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以rRNA为标的的微 生物定量分析方法

阅读：494发布：2020-05-12

专利汇可以提供以rRNA为标的的微生物定量分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供一种能够以高灵敏度并且更准确地进行检测的微生物定量、检测方法。是以在被检测体中的目的微生物rRNA量为指标的目的微生物的定量方法。，下面是以rRNA为标的的微生物定量分析方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种处于生存状态的目的微生物的定量方法，其特征在于：
以被检测体中的目的微生物rRNA量为指标，由目的微生物rRNA量与目的微生物的菌数之间的相关关系求出目的微生物的菌数，目的微生物rRNA量通过测定使用能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段和被检测体试样进行的PCR反应得到的扩增产物而求得，被检测体试样中的目的微生物rRNA是固定在微生物中的rRNA，
检测灵敏度为100个以上/g·样本或100个以上/mL·样本，
从样本的RNA的提取到微生物的定量在6小时以内完成，
扩增产物的测定为确定扩增产物达到一定量时的PCR循环数的测定，
能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段，是由序列号5或6记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，
所述方法用于非诊断目的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
经时地对扩增产物进行计测。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
被检测体为粪便、食品或来自活体的试样。
4.一种用于对处于生存状态的目的微生物进行定量的试剂盒，其特征在于，包括：
(1)能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段；和/或(2)用于RNA的提取、RNA的固定和/或PCR反应的试剂，
能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段，是由序列号5或6记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段。

说明书全文

以rRNA为标的的微 生物定量分析方法

[0001] 本申请是2006年1月30日提出的申请号为200680003601.1的同名专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及一种以rRNA为标的进行的对微生物，特别是处于生存状态的微生物进行定量、检测的方法。

背景技术

[0003] 以往，微生物的定量方法主要使用在预先预测的选择性培养基中培养微生物，计测菌数的方法、在选择性液体培养基中培养微生物，测定混浊度或吸光度的方法。此外，在检测样本中的微生物时需要的微生物鉴定操作中，能够使用通过形态观察、革兰氏染色、需氧性、糖同化特性、在培养基中的生长状态等细菌学性质进行鉴定的方法、通过DNA-DNA同源性试验进行判断、通过微生物表面抗原的单克隆抗体进行检测的方法等。这些方法需要时间并要求熟练，从迅速性和简便性的观点出发尚存在问题。

[0004] 近年，以PCR法为首的基因扩增方法作为用于检测微量核酸的技术而在广泛的领域中使用，该方法不以样本中的微生物培养为必要条件，此外，能够将样本直接作为试样进行处理等，具有能够提供迅速化和简便化的优点，因此，正在讨论将其应用于微生物的定量、检测中。

[0005] 作为在微生物分析中应用PCR法的例子，已知将总DNA作为标的序列，通过使用通用引物的PCR法进行细菌定量的方法(专利文献1)。此外，也实现了使用16SrDNA作为标的的方法，例如，已知通过以16SrDNA为标的序列的PCR法进行的定量分析方法(专利文献2)、通过以16SrDNA为标的序列的PCR法进行的肠内细菌分析方法(专利文献3)、作为啤酒混浊菌的乳酸杆菌属菌种的检测方法(专利文献4)等。但是，由于为这些方法得不到以往使用的培养法那样的检测灵敏度，所以存在不能作为以往方法的替代方法而使用的问题。例如，专利文献2中提出的定量性分析方法，为了其实施，需要相当于微生物数为105个/μl以上的大量的模板DNA，这样的方法是不实用的。此外，灵敏度低可以认为是由于作为PCR反应模板的总DNA或16SrDNA在微生物中所占拷贝数(模板量)少的缘故。此外，已知DNA在微生物死亡后也残留存在，这些方法无非是将死亡后的微生物和生存状态的微生物加在一起进行定量、检测而已，也存在难以准确地定量、检测生存状态的微生物的问题(非专利文献1)。

[0006] 此外，作为在微生物分析中应用PCR法的例子，也出现了将mRNA作为标的序列进行的试验，例如，已知将mRNA作为标的序列对粪便中乳酸菌进行的定量分析(非专利文献2)等。此外，也已知以样本中的癌细胞特异的mRNA作为标的序列对癌细胞进行检测的方法(专利文献5、6)。但是，即使是这些方法，作为定量法，也不能得到能够代替以往方法那样的检测灵敏度。即，在非专利文献2中表示的定量分析的检测限度仅为103.5个以上/g·粪便而已，从检测灵敏度的观点出发，不能作为以往的培养法的替代来使用。此外，这些方法是以各微生物中特有基因的mRNA作为标的的方法，从引物设计的烦杂程度、特异性低等问题出发，不适于检测含有多种微生物的被检测体。

[0007] 因此，期待开发出虽然为使用PCR法等的迅速方法，但是能够同时得到和以往的检测方法同样程度的检测灵敏度，而且能够更准确地定量、检测生存状态的微生物的方法。

[0008] 为了改善灵敏度，也可以考虑将标的向细胞内更稳定的或者更大量存在的物质进行设计变更。但是，如果考虑到怀疑这种稳定的标的在死亡后的细胞中也长期残留，则认为对用于仅以检测生存状态的微生物为目的是不理想的。因此，不容易同时达到充分的高度检测灵敏度和仅检测生存细胞。

[0009] 另一方面，已知rRNA是占细胞内RNA含有率约85％左右的多拷贝，由于和蛋白质形成复合体，因此比mRNA的稳定性高。此外，也有rRNA在死后48小时左右被检测出的报告(非专利文献3)，一般考虑不适于检测处于生存状态的微生物(非专利文献1)。

[0010] 专利文献1：日本专利特开2002-238585号公报

[0011] 专利文献2：日本专利特开2003-259879号公报

[0012] 专利文献3：日本专利特开2001-112485号公报

[0013] 专利文献4：日本专利特开平10-210980号公报

[0014] 专利文献5：日本专利特开平10-248600号公报

[0015] 专利文献6：国际公开第00/17395号小册子

[0016] 非专利文献1：J Food Prot，vol.67，No.4，823-832.(2004)

[0017] 非专利文献2：FEMS Microbiology Letters，vol.231，125-130(2004)[0018] 非专利文献3：Appl.Environ.Microbiol.，vol.64，No.11，4264-4268(1998)发明内容

[0019] 本发明的目的在于提供一种能够实现可代替以往培养法那样的检测灵敏度，并更准确地检测处于生存状态的微生物的微生物定量分析方法。

[0020] 本发明的发明人进行了深入研究，结果发现，如果从稳定性出发，将认为不适于检测处于生存状态的微生物的rRNA(在细菌中为5S、16S、23S，在真核生物中为5S、18S、26S或28S)用于标的，出人意料，能够不反映死细胞而准确地定量、检测处于生存状态的微生物数量，并且发现，如果在定量、检测时使用PCR法，则能够实现可代替以往方法那样的检测灵敏度，从而完成本发明。

[0021] 即，本发明提供一种以被检测体中的目的微生物rRNA量为指标的目的微生物定量方法。

[0022] 此外，本发明提供一种以被检测体中的目的微生物rRNA的存在为指标的目的微生物检测方法。

[0023] 此外，本发明提供一种能够在上述方法中使用的核酸片段，是由序列号2、3或5～28记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或者是由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且功能上等价的核酸片段。

[0024] 此外，本发明还提供一种用于实施上述方法的试剂盒。

[0025] 发明的效果

[0026] 如果使用本发明的以rRNA为标的的检测方法，由于标的大量存在，因此尽管相比于以往的标的能够达到高灵敏度，但同时也能够更准确地检测、定量处于生存状态的微生物。此外，如果在该检测中使用PCR法，则能够实现可成为以往培养法的代替那种程度的检测灵敏度。而且，如果是使用PCR的方法，则相比于培养法等的以往方法，能够实现格外的迅速和简便。即，如果使用本发明的方法，则能够同时实现高检测灵敏度、更准确的定量、检测处于生存状态的微生物、和迅速简便。因此，能够在肠道菌群的分析和在来自食品、生物体的试样中生存的微生物的检测、定量等要求检测、定量微生物的实际应用情况中使用。附图说明

[0027] 图1是表示各种微生物的增殖和rRNA转录量的关系的图。

[0028] 图2是表示由定量RT-PCR法产生的标准曲线和定量PCR法的检测范围的比较的图。

[0029] 图3是表示来自人粪便的绿脓杆菌的检测范围的图。

[0030] 图4是针对人粪便大肠菌群的定量值，比较由定量RT-PCR求出时和由培养法求出时的图。

[0031] 图5是表示来自牛奶的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的检测灵敏度的图。

[0032] 图6是表示来自血液的绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌的检测灵敏度的图。

[0033] 图7是表示来自发酵乳制品的大肠杆菌的检测灵敏度的图。

具体实施方式

[0034] 本发明的目的微生物的定量、检测方法，其特征在于以在被检测体中的目的微生物rRNA的存在量和存在为指标。

[0035] 所谓目的微生物rRNA，指的是以定量、检测为目的的微生物能够具有的rRNA，作为rRNA，例如，可以列举在原核生物中的5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，在真核生物中的5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、26SrRNA、28SrRNA，从作为现在的微生物分类可靠的指标而主要被使用的方面出发，特别优选16SrRNA、23SrRNA、18SrRNA和26SrRNA。此外，所谓目的微生物，指的是作为定量、检测目的的微生物，没有特别的限定，例如，可以列举肠杆菌科、肠球菌属、乳酸杆菌属、链球菌属、葡萄球菌属、韦荣氏球菌属、假单胞菌属、梭菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、优杆菌属、普雷沃菌属、瘤胃球菌属、梭形杆菌属、丙酸杆菌属、消化链球菌属、弧菌属、芽胞杆菌属、弯曲杆菌属、不动杆菌属、乳球菌属、片球菌属、魏斯菌属、明串珠菌属、酒球菌属、螺杆菌属、奈瑟球菌属、李斯特菌属、猪嗜血杆菌属、分枝杆菌属、加德纳菌属、军团菌属、气单胞菌属、莫拉菌属、念珠菌属等微生物和后述表2、表3记载的微生物。此外，本发明的目的微生物的概念不仅包含由1种菌种构成的微生物，而且还包含由共有某种性质的2种以上菌种的集合构成的群、属和科。

[0036] 所谓被检测体，指的是微生物的存在或存在量等的调查对象。作为被检测体，例如，可以列举结膜拭子、牙石、牙斑、咳出的痰、咽拭子、唾液、鼻涕、支气管肺泡灌洗液、胸水、胃液、洗胃液、尿、子宫颈管粘液、阴道分泌物、皮肤损伤、粪便、血液、腹水、组织、脑脊髓液、关节液、患处冲洗液等来自生物的试样、食品、药品、化妆品、食品·药品·化妆品的中间处理物、微生物培养液、植物、土壤、活性污泥、排水等可能含有微生物的对象。此外，所谓被检测体试样，指的是以被检测体为基础摄取或制作的试样，只要是能够反映被检测体微生物存在或存在量的试样，则没有特别的限定，例如，可以列举含有被检测体中所含的核苷酸的混合物和含有RNA的混合物，但从在PCR法中使用的观点出发，优选含有被检测体中所含RNA的混合物。

[0037] 被检测体试样，例如，能够从全部或一部分被检测体，根据需要，在通过提取、分离、精制方法进行前处理后，通过适当的公知方法取得。例如，含有RNA的混合物，根据需要，在通过过滤、离心分离、色谱法等公知的方法进行前处理后，例如，能够通过使用“异硫氰酸胍-氯化铯超速离心法”、“酸性异硫氰酸胍-苯酚氯仿法(AGPC法)”、“磁珠法”、“二氧化硅柱法”等通用方法的提取而得到，此外，也能够使用市售的试剂盒(QIAGEN RNeasy KIt、TRIZOL等)进行。

[0038] 此外，作为被检测体试样，从防止分解、维持高检测灵敏度的观点出发，优选使用在微生物中处于固定状态的RNA。这样的固定，例如，能够通过市售的固定剂(RNAprotect Bacterial Regent、RNAlater等)进行。此外，从避免微生物内的RNA量变化的观点出发，固定优选在采取样本后立即进行。

[0039] 本发明中的目的微生物的定量以在被检测体中的目的微生物rRNA量为指标。这里，被检测体中的目的微生物rRNA量，例如，能够通过(1)使用能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段和被检测体试样，通过PCR法求出扩增产物量；(2)求出能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段和被检测体试样的杂交效率；或(3)以使用其它公知方法的定量方法求出。

[0040] 这里，(1)在使用PCR法时，“能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段”的设计能够通过比较目的微生物具有的碱基序列和其它微生物具有的碱基序列，在目的微生物能够具有的rRNA中选择特异的序列而进行。这里，微生物能够具有的rRNA的碱基序列，例如，能够通过参考数据库(DDBJ、Genbank等)而得到。此外，能够使用软件(Clustal X等)对碱基序列进行比对，通过目测等手段发现特异的序列。此外，目的微生物中特异性序列，优选参考作为定量对象的微生物所包含范围的广度。即，例如，如果以特异性定量某菌种为目的，则优选选择该菌种的特异序列，此外，如果以特异性定量某属为目的，则优选选择该属的特异序列。这样的选择能够使用公知的方法适当地进行。

[0041] 作为能够与目的微生物rRNA杂交的核酸片段，不仅能够使用这样设计的序列，而且也能够按照公知的技术常识适当估计，使用与该碱基序列互补的碱基序列和能够在目的微生物的定量中同样使用的同源的碱基序列，例如，由a)该碱基序列中的1个或多个，优选1至10个碱基取代、添加或缺失的碱基序列；b)与该碱基序列具有90％以上、优选95％以上、更优选99％以上同一性的碱基序列；c)在严格条件下与和该碱基序列互补的碱基序列构成的DNA杂交的碱基序列构成的核酸片段等。

[0042] 此外，这样的核酸片段，也可以是在其两端或一端，优选在5’端添加任意数，优选100个，更优选20个，进一步优选10个以下碱基的核酸片段的一部分。

[0043] 该核酸片段的长度没有特别的限制，优选由5～50个碱基构成的核酸片段，更优选由12～35个碱基构成的核酸片段。

[0044] 这样设计的核酸片段，例如，能够按照其碱基序列以DNA合成机进行人工合成。作为该片段，优选在合成后确认其特异性的片段，这里，作为特异性的确认，例如，当以目的rRNA为模板时，通过和适当的对照相比，确认得到特异的PCR扩增产物而进行。

[0045] 作为这样的核酸片段，例如，可以列举序列号1～30记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段。这里，作为由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，例如，可以列举在以下表示的(a)～(c)中表示的，在目的微生物rRNA的定量、检测中能够使用的核酸片段。

[0046] (a)在由以序列号1～30表示的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段中，1个或多个碱基缺失、取代或添加的核酸片段。

[0047] (b)由与以序列号1～30表示的碱基序列或与其互补的碱基序列具有90％以上，优选95％以上，更优选99％以上同一性的碱基序列构成的核酸片段。

[0048] (c)由在严格的条件下与以序列号1～30表示的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的DNA杂交的碱基序列构成的核酸片段。

[0049] 此外，在这里，碱基序列的同一性，可以通过使用GENETYX(R)的同源性分析程序算出。

[0050] 此外，作为“严格的条件”，例如，可以列举在含有50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液和250mg/mL鲑鱼精子DNA的溶液中，以42℃恒温16～24小时使其杂交的条件。

[0051] 能够在目的微生物rRNA的定量、检测中使用的核酸片段，例如，能够通过进行PCR法，选择以目的微生物rRNA作为模板时能够得到扩增产物，而以其它标的，例如其它微生物rRNA或mRNA作为模板时不能得到扩增产物的核酸片段而得到。

[0052] 这样，(1)由序列号1或2记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测蜡样芽胞杆菌的用途中使用，(2)由序列号3或4记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测产气荚膜梭菌的用途中使用，(3)由序列号5或6记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测肠杆菌科的用途中使用，(4)由序列号7或8记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测葡萄球菌属的用途中使用，(5)由序列号9或10记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测假单胞菌属的用途中使用，(6)由序列号11或12记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测肠球菌属的用途中使用，(7)由序列号13或14记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测嗜酸乳杆菌亚群的用途中使用，(8)由序列号15或16记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测瘤胃乳杆菌亚群的用途中使用，(9)由序列号17或18记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测植物乳杆菌亚群的用途中使用，(10)由序列号19或20记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测罗伊乳杆菌亚群的用途中可以使用，(11)由序列号21或22记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测清酒乳杆菌亚群的用途中使用，(12)由序列号23或24记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测干酪乳杆菌亚群的用途中可以使用，(13)由序列号25或26记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测短乳杆菌亚群的用途中可以使用，(14)由序列号27或28记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测食果糖乳杆菌的用途中使用，(15)由序列号29或30记载的碱基序列或与其互补的碱基序列构成的核酸片段，或由与上述碱基序列同源的碱基序列构成且在功能上等价的核酸片段，能够在特异地定量、检测发酵乳酸杆菌的用途中使用。

[0053] 此外，在这里，由序列号1记载的碱基序列构成的核酸片段是在FEMS Microbiology Letters，vol.202，209-213(2001)中记载的公知的核酸片段。此外，由序列号4记载的碱基序列构成的核酸片段是在Microbiol.Immunol.，vol.46，No.5，353-358(2002)中记载的公知的核酸片段。此外，由序列号29或30记载的碱基序列构成的核酸片段是在日本专利特开平11-151097号公报中记载的公知的核酸片段。另一方面，由序列号2、3或5～28记载的碱基序列构成的核酸片段是本发明的发明人发现的核酸片段。

[0054] 使用这样制作的核酸片段和被检测体试样的PCR法，能够通过“以该核酸片段作为引物使用，在含有被检测体试样的反应体系中，以目的微生物rRNA为模板的PCR反应”而进行。作为这样的PCR法，只要为特异性扩增来自目的微生物rRNA的核苷酸片段的反应，则没有特别的限制，但优选包含将目的微生物rRNA作为模板，通过酶，优选逆转录酶等制作cDNA的工序的方法，此外，更优选在该工序以外，包含以这样制作的cDNA作为模板扩增核苷酸的工序的方法。这样的PCR法，例如，能够通过使用公知的RT-PCR反应而进行。这里，RT-PCR反应能够使用Two-Step RT-PCR或One-Step RT-PCR等公知的方法进行，但是从简便、并且从防止交叉污染的观点出发，特别优选One-Step RT-PCR。

[0055] 这样的One-Step RT-PCR法，例如，可以使用市售的试剂盒(QIAGEN One-Step RT-PCR kit等)进行。作为在RT反应中使用的具有逆转录活性的酶，能够使用M-MHV reverse transcriptase等各种逆转录酶。此外，在使DNA扩增的PCR反应中使用的DNA聚合酶优选为具有90℃以上耐热性的酶。

[0056] 这样的PCR反应，例如，能够通过下述方法进行：以在90～98℃将双链DNA变为单链的热变性反应、在37～72℃使引物与模板cDNA杂交的退火反应、在50～75℃使DNA聚合酶发挥作用的延伸反应的温度条件下，将此作为1个循环，进行1～数十个循环。此外，优选的反应条件的一个例子为，热变性95℃30秒，退火60℃30秒、延伸反应72℃60秒。

[0057] 此外，在PCR反应时，优选将2种引物作为1组使用，此时，两者必须使引导链和后随链进行组合。由于本发明提供的核酸片段将在RT-PCR反应中的退火温度设定为几乎固定的温度，因此能够同时测定多个微生物的核酸片段。此外，既能够作为探针使用，也能够和其它公知的通用引物、寡聚核苷酸等组合使用。

[0058] 此外，作为含有作为该RT-PCR反应模板的rRNA的被检测体试样，优选含有RNA总量为1pg～1μg的RNA的物质，更优选含有10pg～0.1μg的物质。

[0059] 在进行适当的PCR反应时，通常，在“PCR扩增产物量”、“PCR循环数”和“PCR的模板量”之间有相关关系。因此，如果参考通过这样进行的PCR反应而扩增的扩增产物量和PCR循环数而适当计算，就能够求出目的微生物rRNA量。

[0060] 此外，正如后述的实施例图1所示，可知在求出的“目的微生物rRNA量”和“目的微生物的菌数”之间也存在良好的相关关系。因此，如果参考这样求出的“目的微生物rRNA量”而计算，就能够求出目的微生物的菌数。此外，即使不经过计算“目的微生物rRNA量”的过程，通过参考如上述操作进行的“通过PCR反应而扩增的扩增产物量”和“PCR循环数”而适当计算，也能够求出目的微生物的菌数。

[0061] PCR扩增产物量和PCR循环数的得知没有特别的限定，能够通过所有的方法进行，例如，能够通过确定在到达任意设定的一定量的DNA量时的PCR循环数而进行。这样的确定，例如，能够通过使用“并用标记PCR产物的PCR法，经时地计测标记而进行的PCR法”，确定在到达设定的一定荧光强度时的PCR循环数而进行。这里，一定的荧光强度，从能够反映适当的相关关系出发，优选以“扩增产物在对数扩增时能够达到的荧光强度的范围内”而设定。这样的范围通过公知的方法能够适当理解。此外，在这里，作为标记，例如，可以列举以荧光色素产生的标记，作为标记的计测，例如，可以列举荧光强度的计测。此外，在这里，作为以荧光色素产生的标记，例如，可以列举以嵌入性荧光色素产生的标记，作为嵌入性荧光色素，例如，可以列举SYBR(R)Green I。嵌入性色素因嵌入在双链核酸中而具有荧光强度增强的性质，因此发出反映扩增的PCR产物的强度的荧光。此外，以荧光色素产生的标记，也能够通过使用以荧光色素标记的TaqMan探针和分子信标(Moleculer Beacon)等而进行。TaqMan探针和分子信标是使荧光色素和猝灭剂结合在与通过PCR扩增的区域的内部序列具有同源性的寡聚核苷酸中的探针，使其共存在PCR反应中而使用。通过结合在探针中的荧光色素和猝灭剂的相互作用，发出与PCR扩增反应相应的荧光，因此，通过测定在各PCR阶段的荧光强度，能够对被扩增的PCR产物进行经时地观察。但是，TaqMan探针和分子信标等，必须找出适应于探针的细菌中特异的互补序列，有时根据对象不同而存在困难。

[0062] 如果参考这样得知的“PCR扩增产物量和PCR循环数”和适当的比较实验的结果，就能够求出rRNA量。即，例如，如果参考“使用其量已知的rRNA进行的比较实验的结果”，与如上述得知的“PCR扩增产物量和PCR循环数”进行适当的对比，通过公知的方法就能够计算目的微生物rRNA量。

[0063] 这样，如果参考这样计算的“目的微生物rRNA量”和适当的比较实验的结果，就能够求出目的微生物的菌数。即，例如，如果参考“使用对应的其菌数已知的被检测体试样进行的比较实验的结果”，与这样计算的“目的微生物rRNA量”进行适当的对比，通过公知的方法就能够计算目的微生物的菌数。此外，在这样的对比中，从简便性出发，优选使用表示作为PCR模板的“被检测体微生物的菌数”和到达一定的PCR扩增产物量时的“PCR循环数”(以下有时也称为CT值)的相关关系的标准曲线。这样的标准曲线，通常是将作为标的的微生物菌数标绘在横轴，将CT值标绘在纵轴而制成(参照图2)。在标准曲线制成时使用的微生物也可以使用模式株等公知的菌株。

[0064] 此外，如果适当对比“使用对应的其菌数已知的被检测体试样进行的比较实验的结果”和如上述操作而得知的“PCR扩增产物量和PCR循环数”，不经过具体计算rRNA量的过程，也能够直接计算目的微生物的菌数。具体而言，适用将来自被检测体试样的CT值导入上述标准曲线中即可。

[0065] 此外，如上所述，在被检测体中的目的微生物rRNA量，例如，也能够通过(2)得知能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段和被检测体试样的杂交效率而求出。

[0066] 这里，能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段，例如，能够使用如上述设计和制作的核酸片段。此外，作为这样的核酸片段，优选形成标记的核酸片段。这里，作为标记，可以列举酶、顺磁性离子、生物素、荧光色素、发色团、重金属或放射性同位素，作为更优选的标记，可以列举酶，这里，作为酶，可以列举辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。这样的标记能够通过公知的方法进行。

[0067] 如果测定被检测体试样和这样的核酸片段的杂交程度，通过公知的换算方法就能够得知在被检测体中的目的微生物rRNA量和/或目的微生物的菌数。这样的杂交程度的计测没有特别的限定，能够以公知的方法为准进行，例如，能够通过计测添加在核酸片段的标记而进行。即，例如，当使用以荧光色素标记的核酸片段时，能够通过计测荧光强度而进行。这样的计测优选为和适当的对照平行进行的计测。这里，作为适当的对照，例如，可以列举“已知不与使用的核酸片段特异杂交的试样”、“来自所含目的微生物菌数已知的被检测体的被检测体试样”、“从目的微生物rRNA量已知的被检测体摄取或制作的被检测体试样”等。
通过参考这样的对照，以公知的换算方法能够得知目的微生物rRNA量或目的微生物菌数。
此外，微生物菌数的得知也能够参考这样计算的目的微生物rRNA量和适当的比较实验结果，以公知的方法进行。

[0068] 此外，本发明的目的微生物的检测方法，是以在被检测体试样中的目的微生物rRNA的存在为指标的方法。这里，所谓“微生物的检测”包含微生物鉴定的含义。此外，也包含确认检测对象微生物在样本中存在，或确认检测对象微生物在样本中不存在的含义。

[0069] 当使用本发明的检测方法确认目的微生物rRNA在被检测体中存在时，通过下述方法进行即可：(1)检测使用被检测体试样和能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段的PCR产生的扩增产物；(2)检测这样的核酸片段和被检测体试样的杂交；(3)使用其它公知的方法检测目的微生物rRNA等。该(1)～(3)的方法能够通过参考已经叙述的方法而容易地进行。这样，由于目的微生物rRNA的存在表示目的微生物在被检测体中存在，因此能够检测目的微生物。但是，由于非特异的PCR产物扩增和非特异的杂交均能够发生，因此优选和适当的对照比较而进行。

[0070] 如后述的实施例所示，可知以rRNA量为指标的定量方法和以rRNA的存在为指标的检测方法，相比于以往的以rDNA量为指标的方法，能够达到很高的检测灵敏度。此外，如在后述的实施例中所示，可知以rRNA量为指标的方法，能够不将死细胞同时定量、检测，而正确地定量、检测处于生存状态的微生物。

[0071] 因此，如果使用本发明的定量、检测方法(以下也称为“本发明的方法”)，能够以比以往方法更高的检测灵敏度，并且特异地定量、检测处于生存状态的微生物。因此，本发明的方法，例如，能够在下述用途等中使用：(1)以比以往方法更高的检测灵敏度定量、检测在被检测体中含有的处于生存状态的目的微生物；(2)以比以往方法更高的检测灵敏度定量、检测在被检测体中含有的死细胞数；(3)以比以往方法更高的检测灵敏度计测在被检测体中含有的死细胞数和处于生存状态的微生物数的比例；(4)以比以往方法更高的检测灵敏度“确认”处于生存状态的微生物的存在或存在量。这里，作为确认，例如，可以列举(a)在有必要更严格地正确把握处于生存状态的微生物数时，为了把握处于生存状态的微生物的存在或存在量而进行的定量、检测；(b)在“处于生存状态的微生物数”通过其它实验系统被计算时，为了研究该实验的精度和被计算的数值的正确度而进行的确认。此外，当定量死细胞时，例如，优选通过已知同时检测死细胞的公知的方法等，同时计测死细胞数和生存细胞数的合计数而进行。能够通过从合计数除去以本发明的方法计算的生存细胞数而求出。

[0072] 此外，本发明的方法，例如，也可以作为定量、检测不形成菌落的微生物、不能液体培养的微生物等通过以往的培养法难以计测的微生物的方法而使用。

[0073] 此外，如后述的实施例所示，可知在这样的定量、检测方法中，当使用PCR法时，能够实现和培养法同等程度的检测灵敏度。因此，本发明的方法，也能够以和培养法同等程度以上的检测灵敏度，即，100个以上/g·样本，或100个以上/mL·样本的检测灵敏度，而作为定量、检测微生物的方法使用。

[0074] 此外，当使用PCR法时，和培养法比较，能够极其迅速而且简便地进行微生物的定量、检测。此外，如果通过使用PCR法的方法，则从样本的RNA的提取到微生物的定量、检测，能够在约6小时以内完成。因此，本发明的方法也能够作为能够以短时间(6小时以内)检测微生物的方法使用。

[0075] 在本发明的方法中，如果使用采用PCR法的方法，则能够同时实现高检测灵敏度、更准确地定量、检测处于生存状态的微生物、和迅速及简便。因此，本发明的方法，例如，能够在特别要求迅速且灵敏度高的定量、检测的医疗场所和食品工业中的“污染菌、有害菌、病原微生物等的检查”的用途中使用。

[0076] 本发明的方法也能够使用用于实施该方法的试剂盒而进行。这里，作为用于实施该方法的试剂盒，例如，可以列举包含(1)能够与目的微生物rRNA特异杂交的核酸片段、(2)记载实施方法的实验设计、和/或(3)在RNA提取、RNA固定或PCR反应中使用的试剂的试剂盒，但本发明的试剂盒不限定于这些，也指集合了进行该方法的全部或一部分工序所需物质的全部或一部分的试剂盒。这里，“进行工序所需的物质”能够通过参考本说明书的记载而适当理解。

[0077] 实施例

[0078] 以下，通过实施例对本发明的内容进行更详细地说明，但本发明并不限于这些实施例。

[0079] 实施例1引物的制作

[0080] 针对各种细菌菌种，从DNA Data Bank of Japan(http：//www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html)入手16S和23S rRNA的DNA序列。通过Clustal W程序将这些序列比对后，制成系统树。以系统树为基础，将各菌种分类为科、属、亚群，在每个分类中进行引物的设计。在表1中表示制成的引物序列和作为对象的rRNA种类。此外，表1的参考文献栏表示记载该序列的文献。此外，该栏为空栏的，表示该序列是由本发明发现的新序列。此外，非专利文献4表示Microbiol.Immunol.，vol.46，No.5，353-358(2002)，非专利文献5表示FEMS Microbiology Letters，vol.202，209-213(2001)，专利文献7表示日本专利特开平11-151097号公报。

[0081] [表1-1]

[0082]

[0083] [表1-2]

[0084]

[0085] 实施例2引物的特异性确认

[0086] 为了确认实施例1的引物在实际中是否具有特异性，研究对各种细菌的特异性。即，将在表2(28个菌属57个菌种)和表3(18个菌属60个菌种)中所示的各种细菌悬浮液50μl悬浮在2倍量的RNAprotect Bacterial Reagent(QIAGEN)中，室温孵育5分钟。以5000g离心分离10分钟，除去上清后，添加450μl溶菌缓冲液[346.5μl RLT缓冲液(QIAGEN)、3.5μlβ-巯基乙醇、100μl TE缓冲液]和300mg(直径0.1mm)玻璃珠，通过FastPrep FP120(Biol01)以
5000rpm激烈振荡1分钟，破碎菌体。向破碎液中添加500μl水饱和酚，在60℃下孵育10分钟。
添加100μl氯仿/异戊醇(CIA)搅拌后，以12000rpm、4℃、5分钟的条件进行离心分离操作。向回收的上清中加入等量的水饱酚(水饱和)/氯仿进行搅拌，再次以同样条件进行离心分离操作。向回收的上清中加入等量的CIA进行振荡，再次以同样条件进行离心分离操作。向回收的400μl上清中添加等量的异丙醇和1/10量的3M醋酸钠，颠倒混合后，以15000rpm、4℃、
10分钟的条件进行离心分离操作。向去除上清的物质中加入500μl的75％乙醇，颠倒混合后，以15000rpm、4℃、2分钟的条件进行离心分离操作。除去上清，使管内风干后，以50μl的无RNA酶水溶解沉淀物，将该溶液作为总RNA提取溶液。定量RT-PCR反应使用QIAGEN OneStep RT-PCR试剂盒(QIAGEN)进行。反应液(总量25μl)的组成为，2μl的总RNA溶液(相当
5
于2×10CFU)，和调整使得作为终浓度为1×QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer、0.5mM dNTP Mix、1/25量的QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix、1/100000量的SYBR(R)Green I(Molecular Probes)、0.75μtM各引物(在表1中记载)。此外，对于RT-PCR反应，使用相当于2×105CFU的RNA作为模板。反应液首先在50℃下进行30分钟的逆转录反应，此后，为了使逆转录酶失活，在95℃下加热15分钟。接着，以94℃20秒、55℃或60℃20秒、72℃50秒进行40～
45个循环，每次循环中，测定作为SYBR(R)Green I的荧光强度的扩增产物量。这些一系列反应通过ABI PRISM(R)7900HT(Applied Biosystems)进行。

[0087] 其结果如在表2中所示，可知引物En-lsu 3F/3’R(肠杆菌科)、g-Staph-F/R(葡萄球菌属)、PSD7F/R(假单胞菌属)、s-Clper-F/ClPER-R(产气荚膜梭菌)、S-S-Bc-200-a-S-18/Bc2R(蜡样芽胞杆菌)、g-Encoc F/R(肠球菌属)，仅能够特异地检测目的菌属或菌种。此外，如在表3中所示，可知引物sg-Laci-F/R(嗜酸乳杆菌亚群)、sg-Lsak-F/R(清酒乳杆菌亚群)、sg-Lcas-F/R(干酪乳杆菌亚群)、sg-Lrum-F/R(瘤胃乳杆菌亚群)、sg-Lreu-F/R(罗伊乳杆菌亚群)、sg-Lpla-F/R(植物乳杆菌亚群)、s-Lbre-F/R(短乳杆菌亚群)、s-Lfru-F/R(食果糖乳杆菌)、LFer-1/2(发酵乳酸杆菌)仅能够特异地检测目的亚群或菌种。此外，在表
2、表3中，+表示能够进行特异的检测(CT值为1～30)，-表示CT值为31以上或完全不能得到扩增产物。

[0088]

[0089]

[0090]

[0091]

[0092] 实施例3各种微生物的生长状况与rRNA转录量的相关性的研究

[0093] 使用大肠杆菌(大肠杆菌)、金黄色葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)、绿脓杆菌(绿脓杆菌)的各培养期的菌体，调查以培养法测定的活菌数和从以定量RT-PCR法测定的rRNA转录量导出的具有菌落形成能力的细菌数的关系。即，使用BHI培养基，在37℃下开始好氧振荡培养后，使用经时采取的菌液，通过使用BHI琼脂培养基的培养法(37℃，24小时)测定菌数。另一方面，从同样采取的样品中提取RNA，进行定量RT-PCR分析。使用从菌数已知的对数增殖后期菌株提取的RNA，以在实施例4中记载的要点制成的标准曲线，基于该标准曲线算出各样品中的菌数。另外，总RNA提取和定量RT-PCR如实施例2所述进行。其结果表示在图1中。
在图1中，将从rRNA转录量算出的菌数以●(黑点)表示，由培养法得出的菌数以○(白点)表示。对于用于分析的全部菌株，从对数增殖期到死亡期，确认由菌液中的培养法得出的活菌数和从rRNA转录量算出的菌数各自的变化曲线具有高相关性。由此可知，通过测定rRNA的转录量，在任意状态下都能够测定处于生存状态的微生物数。

[0094] 实施例4标准曲线的制成和与定量PCR法的比较

[0095] 使用绿脓杆菌YIT6108T(模式株)和金黄色葡萄球菌YIT6075 T(模式株)的对数增殖后期的培养菌体，通过本发明的方法(定量RT-PCR法)进行标准曲线的制成。此外，通过定量PCR法制成标准曲线，和本发明方法进行比较。分别取得使用BHI培养基的各自的纯培养菌株，使得菌数为105、104、103、102、101、100，和实施例2同样地提取RNA。使用在表1中记载这些的引物，按照实施例2进行定量RT-PCR。调查得到的CT值和以实施例3中记载的培养法求出的菌数的相关性。此外，同时也通过以下所示的方法，对由相同样品得到的DNA研究通过以rDNA作为标的序列的PCR法进行的定量。具体而言，向分别取得的菌数为105、104、103、102、101、100的菌液中加入1mL的PBS，搅拌后，以15000rpm、4℃、5分钟的条件进行离心分离，除去上清。重复进行2次向沉淀物中加入1mL的PBS、搅拌、离心、除去上清的操作。向该片状沉淀物中添加300μl溶菌缓冲液(100mM Tris-HCl，40mM EDTA，1％SDS，pH9.0)、500μl TE饱和酚和300mg玻璃珠(直径0.1mm)，通过FastPrep FP120以5000rpm激烈振荡30秒钟，破碎菌体。以15000rpm、4℃、5分钟的条件进行离心分离，回收上清。向上清中加入酚(TE饱和)/氯仿/异戊醇，通过FastPrep FP120以4000rpm激烈振荡45秒钟后，以15000rpm、4℃、5分钟的条件进行离心操作。使用分离、回收的上清进行醇沉淀后，溶解在50μl的TE缓冲液中，制成DNA溶液。接着，以得到的DNA溶液作为模板进行PCR反应。PCR反应在总量为25μl，含有2μl DNA溶液和作为最终浓度，为10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.45％Triton X-100、200μM dNTP混合物、1/100000量的SYBR(R)Green I、11ng/μl TaqStart(R)抗体(ClonTech)、0.05U/μl Taq DNA polymerase(TaKaRa)、0.25μM各引物(PSD7F/R、g-Staph-F/R)的反应液中进行。反应液在94℃加热5分钟后，以94℃20秒、60℃20秒、72℃50秒进行40个循环，然后，以72℃反应10分钟。在每个循环中，测定作为SYBR(R)Green I的荧光强度的扩增产物量。这些一系列的反应通过ABI PRISM(R)7900HT进行。此外，将RNA和DNA提取量的1/25用于反应。

[0096] 该结果如在图2中所示，在两种方法中，微生物数的对数值和CT值均显示出非常良好的相关性。图2是将CT值标绘在纵轴，将以培养法中测定的用于样品的各菌种的个数/提取标绘在横轴的图。定量RT-PCR以●(黑点)表示，定量PCR以○(白点)表示。由于通过定量2
RT-PCR法得到的近似曲线中的相关系数R 值，在绿脓杆菌中为0.9955，在金黄色葡萄球菌中为0.9961，因此可知，能够利用该标准曲线从CT值算出菌数。此外，定量RT-PCR法即使在提取的样品中微生物数为100个也能够检测，具有和以往使用的培养法同等的检测灵敏度，因此可知，能够作为培养法的替代而用于微生物的定量、检测。相比较于将rDNA作为标的序列的PCR法比较，本发明方法的检测灵敏度高至约1000倍，相比较于以往研究的使用基因扩增法的微生物定量手段，可知具有格外高的检测灵敏度。

[0097] 实施例5粪便中细菌的定量检测

[0098] 向人粪便中添加各种浓度的绿脓杆菌，比较定量PCR法和本发明方法的检测范围。制作每20mg人大便菌数分别添加相当于101、102、103、104、105、106、107、108个菌数的绿脓杆菌的添加绿脓杆菌的粪便样品，从添加绿脓杆菌的粪便样品中提取总RNA，将其作为模板进行本发明的定量RT-PCR。此外，从同样的样品中提取DNA，将其作为模板进行定量PCR。再以同样的样品通过培养法测定菌数。总RNA的提取和定量RT-PCR法和实施例2同样进行，培养法和实施例3同样进行，DNA的提取和定量PCR法和实施例4同样进行。此外，将得到的总RNA和总DNA中的1/2500用于定量RT-PCR和定量的PCR。

[0099] 该结果如在图3中所示，在添加绿脓杆菌的粪便样品中，通过本发明的方法，在每1g粪便为102.9至1010个/g·粪便的范围内，能够确认测定值的近似曲线的直线性。图3是将CT值标绘在纵轴，将以培养法测定的用于样品的绿脓杆菌的个数/g·粪便标绘在横轴的图。定量RT-PCR以●(黑点)表示，定量PCR以○(白点)表示。本发明方法在人粪便样品中的
2.9 2
定量限度为10 个以上/g·粪便，与10个以上/g·粪便的培养法几乎同等。此外，相对于以培养法中需要1天时间的天数，以本发明的方法从样本的RNA固定到定量约6小时完成。另一方面，在以定量PCR法的分析中，在从105.8至1010个/g·粪便的范围内，能够确认测定值的近似曲线的直线性，检测限度约为定量RT-PCR法的1/1000。

[0100] 实施例6以定量RT-PCR和培养法进行的人粪便大肠菌群的分析

[0101] 使用大肠菌群特异引物En-lsu3F/3’R，通过定量RT-PCR法进行人粪便菌群的分析。采取38名成人的新鲜排泄粪便，在厌氧条件下以运送培养基(甘油10％，半胱氨酸5％，lab lemco powderl％，NaCl 0.045％，KH2PO40.0225％，K2HPO40.0225％，(NH4)2SO40.0225％，CaCl20.00225％，MgSO40.00225％)10倍稀释。从该稀释液中分别取得200μl(相当于20mg粪便)，通过定量RT-PCR法提取使用的总RNA。以总RNA的1/2500量作为模板进行定量RT-PCR。此外，以同样的稀释液通过培养法(DHL选择性培养基)进行CFU的定量。RNA的固定、总RNA的提取和定量RT-PCR按照实施例2的记载进行，培养法按照规定方法进行。在用于通过定量RT-PCR算出菌数的标准曲线使用从大肠杆菌YIT 6044T(模式株)中提取的总RNA。

[0102] 该结果如在图4中所示，可知本发明的以rRNA作为标的的定量RT-PCR法和培养法显示出相关系数高达0.9255的相关关系。另外，在纵轴表示以培养法得到的定量结果，在横轴表示以本发明得到的定量结果。此外，相对于以培养法需要2天时间的天数进行全部操作，以本发明的方法以约6小时完成所有的操作。

[0103] 实施例7牛奶的微生物检查

[0104] 在市售的牛奶中添加各种浓度的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌，比较倾注平板培养法和本发明方法的定量值。向市售的牛奶中添加大肠杆菌或金黄色葡萄球0 1 2 3 4 5 6
菌，使其为10、10 、10 、10 、10 、10、10个/mL，将其作为样品。在各样品中，将1mL用于总RNA提取，1mL用于倾注平板培养法(大肠杆菌：去氧胆酸盐琼脂培养基，金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌：一般琼脂培养基，37℃，20±2小时)。对提取的总RNA，使用在表1中记载的引物，以定量RT-PCR法进行分析，求出CT值和以倾注平板培养法得到的菌数的相关性。此外，以在实施例2中记载的方法进行总RNA提取和定量RT-PCR法，将提取的总RNA中的1/25用于定量RT-PCR。

[0105] 该结果如在图5中所示，任意菌种在每1mL牛奶100～106的范围内，其CT值均和菌数相关。图5是将CT值标绘在纵轴，将以倾注平板培养法测定的用于样品的大肠杆菌(图5左上)、金黄色葡萄球菌(图5右)和蜡样芽胞杆菌(图5右下)的个数/mL·牛奶标绘在横轴的图。此外，本发明方法的定量限度为100个以上/mL·牛奶，由于和倾注平板培养法同等，因此明确，该方法能够成为使用在乳品等省令中记载的法定培养基(去氧胆酸盐琼脂培养基，一般琼脂培养基)的倾注平板培养法的替代。此外，相对于以倾注平板培养法需要1天时间的天数，以本发明的方法从样本RNA固定到定量约6小时完成。

[0106] 实施例8血液中的细菌检查

[0107] 向人血液中添加各种浓度的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌，比较倾注平板培养法(血液培养法)和本发明方法的定量值。向人血液中添加1/10量的3.8％柠檬酸钠作为抗凝剂，向该血液中添加金黄色葡萄球菌或绿脓杆菌，使其为100、101、102、103、104、105个/mL，将其作为样品。在各样品中，将0.5mL用于总RNA提取，0.5mL用于倾注平板培养法(BHI琼脂培养基)。对提取的总RNA通过定量RT-PCR法进行分析，求出得到的CT值和以倾注平板培养法得到的菌数的相关性。另外，以在实施例2中记载的方法进行总RNA提取和定量RT-PCR法。另外，将提取的总RNA中的1/25用于定量RT-PCR法。

[0108] 该结果如在图6中所示，在100～105个/0.5mL的范围内能够看到菌数和CT值相关。图6是将CT值标绘在纵轴，将以倾注平板培养法测定的用于样品的绿脓杆菌(图6左)和金黄色葡萄球菌(图6右)的个数/0.5mL·血液标绘在横轴的图。此外，本发明方法的定量限度为
100个以上/0.5mL血液，由于和倾注平板培养法同等，因此显示能够成为倾注平板培养法的替代。进而，相对于在倾注平板培养法中需要1天时间的天数，以本发明的方法从样本RNA固定到定量约6小时完成。

[0109] 实施例9发酵乳制品的大肠杆菌检查

[0110] 向市售的益力多((株)益力多本社生产)中添加大肠杆菌，使其为100、101、102、103、104、105个/mL菌数，将其作为样品。在各样品中，将1mL用于总RNA提取，1mL用于采用去氧胆酸盐琼脂培养基的倾注平板培养法(37℃，20±2小时)。对提取的总RNA，使用大肠菌群特异的引物En-lsu3F/3’R，通过定量RT-PCR法进行分析，调查得到的CT值和以倾注平板培养法得到的菌数的相关性。总RNA提取，除通过添加玻璃珠进行菌体破碎以外，以在实施例2中记载的方法进行，定量RT-PCR法以在实施例2中记载的方法进行。另外，将提取的总RNA中的1/25用于定量RT-PCR法。

[0111] 该结果如在图7中所示，在100～105个/mL的范围内，CT值和菌数高度相关。图7是将CT值标绘在纵轴，将以倾注平板培养法测定的用于样品的大肠杆菌的log10个数/mL·益力多标绘在横轴的图。本发明方法的定量限度为100个以上/mL·益力多，由于和倾注平板培养法同等，因此明确，该方法能够成为使用在乳品等省令中记载的法定培养基(去氧胆酸盐琼脂培养基)的倾注平板培养法的替代。另外，相对于在倾注平板培养法中需要1天时间的天数，以本发明的方法从样本RNA固定到定量约6小时完成。

[0112] 实施例10通过定量RT-PCR和培养法进行的人粪便中的乳酸菌、肠球菌的分析[0113] 对人粪便中的乳酸杆菌属、肠球菌属的菌数，进行使用表1记载的引物的定量RT-PCR法和培养法的比较。采取48名健康正常成人的新鲜排泄粪便，以在实施例6中记载的方法处理粪便，以在实施例2中记载的方法进行RNA的固定、总RNA提取和定量RT-PCR法。将得到的总RNA中的1/2000～1/200000用于定量RT-PCR。此外，以同样的粪便稀释液，通过培养法(乳酸杆菌属：LBS培养基，肠球菌属：COBA培养基，均为37℃，48小时)进行CFU的定量。培养法按照常规方法进行，出现的菌落通过生物化学的性状试验(革兰氏染色，过氧化氢酶试验、API Strep)进行菌种的鉴定。以定量RT-PCR法得出的乳酸杆菌属的菌数值为通过合算使用sg-Laci-F/R(嗜酸乳杆菌亚群)、sg-Lsak-F/R(清酒乳杆菌亚群)、sg-Lcas-F/R(干酪乳杆菌亚群)、sg-Lrum-F/R(瘤胃乳杆菌亚群)、sg-Lreu-F/R(罗伊乳杆菌亚群)、sg-Lpla-F/R(植物乳杆菌亚群)、s-Lbre-F/R(短乳杆菌)、s-Lfru-F/R(食果糖乳杆菌)、LFer-1/2(发酵乳酸杆菌)的各引物的定量RT-PCR法得到的菌数而算出。

[0114] 该结果如在表4中所示，人粪便中的乳酸杆菌属、肠球菌属的菌数，以本发明的方法和以培养法几乎同等。另一方面，相比于培养法，两菌属均以本发明的方法的检测频率高。这推测是由于虽然属于作为本次标的的乳酸杆菌属、肠球菌属，但是存在有因使用的选择性培养基的选择性强于必须以上而不能增殖的菌，或者因使用的选择性培养基的选择性弱，因此大量存在其它的属于标的以外菌属的菌在培养基中生长，而无法检测标的菌属。通过以上所述，本发明的方法不仅可能够得到和培养法同等的菌数，而且也显示能够检测、定量即使以培养法至今也不能检测的菌。此外，相对于以培养法进行包括菌种鉴定在内的全部操作需要7天时间，以本发明的方法以约20小时完成全部操作。

[0115] [表4]

[0116]

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