首页 / 专利库 / 人工智能 / 恐怖谷 / 使用纳米粒子解毒

使用纳米粒子解毒

阅读:782发布:2020-05-11

专利汇可以提供使用纳米粒子解毒专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及受试者的毒素 治疗 。所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性。本发明提供尤其使用有效量的 纳米粒子 降低或中和受试者体内的毒素作用的方法、组合和药物组合物,所述纳米粒子包含内部核心,包含非细胞材料;和外表面,包含来源于源细胞的细胞膜。示范性毒素包括乙酰胆 碱 酯酶(AChE) 抑制剂 ,如有机 磷酸 酯中毒。,下面是使用纳米粒子解毒专利的具体信息内容。

1.一种用于降低或中和受试者体内的毒素作用的方法,所述方法包含向有需要的受试者或所述受试者的细胞给予有效量的纳米粒子,所述纳米粒子包含a)内部核心,包含非细胞材料,和b)外表面,包含来源于源细胞的细胞膜,
其中所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性,以及
1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或
2)所述毒素是乙酰胆酯酶(AchE)抑制剂,并且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述受试者是哺乳动物
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述哺乳动物是人类。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述哺乳动物是非人类哺乳动物。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,所述方法用于降低受试者体内的毒素作用。
6.根据权利要求1到4中任一项所述的方法,所述方法用于中和受试者体内的毒素作用。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的方法,其中所述内部核心包含聚合粒子核心。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述聚合粒子核心包含光学位移特性。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述聚合粒子核心包含金属。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述金属是金、量子点
11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法,其中所述内部核心包含选自由以下组成的组的生物相容性材料或合成材料:聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚离胺酸和聚谷酸。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法,其中所述内部核心支撑所述外表面。
13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法,其中所述细胞膜包含来源于源细胞的质膜,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞。
14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子另外包含可释放的荷重。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述可释放的荷重位于所述内部核心内或上,介于所述内部核心和所述外表面之间,或位于所述外表面内或上。
16.根据权利要求14或15所述的方法,其中所述可释放的荷重的释放由所述纳米粒子和所述受试者或所述受试者的细胞之间的接触或通过改变所述纳米粒子周围的物理参数来触发。
17.根据权利要求14到16中任一项所述的方法,其中所述可释放的荷重是治疗剂、预防剂、诊断或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述治疗剂或预防剂是降低或中和所述受试者体内的所述毒素作用的试剂
19.根据权利要求17所述的方法,其中所述分离剂是促进从所述受试者分离和去除所述毒素的磁性材料。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述磁性材料包含氧化铁。
21.根据权利要求14到20中任一项所述的方法,其中所述可释放的荷重是金属粒子、聚合粒子、树枝状粒子或无机粒子。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子的直径是约10nm到约
10μm。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子大体上不含所述源细胞的组分,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞;或心脏细胞,细胞膜来源于这些细胞。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述源细胞是红血球并且所述纳米粒子大体上不含血红蛋白。
25.根据权利要求1到24中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子大体上保持来源于源细胞的细胞膜或来源于源细胞的细胞膜的组分的天然结构完整性或活性。
26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子是生物相容或生物可降解的。
27.根据权利要求1所述的方法,其中所述纳米粒子的所述内部核心包含PLGA并且所述纳米粒子的所述外表面包含来源于红血球的质膜。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述纳米粒子在体内血液循环中的半衰期是PEG涂布的相当纳米粒子的半衰期的至少约2-5倍,或在体内血液循环中的半衰期是至少约1到约40小时。
29.根据权利要求1到28中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子的所述外表面另外包含合成膜。
30.根据权利要求1到29中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子大体上不含针对所述受试者的免疫原性。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述细胞膜来源于源细胞,例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞,来自相同物种的受试者。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述受试者是人类并且所述细胞膜来源于人类源细胞。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述细胞膜来源于打算治疗的人类的源细胞。
34.根据权利要求1到33中任一项所述的方法,其中所述毒素经相同机制结合于所述目标细胞和所述源细胞。
35.根据权利要求1到33中任一项所述的方法,其中所述毒素经不同机制结合于所述目标细胞和所述源细胞。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的方法,其中所述毒素通过结合到所述目标细胞的所述质膜上的蛋白质结合于所述目标细胞。
37.根据权利要求1到36中任一项所述的方法,其中所述毒素通过结合到所述源细胞的所述质膜上的蛋白质结合于所述源细胞。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的方法,其中所述目标细胞是主要来源于内胚层的细胞。
39.根据权利要求38所述的方法,其中所述目标细胞是外分泌上皮细胞或激素分泌细胞。
40.根据权利要求1到37中任一项所述的方法,其中所述目标细胞是主要来源于外胚层的细胞。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述目标细胞是化型上皮细胞、湿润复层屏障上皮细胞,或神经元。
42.根据权利要求41所述的方法,其中所述神经元选自由以下组成的组:感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支撑细胞、中枢神经系统神经元、中枢神经系统神经胶质细胞和晶状体细胞
43.根据权利要求1到37中任一项所述的方法,其中所述目标细胞是主要来源于中胚层的细胞。
44.根据权利要求43所述的方法,其中所述目标细胞是代谢和存储细胞、屏障功能细胞、胞外基质细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、生殖细胞、看护细胞或间质细胞。
45.根据权利要求1到44中任一项所述的方法,其中所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞。
46.根据权利要求45所述的方法,其中所述源细胞是血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞或肌肉细胞。
47.根据权利要求46所述的方法,其中所述血细胞是红血球、白血球、血小板或巨噬细胞。
48.根据权利要求46所述的方法,其中所述目标细胞是神经元细胞和/或肌肉细胞,并且所述源细胞是血细胞。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述血细胞是红血球、白血球、血小板或巨噬细胞。
50.根据权利要求1到49中任一项所述的方法,其中所述毒素是AchE抑制剂。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞和心脏细胞。
52.根据权利要求51所述的方法,其中所述源细胞是血细胞。
53.根据权利要求52所述的方法,其中所述血细胞是红血球、白血球、血小板或巨噬细胞。
54.根据权利要求1到53中任一项所述的方法,其中所述毒素结合于所述目标细胞的所述质膜上的乙酰胆碱酯酶(AchE)和所述源细胞的所述质膜上的AchE。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述毒素是AchE抑制剂。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述毒素是可逆AchE抑制剂。
57.根据权利要求55所述的方法,其中所述毒素是不可逆AchE抑制剂。
58.根据权利要求55所述的方法,其中所述毒素是有机磷酸酯。
59.根据权利要求58所述的方法,其中所述有机磷酸酯用作神经剂、杀虫剂、杀昆虫剂或除草剂
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述神经剂是梭曼(soman)、沙林(sarin)、塔崩(tabun)或VX。
61.根据权利要求59所述的方法,其中所述杀昆虫剂是拉松(malathion)、巴拉松(parathion)、二嗪磷(diazinon)、芬杀松(fenthion)、二氯松(dichlorvos)、陶斯松(chlorpyrifos)、爱杀松(ethion)或美曲磷酯(metrifonate)。
62.根据权利要求59所述的方法,其中所述除草剂是脱叶磷(tribufos)或脱叶亚磷(merphos)。
63.根据权利要求1到62中任一项所述的方法,其中所述受试者经吸入、吸收或摄入暴露于所述毒素。
64.根据权利要求1到63中任一项所述的方法,其中所述受试者作为战争、恐怖袭击、自杀企图或事故的部分暴露于所述毒素。
65.根据权利要求1到64中任一项所述的方法,其另外包含向所述受试者给予另一活性成分。
66.根据权利要求65所述的方法,其中所述另一活性成分用于降低或中和所述受试者体内的所述毒素作用。
67.根据权利要求66所述的方法,其中所述毒素是有机磷酸酯并且所述另一活性成分是保护AChE免于所述有机磷酸酯、抗胆碱激导剂、酶生物清除剂或III类抗心律不齐剂抑制的试剂。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述保护AChE免于所述有机磷酸酯抑制的试剂是氨基甲酸酯。
69.根据权利要求67所述的方法,其中所述抗胆碱激导剂是阿托品(atropine)、解磷定(pralidoxime)和/或吡啶鎓肟(例如双磷定(trimedoxime)或双复磷(obidoxime))。
70.根据权利要求67所述的方法,其中所述酶生物清除剂是胆碱酯酶。
71.根据权利要求70所述的方法,其中所述胆碱酯酶是人类血清BChE(HuBChE)。
72.根据权利要求1到71中任一项所述的方法,其另外包含向所述受试者给予药学上可接受的载剂或赋形剂。
73.根据权利要求1到72中任一项所述的方法,其中所述纳米粒子经药剂传递系统给予。
74.根据权利要求1到73中任一项所述的方法,其另外包含评定所述纳米粒子和/或所述另一活性成分降低或中和所述受试者体内的所述毒素作用的功效。
75.根据权利要求1到74中任一项所述的方法,其中单独或与另一活性成分组合的所述纳米粒子通过经口、肠胃外、直肠、经鼻、局部或眼途径或通过吸入给予。
76.根据权利要求75所述的方法,其中所述肠胃外给予是通过静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或皮下途径。
77.一种有效量的纳米粒子的用途,其用于制造降低或中和受试者体内的毒素作用的药剂,其中所述纳米粒子包含:
a)内部核心,包含非细胞材料,以及
b)外表面,包含来源于源细胞的细胞膜,
所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性,以及
1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或
2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。
78.一种用于降低或中和受试者体内的毒素作用的组合,所述组合包含有效量的纳米粒子和有效量的第二预防性或治疗性试剂用于降低或中和受试者体内的毒素作用,其中所述纳米粒子包含:
a)内部核心,包含非细胞材料,以及
b)外表面,包含来源于源细胞的细胞膜,
所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性,以及
1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或
2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。
79.根据权利要求78所述的组合,其中所述毒素是有机磷酸酯并且所述第二预防性或治疗性试剂是保护AChE免于所述有机磷酸酯、抗胆碱激导剂、酶生物清除剂或III类抗心律不齐剂抑制的试剂。
80.一种药物组合物,包含与至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂掺合的根据权利要求78或79所述的组合。
81.一种降低或中和受试者体内的毒素作用的方法,所述方法包含向有需要的受试者或所述受试者的细胞给予有效量的根据权利要求78或79所述的组合或根据权利要求80所述的药物组合物。
82.根据权利要求1到50中任一项所述的方法,其中所述毒素是AchE抑制剂,并且所述目标细胞包含AchE,例如神经元细胞和/或肌肉细胞。
83.根据权利要求82所述的方法,其中所述神经元细胞是运动神经元或感觉神经元。
84.根据权利要求82或83所述的方法,其中所述目标细胞是以下的部分:神经肌肉接头;胆碱激导性突触,例如胆碱激导性脑突触;中枢神经组织;周围神经组织;运动纤维;感觉纤维;运动和感觉纤维;胆碱激导性纤维或非胆碱激导性纤维。

说明书全文

使用纳米粒子解毒

[0001] 关于联邦政府资助的研究的声明
[0002] 本发明在国防威胁降低局联合化学与生物防御科学与技术办公室(the Defense Threat Reduction Agency Joint Science and Technology Office for Chemical and 
Biological Defense)根据拨款编号HDTRA1-14-1-0064和美国国家卫生研究院的国立糖尿
病消化与肾病研究所(the National Institute of Diabetes and Digestive and 
Kidney Diseases of the National Institutes of Health)根据拨款编号R01DK095168
授予的政府支持下进行。美国政府依据这一拨款对本发明具有一定权利。
[0003] 相关申请的交叉引用
[0004] 本申请要求2015年4月29日提交的美国临时申请第62/154,307号的优先权,其全部内容以引用的方式并入本文中。

技术领域

[0005] 本发明涉及受试者体内的毒素的治疗。所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性。本发明提供尤其使用有效量的纳米粒子降低或
中和受试者体内的毒素作用的方法、组合和药物组合物,所述纳米粒子包含内部核心,包含非细胞材料;和外表面,包含来源于源细胞的细胞膜。示范性毒素包括乙酰胆酯酶(AChE)抑制剂,如有机磷酸酯中毒。

背景技术

[0006] 有机磷酸酯中毒是由暴露于有机磷化合物(OP)引起,这通过将AChE上的丝酸羟基残基磷酸化来不可逆地不活化乙酰胆碱酯酶(AChE)并且导致乙酰胆碱(ACh)在身体里积
聚。这类积聚扰乱胆碱激导性突触传播并且能够导致多种神经毒性作用,包括严重案例中
的死亡。OPs是全世界的一种最常见的中毒起因,并且通常用于自杀企图中。估计全球每年有750,000到3,000,000OP中毒案例,其中每年有几十万例死亡案例(1,2)。因为OP对人类的强毒性,所以许多OP应用于化学战中,用作多种神经试剂中的主要成分,所述多种神经试剂包括沙林(sarin)、塔崩(tabun)、梭曼(soman)以及VX。通常,这些神经试剂在暴露1-10分钟内发挥作用并且能够在15-30分钟内引起急性致死(3)。与容易制造相结合,高度毒性OP对
军事和民用群体具有极大威胁(4)。OP中毒的有效治疗对公众健康状况具有重要价值。
[0007] 难以从身体去除OP,因为它们能够容易地通过包括吸入、摄入和真皮吸收等数种途径进入循环。OP中毒的现行解毒剂由以下组成:用氨基甲酸酯预处理来保护AChE免于被
OP化合物抑制并且用抗胆碱激导性药物(5)进行暴露后处理,这用来抵消过量ACh的作用。
阿托品是与解磷定或用于AChE再活化的其它吡啶鎓肟(如双磷定(trimedoxime)和双复磷
(obidoxime))结合的最广泛使用的针对OP中毒的解毒剂(6)。然而,这些处理引起严重副作用并且可能难以给予。最近的统合分析指示使用“-肟”看起来没有益处并且可能有害(7,
8)。另外,可能难以实现足够程度的阿托品处理法(9),因为需要大剂量的蕈毒碱拮抗剂来阻断AChE不活化之后的过度积聚的周围ACh。已经对如人类血清丁酰胆碱酯酶(BChE)和人
磷酶1(PON1)的酶生物清除剂进行研究,作为在OP能够到达它们的生理学目标之前反
应和解OP的治疗选择(10-12)。然而,这些重组蛋白的大规模产生在其转译中仍有障碍
(13)。OP中毒的临床治疗可能因此受益于替代策略,所述替代策略能够有效去活化血流中
的化合物。
[0008] 需要用于降低或中和受试者体内例如有机磷酸酯中毒的毒素作用的新方法和组合物。本公开阐述所属领域中的这种需要和相关需要。

发明内容

[0009] 一方面,本发明提供用于降低或中和受试者体内的毒素作用的方法,所述方法包含向有需要的受试者或所述受试者的细胞给予有效量的纳米粒子,所述纳米粒子包含a)包
含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,其中所述毒素通过
结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性,并且1)所述源细胞
和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并
且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。
[0010] 另一方面,本发明是针对有效量的纳米粒子用于制造降低或中和受试者体内的毒素作用的药剂的用途,其中所述纳米粒子包含:a)包含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者
体内至少部分实现其毒性,并且1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或
2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞和心脏细胞。
[0011] 另一方面,本发明提供用于降低或中和受试者体内的毒素作用的组合,所述组合包含有效量的纳米粒子和用于降低或中和所述受试者体内的毒素作用的有效量的第二预
防剂或治疗剂,其中所述纳米粒子包含:a)包含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞至少部分实现其在所
述受试者体内的毒性,并且1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或2)所
述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞和心脏细胞。本发明还提供包含所述组合的药物组合物和使用所述组合或包含所述组合的所述药物组合物的方法。
[0012] 一些方面,本公开涉及2013年3月14日提交的美国申请第13/827,906号、2012年5月24日提交的国际申请第PCT/US2012/039411号以及公开为WO 2013/052167A2和2011年6
月2日提交的美国临时申请第61/492,626号。上述申请的全部内容以引入的方式并入。
附图说明
[0013] 图1.RBC-NP作为用于治疗OP中毒的抗OP生物清除剂的示意图。没有治疗的情况下(左),作为模型OP的二氯松(DDVP)不可逆地结合乙酰胆碱酯酶(AChE),防止乙酰胆碱(ACh)分解成胆碱和乙酸根。当引入RBC-NP时(右),它们清除游离DDVP分子,保持内源性AChE执行分解Ach的功能的能
[0014] 图2A-2F.RBC-NP和RBC-NP/DDVP复合物的体外表征。(2A)显示RBC重像和RBC-NP的西方墨点法在抗AChE染色之后具有相似的墨点图案。(2B)显示RBC重像和RBC-NP的西方墨
点条带强度的定量含有等效量的AChE,指出RBC-NP制备期间膜结合的AchE几乎不损失。
(2C)由等效膜含量制备的显示RBC-NP和RBC重像的AChE活性测试具有相似AChE活性。(2D)
TEM图像证实RBC-NP/DDVP复合物的核/壳结构。比例尺=100nm。RBC-NP和RBC-NP/DDVP复合物的(2E)尺寸和(2F)表面ζ电位。全部误差条表示平均值的标准误差。
[0015] 图3A-3E.RBC-NP对DDVP的体外中和。(3A)通过滴定反应混合物中的DDVP的浓度来分析不同量的RBC-NP的DDVP去除。(3B)通过用不同浓度的RBC-NP培育DDVP持续30分钟来研
究DDVP吸收和去除的动力学。(3C)通过用不同纳米调配物(PEG-NP、PEG脂质体和RBC-NP)培育DDVP持续30分钟来分析对应纳米调配物的DDVP吸收和去除。(3D)在不同浓度的RBC-NP存
在下,用不同含量的DDVP培育30分钟之后的RBC重影AChE活性。较高RBC-NP含量赋予较高体外抗OP作用。(3E)在不同纳米调配物(PEG-NP、PEG脂质体和RBC-NP)存在下,在与DDVP一起培育30分钟之后的RBC重影AChE活性。与RBC-NP共同孵育导致RBC重像的最高AChE活性保
留。全部误差条表示平均值的标准误差。
[0016] 图4A-4D.RBC-NP对DDVP的体内中和。(4A)小鼠经16天的存活率曲线和(4B)小鼠在紧接在静脉内注射致死剂量(10mg/kg)的DDVP之后,静脉内给予200mg/kg RBC-NP或PEG-NP
之后的相对RBC AChE活性(n=10)。(4C)小鼠经16天的存活率曲线和(4D)小鼠在紧接在经
口给予致死剂量(150mg/kg)的DDVP之后,给予200mg/kg RBC-NP或PEG-NP之后的相对RBC 
AChE活性(n=10)。全部误差条表示平均值的标准误差。
[0017] 图5A-5D.RBC-NP进行OP解毒之后,RBC AChE活性恢复。(5A)小鼠用DDVP(10mg/kg)静脉内攻击并且用RBC-NP(200mg/kg)立即处理之后,经4天跨度恢复的相对RBC AChE活性
(n=10)。(5B)小鼠用DDVP(150mg/kg)经口攻击并且用RBC-NP(200mg/kg)立即处理之后,经
4天跨度恢复的相对RBC AChE活性(n=10)。(5C)静脉内注射24小时之后,RBC-NP/DDVP复合物的生物分布。(5D)苏木精和曙红(H&E)染色的肝脏组织结构显示在RBC-NP/DDVP复合物注
射之后的第3天(顶部)和第7天(底部)没有组织损伤。每个图像代表五个检验区段。比例尺
=150μm。全部误差条表示平均值的标准误差。

具体实施方式

[0018] 除非另外指示,否则本发明的实践将采用纳米技术、纳米工程改造、分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、免疫学和药理学的常规技术,这些在所属领域的技术范围内。这类技术在文献中充分解释,如《分子克隆:实验指南第2版
(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.)》(萨布鲁克(Sambrook)等人,1989);
《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.盖特(M.J.Gait)编,1984)《;动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.弗瑞旭尼(R.I.Freshney)编,1987);《酶学方法
(Methods in Enzymology)》(学术出版公司(Academic Press,Inc.));《最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.奥斯贝(F.M.Ausubel)等
人编,1987,和定期更新);《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(穆利斯(Mullis)等人编,1994);以及雷明顿(Remington)《, 药学科学与实践第20版(The Science and Practice of Pharmacy,20th ed.)》,(利平科特(Lippincott),威廉姆斯和威尔金斯(Williams&Wilkins)2003)。
[0019] 除非另外定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。本文中所提到的所有专利、申请、公开的申请和其它公开案都以其全文引用的方式并入本文中。如果这一部分中阐述的定义与以引用的方式并
入本文中的专利、申请、公开的申请和其它公开案中阐述的定义相反或不一致,那么这一部分中阐述的定义优先于以引用的方式并入本文中的定义。
[0020] A.定义
[0021] 为了促进理解本发明,如本文所用的多个术语和缩写如下定义在下文中:
[0022] 在介绍本发明的要素或其优选实施例时,冠词“一(a/an)”和“所述(the/said)”打算意指存在所述要素中的一个或多个。术语“包括(comprising)”、“包括(including)”和“具有”打算是包括性的并且意味着可能存在除了所列元件之外的额外元件。
[0023] 术语“和/或”在用于两个或更多个物品的列表中时,意思是所列物品中的任一个可以单独或与所列物品中的任何一个或多个组合采用。举例来说,表述“A和/或B”打算意指A和B中的任一个或两个,即单独的A、单独的B或组合的A和B。表述“A、B和/或C”打算意指单独的A、单独的B、单独的C、组合的A和B、组合的A和C、组合的B和C或组合的A、B和C。
[0024] 细胞膜:如本文所用的术语“细胞膜”指的是细胞或出现的病毒粒子内或周围的用作选择性屏障的生物膜封闭或分隔结构。细胞膜选择性渗透离子和有机分子并且控制物质移动进入和离开细胞。细胞膜包含磷脂单层或双层,并且任选地包含相关蛋白质水化
合物。如本文所用,细胞膜指的是从细胞或细胞器的天然存在的生物学膜获得的膜,或由其产生的膜。如本文所用,术语“天然存在”指的是自然界中存在的。如本文所用,术语“由此衍生”指的是天然膜的任何随后修饰,如分离细胞膜、形成膜的部分或片段、从获自细胞或细胞器的膜去除和/或向其中添加特定组分,如脂质、蛋白质或碳水化合物。膜可以通过任何适合方法来源于天然存在的膜。举例来说,膜可以从细胞或病毒制备或分离,并且制备或分离的膜可以与其它物质或材料组合形成衍生的膜。在另一实例中,细胞或病毒可以重组方
式工程改造产生体内并入到其膜中的“非天然”物质,并且细胞或病毒膜可以从细胞或病毒制备或分离形成衍生的膜。
[0025] 在多个实施例中,覆盖单层或多层纳米粒子中的任一个的细胞膜可以用如胆固醇、游离脂肪酸和磷脂等其它脂质组分进一步修饰成饱和或不饱和,还可以包括内源性或
添加蛋白质和碳水化合物,如细胞表面抗原。在这类情况下,可以向膜壁添加过量的其它脂质组分,它们将脱落直到膜壁中的浓度达到平衡,所述平衡可能取决于纳米粒子环境。膜还可以包含可以提高或不提高纳米粒子活性的其它试剂。在其它实例中,如抗体和适体的官
能团可以添加到膜的外表面来提高如靶向癌细胞中存在的细胞表面表位的位点。纳米粒子
的膜还可以包含可以是生物可降解阳离子纳米粒子的粒子,包括(但不限于)金、和合成
纳米粒子。
[0026] 合成或人造膜:如本文所用,术语“合成膜”或“人造膜”指的是从有机材料,如聚合物和液体,以及无机材料制造的人工制成的膜。所属领域中众所周知多种合成膜。
[0027] 纳米粒子:如本文所用的术语“纳米粒子”指的是至少一个维度(例如高度、长度、宽度或直径)介于约1nm和约10μm之间的纳米结构、粒子、囊泡或其片段。对于全身用途,约50nM到约500nm,或100nm到250nm的平均直径可以是优选的。术语“纳米结构”包括但不必限于粒子和工程改造的特征。粒子和工程改造的特征可以具有例如规则或不规则形状。这类
粒子也称为纳米粒子。纳米粒子可以由有机材料或其它材料构成,并且可以替代地用多孔
性粒子实施。纳米粒子的层可以用单层的纳米粒子或具有纳米粒子结的层实施。在一些
实施例中,包含内部核心或由内部核心组成的纳米粒子由包含如本文中所论述的膜的外表
面覆盖。本发明涵盖目前已知和后续开发的任何可以用本文所述的膜包覆的纳米粒子。
[0028] 药学活性:如本文所用的术语“药学活性”指的是物质对活物质,并且具体来说对人体的细胞和组织有益的生物活性。“药学活性剂”或“药物”是药学上活性的物质并且“药学活性成分”(API)是药物中的药学活性物质。
[0029] 药学上可接受:如本文所用的术语“药学上可接受”意思是除了动物,并且更具体地说人类和/或非人类哺乳动物中使用安全的其它调配物以外,联邦监管机构或州政府批准或美国药典,其它公认药典中列出。
[0030] 药学上可接受的盐:如本文所用的术语“药学上可接受的盐”指的是本公开中的化合物的酸加成盐或碱加成盐,如多药物结合物。药学上可接受的盐是保留母纳米粒子或化合物活性并且不对所给予的受试者以及所给予的情境赋予任何有害或不适当作用的任何
盐。药学上可接受的盐可以来源于氨基酸,包括但不限于半胱氨酸。制造作为盐的化合物的方法是所属领域的技术人员已知(参看例如斯塔尔(Stahl)等人《,药物盐手册:特性、选择和用途(Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use)》,Wiley-
VCH;苏黎士的费尔拉格海尔维提卡化学学报(Verlag Helvetica Chimica Acta,Zurich),
2002;贝尔奇(Berge)等人《, 药物科学杂志(J Pharm.Sci.)》66:1,1977)。在一些实施例中,“药学上可接受的盐”打算意指本文呈现的纳米粒子或化合物的游离酸或碱的盐,它们无
毒、生物上可耐受或另外生物学上适于给予受试者。一般来说,参看贝尔奇(Berge)等人,
《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.)》,1977,66,1-19。优选的药学上可接受的盐是药理学有效并且适于与受试者的组织接触但没有过度毒性、刺激或过敏反应的那些。本文所述的纳米
粒子或化合物可以具有充分酸性基团、充分碱性基团、两种类型的官能团或每种类型中超
过一个,并且因此与许多无机或有机碱,和无机和有机酸反应,形成药学上可接受的盐。
[0031] 药学上可接受的盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、乙二酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、反丁烯二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1,4-二酸盐、己炔-1,6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、甲基磺酸盐、丙基磺酸盐、苯磺酸盐、二甲苯磺酸盐、-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、[γ]-羟基丁酸盐、乙醇酸盐、酒石酸盐以及扁桃酸盐。
[0032] 药学上可接受的载剂:如本文所用的术语“药学上可接受的载剂”指的是与纳米粒子或化合物,如多药物结合物一起给予的赋形剂、稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、助剂和/或媒剂。这类载剂可以是灭菌液体,如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,如花生油大豆油、矿物油、芝麻油等;聚乙二醇;丙三醇;丙二醇或其它合成溶剂。抗菌剂,如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯;抗氧化剂,如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;螯合剂,如乙二胺四乙酸;以及用于调整张力的试剂,如氯化钠或右旋糖也可以是载剂。制造组合物与载剂的组合的
方法为所属领域的技术人员已知。在一些实施例中,措辞“药学上可接受的载剂”打算包括任何和所有的与药物给药相容的溶剂、分散介质、涂料、等张剂以及吸收延迟剂等。这类介质和药剂用于药学活性物质的用途是所属领域中众所周知的。参看例如雷明顿
(Remington)《, 药学科学与实践第20版(The Science and Practice of Pharmacy.20"'
ed.)》(利平科特(Lippincott),威廉姆斯和威尔金斯(Williams&Wilkins)2003)。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容,否则考虑组合物中的这类用途。
[0033] 磷脂:如本文所用的术语“磷脂”指的是含有二甘油酯、磷酸基和简单有机分子,如胆碱的许多脂类中的任一个。磷脂的实例包括(但不限于)磷脂酸(Phosphatide acid/phosphatidate)(PA)、磷脂酰乙醇胺(脑磷脂)(PE)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)和磷酸肌醇,包括但不限于磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)和磷脂酰肌醇三磷酸酯(P1P3)。PC的其它实例包括如所属领域中定义的
DDPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DRPC和DEPC。
[0034] 治疗有效量:如本文所用,术语“治疗有效量”指的是当鉴于受试者的疾病或病况的种类和严重程度给予特定受试者时将具有期望治疗效果的那些量,例如将治愈、预防、抑制或至少部分停滞或部分预防目标疾病或病况的量。更具体实施例包括于下文的药物制剂和给药方法部分。在一些实施例中,术语“治疗有效量”或“有效量”指的是当单独或与额外治疗剂组合给予细胞、组织或受试者时有效预防或改善如溶血性疾病或病况等疾病或病况
或疾病或病况进展的治疗剂的量。治疗有效剂量另外指的是足以导致症状改善,例如治疗、治愈、预防或改善相关医学病况,或提高治疗、治愈、预防或改善这类病况的速率的治疗剂的量。当应用单独给予的个别活性成分时,治疗有效剂量仅指所述成分。当应用于组合时,治疗有效剂量指的是产生治疗效果的活性成分的组合量,无论是组合给予、依序给予还是
同时给予。
[0035] “治疗(Treating/treatment)”或“缓解”指的是其中目标是减缓(减轻)(如果没有治愈)目标病理性病况或病症或预防病况复发的治疗性处理。在接收治疗量的治疗剂之后,如果受试者展示特定疾病的一种或多种病征和症状可观测和/或可测量的降低或不存在,那么受试者被成功“治疗”。疾病病征或症状的减轻还可以被患者感觉到。如果患者经历稳定疾病,那么也认为患者被治疗。在一些实施例中,用治疗剂治疗有效导致患者在治疗之后
3个月,优选地6个月,更优选地一年,甚至更优选地治疗之后2年或更多年没有疾病。这些用于评定疾病的成功治疗和改良的参数容易通过具有所属领域的适当技能的医生熟悉的常
规程序测量。
[0036] 如本文所用,“预防性”治疗意思是指示延缓疾病、疾病症状或医学病况的发展、抑制可能出现的症状或降低产生或复发疾病或症状的险。“治愈性”治疗包括减轻现有疾病、症状或病况的严重程度的抑制现有疾病、症状或病况恶化。
[0037] 术语“组合”指的是一个单位剂型的固定组合,或用于组合给药的部分的试剂盒,其中纳米粒子或化合物和组合搭配物(例如如下文所解释的另一种药物,也称为“治疗剂”或“辅剂”)可以同时或在时间间隔内分别独立地给予,这些时间间隔允许组合搭配物显示合作,例如协同作用时尤其如此。如本文所用的术语“共同给药”或“组合给药”等打算涵盖向有需要的单个受试者(例如患者)给予所选组合搭配物,并且打算包括试剂并非必须通过相同给药途径或同时给予的治疗方案。如本文所用的术语“药物组合”意思是由混合或组合超过一种活性成分产生并且包括活性成分的固定和非固定组合的产物。术语“固定组合”意思是例如纳米粒子或化合物和组合搭配物等活性成分都以单个实体或剂量形式同时给予
患者。术语“非固定组合”意思是例如纳米粒子或化合物和组合搭配物等活性成分都作为独立实体不使用特定时间界限同时、并行或依序给予患者,其中这类给药在患者身体内提供
治疗有效水平的两种部分或化合物。非固定组合还应用于混合疗法,例如给予三种或更多
种活性成分。
[0038] 应理解,本文所述的本发明的各方面和实施例包括“组成为”和“基本上组成为”各方面和实施例。
[0039] 在本公开通篇,本发明的各种方面都可以用范围型式呈现。应理解,范围型式的描述仅仅是为了方便和简洁起见并且不应该被解释为是对本发明的范围的不可改变的限制。因此,对范围的描述应该认为已经具体地公开了所述范围内所有可能的子范围以及个别数
值。举例来说,如1到6的范围的描述应该认为是已经确切地公开了子范围,如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等,以及所述范围内的个别数值,例如1、2、3、4、5和6。不管范围的广度如何,这都适用。
[0040] 如本文所用,有需要的受试者指的是动物,非人类哺乳动物或人类。如本文所用,“动物”包括宠物、农畜、经济动物、体育动物和实验动物,如猫、狗、公牛、猪、驴、绵羊、羔羊、山羊、小鼠、兔、鸡、鸭、鹅、灵长类动物,包括猴和黑猩猩。
[0041] 在结合附图阅读以下说明书后,本发明的其它目标、优势和特征将变得显而易知。
[0042] B.降低或中和受试者的毒素作用的方法
[0043] 一方面,本发明提供用于降低或中和受试者体内的毒素作用的方法,所述方法包含向有需要的受试者或所述受试者的细胞给予有效量的纳米粒子,所述纳米粒子包含a)包
含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,其中所述毒素通过
结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者体内至少部分实现其毒性,并且1)所述源细胞
和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并
且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。在一些实施例中,毒素不是2013年3月14日提交的美国申请第13/827,
906号、2012年5月24日提交的国际申请第PCT/US2012/039411号以及公开为WO 2013/
052167A2和2011年6月2日提交的美国临时申请第61/492,626号中公开的毒素。
[0044] 本发明方法可以用于降低或中和任何适合受试者体内的毒素作用。在一些实施例中,受试者是哺乳动物。在一些实施例中,哺乳动物是人类。在其它实施例中,哺乳动物是非人类哺乳动物,包括宠物、农畜、经济动物、体育动物和实验动物,如猫、狗、马、牛、公牛、猪、驴、绵羊、羔羊、山羊、小鼠、兔、灵长类动物,包括猴和黑猩猩。
[0045] 在一些实施例中,本发明方法可以用于降低受试者的毒素作用。在其它实施例中,本发明方法可以用于中和受试者的毒素作用。本发明方法可以用于将受试者体内的毒素作用降低或中和到任何适合程度。举例来说,与相当未经治疗的受试者或未经治疗阶段的相
同受试者相比,本发明方法可以用于将受试者体内的毒素作用降低或中和至少10%、20%、
30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%或更多。
[0046] 本发明方法中所用的纳米粒子可以包含任何适合内部核心。举例来说,纳米粒子的内部核心可以包含聚合粒子核心、二氧化粒子核心或金属粒子核心,例如金粒子核心。
可以使用任何适合聚合粒子核心。在一些实施例中,聚合粒子核心可以包含光学位移特性。
在其它实施例中,聚合粒子核心可以包含金属,例如金、氧化量子点。在其它实施例中,纳米粒子的内部核心可以包含生物相容性材料或合成材料,如聚(乳酸-共-乙醇酸)
(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚离胺酸以及聚谷氨酸。在其它实施例中,纳米粒子的内部核心支撑外表面。
[0047] 本发明方法中所用的纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的细胞膜。举例来说,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的质膜或胞内膜。在一些实施例中,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的胞内膜,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞。在其它实施例中,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的质膜,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞。
[0048] 治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在本发明方法中所用的组合物中的任何适合位置中。举例来说,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米粒子中。在一些实施例中,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含于纳米粒子中的可释放的荷重中。纳米粒子可以包含任何适合位置处的可释放的荷重。举例来说,可释放的荷重可以位于所述内部核心内或上,介于所述内部核心和所述外表面之间,或位于所述外表面内或上。可释放的荷重的释放可以被任何适合机制触发。举例来说,可释放的荷重的释放可以被纳米粒子和受试者或受试者的细胞之间的接触触发,或者被纳米粒子周围的物理参数的
改变触发。纳米粒子可以包含任何适合类型的可释放的荷重。举例来说,可释放的荷重可以是金属粒子、聚合粒子、树枝状粒子或无机粒子。在一些实施例中,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含于本发明方法所用的组合物中,但在纳米粒子外部。在其它实施例中,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以从本发明方法中所用的组合物分别给予受试者。本发明方法中所用的组合物
和额外物质可以同时或依序给予受试者。
[0049] 本发明方法中所用的纳米粒子可以具有任何适合尺寸。举例来说,纳米粒子可以具有约10nm到约10μm的直径。在某些实施例中,纳米粒子的直径是约10nm、20nm、30nm、
40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、200nm、
300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm以及10μm,或约10nm到约10μm内的任何子范围,例如介于任何两个上述尺寸之间的任何范围。
[0050] 本发明方法中所用的纳米粒子可以具有任何适合形状,包括(但不限于)球形、正方形、矩形、三形、圆盘、立方体样形状、立方体、长方体(rectangular parallelepiped/cuboid)、圆锥体、圆柱、棱柱、角锥形、直立圆柱和其它规则或不规则形状。
[0051] 在一些实施例中,本发明方法中所用的纳米粒子大体上不含源细胞的组分,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞;或心脏细胞,细胞膜来源于这些细胞。举例来说,纳米粒子可以不含10%、20%、30%、
40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%源细胞的组分,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞或心脏细胞,细胞膜来源于这些细胞。
在一些实施例中,纳米粒子包含来源于红血球的质膜并且纳米粒子大体上不含血红蛋白。
举例来说,纳米粒子可以不含10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%血红蛋白。
[0052] 在一些实施例中,本发明方法中所用的纳米粒子大体上保持来源于源细胞的细胞膜或来源于源细胞的细胞膜的组分的天然结构完整性或活性,使得纳米粒子充当毒素的目
标细胞,例如神经元细胞的诱饵。举例来说,纳米粒子可以保留10%、20%、30%、40%、
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%、99%或100%天然结构完整性用于充当毒素的目标细胞,例如神经元细胞的诱饵。
[0053] 在一些实施例中,本发明方法中所用的纳米粒子是生物相容或生物可降解的。举例来说,纳米粒子的内部核心包含PLGA并且纳米粒子的外表面包含来源于源细胞的质膜,
所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞;或心脏细胞。
[0054] 本发明方法中所用的纳米粒子可以具有任何适合体内半衰期。举例来说,纳米粒子的体内血液循环半衰期可以是PEG涂布的相当纳米粒子的半衰期的至少约2-5倍,或体内
血液循环半衰期是至少约1到约40小时,例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35或
40小时。
[0055] 本发明方法中所用的纳米粒子的外表面可以进一步包含合成膜。在一些实施例中,本发明方法中所用的纳米粒子包含外表面包含细胞膜的纳米粒子与外表面包含合成膜
的纳米粒子的混合物。外表面包含合成膜的纳米粒子可以或可以不吸收或结合于毒素。在
一些实施例中,外表面包含细胞膜的纳米粒子和外表面包含合成膜的纳米粒子吸收或结合
于毒素。在其它实施例中,外表面包含细胞膜的纳米粒子吸收或结合于毒素,但外表面包含合成膜的纳米粒子不吸收或结合于毒素。
[0056] 本发明方法中所用的组合物可以包含任何适合比率的外表面包含细胞膜的纳米粒子和外表面包含合成膜的纳米粒子。在一些实施例中,本发明组合物可以包含至少约1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、
91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、99重量%或更多外表面包含细胞膜的纳米粒子。在其它实施例中,本发明组合物可以包含至少
约1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、
99重量%或更多外表面包含合成膜的纳米粒子。举例来说,本发明方法中所用的组合物可
以包含约1-10重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约90-99重量%外表面包含合成膜的
纳米粒子,约11-25重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约75-89重量%外表面包含合成
膜的纳米粒子,约50重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约50重量%外表面包含合成膜
的纳米粒子,约51-75重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约49-25重量%外表面包含合
成膜的纳米粒子,或约90-100重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约0-10重量%外表面
包含合成膜的纳米粒子。
[0057] 在一些实施例中,本发明方法中所用的纳米粒子大体上不含针对受试者,例如哺乳动物的免疫原性。举例来说,细胞膜可以来源于源细胞,例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞,来源于相同物种的哺乳动物。在另一实例中,哺乳动物是人类并且细胞膜来源于人类源细胞,例如人类红血球。在一些实施例中,细胞膜可以来源于打算治疗的哺乳动物的源细胞,例如红血球。举例来说,细胞膜可以来源于打算治疗的人类的人类源细胞,例如人类红血球。
[0058] 毒素可以通过任何机制结合于目标细胞和源细胞。在一些实施例中,毒素通过相同机制结合于目标细胞和源细胞。在其它实施例中,毒素通过不同机制结合于目标细胞和
源细胞。在其它实施例中,毒素可以通过结合到目标细胞的质膜上的蛋白质结合于目标细
胞。在其它实施例中,毒素可以通过结合到源细胞的质膜上的蛋白质结合于源细胞。
[0059] 本发明方法可以用于降低或中和靶向受试者的任何目标细胞的毒素作用。在一些实施例中,本发明方法可以用于降低或中和靶向主要来源于内胚层的目标细胞的毒素作
用,所述目标细胞例如外分泌上皮细胞或激素分泌细胞。在其它实施例中,本发明方法可以用于降低或中和靶向主要来源于外胚层的目标细胞的毒素作用,所述目标细胞例如角化型
上皮细胞、湿润复层屏障上皮细胞,或神经元。示范性神经元包括感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支撑细胞、中枢神经系统神经元、中枢神经系统神经胶质细胞和晶状体细胞。在其它实施例中,本发明方法可以用于降低或中和靶向主要来源于中胚
层的目标细胞的毒素作用,所述目标细胞例如代谢和存储细胞、屏障功能细胞、胞外基质细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、生殖细胞、看护细胞或间质细胞。在一些实施例中,本发明方法可以用于降低或中和神经毒素的作用。
[0060] 源细胞和目标细胞可以是两种不同类型的细胞。包含来源于任何适合源细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于本发明方法中。在一些实施例中,包含来源于血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞或心脏细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于本发明方法中。示范性血
细胞包括红血球、白血球、血小板和巨噬细胞。在一些实施例中,毒素靶向受试者的神经元细胞,并且包含来源于血细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于降低或中和受试者体内的毒素
作用。举例来说,包含来源于红血球、白血球、血小板或巨噬细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于降低或中和受试者体内靶向神经元细胞的毒素作用。
[0061] 本发明方法可以用于降低或中和受试者体内的任何适合毒素的作用,所述适合毒素是AchE抑制剂,例如可逆AchE抑制剂或不可逆AchE抑制剂。包含来源于任何适合源细胞
的细胞膜的纳米粒子可以用于本发明方法中。在一些实施例中,可以使用包含来源于血细
胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞和心脏细胞的细胞膜的纳米粒子。在一些实施例中,可以使用包含来源于血细胞,例如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞,的细胞膜的纳米粒子。
在一些实施例中,毒素结合于目标细胞的质膜上的乙酰胆碱酯酶(AchE),并且可以使用包
含来源于源细胞的质膜的细胞膜的纳米粒子。
[0062] 可以通过任何适合方法评定毒素是否抑制AchE。在一些实施例中,可以通过任何适合AchE活性分析法评定毒素是否抑制AchE。在一个实例中,AchE活性分析法是基于使用
替代底物乙酰硫代胆碱和5,5'-二硫基-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)的埃尔曼法(Ellman's 
method)。由于电子迁移到硫原子,反应导致产生黄色的5-硫基-2-硝基苯甲酸酯。参看例如埃尔曼G.L.(Ellman,G.L.);考特尼D.K.(Courtney,D.K.);安杜利森,V.(Andreas,V.);菲特史东R.M.(Featherstone,R.M.)《乙酰胆碱酯酶活性的新颖和快速比色测定(A new and 
rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity)》《.生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)》1961,7,88-95;以及普韩卡,M.(Pohanka,M.);君,D.
(Jun,D.);库卡,K.(Kuca,K.)用通过复活剂鉴别的方式改良用于有机磷酸酯的基于乙酰胆
碱酯酶的分析法(Inprovement of acetylcholinesterase-based assay for 
organophosphates in way of identification by reactivators).塔兰泰(Talanta)
2008,77,451-454。在另一实例中,AchE活性分析法使用吲哚乙酸酯作为底物。参看例如普韩卡(Pohanka)等人《, 国际科学分子杂志(Int.J.Mol.Sci.)》2011,12,2631-2640;doi:
10.3390/ijms12042631。在另一实例中,AchE活性分析法使用来自西格玛-奥德里奇公司
(西格玛-奥德里奇公司)的乙酰胆碱酯酶活性分析试剂盒,这是埃尔曼法的优化型式,其中AChE产生的硫代胆碱与5,5′-二硫基双(2-硝基苯甲酸)反应形成与存在的AChE活性成比例
的比色(412nm)产物。参看例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)目录号MAK119。
[0063] 本发明方法可以用于降低或中和受试者体内的任何适合毒素的作用,所述适合毒素是有机磷酸酯或有机磷酸酯毒物。有机磷酸酯中毒由暴露于有机磷酸酯(OP)产生,这引
起抑制乙酰胆碱酯酶(AchE),导致乙酰胆碱(Ach)在身体内积聚。在一些实施例中,有机磷酸酯(有时缩写成OP)或磷酸酯是磷酸酯的通用名称。在其它实施例中,“有机磷酸酯”指的是作用于酶AchE的杀虫剂或神经剂的群组。所述术语通常用于描述实际上任何含有有机磷
(V)的化合物,当用神经毒性化合物处理时尤其如此。许多所谓的有机磷酸酯含有C-P键。举例来说,沙林是甲氟膦酸O-异丙酯,其形式上来源于亚磷酸(HP(O)(OH)2),而非磷酸(P(O)(OH)3)。另外,作为次膦酸衍生物的许多化合物用作神经毒性有机磷酸酯。在其它实施例
中,有机磷酸酯具有以下结构特征:末端氧通过双键连接到磷,即磷酰基;两个亲脂性基团键结于磷;以及离去基团键结于磷,通常卤化物。在其它实施例中,有机磷酸盐具有下式I:
[0064]
[0065] 其中R1、R2和R3中的每一个独立地是烷基、芳基、亲脂性基团、亲水性基团和/或离去基团。示范性有机磷酸酯或有机磷酸酯毒物包括欧杀松(acephate)(Orthene)、丙硫特普(aspon)、甲基谷硫磷(Azinphos-Methyl)(Guthion)、卡巴呋喃(Carbofuran)(Furadan,F调配物)、三硫磷(Carbophenothion)(Trithion)、克芬松(Chlorfenvinphos)(Birlane)、陶斯松(Chlorpyrifos)(Dursban,Lorsban)、蝇毒磷(Coumaphos)(Co-Ral)、巴毒磷(crotoxyphos)(Ciodrin,Ciovap)、育畜磷(crufomate)(Ruelene)、内吸磷(Demeton)
(Systox)、二嗪磷(Diazinon)(Spectracide)、二氯松(dichlorvos)(DDVP,Vapona)、百治磷(dicrotophos)(Bidrin)、乐果(Dimethoate)(Cygon,De-Fend)、敌杀磷(dioxathion)
(Delnav)、二硫松(Disulfoton)(Di-Syston)、EPN、爱杀松(Ethion)、灭克磷(Ethoprop)
(Mocap)、氨磺磷(famphur)、克线磷(fenamiphos)(Nemacur)、杀螟硫磷(Fenitrothion)
(Sumithion)丰索磷(fensulfothion)(Dasanit)芬杀松(fenthion)(Baytex,Tiguvon)、地
虫磷(Fonofos)(Dyfonate)、异柳磷(isofenfos)(Oftanol,Amaze)、马拉硫磷(Malathion)
(Cythion)、多灭磷(Methamidophos)(Monitor)、杀扑磷(methidathion)(Supracide)、甲基巴拉松(methyl parathion)、速灭磷(Mevinphos)(Phosdrin)、久效磷(Monocrotophos)、二溴磷(Naled)(Dibrom)、神经剂(沙林、梭曼、梭曼、VX)、甲基亚砜磷(oxydemeton-methyl)(Meta systox-R)、巴拉松(Parathion)(Niran,Phoskil)、甲拌磷(Phorate)(Thimet)、伏杀磷(phosalone)(Zolonc)、亚胺硫磷(phosmet)(Irnidan,Prolate)、磷胺(Phosphamidon)
(Dimecron)、双硫磷(temephos)(Abate)、TEPP、特丁磷(Terbufos)(Counter)、杀虫畏
(tetrachlorvinphos)(Rabon,Ravap)以及三氯磷酸酯(Trichlorfon)(Dylox,Neguvon)。本
发明方法可以用于降低或中和受试者体内的上述有机磷酸酯或有机磷酸酯毒物的作用。
[0066] 本发明方法还可以用于降低或中和用作神经剂、杀虫剂、杀昆虫剂或除草剂的有机磷酸酯的作用。示范性神经剂包括梭曼、沙林、塔崩和VX。示范性杀虫剂包括马拉硫磷、巴拉松、二嗪磷、芬杀松、二氯松、陶斯松、爱杀松和三氯磷酸酯(美曲磷酯)。示范性除草剂包括脱叶磷和脱叶亚磷。
[0067] 在一些实施例中,本发明方法还可以用于通过抑制例如神经元细胞和/或肌肉细胞等目标细胞中或上的AchE来降低或中和是AchE抑制剂,例如有机磷酸酯的毒素作用,并
且至少部分实现其在受试者体内的毒性。示范性神经元细胞包括运动神经元和感觉神经
元。目标细胞可以位于受试者的任何适合部位。举例来说,目标细胞可以是神经肌肉接头;
胆碱激导性突触,例如胆碱激导性脑突触;中枢神经组织;周围神经组织;运动纤维;感觉纤维;运动和感觉纤维;胆碱激导性纤维或非胆碱激导性纤维的部分。
[0068] 本发明方法可以用于通过任何途径或机制,如吸入、吸收或摄入来降低或中和暴露于毒素的受试者体内的毒素作用。本发明方法还可以用于降低或中和作为战争、恐怖袭
击、自杀企图或事故的部分暴露于毒素的受试者体内的毒素作用。
[0069] 本发明方法可以另外包含给予受试者另一活性成分。另一活性成分可以用于降低或中和受试者体内的毒素作用。在一些实施例中,毒素是有机磷酸盐并且另一活性成分是
保护AChE免于有机磷酸酯、抗胆碱激导剂、酶生物清除剂或III类抗心律不齐剂抑制的试
剂。在一个实例中,保护AChE免于有机磷酸酯抑制的试剂是氨基甲酸酯。在另一实例中,抗胆碱激导剂是阿托品(atropine)、解磷定(pralidoxime)和/或吡啶鎓肟(例如双磷定
(trimedoxime)或双复磷(obidoxime))。在另一实例中,酶生物清除剂是胆碱酯酶,例如人类血清BChE(HuBChE)。
[0070] 在一些实施例中,本发明方法可以进一步包含给予受试者药学上可接受的载剂或赋形剂。
[0071] 本发明方法中所用的组合物可以使用任何适合传递机制或技术给予。在一些实施例中,组合物可以单独给予。在其它实施例中,组合物可以与药学上可接受的载剂或赋形剂一起给予。在其它实施例中,组合物可以通过药剂传递系统或医疗装置给予。可以使用任何适合药剂传递系统或医疗装置。举例来说,药剂传递系统或医疗装置可以是植入物,例如骨骼手术期间或之后放置的植入物、导液管或持续释放药物传递系统。
[0072] 在一些实施例中,本发明方法可以另外包含评定纳米粒子和/或另一活性成分降低或中和受试者体内的毒素作用的功效。纳米粒子和/或另一活性成分降低或中和毒素作
用的功效可以通过任何适合方法,例如体外和/或体内测试来评定。在一个实例中,纳米粒子和/或另一活性成分降低或中和毒素作用的功效可以通过评定例如有机磷酸酯等毒素和
包覆有细胞膜的纳米粒子,例如包覆有来源于红血球的细胞膜的纳米粒子之间的结合来评
定。毒素与纳米粒子之间的结合可以通过任何适合方法,例如通过评定结合于纳米粒子的
毒素的量或通过评定结合于毒素的纳米粒子的细胞膜上的受体或酶的活性来评定。在另一
实例中,纳米粒子和/或另一活性成分降低或中和毒素作用的功效可以通过评定纳米粒子
从液体去除的毒素来评定。在另一实例中,纳米粒子和/或另一活性成分降低或中和毒素作用的功效可以通过评定实验动物暴露于致死剂量的毒素并且用纳米粒子和/或另一活性成
分处理时实验动物的存活率来评定。在另一实例中,纳米粒子和/或其它活性成分降低或中和毒素作用的功效可以通过评定或监测结合于所治疗受试者体内的毒素的受体或酶的活
性,例如所治疗受试者体内的RBC AChE活性来评定。
[0073] 本发明方法中所用的组合物可以通过任何适合给药途径给予受试者。在一些实施例中,单独或与其它活性成分组合的本发明方法中所用的纳米粒子可以经口、肠胃外、直
肠、经鼻、局部或眼部引导,或通过吸入给予。示范性肠胃外给予可以通过静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或皮下途径。
[0074] 另一方面,本发明是针对有效量的纳米粒子用于制造降低或中和受试者体内的毒素作用的药剂的用途,其中所述纳米粒子包含:a)包含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞在所述受试者
体内至少部分实现其毒性,并且1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或
2)所述毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:
血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。
[0075] C.降低或中和受试者的毒素作用的组合
[0076] 另一方面,本发明是针对用于降低或中和受试者体内的毒素作用的组合,所述组合包含有效量的纳米粒子和用于降低或中和受试者体内的毒素作用的有效量的第二预防
剂或治疗剂,其中所述纳米粒子包含:a)包含非细胞材料的内部核心,和b)包含来源于源细胞的细胞膜的外表面,所述毒素通过结合到所述受试者的目标细胞至少部分实现其在所述
受试者体内的毒性,并且1)所述源细胞和所述目标细胞是两种不同类型的细胞;或2)所述
毒素是乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂,并且优选地,所述源细胞选自由以下组成的组:血细
胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞、心脏细胞和肌肉细胞。在一些实施例中,毒素不是
2013年3月14日提交的美国申请第13/827,906号、2012年5月24日提交的国际申请第PCT/
US2012/039411号以及公开为WO2013/052167A2和2011年6月2日提交的美国临时申请第61/
492,626号中公开的毒素。
[0077] 本发明组合可以在任何适合调配物中制备、储存和/或使用。在一些实施例中,本发明提供一种药物组合物,其包含上述组合与至少一种医药学上可接受的载剂或赋形剂的
掺合物。在其它实施例中,本发明提供用于降低或中和受试者体内的毒素作用的方法,所述方法包含向有需要的受试者或所述受试者的细胞给予有效量的上述组合或药物组合物。
[0078] 上述组合或药物组合物可以用于降低或中和受试者体内的毒素作用。在一些实施例中,受试者是哺乳动物。在一些实施例中,哺乳动物是人类。在其它实施例中,哺乳动物是非人类哺乳动物,包括宠物、农畜、经济动物、体育动物和实验动物,如猫、狗、马、牛、公牛、猪、驴、绵羊、羔羊、山羊、小鼠、兔、灵长类动物,包括猴和黑猩猩。
[0079] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以用于降低受试者体内的毒素作用。在其它实施例中,上述组合或药物组合物可以用于中和受试者体内的毒素作用。上述组合
或药物组合物可以用于将受试者体内的毒素作用降低或中和到任何适合程度。举例来说,
与相当的未经治疗的受试者或未经治疗阶段的相同受试者相比,上述组合或药物组合物可
以用于将受试者体内的毒素作用降低或中和至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、
80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
[0080] 上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子可以包含任何适合内部核心。举例来说,纳米粒子的内部核心可以包含聚合粒子核心、二氧化硅粒子核心或金属粒子核心,例如金粒子核心。可以使用任何适合聚合粒子核心。在一些实施例中,聚合粒子核心可以包含光学位移特性。在其它实施例中,聚合粒子核心可以包含金属,例如金、氧化铁或量子点。在其它实施例中,纳米粒子的内部核心可以包含生物相容性材料或合成材料,如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、聚离胺酸以及聚谷氨酸。在其它实施例中,纳米粒子的内部核心支撑外表面。
[0081] 上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的细胞膜。举例来说,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的质膜或胞内膜。在一些实施例中,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的胞内膜,所述源细胞例如血细胞,如红血
球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞。在其它实施例中,纳米粒子可以包含来源于任何适合源细胞的质膜,所述源细胞例如血细胞,如红血
球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞。
[0082] 治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在上述组合或药物组合物中的任何适合位置。举例来说,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含在纳米粒子中。在一些实施例中,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含于纳米粒子中的可释放的荷重中。纳米粒子可以包含任何适合位置处的可释放的荷重。举例来说,可释放的荷重可以位于所述内部核心内或上,介于所述内部核心和所述外表面之间,或位于所述外表面内或上。可释放的荷重的释放可以被任何适合机制触发。举例来说,可释放的荷重的释放可以被纳米
粒子和受试者或受试者的细胞之间的接触触发,或者被纳米粒子周围的物理参数的改变触
发。纳米粒子可以包含任何适合类型的可释放的荷重。举例来说,可释放的荷重可以是金属粒子、聚合粒子、树枝状粒子或无机粒子。在一些实施例中,治疗剂、预防剂、诊断剂或标记剂、预后剂、分离剂、监测剂或其组合可以包含于上述组合或药物组合物中所用的组合物
中,但在纳米粒子外部。
[0083] 上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子可以具有任何适合尺寸。举例来说,纳米粒子可以具有约10nm到约10μm的直径。在某些实施例中,纳米粒子的直径是约10nm、
20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、
200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm以及10μm,或约10nm到约10μm内的任何子范围,例如介于任何两个上述尺寸之间的任何范围。
[0084] 上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子可以具有任何适合形状,包括但不限于球形、正方形、矩形、三角形、圆盘、立方体样形状、立方体、长方体(rectangular 
parallelepiped/cuboid)、圆锥体、圆柱、棱柱、角锥形、直立圆柱和其它规则或不规则形状。
[0085] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物中的纳米粒子大体上不含源细胞的组分,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞;或心脏细胞,细胞膜来源于这些细胞。举例来说,纳米粒子可以不含10%、20%、
30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、
95%、96%、97%、98%、99%或100%源细胞的组分,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞或心脏细胞,细胞膜来源于这些细胞。在一些实施例中,纳米粒子包含来源于红血球的质膜并且纳米粒子大体上不含血红
蛋白。举例来说,纳米粒子可以不含10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、
75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%血红蛋白。
[0086] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物中的纳米粒子大体上保持来源于源细胞的细胞膜或来源于源细胞的细胞膜的组分的天然结构完整性或活性,使得纳米粒子充当毒
素的目标细胞,例如神经元细胞的诱饵。举例来说,纳米粒子可以保留10%、20%、30%、
40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%、99%或100%天然结构完整性用于充当毒素的目标细胞,例如神经元细胞的诱饵。
[0087] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子是生物相容或生物可降解的。举例来说,纳米粒子的内部核心包含PLGA并且纳米粒子的外表面包含来源于源细
胞的质膜,所述源细胞例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞;或心脏细胞。
[0088] 上述组合或药物组合物中的纳米粒子可以具有任何适合体内半衰期。举例来说,纳米粒子的体内血液循环半衰期可以是PEG涂布的相当纳米粒子的半衰期的至少约2-5倍,
或体内血液循环半衰期是至少约1到约40小时,例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、
30、35或40小时。
[0089] 上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子的外表面可以另外包含合成膜。在一些实施例中,上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子包含外表面包含细胞膜的纳米粒子与
外表面包含合成膜的纳米粒子的混合物。外表面包含合成膜的纳米粒子可以或可以不吸收
或结合于毒素。在一些实施例中,外表面包含细胞膜的纳米粒子和外表面包含合成膜的纳
米粒子吸收或结合于毒素。在其它实施例中,外表面包含细胞膜的纳米粒子吸收或结合于
毒素,但外表面包含合成膜的纳米粒子不吸收或结合于毒素。
[0090] 上述组合或药物组合物可以包含任何适合比率的外表面包含细胞膜的纳米粒子和外表面包含合成膜的纳米粒子。在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以包含至少
约1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、
99重量%或更多外表面包含细胞膜的纳米粒子。在其它实施例中,上述组合或药物组合物
可以包含至少约1重量%、2重量%、3重量%、4重量%、5重量%、6重量%、7重量%、8重量%、9重量%、10重量%、20重量%、30重量%、40重量%、50重量%、60重量%、70重量%、
80重量%、90重量%、91重量%、92重量%、93重量%、94重量%、95重量%、96重量%、97重量%、98重量%、99重量%或更多外表面包含合成膜的纳米粒子。举例来说,上述组合或药物组合物可以包含约1-10重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约90-99重量%外表面包
含合成膜的纳米粒子,约11-25重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约75-89重量%外表
面包含合成膜的纳米粒子,约50重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约50重量%外表面
包含合成膜的纳米粒子,约51-75重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约49-25重量%外
表面包含合成膜的纳米粒子,或约90-100重量%外表面包含细胞膜的纳米粒子和约0-10重
量%外表面包含合成膜的纳米粒子。
[0091] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物中所用的纳米粒子大体上不含针对受试者,例如哺乳动物的免疫原性。举例来说,细胞膜可以来源于源细胞,例如血细胞,如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞;内皮细胞;上皮细胞;神经元细胞或心脏细胞,来源于相同物种的哺乳动物。在另一实例中,哺乳动物是人类并且细胞膜来源于人类源细胞,例如人类红血球。在一些实施例中,细胞膜可以来源于打算治疗的哺乳动物的源细胞,例如红血球。
举例来说,细胞膜可以来源于打算治疗的人类的人类源细胞,例如人类红血球。
[0092] 毒素可以通过任何机制结合于目标细胞和源细胞。在一些实施例中,毒素通过相同机制结合于目标细胞和源细胞。在其它实施例中,毒素通过不同机制结合于目标细胞和
源细胞。在其它实施例中,毒素可以通过结合到目标细胞的质膜上的蛋白质结合于目标细
胞。在其它实施例中,毒素可以通过结合到源细胞的质膜上的蛋白质结合于源细胞。
[0093] 上述组合或药物组合物可以用于降低或中和靶向受试者的任何目标细胞的毒素作用。在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以用于降低或中和靶向主要来源于内胚
层的目标细胞,例如外分泌上皮细胞或激素分泌细胞,的毒素作用。在其它实施例中,上述组合或药物组合物可以用于降低或中和靶向主要来源于外胚层的目标细胞,例如角化型上
皮细胞、湿润复层屏障上皮细胞,或神经元,的毒素作用。示范性神经元包括感觉转导细胞、自主神经元细胞、感觉器官和周围神经元支撑细胞、中枢神经系统神经元、中枢神经系统神经胶质细胞和晶状体细胞。在其它实施例中,上述组合或药物组合物可以用于降低或中和
靶向主要来源于中胚层的目标细胞,例如代谢和存储细胞、屏障功能细胞、胞外基质细胞、收缩细胞、血液和免疫系统细胞、生殖细胞、看护细胞或间质细胞,的毒素作用。在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以用于降低或中和神经毒素的作用。
[0094] 源细胞和目标细胞可以是两种不同类型的细胞。包含来源于任何适合源细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于上述组合或药物组合物中。在一些实施例中,包含来源于血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞或心脏细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于上述组合或药
物组合物中。示范性血细胞包括红血球、白血球、血小板和巨噬细胞。在一些实施例中,毒素靶向受试者的神经元细胞,并且包含来源于血细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于降低或中
和受试者体内的毒素作用。举例来说,包含来源于红血球、白血球、血小板或巨噬细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于降低或中和受试者体内靶向神经元细胞的毒素作用。
[0095] 上述组合或药物组合物可以用于降低或中和受试者体内的任何适合毒素的作用,所述适合毒素是AchE抑制剂,例如可逆AchE抑制剂或不可逆AchE抑制剂。包含来源于任何
适合源细胞的细胞膜的纳米粒子可以用于上述组合或药物组合物中。在一些实施例中,可
以使用包含来源于血细胞、内皮细胞、上皮细胞、神经元细胞和心脏细胞的细胞膜的纳米粒子。在一些实施例中,可以使用包含来源于血细胞,例如红血球、白血球、血小板或巨噬细胞,的细胞膜的纳米粒子。在一些实施例中,毒素结合于目标细胞的质膜上的乙酰胆碱酯酶(AchE),并且可以使用包含来源于源细胞的质膜的细胞膜的纳米粒子。
[0096] 可以通过任何适合方法评定毒素是否抑制AchE。在一些实施例中,可以通过任何适合AchE活性分析法评定毒素是否抑制AchE。在一个实例中,AchE活性分析法是基于使用
替代底物乙酰硫代胆碱和5,5'-二硫基-双-2-硝基苯甲酸(DTNB)的埃尔曼法(Ellman's 
method)。由于电子迁移到硫原子,反应导致产生黄色的5-硫基-2-硝基苯甲酸酯。参看例如埃尔曼G.L.(Ellman,G.L.);考特尼D.K.(Courtney,D.K.);安杜利森,V.(Andreas,V.);菲特史东R.M.(Featherstone,R.M.)《乙酰胆碱酯酶活性的新颖和快速比色测定(A new and 
rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity)》《.生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)》1961,7,88-95;以及普韩卡,M.(Pohanka,M.);君,D.
(Jun,D.);库卡,K.(Kuca,K.)用通过复活剂鉴别的方式改良用于有机磷酸酯的基于乙酰胆
碱酯酶的分析法(Inprovement of acetylcholinesterase-based assay for 
organophosphates in way of identification by reactivators).塔兰泰(Talanta)
2008,77,451-454。在另一实例中,AchE活性分析法使用吲哚乙酸酯作为底物。参看例如普韩卡(Pohanka)等人《, 国际科学分子杂志(Int.J.Mol.Sci.)》2011,12,2631-2640;doi:
10.3390/ijms12042631。在另一实例中,AchE活性分析法使用来自西格玛-奥德里奇公司
(西格玛-奥德里奇公司)的乙酰胆碱酯酶活性分析试剂盒,这是埃尔曼法的优化型式,其中AChE产生的硫代胆碱与5,5′-二硫基双(2-硝基苯甲酸)反应形成与存在的AChE活性成比例
的比色(412nm)产物。参看例如西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)目录号MAK119。
[0097] 上述组合或药物组合物可以用于降低或中和受试者体内的任何适合毒素的作用,所述适合毒素是有机磷酸酯或有机磷酸酯毒物。有机磷酸酯中毒由暴露于有机磷酸酯(OP)
产生,这引起抑制乙酰胆碱酯酶(AchE),导致乙酰胆碱(Ach)在身体内积聚。在一些实施例中,有机磷酸酯(有时缩写成OP)或磷酸酯是磷酸酯的通用名称。在其它实施例中,“有机磷酸酯”指的是作用于酶AchE的杀虫剂或神经剂的群组。所述术语通常用于描述实际上任何
含有有机磷(V)的化合物,当用神经毒性化合物处理时尤其如此。许多所谓的有机磷酸酯含有C-P键。举例来说,沙林是甲氟膦酸O-异丙酯,其形式上来源于亚磷酸(HP(O)(OH)2),而非磷酸(P(O)(OH)3)。另外,作为次膦酸衍生物的许多化合物用作神经毒性有机磷酸酯。在其它实施例中,有机磷酸酯具有以下结构特征:末端氧通过双键连接到磷,即磷酰基;两个亲脂性基团键结于磷;以及离去基团键结于磷,通常卤化物。在其它实施例中,有机磷酸盐具有下式I:
[0098]
[0099] 其中R1、R2和R3中的每一个独立地是烷基、芳基、亲脂性基团、亲水性基团和/或离去基团。示范性有机磷酸酯或有机磷酸酯毒物包括欧杀松(acephate)(Orthene)、丙硫特普(aspon)、甲基谷硫磷(Azinphos-Methyl)(Guthion)、卡巴呋喃(Carbofuran)(Furadan,F调配物)、三硫磷(Carbophenothion)(Trithion)、克芬松(Chlorfenvinphos)(Birlane)、陶斯松(Chlorpyrifos)(Dursban,Lorsban)、蝇毒磷(Coumaphos)(Co-Ral)、巴毒磷(crotoxyphos)(Ciodrin,Ciovap)、育畜磷(crufomate)(Ruelene)、内吸磷(Demeton)
(Systox)、二嗪磷(Diazinon)(Spectracide)、二氯松(dichlorvos)(DDVP,Vapona)、百治磷(dicrotophos)(Bidrin)、乐果(Dimethoate)(Cygon,De-Fend)、敌杀磷(dioxathion)
(Delnav)、二硫松(Disulfoton)(Di-Syston)、EPN、爱杀松(Ethion)、灭克磷(Ethoprop)
(Mocap)、氨磺磷(famphur)、克线磷(fenamiphos)(Nemacur)、杀螟硫磷(Fenitrothion)
(Sumithion)丰索磷(fensulfothion)(Dasanit)芬杀松(fenthion)(Baytex,Tiguvon)、地
虫磷(Fonofos)(Dyfonate)、异柳磷(isofenfos)(Oftanol,Amaze)、马拉硫磷(Malathion)
(Cythion)、多灭磷(Methamidophos)(Monitor)、杀扑磷(methidathion)(Supracide)、甲基巴拉松(methyl parathion)、速灭磷(Mevinphos)(Phosdrin)、久效磷(Monocrotophos)、二溴磷(Naled)(Dibrom)、神经剂(沙林、梭曼、梭曼、VX)、甲基亚砜磷(oxydemeton-methyl)(Meta systox-R)、巴拉松(Parathion)(Niran,Phoskil)、甲拌磷(Phorate)(Thimet)、伏杀磷(phosalone)(Zolonc)、亚胺硫磷(phosmet)(Irnidan,Prolate)、磷胺(Phosphamidon)
(Dimecron)、双硫磷(temephos)(Abate)、TEPP、特丁磷(Terbufos)(Counter)、杀虫畏
(tetrachlorvinphos)(Rabon,Ravap)以及三氯磷酸酯(Trichlorfon)(Dylox,Neguvon)。上
述组合或药物组合物可以用于降低或中和受试者体内的上述有机磷酸酯或有机磷酸酯毒
物的作用。
[0100] 上述组合或药物组合物还可以用于降低或中和有机磷酸酯的作用,所述有机磷酸酯用作神经剂、杀虫剂、杀昆虫剂或除草剂。示范性神经剂包括梭曼、沙林、塔崩和VX。示范性杀虫剂包括马拉硫磷、巴拉松、二嗪磷、芬杀松、二氯松、陶斯松、爱杀松和三氯磷酸酯(美曲磷酯)。示范性除草剂包括脱叶磷和脱叶亚磷。
[0101] 在一些实施例中,上述组合或药物组合物还可以用于通过抑制例如神经元细胞和/或肌肉细胞等目标细胞中或上的AchE来降低或中和是AchE抑制剂,例如有机磷酸酯的
毒素作用,并且至少部分实现其在受试者体内的毒性。示范性神经元细胞包括运动神经元
和感觉神经元。目标细胞可以位于受试者的任何适合部位。举例来说,目标细胞可以是神经肌肉接头;胆碱激导性突触,例如胆碱激导性脑突触;中枢神经组织;周围神经组织;运动纤维;感觉纤维;运动和感觉纤维;胆碱激导性纤维或非胆碱激导性纤维的部分。
[0102] 上述组合或药物组合物可以用于通过任何途径或机制,如吸入、吸收或摄入来降低或中和暴露于毒素的受试者体内的毒素作用。上述组合或药物组合物还可以用于降低或
中和作为战争、恐怖袭击、自杀企图或事故的部分暴露于毒素的受试者体内的毒素作用。
[0103] 上述组合或药物组合物可以包含任何适合活性成分,其可以用于降低或中和受试者体内的毒素作用。在一些实施例中,毒素是有机磷酸盐并且另一活性成分是保护AChE免
于有机磷酸酯、抗胆碱激导剂、酶生物清除剂或III类抗心律不齐剂抑制的试剂。在一个实例中,保护AChE免于有机磷酸酯抑制的试剂是氨基甲酸酯。在另一实例中,抗胆碱激导剂是阿托品(atropine)、解磷定(pralidoxime)和/或吡啶鎓肟(例如双磷定(trimedoxime)或双
复磷(obidoxime))。在另一实例中,酶生物清除剂是胆碱酯酶,例如人类血清BChE
(HuBChE)。
[0104] 上述组合或药物组合物可以使用任何适合传递机制或技术给予。在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以单独给予。在其它实施例中,上述组合或药物组合物可以与药学上可接受的载剂或赋形剂一起给予。在其它实施例中,上述组合或药物组合物可以通
过药剂传递系统或医疗装置给予。可以使用任何适合药剂传递系统或医疗装置。举例来说,药剂传递系统或医疗装置可以是植入物,例如骨骼手术期间或之后放置的植入物、导液管
或持续释放药物传递系统。
[0105] 上述组合或药物组合物可以通过任何适合给药途径给予受试者。在一些实施例中,上述组合或药物组合物可以通过经口、肠胃外、直肠、经鼻、局部或眼部途径,或通过吸入给予。示范性肠胃外给予可以通过静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或皮下途径。
[0106] D.药物组合物和给药途径
[0107] 单独或与其它活性成分组合的本文所述的包含纳米粒子的药物组合物可以另外包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂是无毒并且另外生物学上
适于给予受试者的物质。这类赋形剂促进给予单独或与其它活性成分组合的本文所述并且
与活性成分相容的纳米粒子。药学上可接受的赋形剂的实例包括稳定剂、润滑剂表面活性剂、稀释剂、抗氧化剂、粘合剂着色剂、膨胀剂、乳化剂或口味调节剂。在优选实施例中,根据多个实施例的药物组合物是灭菌组合物。药物组合物可以使用所属领域的技术人员已知
或可获得的混配技术制备。
[0108] 灭菌组合物在本公开内,包括根据管控这类组合物的国家和地方法规的组合物。
[0109] 药物组合物和单独或与其它活性成分组合的本文所述的纳米粒子可以根据所属领域中已知的用于制备多种剂型的常规方法调配成适合药物溶剂或载剂中的溶液、乳液、
悬浮液或分散液,或与固体载剂一起调配成丸剂、片剂、口含片、栓剂、药囊、糖衣药丸、颗粒、粉末、复原用粉末或胶囊。单独或与其它活性成分组合并且优选地采用药物组合物形式的本文所述的纳米粒子可以通过适合传递途径,如经口、肠胃外、直肠、经鼻、局部或眼部途径,或通过吸入给予。在一些实施例中,组合物调配成用于静脉内或经口给药。
[0110] 对于经口给药,单独或与另一活性成分组合的纳米粒子可以如片剂或胶囊等固体形式提供,或以溶液、乳液或悬浮液形式提供。为了制备口服组合物,单独或与其它活性成分组合的纳米粒子可以调配成提供例如每天约0.01到约50mg/kg,或每天约0.05到约20mg/
kg,或每天约0.1到约10mg/kg的剂量。经口片剂可以包括与相容药学上可接受的赋形剂混
合的活性成分,如稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂调味剂、着色剂和防腐剂。适合惰性填充剂包括碳酸钠和碳酸、磷酸钠和磷酸钙、乳糖、淀粉、糖、葡萄糖、甲基纤维素硬脂酸镁、甘露糖醇、山梨糖醇等。示范性液体经口赋形剂包括乙醇、丙三醇、水等。淀粉、聚乙烯-吡咯烷(PVP)、羟基乙酸淀粉钠、微晶纤维素和海藻酸是示范性崩解剂。粘合剂可以包括淀粉和明胶。润滑剂如果存在,可以是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。需要时,片剂可以包覆有如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯等材料来延迟在胃肠道中的吸收,或可以包覆有肠溶
包衣。
[0111] 用于经口给药的胶囊包括硬明胶胶囊和软明胶胶囊。为了制备硬明胶胶囊,活性成分可与固体、半固体或液体稀释剂混合。软明胶胶囊可以通过混合活性成分与以下各物
来制备:水;油状物,如花生油或橄榄油;液体石蜡;短链脂肪酸、聚乙二醇400或丙二醇的单甘油酯和二甘油酯的混合物。
[0112] 经口给药的液体可以呈悬浮液、溶液、乳液或糖浆形式,或可以呈在使用前用水或其它适合媒剂复原的干燥产品的形式呈现。这类液体组合物可以任选地含有:药学上可接受的赋形剂,如悬浮剂(例如山梨糖醇、甲基纤维素、海藻酸钠、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸凝胶等);非水媒剂,例如油状物(例如苦杏仁油分馏椰子油)、丙二醇、乙醇或水;防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸);湿润剂,如卵磷脂;以及需要时,调味剂或着色剂。
[0113] 组合物可以针对直肠给药调配成栓剂。对于肠胃外用途,包括静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内或皮下途径,单独或与其它活性成分组合的纳米粒子可以提供于缓冲到适当pH并且等张的灭菌水溶液或悬浮液中或提供于肠胃外可接受的油中。适合水性媒剂可以包括
林格氏溶液(Ringer's solution)和等张氯化钠。这类形式可以单位剂量形式呈现,如安瓿或一次性注射装置;以多剂量形式呈现,如可以撤回适当剂量的小瓶;或以固体形式或预浓缩物形式呈现,其可以用于制备可注射调配物。说明性输注剂量在几分钟到几天范围的时
间段约1到1000μg/kg/分钟与药物载剂掺合的试剂范围内。
[0114] 对于经鼻、吸入或经口给药,单独或与其它活性成分组合的纳米粒子可以使用例如还含有适合载剂的喷雾调配物给予。
[0115] 对于局部施用,单独或与其它活性成分组合的纳米粒子优选地调配成乳霜或软膏或适于局部给药的类似媒剂。对于局部给药,单独或与其它活性成分组合的纳米粒子可以
约0.1%到约10%药物比媒剂的浓度与药物载剂混合。给予单独或与其它活性成分组合的
纳米粒子的另一模式可以利用贴片调配物来实现经皮传递。
[0116] 在某些实施例中,本公开提供药物组合物,其包含单独或与其它活性成分组合的纳米粒子,和甲基纤维素。在某些实施例中,悬浮液中的甲基纤维素为约0.1%、0.2%、
0.3%、0.4%或0.5%到约1%。在某些实施例中,悬浮液中的甲基纤维素为约0.1%到约
0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%或1%。在某些实施例中,悬浮液中的甲基纤维素为约
0.1%到约1%。在某些实施例中,悬浮液中的甲基纤维素为约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、
0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.8%或1%。在某些实施例中,悬浮液中的甲基纤维素为约
0.5%。
[0117] E.实例1.使用纳米粒子生物清除剂的有机磷酸盐中毒的解毒
[0118] 血液中的血清胆碱酯酶(包括AChE和BChE)的活性是最广泛使用的诊断OP中毒的标记物(14)。而BChE主要以自由可溶性形式存在于血浆中,AChE是红血球(RBC)膜、神经肌肉接头和胆碱激导性脑突触上通常观测到的膜锚定的蛋白质。纳米技术,具体来说细胞膜
遮蔽纳米粒子的最新进展已经为打算用于生物医学应用的膜结合的AChE提供机会。已证实
细胞膜遮蔽法使膜蛋白能够以外翻方式可控地锚定和呈现于纳米尺寸微粒上(15-17),并
且所得仿生纳米粒子已经用于多种生物医学功能,包括用于吸收蛋白质毒素和自动反应性
免疫因素的生物清除剂应用(15,18)。设想平台可以允许全身给予细胞膜关联的AChE来拦
截血流中的毒性OP。为了证明使用仿生纳米粒子的OP解毒,此处我们制备RBC膜遮蔽纳米粒子(标为“RBC-NP”)来开发用于OP清除的RBC表面AChE(图1)。二氯松(DDVP)是有机磷农药中最广泛使用的化合物之一,在本研究中用作模型OP。我们展示以下细胞膜遮蔽,RBC-NP保留膜结合的AChE以及其酶促活性。仿生纳米粒子用作OP清除剂来帮助维持OP暴露之后的内源
性胆碱酯酶活性。
[0119] 结果
[0120] RBC-NP根据此前报道的方案制备,其中纯化的RBC膜通过超声处理法涂布到100nm聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)聚合核心上。为了研究AChE在所得RBC-NP中的保留,对RBC重像和等效膜含量的RBC-NP进行西方墨点法。已经显示在用抗AChE抗体染色之后,RBC-NP具有
与RBC重像类似的带型,包括对应于蛋白质的单体、二聚体和四聚体的条带(图2A)。通过
ImageJ分析的总墨点强度证实RBC重像和RBC-NP之间的总墨点强度不存在统计学显著差
异,指示膜蛋白到纳米粒子底物上的高效移位(图2B)。AChE活性的进一步检验显示RBC-NP
和RBC重像具有基本上类似的AChE活性(图2C)。这些结果指示在纳米粒子制备之后,膜关联的AChE含量存在最低损失并且AChE酶活性几乎无改变,这与证实表面蛋白质官能团在这些
细胞膜遮蔽纳米粒子上的保存的前述发现相符(16,19)。由于OP和AChE之间的良好研究反
应性,我们接着检验DDVP对RBC-NP的物理化学特性的作用。透射电子显微法(TEM)揭示在与DDVP混合之后,RBC-NP保留对应于纳米粒子上的单层膜图层的核/壳结构(图2D)。另外,动态光散射测量显示在DDVP暴露之后RBC-NP的尺寸保持类似(图2E),指示DDVP反应对RBC-NP
的结构和稳定性几乎没有作用。在与DDVP一起培育之后,观测到粒子的ζ电位提高(图2F),这可能归因于结合的DDVP分子的表面电荷屏蔽作用。
[0121] 为了研究RBC-NP清除OP的能力,将悬浮于100μL水溶液中的0.4和0.1mg粒子与约1μg/mL到1mg/mL范围内的不同浓度的DDVP一起培育30分钟。在通过离心去除纳米粒子之后,通过经高效液相色谱(HPLC)测量清液层中的剩余DDVP浓度来定量纳米粒子关联的DDVP的
量。可以观测到以浓度依赖性方式发生RBC-NP/DDVP关联(图3A)。RBC-NP浓度的4倍增加与
观测到的吸收能力右移相关良好,反映OP和AChE之间的共价相互作用后的1:1化学计量。我们还用100μL水溶液和5μg DDVP滴定反应混合物中的RBC-NP(图3B)。观测到吸收50%或2.5μg DDVP需要约32μg RBC-NP。随着RBC-NP浓度升高到超过1mg/mL达到饱和度。为了评估通过RBC-NP去除DDVP的特异性,包括0.4mg RBC-NP、聚乙二醇化NP(PEG-NP)和PEG-脂质体的
不同纳米调配物与5μg DDVP一起培育30分钟(图3C)。通过RBC-NP去除几乎全部DDVP,而
PEG-NP和PEG-脂质体显示几乎没有DDVP去除,表明仅RBC-NP有能力去除DDVP。另外,通过在RBC-NP存在下用增加浓度的DDVP共培育RBC重像来评估体外AChE保护功效(图3D)。在培育
30分钟之后,从反应混合物分离RBC重像并且检验AChE活性。观测到对于含有0、1和4mg/mL RBC-NP的混合物,抑制RBC重像上50%AChE活性所需的DDVP浓度分别是10、43和312μg/mL。
RBC重像上增加的AChE活性保留验证RBC-NP的清除作用。使用与5μg DDVP和2%RBC重像一
起在100μL反应混合物中培育的4mg/mL PEG-NP、PEG-脂质体以及RBC-NP进行不同纳米载剂的抗OP作用的比较(图3E)。在30分钟培育之后,分析经分离的RBC重像的AChE活性。RBC-NP组显示与其它纳米调配物相比显著较高的RBC重像上的AChE活性保留。在RBC-NP存在下保
留约90%RBC重像的AChE活性,确证仿生纳米粒子实现受体特异性抗OP作用。
[0122] 为了检验RBC-NP体内解毒DDVP的可能,我们使用静脉内或经口给予DDVP的OP中毒小鼠模型。对于静脉内DDVP给药,经尾静脉注射能够诱发小鼠急性死亡的致死剂量的DDVP
(10mg/kg)。处理组中的小鼠接收200mg/kg剂量的RBC-NP或PEG-NP的静脉内注射。显示没有任何处理的小鼠在DDVP注射之后7分钟内有100%死亡率(图4A)。在用RBC-NP处理的组中,
用致死的DDVP攻击的全部小鼠存活(n=10,p<0.0001)。相比之下,PEG-NP未能提高DDVP攻击小鼠的存活率并且PEG NP处理组和非处理组之间的存活率没有显著性(p=0.380)。分析
DDVP攻击和处理之后的循环RBC AChE活性进一步证实与PEG NP组(p<0.001)和非处理组(p
<0.001)相比,RBC-NP显著提高RBC AChE活性(图4B),而PEG-NP处理组和非处理组之间的循环RBC AChE活性没有观测到统计显著性(p=0.226)。对于经口DDVP攻击,小鼠经口给予致
死剂量的DDVP(150mg/kg)。处理组中的小鼠接收200mg/kg剂量的RBC-NP或PEG-NP的静脉内
注射。显示90%没有任何处理的小鼠在DDVP给药之后11分钟内死亡(图4C)。RBC-NP处理对
整体存活率仍有益,100%存活率(p=0.0002,n=10),而PEG-NP处理显示没有存活率优势(p=0.8989)。经口DDVP攻击小鼠的RBC AChE含量与静脉内攻击小鼠相符。而RBC-NP处理导致与非处理组相比循环中的显著RBC AChE活性保留(p<0.001),非处理组与PEG-NP处理组
之间没有观测到AChE活性中的统计显著性(p=0.362)(图4D)。
[0123] DDVP中毒之后的恢复还使用循环RBC AChE活性作为标记物研究(图5A和5B)。显示第4天,用RBC-NP处理的那些小鼠中RBC AChE活性回到正常水平。这指示OP的最终清除率和循环中胆碱酯酶含量的补充。为了检验RBC-NP解毒的DDVP的体内遭遇,对负载DDVP的RBC-
NP的生物分布进行研究。显示RBC-NP/DDVP复合物主要积聚在肝脏中(图5C)。RBC-/DDVP给
药之后第3天和第7天的苏木精和曙红(H&E)染色的肝脏组织结构揭示窦状隙中没有纳入库
普弗细胞(Kupffer cell)的血管供应的正常肝细胞(图5D)。不具有肝脏组织损伤表明螯合
的DDVP安全代谢,显示组织分布时的最小残余毒性。
[0124] 论述
[0125] OP中毒仍然是一种重大公众健康问题,因为其与高发病率和死亡率有关。高度毒性OP视为最危险化学战争试剂之一并且极大地威胁军事和民用群体的安全。OP通过抑制
AChE诱发其急性毒理学作用,导致ACh在突触处积聚,随后过度刺激胆碱激导性受体并且破坏神经传递。在严重OP中毒之后几分钟内可能发生死亡,这一般是由于几种机制介导的呼
吸道衰竭。烟碱ACh受体障碍引起的呼吸道肌肉麻痹是OP诱导的致死率的主要起因,并且周围蕈毒碱受体的过度刺激也可以导致因过度支气管粘液溢和支气管收缩而窒息。因为疏水
性OP容易跨越血脑屏障对中枢神经系统发挥其作用,所以脑部损伤是OP中毒的另一严重作
用。因此,抗OP疗法需要以直接和有效方式来预防OP的病理生理学作用。
[0126] 当前,OP中毒的治疗仍具有挑战性(20)。自1950和1970以来开发出来的治疗选项非常少,这时在急症情形中引入抗胆碱药物、基于氨基甲酸酯的预处理、吡啶鎓肟和苯并二氮呯作为抗OP对策(21)。针对OP中毒的医学干预的研究已经相对稳定,1940的标准解毒剂
阿托品仍是主要抗OP治疗。这是蕈毒碱症状的仅有的通用公认的治疗,所述蕈毒碱症状如
瞳孔缩小、支气管痉挛、呕吐、出汗增加、腹泻和尿失禁。然而,尽管其可接受,但其给药和剂量不存在通用指南。剂量不足可能延迟最佳阿托品处理,导致呼吸中枢抑制、缺氧和低血压引起的死亡。相对来说,剂量过量可能导致过度抗胆碱毒性,这在严重情况下可能致死
(22)。肟是独特类别的抗OP对策,因为它们从抑制的AChE去除神经剂来重新激活其活性。然而,肟疗法的功效仍在讨论中。几种神经剂(例如塔崩和梭曼)的AChE抑制已经显示不可逆,但临床上使用的肟用作胆碱酯酶在磷酸化时快速转化成不可再活化形式(23)。尽管大规模
研究和开发,但不存在适于针对全部OP剂的解毒治疗的单一广谱肟(24)。
[0127] 近年来出现生物清除剂疗法作为解毒血流中的OP的医学对策。这些清除剂可以是化学计量(摩尔比摩尔中和)或催化(促进OP水解)的。PON-1例如是正在开发的前沿催化生
物清除剂(10,12)。PON-1是高效水解许多OP的钙依赖性酶(25)。静脉内给予纯化的PON-1已经显示保护豚鼠免于沙林和梭曼(26,27)。然而,大规模制造和使用PON-1作为治疗候选物
存在局限性。这些包括难以使用微生物表达系统制造重组PON-1、野生型PON-1对特定底物
的低水解活性以及纯化酶的低储存稳定性。HuBChE是另一前沿生物清除剂候选物。据估算
200mg这些化学计量的抗OP清除剂可以保护人类抵抗两倍LD50剂量的梭曼(28)。豚鼠中的动物研究揭示给予大剂量HuBChE赋予针对高达5.5倍LD50的梭曼或8倍LD50的VX的保护(29)。
然而,缺乏负担得起的酶来源仍然是其转译的主要障碍。从人类血液分离HuBChE经济成本
过高,并且使用转基因生物体的替代制造策略具有免疫原性问题。在其它抗OP候选物中,
AChE代表立体选择性高于BuChE的有前景的生物清除剂。人类AChE已经显示比人类HuBChE
更高效地清除VX剂(30,31)。令人遗憾的是,开发AChE作为化学计量生物清除剂已经由于类似的转译难题而中断(21)。由于这种背景,开发OP生物清除剂的替代策略可能具有极大治
疗性影响。
[0128] 纳米粒子由于其在药物传递中的极大可能而在过去几年已经快速发展。近年来,纳米粒子已经应用于从血液去除毒素或化学物质用于生物解毒(32,33)。为此,在应用纳米粒子作为针对OP中毒的解毒剂方面所作的工作很少。此处,我们证实用仿生表面工程改造
的纳米粒子可以适用于拦截OP与内源性AChE之间的结合,由此减轻OP中毒的严重程度。通
过涂布细胞膜,聚合纳米粒子用酶活性膜结合的蛋白质成功官能化。RBC-NP证实此处基本
上保留了天然RBC上的AChE含量和功能。这些仿生纳米粒子此前证实具有许多细胞样功能,包括长全身循环(16)和与膜活性病原性因素自发相互作用(15,18)。本发明研究验证RBC-
NP作为新颖形式的抗OP生物清除剂的可能。使用OP中毒的小鼠模型通过静脉内和经口OP攻
击证明RBC-NP的治疗性可能。显示RBC-NP处理后死亡率明显降低。相比之下,相等剂量的具有类似物理化学特性的PEG-NP未能提高DDVP攻击小鼠的存活率,由此再次证实RBC-NP在抗
OP应用中的独特功能。不同于与ACh竞争或阻断ACh受体的现有抗OP疗法,RBC-NP充当OP诱
饵并且因此不大可能诱发抗胆碱副作用,包括心室颤动、头晕、恶心、视力模糊、失去平衡、瞳孔扩张、畏光、口干以及极端意识模糊。平台的全部生物相容特性和生物可降解特性还使与纳米材料给药有关的安全问题降到最低。
[0129] 对于未来转译,RBC-NP平台可能存在优于其它实验生物清除剂平台的制造优势,因为纯化的RBC容易用于输血操作中。可以设想血型匹配的RBC-NP可以给予中毒受试者进
行OP中和,其中免疫原性问题最少。另外,因为有核和非有核哺乳动物细胞膜都已经证实用于制备细胞膜遮蔽纳米粒子(16,34),所以可以针对不同生物解毒目的制备其它具有特异
性表面受体的仿生纳米粒子。使用细胞膜遮蔽纳米粒子的独特生物清除剂法提供去除生物
学和化学有毒物质的新颖策略。
[0130] 材料和方法
[0131] 伦理学表述
[0132] 所有动物实验都遵照加利福尼亚大学(the University of California),圣地亚哥机构生物安全计划和机构动物护理和使用委员会(San Diego's institutional 
biosafety program and the Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)
审查、批准和执行的方案。
[0133] RBC-NP的制备和表征.
[0134] RBC-NP如先前描述制备(19)。简单来说,通过纳米沉淀方法制备100nm PLGA聚合核心。首先,将0.67dL/g羧基封端的50:50PLGA(LACTEL可吸收聚合物(LACTEL Absorbable Polymers))以10mg/mL的浓度溶解于丙酮中。将1mL PLGA溶液快速添加到2mL水中,接着置
真空加速丙酮蒸发。所得纳米粒子溶液与CD-1小鼠RBC膜微囊混合并且使用FS30D浴槽
声波仪以100W功率超声处理2分钟。荧光标记的RBC-NP使用相同方法制备,但在纳米粒子核心制备期间向聚合物溶液中并入10μg/mL浓度的1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基
吲哚二碳菁过氯酸酯(DiD;激发/发射=644/665nm;生命技术(Life Technologies))。应注意RBC-NP的全部所述浓度值指的是纳米粒子调配物中PLGA聚合物的浓度。通过混合100μL RBC-NP(5mg/mL)与10μL DDVP(1mg/mL)持续15分钟来制备RBC-NP/DDVP复合物。RBC-NP和
RBC-NP/DDVP复合物的粒径和ζ电位通过动态光散射(DLS)测量使用Malvern ZEN 
3600Zetasizer测定,其分别显示123nm和130nm的平均流体动力学直径。在用1重量%乙酸
酰染色之后,用透射电子显微法(TEM)检验RBC-NP/DDVP的形态(16)。作为对照,通过纳米沉淀法遵照此前公布的方案制备DSPE-PEG(2000)涂布的脂质-PLGA杂化纳米粒子(PEG-NP)
(35)。作为另一对照,通过如先前描述的膜水合法制备由80重量%卵PC和20重量%DSPE-
PEG(2000)-甲氧基(Avanti Polar Lipids)组成的聚乙二醇化脂质体(PEG脂质体)(36)。通
过DLS测量,PEG-NP和PEG-脂质体的直径分别是117nm和105nm。
[0135] RBC-NP中的AChE和AChE活性的西方墨点法.
[0136] 在SDS样品缓冲液(Invitrogen)中制备RBC重像和RBC-NP,并且样品中的总蛋白含量通过Pierce BCA蛋白质分析试剂盒(Thermo)定量。接着在NuPAGE Novex 4-12%Bis-
Tris 12孔凝胶上在MOPS操作缓冲液中使用Novex  SureLock X-细胞电泳系统
(Invitrogen)解析样品。样品在165V下操作45分钟。所得聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质接着
在15V下转移到Protran纯硝化纤维转移和固定膜(Perkin Elmer)上持续30分钟。在室温下
用5%含新鲜牛奶的PBST阻断2小时之后,将硝酸纤维膜与单克隆小鼠抗AChE(在5%含新鲜
牛奶的PBST中1:2000倍稀释;Abgent)一起在4℃下培育过夜。用PBST洗涤3次之后,接着将硝酸纤维膜与山羊抗小鼠IgG HRP结合物(在5%含新鲜牛奶的PBST中1:2000倍稀释;
Millipore)一起在室温下培育2小时。随后,染色的硝酸纤维膜经受ECL西方墨点法底物
(Pierce)持续1分钟,且用Mini-Medical/90显色剂(ImageWorks)显色。通过ImageJ软件
析总墨点强度来比较RBC-NP和RBC重像之间的AChE含量。RBC-NP和RBC重像中的AChE活性用
Amplex Red ACh/AChE分析试剂盒(Invitrogen)使用电鳗AChE作为标准物测量。
[0137] 通过RBC-NP去除DDVP.
[0138] 为了研究RBC-NP的DDVP吸收和去除能力,含有4mg/mL或1mg/mL RBC-NP的100μL PBS(1X,pH=7.2)溶液与10μL不同浓度的DDVP一起培育30分钟。各样品接着在贝克曼库尔特公司微量离心22R离心机(Beckman Coulter Microfuge 22R Centrifuge)中在14,
000rpm下离心10分钟,使纳米粒子集结成离心块。通过使用具有分析柱(150mm×4.6mm;孔
径5μm;ZORBAX SB-C18;Agilent)的HPLC系统(Agilent 1100)在室温下测定上清液中的游离DDVP含量。移动相由1.0mL/min流动速率的乙腈和水的混合物(50:50,v/v)组成。样品注射体积是10μL,并且检测器波长是215nm。使用下式计算DDVP去除率:DDVP去除率(%)=(1-上清液中的DDVP/总DDVP输入)×100%。全部实验重复三次进行。将DDVP去除率绘制成曲线
并且与结合-饱和度等式在GraphPad Prism中拟合。为了研究RBC-NP浓度对DDVP去除率的
作用,将含有5μg DDVP的10μL PBS(1X,pH=7.2)溶液与100μL含有不同浓度的RBC-NP的溶液一起培育30分钟。各样品如上文所述处理并且计算DDVP去除率,与DDVP浓度一起绘制曲
线并且与结合-饱和度等式拟合。为了比较不同纳米调配物的去除能力,含有4mg/mL RBC-
NP、PEG-NP或PEG-脂质体的100μL PBS(1X,pH=7.2)溶液与10μL含有5μg DDVP的溶液一起培育30分钟。各样品如上文所述加工和分析并且计算DDVP去除率。
[0139] RBC-NP的体外抗OP作用.
[0140] 基于与RBC-NP和DDVP一起共培育之后RBC重像上的AChE活性来研究RBC-NP的体外抗OP作用。简单来说,含有2μL RBC重像和不同浓度的RBC-NP的100μL PBS(1X,pH=7.2)溶液与不同浓度的DDVP一起培育30分钟。各样品接着在贝克曼库尔特公司微量离心22R离心
机中在2,000rpm下离心10分钟来选择性离心RBC重像,在上清液中留下RBC-NP和DDVP。丢弃上清液之后,将RBC重像的离心块悬浮于10μL PBS中并且通过Amplex Red ACh/AChE分析试剂盒(Invitrogen)测量其AChE活性。为了比较不同纳米调配物的AChE保护作用,含有4mg/
mL RBC-NP、PEG-NP或PEG-脂质体的100μL PBS(1X,pH=7.2)溶液与10μL含有5μg DDVP的溶液一起培育30分钟。各样品在贝克曼库尔特公司微量离心22R离心机中在14,000rpm下离心
10分钟,去除纳米调配物。将上清液添加到2μL RBC重像并且培育30分钟。经分离的RBC重像上的AchE活性如上文所述测量。
[0141] 静脉内DDVP攻击之后RBC-NP的体内OP解毒.
[0142] 首先制备以25mg/mL浓度悬浮于10%蔗糖中的RBC-NP和PEG-NP。将三十(30)只CD-1小鼠随机分成三组,每组10只小鼠。每组小鼠经尾静脉静脉内给予10mg/kg剂量的DDVP。处理组在DDVP注射之后立即接收200mg/kg纳米调配物的尾静脉静脉内注射。无处理组仅注射
DDVP。记录DDVP注射之后的存活率并且使用对数秩测试测定统计显著性。对于无处理组和
PEG-NP组,通过在死亡之后立即心脏穿刺来收集50μL血液。对于RBC-NP组,在DDVP注射之后
1小时通过颌下穿孔收集50μL血液。接着基于此前描述的方案从收集的血液获得RBC重像
(16)并且测量10μL RBC重像的AChE活性并且与正常小鼠比较。
[0143] 经口给予DDVP之后RBC-NP的体内OP解毒.
[0144] 首先制备以25mg/mL浓度悬浮于10%蔗糖中的RBC-NP和PEG-NP。将三十(30)只CD-1小鼠分成三组,每组10只小鼠。每组小鼠经口给予150mg/kg剂量的DDVP。处理组在DDVP给予之后立即接收200mg/kg纳米调配物的尾静脉静脉内注射。无处理组仅给予DDVP。记录
DDVP给药之后的存活率并且使用对数秩测试测定统计显著性。对于无处理组和PEG-NP组,
通过在死亡之后立即心脏穿刺来收集50μL血液。对于RBC-NP组,在DDVP给药之后1小时通过颌下穿孔收集50μL血液。如先前描述获得RBC重像(16)并且测量10μL RBC重像的AChE活性,与正常小鼠的活性比较。
[0145] RBC-NP处理之后的RBC AChE活性恢复.
[0146] 在小鼠通过静脉内或经口DDVP给药攻击并且用RBC-NP处理之后,在第0天、第2天和第4天收集50μL血液。RBC重像来源于收集的血液并且测量10μL RBC重像的AChE活性来监测RBC-NP处理之后AChE活性的恢复。
[0147] RBC-NP/DDVP复合物的生物分布.
[0148] 首先通过混合5mg DiD标记的RBC-NP与250μg DDVP来制备RBC-NP/DDVP复合物。混合物随后经Sepharose CL-4B柱过滤去除未结合的DDVP。对于生物分布研究,在经尾静脉静脉内注射荧光RBC-NP/DDVP复合物之后24小时处死6周大雄性CD-1小鼠。收集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、、脑和血液并且均质化。使用Tecan Infinite M200多孔板读取器读取640nm激发波长下匀浆在665nm处的荧光。所得信号接着乘以相应器官重量获得总器官荧光,并且计算各器官中的RBC-NP/DDVP复合物的相对分布(n=6)。对于肝毒性研究,一组小鼠在第3天
在注射RBC-NP/DDVP复合物之后处死并且另一组在第7天处死。将肝脏收集、切片并且用H&E染色用于组织学分析。
[0149] 参考文献
[0150] 1.D.古内尔(D.Gunnell)、M.德斯顿(M.Eddleston),M.R.菲利浦(M.R.Phillips),F.康拉德森(F.Konradsen)《, 致死性杀虫剂自体中毒的全球分布:系统评论(The global distribution of fatal pesticide self-poisoning:Systematic 
review)》《. BMC公众健康(BMC Public Health)》7,357(2007)。
[0151] 2.M.艾德斯顿(M.Eddleston)等人《, 斯里兰卡农村的故意自体中毒的流行病学(Epidemiology of intentional self-poisoning in rural Sri Lanka)》《. 美国精神病学杂志(Br.J.Psychiatry)》187,583-584(2005)。
[0152] 3.R.C.古普塔(R.C.Gupta),《化学战试剂的毒理学手册(Handbook of toxicology of chemical warfare agents)》.埃尔塞维尔(Elsevier),英国(UK),(2009)。
[0153] 4.N.柳泽(N.Yanagisawa),H.森田(H.Morita),T.中岛(T.Nakajima)《, 日本的沙林经历:急性毒性和长期作用(Sarin experiences in Japan:Acute toxicity and long-
term effects)》《. 神经病学科学杂志(J.Neurol.Sci.)》249,76-85(2006)。
[0154] 5.P.W.埃辛豪斯(P.W.Elsinghorst),F.沃勒克(F.Worek),H.蒂尔曼(H.Thiermann),T.威尔(T.Wille)《, 针对有机磷中毒处理的药物开发(Drug development for the management of organophosphorus poisoning)》《. 药物发现的专业意见(Expert Opin.Drug.Discov.)》8,1467-1477(2013)。
[0155] 6.M.乔卡诺维克(M.Jokanovic),M.普罗斯特兰(M.Prostran)《作, 为胆碱酯酶复活剂的吡啶鎓肟.治疗有机磷化合物中毒的结构活性关系和功效(Pyridinium oximes as 
cholinesterase reactivators.Structure-activity relationship and efficacy in 
the treatment of poisoning with organophosphorus compounds)》《. 当前药物化学
(Curr.Med.Chem.)》16,2177-2188(2009)。
[0156] 7.M.巴拉里-穆德(M.Balali-Mood),M.沙拉特(M.Shariat)《, 有机磷酸酯中毒的治疗.神经剂和急性杀虫剂中毒对肟作用的经验(Treatment of organophosphate 
poisoning.Experience of nerve agents and acute pesticide poisoning on the 
effects of oximes)》《.巴黎生理学杂志(J.Physiol.Paris)》92,375-378(1998)。
[0157] 8.R.拉哈密(R.Rahimi),S.尼克法(S.Nikfar),M.阿卜杜拉希(M.Abdollahi)《, 通过肟处理的急性人类有机磷酸酯中毒患者的增加的发病率和死亡率:临床试验的综合分析
(Increased morbidity and mortality in acute human organophosphate-poisoned 
patients treated by oximes:A meta-analysis of clinical trials)》《.人类与实验毒理学(Hum.Exp.Toxicol.)》25,157-162(2006)。
[0158] 9.A.卡拉库什(A.Karakus)等人《加, 护病房和新颖治疗法中用高剂量的阿托品治疗的有机磷酸酯中毒案例(Cases of organophosphate poisoning treated with high-
dose of atropine in an intensive care unit and  the novel treatment 
approaches)》《. 毒理学与工业卫生(Toxicol.Ind.Health)》30,421-425(2012)。
[0159] 10.F.纳颂(F.Nachon),X.巴佐罗托(X.Brazzolotto),M.托伐斯雷特(M.Trovaslet),P.马森(P.Masson)《, 基于酶的神经剂生物清除剂的开发进展(Progress 
in the development of enzyme-based nerve agent bioscavengers)》《. 化学生物学相互作用(Chem.Biol.Interact)》.206,536-544(2013)。
[0160] 11.J.J.西隆(J.J.Ceron),F.特克勒斯(F.Tecles),A.特伐炅维西特(A.Tvarijonaviciute)《, 血清氧磷酶1(PON1)测量:更新(Serum paraoxonase1(PON1)
measurement:An update)》《. BMC兽医研究(BMC Vet.Res.)》10,74(2014)。
[0161] 12.D.洛楚(D.Rochu),E.卡布瑞尔(E.Chabriere),P.马森(P.Masson)《,人类氧磷酶:有机磷中毒的有前景治疗前方法和疗法(Human paraoxonase:A promising approach 
for pre-treatment and therapy of organophosphorus poisoning)》.《毒理学
(Toxicology)》233,47-59(2007)。
[0162] 13.B.P.多克特(B.P.Doctor),A.萨克纳(A.Saxena)《, 针对有机磷酸酯毒性保护人类的生物清除剂(Bioscavengers for the protection of  humans against 
organophosphate toxicity)》《.化学生物学相互作用(Chem.Biol.Interact.)》157-158,
167-171(2005)。
[0163] 14.F.沃瑞克(F.Worek),M.科勒(M.Koller),H.蒂尔曼(H.Thiermann),L.斯齐尼克(L.Szinicz)《,有机磷酸酯中毒的诊断方面(Diagnostic aspects of organophosphate poisoning)》《. 毒理学(Toxicology)》214,182-189(2005)。
[0164] 15.C.M.胡(C.M.Hu),R.H.方(R.H.Fang),J.库普(J.Copp),B.T.卢克(B.T.Luk),L.张(L.Zhang),《吸收孔形成毒素的仿生纳米海绵(A biomimetic nanosponge that 
absorbs pore-forming toxins)》《. 自然纳米技术(Nat.Nanotechnol.)》8,336-340
(2013)。
[0165] 16.C.M.胡(C.M.Hu),L.张(L.Zhang),S.阿利亚(S.Aryal),C.蒋(C.Cheung),R.H.方(R.H.Fang)《, 红细胞膜伪装聚合纳米粒子作为仿生传递平台(Erythrocyte membrane-
camouflaged polymeric nanoparticles as a biomimetic delivery platform)》《. 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》108,10980-10985(2011)。
[0166] 17.C.M.胡(C.M.Hu),R.H.方(R.H.Fang),B.T.卢克(B.T.Luk),L.张(L.Zhang),《用于安全和有效疫苗接种的纳米粒子截留的毒素(Nanoparticle-detained toxins for 
safe and effective vaccination)》《. 自然纳米技术(Nat.Nanotechnol.)》8,933-938
(2013)。
[0167] 18.J.A.库普(J.A.Copp)等人,《使用仿生纳米粒子清除病理学抗体(Clearance of pathological antibodies using biomimetic nanoparticles)》《.美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》111,13481-13486(2014)。
[0168] 19.C.M.胡(C.M.Hu)等人《, 经由上而下细胞膜涂布法‘自身标记’官能化纳米级粒子(functionalization of nanoscale particles through a top-down cellular membrane coating approach.)》《纳米尺度(Nanoscale)》5,2664-2668(2013)。
[0169] 20.H.哈勃特兹(H.Hrabetz)等人《, 发达国家的有机磷酸酯中毒-从现在到千禧年的唯一中心经验(Organophosphate poisoning in the developed world-a single 
centre experience from here  to the millennium)》.《化学生物学相互作用
(Chem.Biol.Interact)》.206,561-568(2013)。
[0170] 21.P.马森(P.Masson),《神经剂中毒的治疗方法的进化和观点(Evolution of and perspectives on therapeutic approaches to nerve agent poisoning)》《. 毒理学通讯(Toxicol.Lett.)》206,5-13(2011)。
[0171] 22.M.艾德斯顿(M.Eddleston)等人《, 严重有机磷杀虫剂中毒时初始阿托品化的速度-推荐方案的全身性比较(Speed of initial atropinisation in significant 
organophosphorus pesticide poisoning-A systematic comparison of recommended 
regimens)》《. 毒理学-临床毒理学杂志(J.Toxicol.Clin.Toxicol.)》42,865-875(2004)。
[0172] 23.H.蒂尔曼(H.Thiermann),F.沃勒克(F.Worek),K.科赫(K.Kehe)《,治疗急性化学战试剂中毒的局限性和难题(Limitations and challenges in treatment of acute 
chemical warfare agent poisoning)》《. 化学生物学相互作用(Chem.Biol.Interact.)》
206,435-443(2013)。
[0173] 24.J.卡萨(J.Kassa),K.穆西勒克(K.Musilek),J.Z.卡拉索法(J.Z.Karasova),K.库卡(K.Kuca),J.巴基噶(J.Bajgar)《, 如何提高神经剂中毒的解毒治疗功效的两种可能性(Two possibilities how to increase the efficacy of antidotal treatment of 
nerve agent poisonings)》.《药物化学微型评论(Mini Rev.Med.Chem.)》12,24-34
(2012)。
[0174] 25.P.马森(P.Masson),D.洛楚(D.Rochu)《, 针对毒性酯的催化生物清除剂,一种预防和治疗中毒的替代方法(Catalytic bioscavengers against toxic esters,an 
alternative approach for prophylaxis and treatments of poisonings)》《.自然学报(Acta Naturae)》1,68-79(2009)。
[0175] 26.M.瓦力亚维提(M.Valiyaveettil)等人《,催化生物清除剂氧磷酶1针对豚鼠中的沙林和梭曼暴露的保护性功效(Protective efficacy of catalytic bioscavenger,
paraoxonase 1against sarin and soman exposure in guinea pigs)》《. 生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)》81,800-809(2011)。
[0176] 27.M.瓦力亚维提(M.Valiyaveettil),Y.A.阿拉穆罕(Y.A.Alamneh),
[0177] B.P.多克特(B.P.Doctor),M.P.南比亚尔(M.P.Nambiar)《, 氧磷酶1用于防止神经剂和有机磷酸酯毒性的评估中的歧途(Crossroads in the evaluation of paraoxonase 
1for protection against nerve agent and organophosphate toxicity)》《. 毒理学通讯(Toxicol.Lett.)》210,87-94(2012)。
[0178] 28.Y.阿沙尼(Y.Ashani),S.匹斯廷内(S.Pistinner)《, 防止有机磷酸酯毒性所需的人类丁酰胆碱酯酶剂量上限的估算:基于数学的毒理动力学模型(Estimation of the 
upper limit of human butyrylcholinesterase dose required for protection 
against organophosphates toxicity:A mathematically based toxicokinetic 
model)》《. 毒理科学(Toxicol.Sci.)》77,358-367(2004)。
[0179] 29.A.萨克纳(A.Saxena),W.孙(W.Sun),J.M.菲多克(J.M.Fedorko),I.科普洛维特兹(I.Koplovitz),B.P.多克特(B.P.Doctor)《, 用人类血清丁酰胆碱酯酶预防来保护暴
露于多个致死剂量的梭曼或VX的豚鼠(Prophylaxis  with  human  serum 
butyrylcholinesterase protects guinea pigs exposed to multiple lethal doses 
of soman or VX)》《. 生物化学与药理学(Biochem.Pharmacol.)》81,164-169(2011)。
[0180] 30.O.柯亨(O.Cohen)等人《,聚乙二醇结合的重组型人类乙酰胆碱酯酶与血清人类丁酰胆碱酯酶作为有机磷酸酯化合物的生物清除剂的比较(Comparison  of 
polyethylene glycol-conjugated recombinant human acetylcholinesterase and 
serum human butyrylcholinesterase as bioscavengers of organophosphate 
compounds)》《. 分子药理学(Mol.Pharmacol.)》70,1121-1131(2006)。
[0181] 31.M.凡德哈默(M.Wandhammer)等人《, 人类丁酰胆碱酯酶针对神经毒性V剂的复杂立体选择性的结构研究(Structural study of the complex stereoselectivity of 
human butyrylcholinesterase for the neurotoxic V-agents)》《. 生物化学杂志
(J.Biol.Chem.)》286,16783-16789(2011)。
[0182] 32.B.D.亨(B.D.Henry)等人《, 经工程改造的脂质体在小鼠中螯合细菌外毒素并且防止严重创伤性感染(Engineered liposomes sequester bacterial exotoxins and 
protect from  severe invasive  infections in mice)》.《自然·生物技术
(Nat.Biotechnol.)》33,81-88(2014)。
[0183] 33.J.C.勒鲁(J.C.Leroux),《用于生物解毒的可注射奈米载剂(Injectable nanocarriers for biodetoxification)》《. 自然纳米技术(Nat.Nanotechnol.)》2,679-
684(2007)。
[0184] 34.R.H.方(R.H.Fang)等人《, 涂布用于抗癌疫苗接种和药物传递的纳米粒子的癌细胞膜(Cancer cell membrane-coated nanoparticles for anticancer vaccination 
and drug delivery)》《. 纳米通讯(Nano Lett.)》14,2181-2188(2014)。
[0185] 35.L.张(L.Zhang)等人《, 自组装的脂质-聚合物杂化纳米粒子:稳固药物传递平台(Self-assembled lipid-polymer hybrid nanoparticles:A robust drug delivery 
platform)》《. 美国化学学会·纳米(ACS Nano)》2,1696-1702(2008)。
[0186] 36.D.杨(D.Yang)等人,《脂质体月桂酸针对疮疱丙酸杆菌的抗微生物活性(The antimicrobial activity of liposomal lauric acids against Propionibacterium 
acnes)》《. 生物材料(Biomaterials)》30,6035-6040(2009)。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈