之间，并包括-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3，例如-O-PEG11-OCH3和-O-PEG550-OCH3。在一个方面，R6是-O-PEG11-OCH3。
[0188] 在某些方面，式I-a化合物具有下式：
[0189]
[0190] 在某些方面，式I或II的大分子单体(即聚合物)的尺寸可以根据聚合反应中使用的聚合条件、催化剂和单体的类型和量而变化。例如，大分子单体(即聚合物)可具有约5,
000至约100,000的数均分子量(Mn)。Mn为约30,000至约70,000的大分子单体是水溶性的并
且不易于在水性介质中聚集。通常，本公开的大分子单体具有窄范围的分子量。例如，式I或II的大分子单体的多分散性可以用多分散性指数(PDI)表示。可以使用以下等式计算PDI：
PDI＝Mw/Mn，其中Mw是重均摩尔质量、Mn是数均摩尔质量。
000至约100,000的数均分子量(Mn)。Mn为约30,000至约70,000的大分子单体是水溶性的并
且不易于在水性介质中聚集。通常，本公开的大分子单体具有窄范围的分子量。例如，式I或II的大分子单体的多分散性可以用多分散性指数(PDI)表示。可以使用以下等式计算PDI：
PDI＝Mw/Mn，其中Mw是重均摩尔质量、Mn是数均摩尔质量。
[0191] 在某些方面，本文所述的大分子单体的PDI可为约1.2至2.2，例如1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1或2.2，其中PDI为约1.0至约1.5的聚合物可被认为是单分散的。在某些实施方案中，式I或式II的大分子单体具有约42,000-70,000道尔顿的Mn，窄分布PDI<1.5。
[0192] 在某些方面，式I或式II的大分子单体可溶于常用有机溶剂，例如THF，二氯甲烷、甲醇、甲苯等。本文所述的某些大分子单体也可溶于水性介质，例如水、盐水、缓冲水溶液，例如硼酸盐、碳酸盐或磷酸盐缓冲液等。通常，式I或式II的大分子单体在水或缓冲液，例如PBS中显示高达1.0mg/mL的水溶性。
[0193] 在某些方面，式I或式II的大分子单体包括共轭链段。聚合物骨架内的延长共轭允许大分子单体在适当波长的光激发下显示荧光发射。在某些情况下，芳族基团或杂芳族基
团，例如A和/或B，当存在时完成π-共轭主链。包括共轭链段的荧光大分子单体可以在近紫外(UV)到远红外(IR)范围内具有可调的光物理特性。因为所公开的大分子单体表现出许多
有利的光学性质，所以这类大分子单体可用于需要高水平灵敏度的生物测定。
团，例如A和/或B，当存在时完成π-共轭主链。包括共轭链段的荧光大分子单体可以在近紫外(UV)到远红外(IR)范围内具有可调的光物理特性。因为所公开的大分子单体表现出许多
有利的光学性质，所以这类大分子单体可用于需要高水平灵敏度的生物测定。
[0194] 在某些方面，式I或式II的大分子单体在UV激发时发射明亮的可见光，并且通常吸收具有约500nm或更小(例如，约300nm至约500nm)的波长的光。在某些实施方案中，所公开的聚合物吸收波长为约350nm至约450nm的光；或约380nm至约410nm的光。可使用紫色激光
有效地照射可吸收波长为约405nm的光的大分子单体。在适当波长下照射时，大分子单体可发射波长大于约400nm的光；例如，约400至约800nm；或约400-780nm的光。在大分子单体主链中引入另外的芳族单体残基(A和/或B，例如苯并二噻唑、苯基或噻吩基)可以改变大分子单体的电子性质并改变共聚物的激发和发射波长。
有效地照射可吸收波长为约405nm的光的大分子单体。在适当波长下照射时，大分子单体可发射波长大于约400nm的光；例如，约400至约800nm；或约400-780nm的光。在大分子单体主链中引入另外的芳族单体残基(A和/或B，例如苯并二噻唑、苯基或噻吩基)可以改变大分子单体的电子性质并改变共聚物的激发和发射波长。
[0195] 在某些方面，式I或式II的大分子单体可以表现出以下特性或特征中的一种或多种：在适当波长的光(例如，低于约500nm)下激发时的荧光发射；发射波长大于约400nm的
光；在水中的消光系数大于约2×106cm-1M-1；和约5,000至约70,000，例如5,000至约10,
000、或至15,000、或至20,000、或至25000、或至30,000、或至35,000、或至40,000、或至45,
000、或至50,000、或至55,000、或至60,000、或至65,000、或至70,000的数均分子量(Mn)。
光；在水中的消光系数大于约2×106cm-1M-1；和约5,000至约70,000，例如5,000至约10,
000、或至15,000、或至20,000、或至25000、或至30,000、或至35,000、或至40,000、或至45,
000、或至50,000、或至55,000、或至60,000、或至65,000、或至70,000的数均分子量(Mn)。
[0196] B.使用化合物的方法
[0197] 一方面，本公开的大分子单体用于FRET测定100，例如如图1所示者。例如，诸如用染料125标记的抗体110的生物分子与本公开的大分子单体131反应。本公开的大分子单体以共价方式与抗体110反应以产生具有附着的染料和大分子单体的抗体。在该测定方法中，如果供体荧光团和受体荧光团彼此非常接近，则能量在供体荧光团和受体荧光团之间转
移。如果两个荧光团在给定的邻近范围内，则“供体”即大分子单体131由能量源(例如UV光)产生到“受体”即染料125的能量转移。接着，受体在其特征波长处发射以125的星状描绘为特征的光。
移。如果两个荧光团在给定的邻近范围内，则“供体”即大分子单体131由能量源(例如UV光)产生到“受体”即染料125的能量转移。接着，受体在其特征波长处发射以125的星状描绘为特征的光。
[0198] 有利地，本公开的大分子单体与染料标记的抗体之间的相互作用或结合增加了例如生物分子目标或分析物的检测灵敏度。在另一方面，将本公开的大分子单体共价附着到
附着到生物分子的染料(例如抗体复合物)具有若干优点，包括降低的本底和/或改善的能
量转移。在与生物分子直接连接的情况下，生物识别事件而不是非特异性大分子单体相互
作用或结合事件控制大分子单体的存在。以此方式，可消除大分子单体与生物分子的非特
异性结合，从而减少由反应混合物中未结合或未复合的共轭大分子单体分子产生的本底发
射。
附着到生物分子的染料(例如抗体复合物)具有若干优点，包括降低的本底和/或改善的能
量转移。在与生物分子直接连接的情况下，生物识别事件而不是非特异性大分子单体相互
作用或结合事件控制大分子单体的存在。以此方式，可消除大分子单体与生物分子的非特
异性结合，从而减少由反应混合物中未结合或未复合的共轭大分子单体分子产生的本底发
射。
[0199] 现在转向图2，该示意图200说明本公开的一个实施方案的共轭大分子单体210。在某些方面，本公开的大分子单体210缀合至亲和配体，即对另一生物分子具有亲和力的生物分子。图2说明根据本公开的一类材料，其中大分子单体210连接到例如染料、生物分子或生物分子/染料复合物，即“X”241。可以通过大分子单体上的第一官能团231(A)连接到大分子单体上，该第一官能团231(A)充当能够与连接到生物分子和/或染料“X”241的第二官能团连接体236(A')共价连接的生物结合位点。这种排列可以固定大分子单体210和X241之间的
距离，从而仅确保本公开的大分子单体210和部分X241之间的特定相互作用。设想这些实施方案中的生物分子组分241可以是本文所述的各种生物分子中的任何一种，包括但不限于
抗体、蛋白质、亲和配体、酶、核酸等。
距离，从而仅确保本公开的大分子单体210和部分X241之间的特定相互作用。设想这些实施方案中的生物分子组分241可以是本文所述的各种生物分子中的任何一种，包括但不限于
抗体、蛋白质、亲和配体、酶、核酸等。
[0200] 有利地，接头“A”231可以附着在大分子单体上的任何地方，包括在大分子单体的末端位置、在重复亚单元内部、在重复亚单元之间，或其任何组合。同样地，接头“A'”236可以连接到生物分子和/或染料X上的任何合适的基团。A和A'(231、236)与它们各自的大分子单体或生物分子(或染料或染料标记的生物分子)的连接化学可以包括但不限于互补反应性基团，例如马来酰亚胺/硫醇；硫醇/硫醇；吡啶基二硫醇/硫醇；琥珀酰亚胺基碘乙酸酯/硫醇；N-琥珀酰亚胺基酯(NHS酯)、磺基二氯苯酚酯(SDP酯)或五氟苯基酯(PFP酯)/胺；双琥珀酰亚胺酯/胺；亚氨酸酯/胺；肼或胺/醛、二醛或苯甲醛；异氰酸酯/羟基或胺；碳水化合物-高碘酸酯/肼或胺；二嗪/芳基叠氮化物化学；吡啶基二硫醇/芳基叠氮化物化学；炔/叠氮化物；羧基-碳二亚胺/胺；胺/磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯)/硫醇；和胺/BMPH(N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)/硫醇。本领域技术
人员将知道可用于本公开的其他互补偶联化学。
人员将知道可用于本公开的其他互补偶联化学。
[0201] 在某些方面，在本文中，图2中的“X”部分241可以是但不限于染料、荧光蛋白、纳米材料(例如量子点)、化学发光产生分子、染料和化学发光产生分子之间的缀合物、荧光蛋白和化学发光产生分子之间的缀合物、纳米材料(例如量子点)和化学发光产生分子之间的缀合物、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、酶、酶的底物、酶的底物类似物、受体、受体的配体、受体的配体类似物、DNA、RNA、修饰的核酸、DNA适体、RNA适体、修饰的核酸适体、肽适体、抗体、抗原、噬菌体、细菌或上述任两项的缀合物。
[0202] 在某些方面，本公开提供一种用于检测样品中的分析物的方法，该方法包括：
[0203] (a)合并本公开的样品和大分子单体；
[0204] (b)用光激发所述大分子单体；以及
[0205] (c)检测来自所述大分子单体的荧光，从而检测所述分析物。
[0206] 图3是描述与例如抗体(A)；抗生物素蛋白(B)；核酸(C)；和染料(D)缀合的示例性大分子单体的示意图300。在某些方面，本公开包括使用这些缀合大分子单体作为直接标
记。在某些方面，如图3A所示，大分子单体307与抗体301缀合，抗体301可以是例如第一或第二抗体。与抗体缀合的大分子单体可用作例如生物测定(例如免疫测定)中的直接报道分
子。用光激发大分子单体可导致大分子单体发射，表明抗体存在于测定或测定溶液中。
记。在某些方面，如图3A所示，大分子单体307与抗体301缀合，抗体301可以是例如第一或第二抗体。与抗体缀合的大分子单体可用作例如生物测定(例如免疫测定)中的直接报道分
子。用光激发大分子单体可导致大分子单体发射，表明抗体存在于测定或测定溶液中。
[0207] 图3B和3C进一步举例说明本公开的共轭大分子单体作为能够检测特定目标、分析物和目标相关生物分子的生物分子标记的用途。图3B描述了与抗生物素蛋白(例如链霉抗
生物素蛋白、中性抗生物素蛋白等)310缀合的大分子单体307，前者能够结合生物素修饰的分子、生物分子或底物。图3C描述了核酸(DNA、RNA、PNA等)315缀合物，其包括与核酸315共价连接的本公开的大分子单体307，该缀合物能够与含有互补核酸序列的目标核酸杂交。荧光大分子单体与能够识别目标生物分子、分析物或目标相关分子的分子的连接或缀合提供
了直接的检测手段。在其他方面，由大分子单体的激发产生的信号不被除直接缀合到大分
子单体的那些之外的其他测定组分调节。在这样的实施方案中，大分子单体直接用作荧光
标记。
生物素蛋白、中性抗生物素蛋白等)310缀合的大分子单体307，前者能够结合生物素修饰的分子、生物分子或底物。图3C描述了核酸(DNA、RNA、PNA等)315缀合物，其包括与核酸315共价连接的本公开的大分子单体307，该缀合物能够与含有互补核酸序列的目标核酸杂交。荧光大分子单体与能够识别目标生物分子、分析物或目标相关分子的分子的连接或缀合提供
了直接的检测手段。在其他方面，由大分子单体的激发产生的信号不被除直接缀合到大分
子单体的那些之外的其他测定组分调节。在这样的实施方案中，大分子单体直接用作荧光
标记。
[0208] 另一方面，如图3D所示，本公开的大分子单体307用染料317，例如发色团标记。在该实施方案中，共轭大分子单体307可以充当供体，而染料317可以充当能量转移过程中的受体。这里，共轭大分子单体可以充当光收集器，并且共轭大分子单体的激发之后是通过能量转移过程，例如荧光共振能量转移(FRET)333将激发引导至染料。这导致放大的染料发射(与染料的直接激发相比)。在一个实施方案中，可以猝灭供体缀合的大分子单体的荧光(例如，>90％猝灭)。
[0209] 在本公开中可以使用多种染料。在一些方面，官能团用于标记染料以形成荧光共振能量转移(FRET)对。激发波长优选为约200-900nm，例如约200nm、220nm、240nm、260nm、
280nm、300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、
520nm、540nm、560nm、580nm、600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm、720nm、740nm、
760nm、780nm、800nm、820nm、840nm、860nm、880nm、and/or 900nm.The emission
wavelength is preferably around about 200-900nm such as about 200nm、220nm、
240nm、260nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、
480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm、
720nm、740nm、760nm、780nm、800nm、820nm、840nm、860nm、880nm和/或约900nm。
280nm、300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、
520nm、540nm、560nm、580nm、600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm、720nm、740nm、
760nm、780nm、800nm、820nm、840nm、860nm、880nm、and/or 900nm.The emission
wavelength is preferably around about 200-900nm such as about 200nm、220nm、
240nm、260nm、280nm、300nm、320nm、340nm、360nm、380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、
480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm、620nm、640nm、660nm、680nm、700nm、
720nm、740nm、760nm、780nm、800nm、820nm、840nm、860nm、880nm和/或约900nm。
[0210] 示例性荧光染料包括但不限于荧光素、6-FAM、罗丹明、德克萨斯红、四甲基罗丹明、羧基罗丹明、羧基罗丹明6G、羧基对甲氨基酚、羧基罗丹明110、Cascade蓝、Cascade黄、香豆素、 Cy-Chrome、藻红蛋白、PerCP(多甲藻素叶绿素a蛋
白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4,5-二氯-2,7-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、Marina蓝、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、
Alexa 546、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 633、Alexa
647、Alexa 660、Alexa 680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、 FL、
FL-Br2、 530/550、 558/568、 564/570、 576/
589、 581/591、 630/650、 650/665、 R6G、 TMR、
TR、其缀合物及其组合。示例性镧系元素螯合物包括铕螯合物、铽螯合物和钐螯合
物。本领域技术人员知道可用于实践本公开的其他染料。
白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4,5-二氯-2,7-二甲氧基荧光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-罗丹明)、HEX、荧光黄、Marina蓝、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Alexa 350、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 532、
Alexa 546、Alexa 568、Alexa 594、Alexa 633、Alexa
647、Alexa 660、Alexa 680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、 FL、
FL-Br2、 530/550、 558/568、 564/570、 576/
589、 581/591、 630/650、 650/665、 R6G、 TMR、
TR、其缀合物及其组合。示例性镧系元素螯合物包括铕螯合物、铽螯合物和钐螯合
物。本领域技术人员知道可用于实践本公开的其他染料。
[0211] 在某些情况下，染料可以是猝灭剂染料。猝灭剂染料包括但不限于(最大吸收)，Dabcyl(453)、QSY35(475)、BHQ-0(495)、Eclipse(530)、BHQ-1(534)、QSY 7(560)、QSY 9(562)、BHQ-2(579)、Elle-Quencher(630)、Iowa Black(651)、QSY 21(661)和BHQ-3(672)。
在某些情况下，当本公开的大分子单体被一个或多个取代基例如硝基、氰基或任选取代的
氨基取代时，大分子单体将是猝灭剂染料。
在某些情况下，当本公开的大分子单体被一个或多个取代基例如硝基、氰基或任选取代的
氨基取代时，大分子单体将是猝灭剂染料。
[0212] 图4(A)说明根据本公开用染料410和大分子单体407标记的抗体405，其可用于使用UV光413的FRET测定；图4(B)说明用染料420标记并用根据本公开的大分子单体407标记
的链霉抗生物素蛋白(SA)425，其看用于使用UV光413的FRET测定；图4(C)说明用与本公开
的大分子单体407缀合的猝灭剂分子431标记的核酸探针序列427，核酸探针序列436与序列
427杂交；图4(D)说明用猝灭剂分子431和大分子单体407标记的核酸探针序列427，以及附
加的染料441串联复合物。核酸探针序列427与序列436杂交。
的链霉抗生物素蛋白(SA)425，其看用于使用UV光413的FRET测定；图4(C)说明用与本公开
的大分子单体407缀合的猝灭剂分子431标记的核酸探针序列427，核酸探针序列436与序列
427杂交；图4(D)说明用猝灭剂分子431和大分子单体407标记的核酸探针序列427，以及附
加的染料441串联复合物。核酸探针序列427与序列436杂交。
[0213] 在本公开的大分子单体与染料(图3D)或生物分子/染料复合物(如图4中所示例)直接连接的情况下，供体-受体距离可以是固定的，而不是取决于相互作用或结合的强度，并且能量转移效率可以显著增加。这在改善染料信号传导(或猝灭)和降低与供体-受体串
扰相关的背景荧光方面具有显著的结果。在这种情况下，串扰是指大分子单体(供体)和染
料(受体)发射峰之间的重叠。应当理解，在对于能量转移而言太大的距离处非特异性结合
的大分子单体可有助于背景荧光(或串扰)。供体和受体之间的较短(固定)距离因此不仅可
以促进直接染料扩增，而且可以大大猝灭供体发射。
扰相关的背景荧光方面具有显著的结果。在这种情况下，串扰是指大分子单体(供体)和染
料(受体)发射峰之间的重叠。应当理解，在对于能量转移而言太大的距离处非特异性结合
的大分子单体可有助于背景荧光(或串扰)。供体和受体之间的较短(固定)距离因此不仅可
以促进直接染料扩增，而且可以大大猝灭供体发射。
[0214] 图5说明描绘测定目标生物分子、分析物或目标相关生物分子的各种方法的示意图。例如，图5(A)显示用染料512连接到与第二抗体515结合的第一抗体501的大分子单体
510；图5(B)说明大分子单体520和染料512标记的抗体识别共同目标525；图5(C)说明了具
有连接的染料512和生物素531的抗体515以及链霉抗生物素蛋白541与连接到其上的大分
子单体510的第二生物缀合物；以及图5(D)说明具有染料512和与其结合的生物素555的核
酸562和具有与其缀合的大分子单体510的链霉抗生物素蛋白541。
510；图5(B)说明大分子单体520和染料512标记的抗体识别共同目标525；图5(C)说明了具
有连接的染料512和生物素531的抗体515以及链霉抗生物素蛋白541与连接到其上的大分
子单体510的第二生物缀合物；以及图5(D)说明具有染料512和与其结合的生物素555的核
酸562和具有与其缀合的大分子单体510的链霉抗生物素蛋白541。
[0215] 转到图6，其中示出描绘大分子单体601内的第一连接位点605(A)和第二连接位点615(B)以分别通过互补接头609(A')和接头619(B')附加“X”部分612(例如染料)和“Y”部分
631(例如抗体)的示意图。
631(例如抗体)的示意图。
[0216] 图7(A)说明描绘具有连接的染料709和生物分子710的大分子单体701和所得能量转移的示意图；图7(B)示出具有缀合链霉抗生物素蛋白715和连接染料709的大分子单体
701；以及图7(C)显示与核酸721和染料709缀合的大分子单体701。
701；以及图7(C)显示与核酸721和染料709缀合的大分子单体701。
[0217] 图8说明描绘与连接到生物分子的大分子单体间接联合的示意图。例如，图8(A)显示生物素化抗体815与大分子单体801的共价缀合物804相互作用；图8(B)显示生物素化抗
体815与连接到具有连接染料812的大分子单体801的部分809相互作用；图8(C)显示生物素
化核酸822与大分子单体的共价部分809相互作用；图8(D)显示与具有连接染料812的大分
子单体801的连接部分809结合的生物素化核酸822；图8(E)显示具有与大分子单体801的共
价连接的抗体相互作用的洋地黄毒苷部分831的核酸822；以及图8(F)显示了具有洋地黄毒
苷部分831的核酸822和针对大分子单体染料812串联复合物的共价抗体。
体815与连接到具有连接染料812的大分子单体801的部分809相互作用；图8(C)显示生物素
化核酸822与大分子单体的共价部分809相互作用；图8(D)显示与具有连接染料812的大分
子单体801的连接部分809结合的生物素化核酸822；图8(E)显示具有与大分子单体801的共
价连接的抗体相互作用的洋地黄毒苷部分831的核酸822；以及图8(F)显示了具有洋地黄毒
苷部分831的核酸822和针对大分子单体染料812串联复合物的共价抗体。
[0218] 图9A显示与分析物951结合的一抗905，其中加入了附加有大分子单体915的二抗912。在图9B中，目标分析物951与具有连接的大分子单体915的一抗912结合。
[0219] 图10A显示夹心型复合物，其中一抗1005结合分析物1051。然后加入具有生物素1012的第二抗体1010。接着，加入具有链霉抗生物素蛋白1018的大分子单体1015以产生夹
心型复合物。
心型复合物。
[0220] 图10B显示结合有分析物1051的生物素1012标记的一抗1005。加入与大分子单体1015连接的链霉抗生物素1118。
[0221] 在某些方面，本公开提供用于检测样品中的目标生物分子的方法，该方法包括：
[0222] 提供怀疑含有目标分析物的样品；
[0223] 提供与捕获分子缀合的本文所述的大分子单体，其中该捕获分子能够与目标分析物相互作用；以及
[0225] 在某些方面，该方法在体内进行。在某些方面，样品含有活细胞。在某些方面，分析物是相对于对照核酸包含遗传点突变、缺失或插入的核酸。在某些方面，核酸的检测表明样品中存在癌症。
[0226] C.化合物的制备方法
[0227] 在一个实施方案中，本公开提供用于合成如本文所述的化合物的方法。在某些情况下，单体单元可以衍生为二硼酸酯，该单体随后可以用于聚合，例如通过Suzuki偶联。参见J.Am.Chem.Soc.,2014,136,14027-14030。聚合芴也可以通过使用涉及有机金属催化的
其他反应方案获得。例如，Yamamoto反应使用镍(0)基催化剂用于芳基卤化物单体的催化偶联。另外，也可以使用Stille,Heck和Sonogashira偶联反应合成共轭聚合物。参见例如关于Yamamoto反应方案的Yamamoto等人，Macromolecules 25：1214-1223，1992；Kreyenschmidt等人，Macromolecules 28：4577-4582，1995；和Pei等人，J.Am.Chem.Soc.118：7416-7417，
1996。还参见针对Stille反应方案的Leclerc，Polym.Sci.Part A:Polym.Chem.39:2867-
2873，2001；针对Heck反应方案的Mikroyannidis等人，J.Polym.Sci.Part A:
Polym.Chem.45:4661-4670、2007；和针对Sonogashira反应方案的Sonogashira等人，
Tetrahedron Lett.16：4467-4470，1975，以及Lee等人，Org.Lett.3:2005-2007，2001。
其他反应方案获得。例如，Yamamoto反应使用镍(0)基催化剂用于芳基卤化物单体的催化偶联。另外，也可以使用Stille,Heck和Sonogashira偶联反应合成共轭聚合物。参见例如关于Yamamoto反应方案的Yamamoto等人，Macromolecules 25：1214-1223，1992；Kreyenschmidt等人，Macromolecules 28：4577-4582，1995；和Pei等人，J.Am.Chem.Soc.118：7416-7417，
1996。还参见针对Stille反应方案的Leclerc，Polym.Sci.Part A:Polym.Chem.39:2867-
2873，2001；针对Heck反应方案的Mikroyannidis等人，J.Polym.Sci.Part A:
Polym.Chem.45:4661-4670、2007；和针对Sonogashira反应方案的Sonogashira等人，
Tetrahedron Lett.16：4467-4470，1975，以及Lee等人，Org.Lett.3:2005-2007，2001。
[0228] 在某些方面，制备式I或式II的大分子单体的方法包括将多种反应性单体组合以形成反应混合物，其中反应性单体的第一部分带有第一反应性基团，而单体的第二部分带
有第二反应性基团，其中第一和第二反应性基团不同并且能够彼此反应以形成聚合物。在
某些方面，至少一种反应性单体包括任选地被一个或多个水溶性基团取代的单体。然后使
反应混合物经受其中单体上的第一和第二反应性基团反应形成聚合物的条件。在一些方法
中，将带有合适的可聚合基团的多个单体缩合以产生包括由连接的单体残基形成的聚合物
主链的大分子单体。
有第二反应性基团，其中第一和第二反应性基团不同并且能够彼此反应以形成聚合物。在
某些方面，至少一种反应性单体包括任选地被一个或多个水溶性基团取代的单体。然后使
反应混合物经受其中单体上的第一和第二反应性基团反应形成聚合物的条件。在一些方法
中，将带有合适的可聚合基团的多个单体缩合以产生包括由连接的单体残基形成的聚合物
主链的大分子单体。
[0229] 在某些方面，可采用各种类型的聚合策略来偶联本文所述的可聚合单体。如上所述，制备本文所述的缀合的大分子单体的一种代表性方法包括在金属催化剂(例如镍)存在
下使带有卤化物官能团的单体Yamamoto聚合。在某些情况下，Yamamoto反应将产生无规共
聚物或接枝共聚物产物。
下使带有卤化物官能团的单体Yamamoto聚合。在某些情况下，Yamamoto反应将产生无规共
聚物或接枝共聚物产物。
[0230] 在某些方面，该方法包括在甲苯和DMF的溶剂混合物中在70℃下加热Ni(COD)2、Di-Py、COD30分钟，然后将单体加入到催化剂混合物中并在氩气或惰性气氛下加热混合物
2-3天。
2-3天。
[0231] 在某些方面，聚合方法包括在一定尺寸范围内聚合官能化单体以产生具有较大尺寸范围的“聚合物中间体”，该中间体可溶于标准的、广泛使用的有机溶剂中。这些聚合物中间体化合物然后可以通过任何现在已知的或以后开发的合适的化学方法进一步改性。这些
方法产生可溶于水溶液的聚合物，并且由于存在一定高含量的聚(环氧乙烷)，其可直接用
于例如抗体缀合应用。
方法产生可溶于水溶液的聚合物，并且由于存在一定高含量的聚(环氧乙烷)，其可直接用
于例如抗体缀合应用。
[0233] 在某些方面，PEG大小可以高达5,000kDa；和中等大小的单体亚单元(MW约300至约2000kD)。
[0234] 在某些方面，聚合方法可包括生产均聚物的相同单体或生产共聚物的不同单体。
[0235] 在某些方面，反应在非质子溶剂例如THF、DMF、甲苯、乙腈和其他合适的有机溶剂中进行。
[0236] 在某些方面，聚合策略涉及Suzuki缩聚。Suzuki反应是芳族硼酸衍生物和芳族卤化物之间的产生相应的联苯的Pd催化的偶联反应。通常，Suzuki聚合涉及偶联各自具有两
个反应性官能团的芳族单体。用于Suzuki聚合的合适官能团包括卤化物(例如，Br或I)和含硼官能团，例如硼酸、硼酸酯(例如C1-C6硼酸酯)、硼烷基团(例如C1-C6硼烷)和BF3基团。在一个示例性方法中，第一反应性二卤化物单体与具有两个硼衍生物官能团的第二单体聚合。
在这种布置中，第一和第二单体可以相同以产生均聚物或不同以产生交替共聚物。在第二
示例性方法中，聚合具有硼衍生物官能团和反应性卤化物官能团的单体以形成均聚物。共
聚物可以使用这种排列通过将两种或多种不同类型的单体聚合在一起而制备，每种单体含
有两种官能团。在某些情况下，Suzuki反应通过调节单体的比例产生具有一定含量的交替
链段的交替共聚物产物或主均聚物。
个反应性官能团的芳族单体。用于Suzuki聚合的合适官能团包括卤化物(例如，Br或I)和含硼官能团，例如硼酸、硼酸酯(例如C1-C6硼酸酯)、硼烷基团(例如C1-C6硼烷)和BF3基团。在一个示例性方法中，第一反应性二卤化物单体与具有两个硼衍生物官能团的第二单体聚合。
在这种布置中，第一和第二单体可以相同以产生均聚物或不同以产生交替共聚物。在第二
示例性方法中，聚合具有硼衍生物官能团和反应性卤化物官能团的单体以形成均聚物。共
聚物可以使用这种排列通过将两种或多种不同类型的单体聚合在一起而制备，每种单体含
有两种官能团。在某些情况下，Suzuki反应通过调节单体的比例产生具有一定含量的交替
链段的交替共聚物产物或主均聚物。
[0237] 在某些方面，代表性Suzuki聚合反应涉及形成反应混合物，该反应混合物包括(a)具有至少两个反应性含硼基团的芳族单体和具有至少两个反应性卤化物官能团的芳族单
体；或(b)具有一个反应性卤化物官能团和一个反应性含硼基团的芳族单体。反应在缀合的大分子单体可溶于其中的溶剂中进行。合适的溶剂包括水混溶性极性溶剂，例如THF、DMF和甲苯。反应混合物中包括催化量的催化剂以催化芳族单体的聚合。可以使用可溶性Pd源催
化该反应。Pd(II)盐(例如Pd乙酸盐)或Pd(0)复合物，例如Pd(Ph3P)4是可用于本文公开的方法中的合适Pd源的实施例。该反应还包括碱，其量足以将反应性含硼官能团转化为阴离子-BX3-基团，其中X独立地为F或OH。合适的碱包括无机碱，例如碱金属碳酸盐或碳酸氢盐，例如碳酸氢钾或碳酸氢钠。
体；或(b)具有一个反应性卤化物官能团和一个反应性含硼基团的芳族单体。反应在缀合的大分子单体可溶于其中的溶剂中进行。合适的溶剂包括水混溶性极性溶剂，例如THF、DMF和甲苯。反应混合物中包括催化量的催化剂以催化芳族单体的聚合。可以使用可溶性Pd源催
化该反应。Pd(II)盐(例如Pd乙酸盐)或Pd(0)复合物，例如Pd(Ph3P)4是可用于本文公开的方法中的合适Pd源的实施例。该反应还包括碱，其量足以将反应性含硼官能团转化为阴离子-BX3-基团，其中X独立地为F或OH。合适的碱包括无机碱，例如碱金属碳酸盐或碳酸氢盐，例如碳酸氢钾或碳酸氢钠。
[0238] 在某些方面，本文所述的单体经由Suzuki缩聚聚合以产生2,7-连接的大分子单体。例如，二溴和双(硼酸酯)2,7-二取代的单体可如本文所述聚合以产生聚(2,7-单体)。聚合反应可以利用如本文所述的单体，其可以任选地带有一个或多个水增溶基团。将带有合
适的可聚合基团的芳族单体(例如芳烃或杂芳烃)添加到反应混合物中可以提供具有包括
连接的单体和芳族单体残基的主链的共聚物。在某些方法中，另外的单体可以包括任选取
代的芳烃(例如芴)或杂芳烃基团，由此形成具有包含芳烃或杂芳烃单体的残基的聚合物主
链的共聚物。在本文所述的任何聚合方法中，带有一个或多个水溶性基团的可聚合单体可
用于聚合反应中以提供水溶性聚合物和共聚物。
适的可聚合基团的芳族单体(例如芳烃或杂芳烃)添加到反应混合物中可以提供具有包括
连接的单体和芳族单体残基的主链的共聚物。在某些方法中，另外的单体可以包括任选取
代的芳烃(例如芴)或杂芳烃基团，由此形成具有包含芳烃或杂芳烃单体的残基的聚合物主
链的共聚物。在本文所述的任何聚合方法中，带有一个或多个水溶性基团的可聚合单体可
用于聚合反应中以提供水溶性聚合物和共聚物。
[0239] 下图列出了产生本发明的所需代表性PEG化缀合物的两种代表性反应方案；上面的方案使用Yamamoto偶联化学，而下面的方案使用钯催化的Suzuki反应化学。也包括聚茚
并芴共聚物。
并芴共聚物。
[0240]
[0241] 在某些方面，溶解度是本公开的大分子单体的特征。有几种方法将水溶性基团例如聚乙二醇(PEG)引入到聚合物中以增加它们在水中的溶解度。在某些方面，PEG化单体直
接聚合到聚合物或共聚物上。对于其他方面，首先制备聚合物或共聚物，然后后改性方法将PEG引入到存在于聚合物中的官能团中以增加水溶性。下面提供一些用于改性聚合物的代
表性工艺策略。
接聚合到聚合物或共聚物上。对于其他方面，首先制备聚合物或共聚物，然后后改性方法将PEG引入到存在于聚合物中的官能团中以增加水溶性。下面提供一些用于改性聚合物的代
表性工艺策略。
[0242] 1.策略I-Williamson醚方法
[0243] 在某些方面，聚合物中间体通过聚合羟基(-OH)官能化单体、溴烷基单体和NH-Boc保护的单体形成。然后将所得聚合物用反应性mPEG和聚合物骨架中的官能团例如-OH、NH2、Br改性。应当理解，基于与聚合物链中的官能化主链连接的官能团部分和mPEG单体进行适
当的后改性步骤。
当的后改性步骤。
[0244]
[0245] 2.策略II-阴离子聚合
[0246] 在某些方面，将mPEG单体和羟基单体共聚，然后将环氧乙烷的阴离子聚合接枝到聚合物-OH基团上，如下所示。
[0247]
[0248] 3.策略III--偶联反应
[0249] 在某些方面，将mPEG单体和含胺单体共聚，然后通过EDC化学将mPEG-COOH基团偶联至胺基以形成酰胺键，如下所示。
[0250]
[0251] 4.策略IV---点击化学
[0252] 在某些方面，使mPEG单体和含羟基单体共聚，然后使聚合物与烷基溴物质偶联以形成含有烷基的聚合物。该反应之后是点击化学以与叠氮化物官能化的mPEG分子形成三嗪
环，如下所示：
环，如下所示：
[0253]
[0254] 5.策略V-席夫碱还原
[0255] 在某些方面，使mPEG单体和含胺单体共聚。所得聚合物与mPEG醛官能化部分偶联，之后可以使用如下所示的合适还原剂还原C＝N键。
[0256]
[0257] 实施例
[0258] 提供以下实施例以说明但不限制要求保护的本发明。
[0259] 实施例1说明6,12-二氢茚并[1,2-b]芴的合成。
[0260]
[0261] 6,12-二氢茚并[1,2-b]芴
[0262] 将4.00g(14.17mmol)茚并[1,2-b]芴-6,12-二酮悬浮于330mL三甘醇中并与19.7g(24.80当量，351.41mmol)KOH混合。小心地向混合物中加入26.5mL(29.89当量，
423.49mmol)肼一水合物溶液(80％)并加热至170℃持续24小时。将反应混合物冷却至室温
并倒入1L冰水和60mL盐酸(浓)的混合物中。分离沉淀物、干燥并从甲苯(700mL)中重结晶，
1 8
得到2.17g(60％产率)无色针状物形式的所需化合物。H-NMR(THF-d ,300MHz,)(ppm),
4.259(s,4H),7.574δ(t,2H),7.662(t,2H),7.862(d,2H),8.199(d,2H),8.366(s,2H).
423.49mmol)肼一水合物溶液(80％)并加热至170℃持续24小时。将反应混合物冷却至室温
并倒入1L冰水和60mL盐酸(浓)的混合物中。分离沉淀物、干燥并从甲苯(700mL)中重结晶，
1 8
得到2.17g(60％产率)无色针状物形式的所需化合物。H-NMR(THF-d ,300MHz,)(ppm),
4.259(s,4H),7.574δ(t,2H),7.662(t,2H),7.862(d,2H),8.199(d,2H),8.366(s,2H).
[0263] 实施例2说明6,6,12,12-四(3-苯氧基丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴的合成。
[0264]
[0265] 6,6,12,12-四(3-苯氧基丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴
[0266] 在-25℃下，通过注射器向实施例1中的茚并芴(1.5g，5.94mmol)在THF(60mL)中的悬浮液中加入n-BuLi(2.5M的正己烷，7.1mL，17.8mmol)。将溶液在-25℃搅拌15分钟，然后再升温至室温1小时，并在-25℃通过注射器加入3-苯氧基丙基溴(3.828g，17.8mmol)。搅拌
4小时后，在-25℃下通过注射器加入第二份n-BuLi(2.5M的正己烷，7.1mL，17.8mmol)。1小时后，在-25℃下通过注射器加入第二份3-苯氧基丙基溴(3.828g，17.8mmol)。然后将混合物保持搅拌12h，然后用氯化铵溶液淬灭并用氯仿(3×50mL)萃取。有机层用无水MgSO4干
燥，减压除去溶剂。使用硅胶和氯仿/石油醚作为洗脱剂将粗产物通过柱色谱纯化。获得所需产物，为黄色固体(3.2g，产率61％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz,ppm):7.95(s,2H),7.87
(d,2H),7.50(d,2H),7.38(t,2H),7.33(t,2H),7.11-7.13(t,8H),6.77(t,4H),6.77(d,
8H),3.64(t,8H),2.11(t,8H),1.05-1.09(m,8H).
4小时后，在-25℃下通过注射器加入第二份n-BuLi(2.5M的正己烷，7.1mL，17.8mmol)。1小时后，在-25℃下通过注射器加入第二份3-苯氧基丙基溴(3.828g，17.8mmol)。然后将混合物保持搅拌12h，然后用氯化铵溶液淬灭并用氯仿(3×50mL)萃取。有机层用无水MgSO4干
燥，减压除去溶剂。使用硅胶和氯仿/石油醚作为洗脱剂将粗产物通过柱色谱纯化。获得所需产物，为黄色固体(3.2g，产率61％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz,ppm):7.95(s,2H),7.87
(d,2H),7.50(d,2H),7.38(t,2H),7.33(t,2H),7.11-7.13(t,8H),6.77(t,4H),6.77(d,
8H),3.64(t,8H),2.11(t,8H),1.05-1.09(m,8H).
[0267] 实施例3说明6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴的合成。
[0268]
[0269] 将15mLHBr溶液(水中占48％重量)、2.26g的6,6,12,12-四(3-苯氧基丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴(2.85mmol)、100mL乙酸和10mL甲苯加入烧瓶中并在回流下加热48小
时。将反应混合物倒入水中，并且将所得溶液用氯仿(3×50mL)萃取。合并的有机层用稀
Na2CO3(1M，2×50mL)溶液、水洗涤，用MgSO4干燥，然后除去溶剂，残余物用硅胶色谱法纯化，用石油醚/氯仿(3：1)作为洗脱剂，得到化合物(1.1g，产率56％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.63(s,2H),7.29–7.39(m,6H),3.14(t,J＝
8.0Hz,8H),2.06(t,J＝8.0Hz,8H),1.051.09(m,8H).
时。将反应混合物倒入水中，并且将所得溶液用氯仿(3×50mL)萃取。合并的有机层用稀
Na2CO3(1M，2×50mL)溶液、水洗涤，用MgSO4干燥，然后除去溶剂，残余物用硅胶色谱法纯化，用石油醚/氯仿(3：1)作为洗脱剂，得到化合物(1.1g，产率56％)，为白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.75(d,J＝7.6Hz,2H),7.63(s,2H),7.29–7.39(m,6H),3.14(t,J＝
8.0Hz,8H),2.06(t,J＝8.0Hz,8H),1.051.09(m,8H).
[0270] 实施例4说明2,8-二溴-6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴的合成。
[0271]
[0272] 2,8-二溴-6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴
[0273] 向6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴(1.1g，1.39mmol)在80mL的CH2Cl2中的溶液中加入Br2(0.851g，3.89mmol)。将混合物在室温下搅拌18小时。然后，将溶液混合物用2M的Na2CO3洗涤。有机溶液用MgSO4干燥。除去溶剂，得到粗产物，为黄色固体。
在氯仿和甲醇的混合物中进行重结晶，得到1.12g化合物(91％收率)。1H NMR(DMSO,
400MHz,ppm):7.97(s,2H),7.84(d,2H),7.71(2H),7.57(dd,2H),3.11–3.20(t,8H),2.22
(m,8H),1.02-1.06(m,8H).
在氯仿和甲醇的混合物中进行重结晶，得到1.12g化合物(91％收率)。1H NMR(DMSO,
400MHz,ppm):7.97(s,2H),7.84(d,2H),7.71(2H),7.57(dd,2H),3.11–3.20(t,8H),2.22
(m,8H),1.02-1.06(m,8H).
[0274] 实施例5说明2,8-二溴-6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]氟(PaPeg)的m-聚乙二醇化(聚(乙二醇)甲基醚(mPEG550，HO-PEG550-OCH3)
[0275]
[0276] 在0℃和氮气下将mPEG550醇(HO-PEG550-OCH3)(3.331g，6.01mmol)溶于无水THF(20mL)中。向混合物中加入叔丁醇钾(7.74mmol，7.74mL，1M的THF溶液)。搅拌10分钟后，通过注射器加入在20mL无水THF中的2,8-二溴-6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,
2-b]芴(1.35g，1.50mmol)。将混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发THF后，加入盐水(50mL)，粗产物用二氯甲烷(3×40mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过柱色谱法(DCM-异丙醇)纯
化，得到无色油产物(2.164g)。
2-b]芴(1.35g，1.50mmol)。将混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发THF后，加入盐水(50mL)，粗产物用二氯甲烷(3×40mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过柱色谱法(DCM-异丙醇)纯
化，得到无色油产物(2.164g)。
[0277] 实施例6说明11,12-二氢茚并[2,1-a]芴的合成
[0278]
[0279] 11,12-二氢茚并[2,1-a]芴
[0280] 该化合物可以根据美国专利号7,754,841制备，其通过引用并入本文。
[0281] 实施例7说明11,11,12,12-四(3-苯氧基丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴的合成。
[0282]
[0283] 11,11,12,12-四(3-苯氧基丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴
[0284] 类似于实施例2制备化合物，同时使用实施例6中的11,12-二氢茚并[2,1-a]芴作为起始材料。
[0285] 实施例8说明11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴的合成。
[0286]
[0287] 11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴
[0288] 类似于实施例3制备化合物，同时使用实施例7中的11,11,12,12-四(3-苯氧基丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴作为起始材料。
[0289] 实施例9说明2,9-二溴-11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴的合成。
[0290]
[0291] 2,9-二溴-11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴
[0292] 类似于实施例4制备化合物，同时使用实施例8中的11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴作为起始材料。
[0293] 实施例10说明2,9-二溴-11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴的m-聚乙二醇化(聚乙二醇)甲基醚(mPEG11)。
[0294]
[0295] 类似于实施例5制备化合物，同时将实施例9中的2,9-二溴-11,11,12,12-四(3-溴丙基)-11,12-二氢茚并[2,1-a]芴和mPEG11-OH用作原料。
[0296] 实施例11说明2,2'-(6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴-2,8-二基)双(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)的合成。(TBpeg550)
[0297]
[0298] 实施例5中的产物(0.943g，0.34mmol)、双(频哪醇基)二硼(190mg，0.75mmol)、[1，1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯钯(97mg，0.12mmol)和乙酸钾(200mg，将2.0mmol)的无水
二噁烷(12mL)溶液在Ar气氛下回流加热18h。将反应混合物冷却至室温后、过滤除去固体、真空浓缩滤液。所得粗产物通过柱色谱法纯化、用10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到油状产物。
二噁烷(12mL)溶液在Ar气氛下回流加热18h。将反应混合物冷却至室温后、过滤除去固体、真空浓缩滤液。所得粗产物通过柱色谱法纯化、用10％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到油状产物。
[0299] 实施例12说明2,2’-(6,6,12,12-四(3-溴丙基)-6,12-二氢茚并[1,2-b]芴-2,8-二基)双(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)的合成。(CBPeg11)
[0300]
[0301] 该化合物的制备类似于实施例11所述。
[0302] 实施例13说明2’,7’-二溴-3,3-双(溴甲基)螺[环丁烷-1,9’-芴]的合成。
[0303]
[0304] 在Ar保护下，在250ml三颈烧瓶中，在30分钟内向2,7-二溴芴(3.26g，10mmol)在50ml无水THF中的混合物中加入NaH(0.6g，25mmol)NaH烧瓶。将混合物在室温下搅拌30分
钟，然后将在20ml无水THF中的季戊四醇溴化物(3.87g，10mmol)滴加到烧瓶中。将混合物在
70℃下加热过夜。反应完成后，混合溶液用冰水猝灭，然后用CH2Cl2萃取三次，CH2Cl2溶液用无水硫酸镁干燥、过滤。旋转蒸发滤液，得到棕色固体，通过柱色谱分离固体，得到黄色固体。
钟，然后将在20ml无水THF中的季戊四醇溴化物(3.87g，10mmol)滴加到烧瓶中。将混合物在
70℃下加热过夜。反应完成后，混合溶液用冰水猝灭，然后用CH2Cl2萃取三次，CH2Cl2溶液用无水硫酸镁干燥、过滤。旋转蒸发滤液，得到棕色固体，通过柱色谱分离固体，得到黄色固体。
[0305] 实施例14说明2，6-二氨基(Boc)-1-(2,7-二溴螺[芴-9,4’-哌啶]-基)己-1-酮的合成。(MBoc)：
[0306]
[0307] 原料2,7-二溴-4-甲基-螺[芴-9,4’-哌啶]根据美国专利公开号2014/0243283制备，其通过引用并入本文。
[0308] 将(Boc-Lys(Boc)-OH(6.6g，18mmol)和三乙胺(5.1ml，36mmol)在100mlCH2Cl2中的混合物冷却至0℃，然后加入EDC-HCl盐(3.43g，18mmol)，将混合物搅拌20分钟，加入2,7-二溴-4-甲基-螺[芴-9,4’-哌啶](5.0g，12mmol)并将混合物在室温下搅拌16h。向反应混合物中加入100ml的CH2Cl2和100ml的水。分离各相，水相用100ml的CH2Cl2再次萃取。用水(200ml×2)洗涤收集的有机相。将有机相蒸发至干并通过己烷/EtOAc分离，得到白色棉花固体8.21g(产率95％)。
[0309] 实施例15说明2’,7’-二溴-3,3-双(O-PEG550甲基醚)螺[环丁烷-1,9’-芴](SqPeg)的合成。
[0310]
[0311] 在0℃，氮气下，将mPEG550醇(HO-PEG550-OCH3)(3.331g)溶于无水THF(20mL)中。向混合物中加入叔丁醇钾(7.74mmol，7.74mL，1M的THF溶液)。搅拌10分钟后，通过注射器加入20mL无水THF中的2’,7’-二溴-3,3-双(溴甲基)螺[环丁烷-1,9’-芴](1.45g，2.579mmol)。
将混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发THF后，加入盐水(50mL)，粗产物用二氯甲烷(3×
40mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过柱色谱法(DCM-异丙醇)纯化，得到无色油产物
(2.164g)。
将混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发THF后，加入盐水(50mL)，粗产物用二氯甲烷(3×
40mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过柱色谱法(DCM-异丙醇)纯化，得到无色油产物
(2.164g)。
[0312] 实施例16说明本公开的大分子单体P14的合成方案。
[0313]
[0314] 向Ni(COD)2(552mg，2.0mmol)和2,2’-联吡啶(314mg，2.0mmol)在无水DMF(35ml)中的搅拌溶液中加入COD(246μ1，2.0mmol)，并将所得溶液在氮气下于75℃℃搅拌1h。2,6-二氨基(Boc)-1-(2,7-二溴螺[芴-9,4’-哌啶]-1’-基)己-1-酮(72mg，0.01mmol)和2’,7’-二溴-3,3-双(O-PEG550甲基醚)螺[环丁烷-1,9’-芴](0.551，在氮气下，将单体Papeg
(1.388g，0.50mmol)溶于分离烧瓶中的DMF(6ml)中，然后加入到混合物中。将混合物在氮气下于75℃搅拌过夜24小时。向混合物中加入溴苯(95μl，0.91mmol)并在相同条件下搅拌12小时。通过移液管将混合物缓慢滴加到搅拌的溶剂150ml6NHCl中，并将所得混合物搅拌2小时。混合物用DCM萃取，有机层用50ml1NHCl洗涤。蒸发掉溶剂并进一步在高真空下干燥，得到轻蜡聚合物P14。(820mg)，GPC(Mn＝73,000；PDI＝2.2)。
(1.388g，0.50mmol)溶于分离烧瓶中的DMF(6ml)中，然后加入到混合物中。将混合物在氮气下于75℃搅拌过夜24小时。向混合物中加入溴苯(95μl，0.91mmol)并在相同条件下搅拌12小时。通过移液管将混合物缓慢滴加到搅拌的溶剂150ml6NHCl中，并将所得混合物搅拌2小时。混合物用DCM萃取，有机层用50ml1NHCl洗涤。蒸发掉溶剂并进一步在高真空下干燥，得到轻蜡聚合物P14。(820mg)，GPC(Mn＝73,000；PDI＝2.2)。
[0315] 然后将上述化合物的聚合物P14溶解在30ml的DCM和30ml的TFA混合物中，然后在室温下搅拌过夜。减压除去溶剂，然后在高真空泵下干燥过夜。这种聚合物在标记之前需要进一步纯化。为了纯化，将干燥的聚合物重新悬浮在DI水中并在搅拌下保持过夜。大部分聚合物溶解，通过以10,000rpm离心5min除去未溶解的沉淀。将上清液通过0.22μm的PES过滤器过滤并且通过 Ultra-4离心过滤器单元(MWCO，30K)(可从EMD Millipore
Corporation，Billerica，MA购得)浓缩。然后将该溶液上样到G-25柱(Sephadex G-25Fine，GE Healthcare Life Sciences)以除去催化剂杂质。通过流过Superose6柱(GE Life
Sciences)进一步分级纯化的聚合物以缩小尺寸分布。
Corporation，Billerica，MA购得)浓缩。然后将该溶液上样到G-25柱(Sephadex G-25Fine，GE Healthcare Life Sciences)以除去催化剂杂质。通过流过Superose6柱(GE Life
Sciences)进一步分级纯化的聚合物以缩小尺寸分布。
[0316] 采用Yamamoto法和Suzuki法合成了一系列由单体聚乙二醇化芴(SqPEG)和不同含量的聚乙二醇化茚并芴链段组成的新型共聚物。它们的Mn范围为20K-85K。如上所述，
Yamamoto反应形成无规共聚物，而Suzuki制备交替共聚物。
Yamamoto反应形成无规共聚物，而Suzuki制备交替共聚物。
[0317] 具有SqPeg和PEG化茚并芴链段与Mn的精确含量比的聚合物的示例吸收数据在图13和14中示出。
[0318] 图13表示通过Suzuki聚合制备的聚合物L18的吸收曲线，而图14表示通过Yamamoto聚合制备的聚合物P100的吸收曲线。在这两种情况下，茚并芴单体确实引起吸收
和发射红移。茚并芴具有类似的最低能量跃迁，其可归因于π-π*跃迁，其中λ最大值在363-
400nm范围内并显示蓝色发射。更多信息在表1中示出。
和发射红移。茚并芴具有类似的最低能量跃迁，其可归因于π-π*跃迁，其中λ最大值在363-
400nm范围内并显示蓝色发射。更多信息在表1中示出。
[0319] 表1
[0320]
[0321] 凝胶渗透色谱法(GPC)在THF中在50℃下使用5μm的HR3和HR4GPC柱系统在具有Agilent UV检测器的Agilent1200HPLC分离模块上使用0.5mL/min的流速进行。用Agilent’s Easical PS-2标准物在580-364,000g/mol范围内校准该系统。
[0322] 实施例17说明2,5-二溴氢醌(BPeg11)的m-聚乙二醇化。
[0323]
[0324] 该化合物使用2,5-二溴氢醌制备，且mPEG11-碘用作原料。
[0325] 实施例18说明1,4-二溴-2,5-双(溴甲基)苯的m-聚乙二醇化(Bpeg550)。
[0326]
[0327] 类似于实施例15制备化合物，同时使用1,4-二溴-2,5-双(溴甲基)苯和mPEG550-OH作为原料。
[0328] 实施例19说明本公开的大分子单体的合成。
[0329]
[0330] 在氩气下，向Schlenk烧瓶中的DMF(6mL)中的实施例12中的CBPeg11(0.273g，1mmol)和实施例17中的BPeg11(0.130g，1.1mmol)中的溶液中加入K2CO3水溶液(2M，4mL)，然后加入四(三苯基膦)钯(12mg，0.012mmol)。通过三次冷冻-泵-解冻循环将混合物脱气，然后加热至80℃持续12小时，再加入4-(N-Boc-氨基甲基)苯基硼酸频哪醇酯(50mg)，将混合
物在80℃再加热5小时。在室温下，向20％的EtOH/H2O(20mL)中加入反应混合物EDTA
(100mg，0.33mmol)，并在室温下搅拌1小时。然后将所得混合物通过0.45m杯式过滤器过滤。
使用20％的EtOH/H2O将过滤的溶液稀释至2mg/mL的浓度。然后使用具有30,000kD分子量截
止膜的切向流过滤系统将所得稀释液透析到20％的EtOH/H2O中，直到在洗脱液中存在小于
0.1mg/mL的聚合物。将溶液浓缩并冻干，得到黄色纤维状固体聚合物P15(0.41g)。通过SEC分析相对于聚苯乙烯标准物(MW＝65,000，D＝2.0)测定分子量。
物在80℃再加热5小时。在室温下，向20％的EtOH/H2O(20mL)中加入反应混合物EDTA
(100mg，0.33mmol)，并在室温下搅拌1小时。然后将所得混合物通过0.45m杯式过滤器过滤。
使用20％的EtOH/H2O将过滤的溶液稀释至2mg/mL的浓度。然后使用具有30,000kD分子量截
止膜的切向流过滤系统将所得稀释液透析到20％的EtOH/H2O中，直到在洗脱液中存在小于
0.1mg/mL的聚合物。将溶液浓缩并冻干，得到黄色纤维状固体聚合物P15(0.41g)。通过SEC分析相对于聚苯乙烯标准物(MW＝65,000，D＝2.0)测定分子量。
[0331] 类似于以上实施例17中的聚合物P14处理聚合物15，然后用于活化和进一步生物缀合。
[0332] 实施例20说明本公开的大分子单体的合成。
[0333] 类似于实施例19来制备该化合物，而实施例11中的TBpeg550和实施例18中的Bpeg550用作原料。在PBS中在350nm处吸收，在409nm处发射。
[0334]
[0335] 实施例21聚合物染料(化合物P14)与抗体的缀合
[0336] 描述了将抗体缀合到聚合物染料上的方法。抗人CD4(UCHT1)或抗-人IFN-γ抗体(4S.B3)的小鼠单克隆抗体用于缀合。抗体溶液(5mg/ml的PBS，pH7.2)通过DTT活化(二硫苏糖醇)以160：1的摩尔比还原30分钟。将它们纯化并用G-25柱(Sephadex G-25Fine，GE
Healthcare Life Sciences)将缓冲液换成50mM磷酸盐、5mMEDTApH7.0。通过25倍摩尔过量的磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，Cova Chem)活
化在50mM磷酸盐、5mMEDTApH7.0中的聚合物染料2小时。然后通过G-25柱除去游离的Sulfo-SMCC试剂。为了缀合，将DTT还原的抗体与SMCC活化的聚合物染料以4：1的摩尔比混合18-20小时。用蛋白G树脂纯化后，通过Superose6(GE Life Sciences)将缀合物与游离抗体分离，并通过离心过滤器(30KMw截留，微孔)浓缩。通过流式细胞术评价这些抗体-聚合物缀合物。
Healthcare Life Sciences)将缓冲液换成50mM磷酸盐、5mMEDTApH7.0。通过25倍摩尔过量的磺基-SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯，Cova Chem)活
化在50mM磷酸盐、5mMEDTApH7.0中的聚合物染料2小时。然后通过G-25柱除去游离的Sulfo-SMCC试剂。为了缀合，将DTT还原的抗体与SMCC活化的聚合物染料以4：1的摩尔比混合18-20小时。用蛋白G树脂纯化后，通过Superose6(GE Life Sciences)将缀合物与游离抗体分离，并通过离心过滤器(30KMw截留，微孔)浓缩。通过流式细胞术评价这些抗体-聚合物缀合物。
[0337] 实施例22溶解的洗涤血液(LWB染色)
[0338] 将100μL的抗凝全血添加至含有荧光团缀合的抗体的管中并温和混合。将试管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后向混合物中直接加入2mL室温1XRBC裂解缓冲液
(BioLegend，Inc.)。将试管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后在1200-1500rpm离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液，轻轻涡旋试管以松开细胞沉淀，加入2mL的FACS洗涤缓冲液
(BiolegEnd，Inc)。以1200-1500rpm离心试管5分钟，抽吸上清液，再次涡旋试管以松开沉淀。通过向每个FACS管中加入300-500μL1％多聚甲醛的1XPBS溶液(NaN3，pH7.2)将细胞从沉淀中重新悬浮。然后准备通过流式细胞术分析细胞。样品信噪比(S/N)计算得自正染色群体的平均荧光强度(MFI)除以未染色群体的MFI。染色指数(SI)计算源自阳性染色群体的平
均荧光强度(MFI)减去阴性染色群体的MFI，除以阴性染色群体的稳健标准偏差的两倍。用
配备有355nm紫外线激发激光源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细
胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。结果表明，与Pacific BlueTM对
照相比，聚合物荧光团P43或P100可用于成功鉴定存在于复杂的异质细胞混合物例如LWB制
剂中的CD3+(UCHT1+)细胞。
(BioLegend，Inc.)。将试管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后在1200-1500rpm离心5分钟以沉淀细胞。除去上清液，轻轻涡旋试管以松开细胞沉淀，加入2mL的FACS洗涤缓冲液
(BiolegEnd，Inc)。以1200-1500rpm离心试管5分钟，抽吸上清液，再次涡旋试管以松开沉淀。通过向每个FACS管中加入300-500μL1％多聚甲醛的1XPBS溶液(NaN3，pH7.2)将细胞从沉淀中重新悬浮。然后准备通过流式细胞术分析细胞。样品信噪比(S/N)计算得自正染色群体的平均荧光强度(MFI)除以未染色群体的MFI。染色指数(SI)计算源自阳性染色群体的平
均荧光强度(MFI)减去阴性染色群体的MFI，除以阴性染色群体的稳健标准偏差的两倍。用
配备有355nm紫外线激发激光源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细
胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。结果表明，与Pacific BlueTM对
照相比，聚合物荧光团P43或P100可用于成功鉴定存在于复杂的异质细胞混合物例如LWB制
剂中的CD3+(UCHT1+)细胞。
[0339] 结果
[0340] 用与抗CD3抗体偶联的P43或P100聚合物荧光团染色的人溶解的洗涤血样的细胞表面流式细胞术分析。用与UCHT1单克隆抗体缀合的P43或P100聚合物荧光团的0.5μg/测试将人溶解的洗涤血液(LWB)样品染色。用配备有355nm紫外线激发激光源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR
II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进
行门控。结果显示，与Pacific BlueTM对照(图11A)相比，聚合物荧光团P43(图11B)或P100(图11C)可用于成功鉴定存在于复杂异质细胞混合物例如LWB制剂中的CD3+(UCHT1+)细胞。
百分比表示阴性染色细胞群(M1)和阳性染色细胞群(M2)的相对频率。
II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进
行门控。结果显示，与Pacific BlueTM对照(图11A)相比，聚合物荧光团P43(图11B)或P100(图11C)可用于成功鉴定存在于复杂异质细胞混合物例如LWB制剂中的CD3+(UCHT1+)细胞。
百分比表示阴性染色细胞群(M1)和阳性染色细胞群(M2)的相对频率。
[0341] 实施例23说明PBMC分离
[0342] 根据制造商的说明书，通过Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare)梯度分离人外周血单核细胞(PBMC)。将细胞悬浮在FACS洗涤缓冲液(BioLegend)中并计数。将细胞以1200-
1500rpm离心5分钟并除去洗涤上清液。通过温和混合松开细胞沉淀，然后在涡旋的同时将
细胞重新悬浮在3mL的4％甲醛固定缓冲液中。使细胞在室温下在黑暗中固定20分钟。细胞
用1×透化缓冲液(BioLegend)洗涤两次，方法是将细胞在1200-1500rpm下沉淀5分钟，除去
上清液，涡旋使沉淀松散。用1x透化缓冲液将细胞密度调节至5百万-1千万个细胞/mL。将
100μL细胞悬浮液添加到含有针对CD3和针对穿孔素(克隆dG9)的适当抗体的稀释液的管
中。将细胞在室温下在黑暗中温育20-30分钟，然后用FACS洗涤缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于500μL的FACS洗涤缓冲液中并通过流式细胞术分析。用配备有355nm紫外线激发激光
源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射
(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。结果表明，与Pacific BlueTM对照相比，聚合物荧光团P43或P100可用于成功鉴定存在于复杂的异质细胞混合物如PBMC中的穿孔素(克隆dG9+)细胞。
1500rpm离心5分钟并除去洗涤上清液。通过温和混合松开细胞沉淀，然后在涡旋的同时将
细胞重新悬浮在3mL的4％甲醛固定缓冲液中。使细胞在室温下在黑暗中固定20分钟。细胞
用1×透化缓冲液(BioLegend)洗涤两次，方法是将细胞在1200-1500rpm下沉淀5分钟，除去
上清液，涡旋使沉淀松散。用1x透化缓冲液将细胞密度调节至5百万-1千万个细胞/mL。将
100μL细胞悬浮液添加到含有针对CD3和针对穿孔素(克隆dG9)的适当抗体的稀释液的管
中。将细胞在室温下在黑暗中温育20-30分钟，然后用FACS洗涤缓冲液洗涤两次。将细胞重悬于500μL的FACS洗涤缓冲液中并通过流式细胞术分析。用配备有355nm紫外线激发激光
源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射
(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。结果表明，与Pacific BlueTM对照相比，聚合物荧光团P43或P100可用于成功鉴定存在于复杂的异质细胞混合物如PBMC中的穿孔素(克隆dG9+)细胞。
[0343] 结果
[0344] 用抗穿孔素抗体缀合P43或P100聚合物荧光团的穿孔素(克隆dG9)的细胞内流式细胞术分析。使用缀合抗体染色人外周血单核细胞(PBMC)样品中的细胞内穿孔素。样品也
用别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD3抗体表面染色以同时鉴定T细胞。以0.25μg/试验使用缀合的抗-穿孔素抗体。用配备有355nm紫外线激发激光源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细
胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。数据绘制
为纵坐标上的Perforin和横坐标上的CD3。结果显示，与Pacific BlueTM对照(图12A)相比，P43(图12B)或P100(图12C)聚合物荧光团可以用于细胞的复杂异质混合物(例如PBMC)中的
细胞内染色方案，与缀合有不同荧光团的表面染色抗体一起鉴定产生穿孔素的CD3+T细胞。
百分比表示象限内每个群体的相对频率。
用别藻蓝蛋白(APC)缀合的抗CD3抗体表面染色以同时鉴定T细胞。以0.25μg/试验使用缀合的抗-穿孔素抗体。用配备有355nm紫外线激发激光源、405nm紫罗兰激发激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BD LSR II仪器进行流式细
胞术分析。基于淋巴细胞的正向(FSC)和侧向散射(SSC)谱对淋巴细胞进行门控。数据绘制
为纵坐标上的Perforin和横坐标上的CD3。结果显示，与Pacific BlueTM对照(图12A)相比，P43(图12B)或P100(图12C)聚合物荧光团可以用于细胞的复杂异质混合物(例如PBMC)中的
细胞内染色方案，与缀合有不同荧光团的表面染色抗体一起鉴定产生穿孔素的CD3+T细胞。
百分比表示象限内每个群体的相对频率。
[0345] 实施例24说明2'，8'-二溴-3,3,3”,3”-四(溴甲基)二螺[环丁烷-1,6'-茚并[1,2-b]芴-12',1”-环丁烷]的合成。
[0346]
[0347] 2'，8'-二溴-3,3,3”,3”-四(溴甲基)二螺[环丁烷-1,6'-茚并[1,2-b]芴-12',1”-环丁烷]
[0348] 上述化合物可以按照上述实施例2、3和4的类似方式制备。
[0349] 实施例25说明2',9'-二溴-3,3,3”,3”-四(溴甲基)二螺[环丁烷-1,1'-茚并[2,1-a]芴-12',1”-环丁烷]的合成。
[0350]
[0351] 2',9'-二溴-3,3,3”,3”-四(溴甲基)二螺[环丁烷-1,1'-茚并[2,1-a]芴-12',1”-环丁烷]
[0352] 上述化合物可以按照上述实施例2、3和4的类似方式制备。
[0353] 实施例26说明实施例25中化合物的聚乙二醇化。
[0354]
[0355] 该化合物可以按照类似于实施例10的方法制备。
[0356] 实施例27说明实施例24中化合物的聚乙二醇化。
[0357]
[0358] 该化合物可以按照类似于实施例10的方法制备。
[0359] 本说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物指示本公开所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物在此全部引入作为参考用于所有目的，在某种程度上，就好像每个出版物都被专门地和单独地指出为了任何和所有目的通过引用整体并入
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