治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的工具包
阅读：692发布：2020-05-29
专利汇可以提供治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的工具包专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且治疗 恶性病状、自身免疫性 疾病 或传染病的部件 试剂 盒 ，该部件试剂盒包括在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞和单克隆 抗体 ，其中所述单克隆抗体的Fc区对CD16的亲和 力 大于多克隆免疫球蛋白的Fc区对CD16的亲和力。，下面是治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的工具包专利的具体信息内容。
1.一种治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的部件试剂盒，该部件试剂盒包括表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞，和单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的Fc区对CD16的亲和力大于多克隆免疫球蛋白的Fc区对CD16的亲和力。
2.根据权利要求1所述的部件试剂盒，其中，所述表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞是表面表达FcγRIII受体(CD16)的单核细胞、或由单核细胞或单核细胞前体衍生的表面表达FcγRIII受体(CD16)的细胞。
3.根据权利要求1或2所述的部件试剂盒，其中，所述由单核细胞或单核细胞前体衍生的表面表达CD16的细胞选自表达CD16的单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)、树突状细胞、和所有外周血单核细胞(或PBMC)。
4.根据权利要求3所述的部件试剂盒，其中，所述由单核细胞或单核细胞前体衍生的表面表达CD16的细胞是巨噬细胞。
5.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，由于所述单克隆抗体的Fc区对CD16的所述亲和力，所述单克隆抗体不会被多克隆免疫球蛋白所取代，特别是人血清中的那些多克隆免疫球蛋白。
6.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，所述单克隆抗体与所述
6 -1
由单核细胞或单核细胞前体衍生的细胞的CD16以大于2.10M 的亲和力结合。
7.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，所述单克隆抗体是以单克隆抗体组合物的形式产生的，在该单克隆抗体组合物中的每种抗体具有连接在Fcγ糖基化位点(根据Kabat的天冬酰胺297)上的N连接的糖链，其中在所述组合物的所有抗体的所述糖基化位点上的所有N连接的糖链中，岩藻糖的比例小于65％。
8.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，所述单克隆抗体针对的抗原选自抗原5C5(由肾癌细胞表达的肿瘤抗原)、B细胞受体、独特型(例如抗FVIII抑制剂抗体的独特型)、T细胞受体、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD45、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、CD154、黏蛋白1、黏蛋白2、黏蛋白3、黏蛋白
4、黏蛋白16、HM1.24(在多发骨髓瘤中过度表达的浆细胞特异性抗原)、生腱蛋白(细胞外基质的蛋白)、γ谷氨酰转肽酶、血管内皮生长因子、内皮生长因子受体、癌胚抗原、结肠特异性抗原p、胰岛素样生长因子、胎盘生长因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、S100蛋白(钙结合蛋白的多基因家族)、MART-1(与黑色素瘤相关的肿瘤分化抗原)、酪氨酸酶相关蛋白
1、酪氨酸酶相关蛋白2、100kDa糖蛋白、淀粉样蛋白、猕猴D抗原、I类和II类MHC分子(如HLA-DR)、突变基因(特别是致癌基因或肿瘤抑制基因)表达形成的抗原、源于某些已确定肿瘤表达的致癌基因病毒的抗原、在某些肿瘤中过度表达和某些正常组织轻微表达的普通抗原(如苗勒管激素的II型受体)、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染的细胞在膜上自身或非自身表达或暴露的分子(如磷脂酰丝氨酸)、和由致病体表达或分泌的蛋白(细菌毒素、细菌或寄生虫壁的蛋白复合物，例如HIV病毒、HBV、HCV和RSV的病毒囊膜糖蛋白)。
9.根据权利要求8所述的部件试剂盒，其中，所述单克隆抗体针对CD20。
10.根据权利要求9所述的部件试剂盒，其中，所述抗CD20抗体是由登录号为I-3314的保藏在CNCM的细胞株R509、或由登录号为I-3529的保藏在CNCM的细胞株R603产生的。
11.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，所述部件试剂盒同时地、依次地或单独地用于治疗中。
12.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，所述表面表达CD16的效应细胞对所述抗体的靶细胞具有细胞毒性活性，所述抗体与CD16的相互作用促进该细胞毒性活性。
13.根据前述权利要求中的任意一项所述的部件试剂盒，其中，在表达CD16的效应细胞的存在下，所述单克隆抗体通过ADCC活性或所述抗体的靶细胞的吞噬作用而诱导细胞毒性。
14.一种药物组合物，该药物组合物包括权利要求1-13中的任意一项所述的部件试剂盒，和药物可接受的赋形剂。
15.权利要求1-13中的任意一项所述的部件试剂盒在药物制备中的应用。
16.权利要求1-13中的任意一项所述的部件试剂盒在制备治疗恶性病状的药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的部件试剂盒的应用，所述药物用于治疗选自固体肿瘤和恶性血液病的恶性病状。
18.根据权利要求17所述的部件试剂盒的应用，其中，所述固体肿瘤选自黑色素瘤、癌、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。
19.根据权利要求18所述的部件试剂盒的应用，其中，所述癌选自由肾癌、乳腺癌、口腔癌、肺癌、胃肠道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、皮肤癌和睾丸癌所组成的组中。
20.根据权利要求17所述的部件试剂盒的应用，其中，所述恶性血液病选自淋巴组织增生、骨髓组织增生、骨髓发育不良综合征和B型NHL急性骨髓样白血病、急性或慢性B淋巴白血病、伯基特淋巴瘤、毛状白细胞白血病、急性和慢性骨髓样白血病、T淋巴瘤和白血病、霍奇金淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血病和多发性骨髓瘤。
21.权利要求1-13中的任意一项所述的部件试剂盒在制备预期治疗自身免疫性疾病和/或原发或继发炎症疾病的药物中的应用，所述疾病具有器官特异性或是全身的，并与致病的自身抗体相关或不相关。
22.根据权利要求21所述的部件试剂盒的应用，所述药物用于治疗自身免疫性疾病和/或原发或继发炎症疾病，所述疾病具有器官特异性或是全身性的，并与致病的自身抗体相关或不相关，所述疾病选自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、类风湿性多发性关节炎、传播性红斑狼疮、硬皮病、原发性干燥综合征、包括多发性硬化症在内的自身免疫多发性神经病、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、强直性脊椎关节炎、赖特综合征、痛风关节炎、乳糜泻、克罗恩病、桥本氏甲状腺炎、爱迪生病、自身免疫性肝炎、巴泽多病、溃疡性结肠炎、包括抗中性白细胞胞质抗体相关的系统性脉管炎在内的脉管炎、包括急性或慢性自身免疫血小板减少在内的自身免疫性血球减少和其他成人和儿童血液病并发症、自身免疫溶血性贫血、新生儿溶血病、冷凝集素疾病、血小板减少血栓紫癜和获得性自身免疫血友病；古德帕斯丘综合征、膜外肾病、自身免疫大疱皮肤病、重症肌无力、混合性冷沉球蛋白血症、银屑病、幼年型慢性关节炎、炎症性肌炎、皮肌炎和包括抗磷脂综合征在内的儿童系统性自身免疫病。
23.权利要求1-13中的任意一项所述的部件试剂盒在制备治疗传染病的药物中的应用。
24.根据权利要求23所述的部件试剂盒的应用，所述药物用于治疗选自以下的传染病：由病毒(人类免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒或EBV、巨细胞病毒或CMV、肠病毒、甲型、乙型和丙型流感病毒引起的流感、多核呼吸病毒或SRV、或HTLV)、细菌和/或它们的毒素(破伤风、白喉、肺炎双球菌、脑膜炎球菌、包含甲氧西林抗性形式的葡萄球菌、克雷伯氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、肠道菌或包括医源性疾病的抗生素抗性病状)、寄生虫(疟疾、利什曼虫病、锥虫病)诱发的疾病；新出现的疾病，例如切昆汞亚热、禽流感、严重急性呼吸综合征病毒或SARS、引起出血性发热(如埃博拉或登革热)的病毒或西尼罗病毒；以及，与生物恐怖主义相关的那些疾病，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花和痘病毒、兔热病、出血性发热剂、普鲁斯病、葡萄球菌B肠毒素、白喉毒素或病毒性脑炎。
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技术领域
背景技术
[0002] 在研究中越来越多地使用的抗体也是诊断和治疗中选择的工具，它们可替代常规治疗。
[0004] 最近的研究集中于改善抗体的效力，更特别地集中于对它们恒定Fc区的操作。后者负责抗体的“效应”特性，因为其可动员免疫系统的效应细胞和补体蛋白。通过在特定效应细胞上存在的糖蛋白(即Fc受体(FcR))使这种能力成为可能。一旦抗体通过其可变区固定在靶抗原上，这些受体能与抗体的恒定区结合。抗体Fc区与效应细胞携带的FcR的结合引发后者中细胞毒性机制的激活，如吞噬作用和ADCC(依赖抗体的细胞毒性或抗体依赖细胞介导的细胞毒性)。在自身免疫性疾病中，天然作用为保护生物体免受侵犯的免疫系统在没有外来体时引发炎症反应，从而其本身通过“意外地”攻击自身分子导致组织损伤。不同的自身免疫性病状影响身体的不同组织或不同功能。例如，对于患有多发性硬化症的那些患者影响脑，对于患有克罗恩病(Crohn’s disease)的患者靶向肠，对于患有类风湿性多发性关节炎的患者影响滑液、骨和软骨。
[0005] 自身免疫性疾病发展期间，可能发生几种现象，如一种或多种类型的组织的渐进坏死、器官的非正常生长或受影响的器官的一种或多种功能的改变。自身免疫性疾病中最常受影响的组织或器官是造血细胞、血管、结缔组织、内分泌腺、肌肉、关节和皮肤。自身免性疫疾病通常与慢性炎症性病状相关。最常见的情况是两类炎症性关节炎：类风湿性多发性关节炎和幼年型类风湿性关节炎。关节炎是表示关节炎症的通用术语。
[0006] 很多治疗有许多副作用或不能完全防止疾病的发展。目前没有理想的治疗，不能治愈患者，最终显然需要更有效的且能治愈以上所有病状的新型疗法。
[0007] 因为B淋巴细胞(LB)是产生通常负责自身免疫性疾病发展的自身抗体的细胞，通过给药这种细胞类型的特异性单克隆抗体来破坏它们可能对患者有利，如近来核准的用于治疗类风湿性多发性关节炎的利妥昔单抗(rituximab)所表现出的。
[0008] 而且，尽管在改善卫生状况、免疫法和抗微生物疗法上有相当的进步，传染病仍是现代医学中的持久且严重的难题。最普遍的疾病普通感冒是与最可怕的疾病AIDS(获得性免疫缺陷综合征)同类的传染病。已证实某些神经失调类疾病(如退化性疾病)事实上与感染有关。
[0009] 传染病在未来仍是主要的医学难题。
[0010] 传染病中，单克隆抗体可能发挥两种互补的作用：在感染的急性阶段期间中和致病剂或所分泌毒素的作用，和在向慢性阶段过渡期间破坏储存细胞的作用。
[0011] 破坏能低噪复制致病剂的宿主细胞可防止疾病发展至慢性阶段，最常见在严重病状(如自身免疫性疾病或癌症)发展的最终进入慢性阶段。尽管目前存在真实需求，但在慢性阶段的治疗中几乎没有有效的抗感染治疗。另一方面，随着交叉抗药性的发展，在感染的急性阶段期间小分子(抗生素、抗寄生的、抗病毒的)的有益效应不断减弱。因此细菌对抗生素表现出的多重抗药性导致了一个公共健康难题，6-7％的住院治疗患者都伴随着或多或少的严重医院交叉感染，或每年每1.5亿住院治疗患者中接近750000例有医院交叉感染(http://www.senat.fr/rap/r05-21/r05-4211.html#toc13)。每年医院交叉感染总共造成9000人死亡，其中4200位涉及的患者在他们所入住医院期间短期内不会有重要的预后。(http://www.senat.fr/rap/r05-421/r05-4213.html).
[0012] 因此，看来需要开发可为医生和他们的患者提供可选择的治疗的新型药物。
[0013] 肿瘤是由细胞增殖失控引起的瘤块，其可以是良性或恶性的。良性肿瘤通常保持在局部不动。恶性肿瘤通称为癌。术语“恶性”通常指能够侵入和破坏邻近结构并扩散至更远位置的肿瘤，最后导致患者死亡(Robbins andAngell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-122)。癌可在许多不同位置发生并随其组织起源的功能而表现不同。目前，治疗癌症的手段是外科手术，化学疗法，激素疗法，和/或放射疗法，以消灭患者身上存在的肿瘤细胞(Stockdale，1998，″Principles of Cancer PatientManagement″，in Scientific American：Medicine，vol.3，Rubenstein andFederman，Eds.，Chapter 12)。所有这些治疗都有主要缺陷。例如，尽管大量不同化学分子的有效性，但化学疗法导致许多副作用，如严重的反胃、骨髓发育不全、免疫抑制等。某些这类影响严重时会迫使医生中止治疗。此外，尽管以几种化学分子的组合给药，但是大部分肿瘤细胞有抗药性或形成对化疗剂的抗药性。事实上，对当前方案中对特定给药药剂有抗药性的细胞不幸地也对其他药物有抗药性，包括通过不同于治疗方案中给药药剂所用的机制起作用的那些药剂。被称多药抗药性的这种现象通常是标准化疗方案治疗失败的原因。
[0014] 因此，确实需要新型的抗癌治疗，尤其是治疗常规疗法(如外科手术、放射疗法、化学疗法或激素疗法)难以治愈的癌症。
[0015] 一个有前景的可选方案是免疫疗法，其中通过肿瘤抗原特异性的抗体特异地靶向肿瘤细胞。在利用免疫反应的特异性方面进行了主要的努力，例如杂交技术已促使了特异性针对肿瘤细胞表达的抗原的单克隆抗体的开发(Green M.C.等.，2000Cancer Treat Rev.，26：269-286；Weiner L.M.，1999Semin Oncol.26(suppl.14)：43-51)。
[0016] 宿主有害细胞或致病剂的消除对应于所希望的单克隆抗体的效能机制，与目标病状无关。从而关键的是要改善这些抗体以使其与患者免疫系统的效应细胞更好地相互作用。
[0017] 慢性淋巴白血病B(LLC-B)，一种以B淋巴细胞(LB)的恶性增殖为特征的疾病，是最常发的白血病形式。目前的治疗实质是基于节制于疾病早期的治疗。在临床或血液病学症候学中，传统地是单独以皮质激素类或结合抗有丝分裂分子来治疗患者。对于大部分患者，或长或短时间会出现对治疗的抗性并通常结果是以化疗抗性细胞的出现而导致治疗失败。化学治疗带来严重的副作用，特别是骨髓毒性从而产生可导致患者出现严重感染、甚至有时死亡的免疫缺陷。评估了许多关注于尽可能特异性消除肿瘤B细胞的治疗途径。通过肿瘤(和正常)LB对CD20分子的特异性表达，可开发基于利用人类抗CD20单克隆抗体的治疗。
[0018] 单个非放射标记的抗CD20单克隆抗体，利妥昔单抗( Genentech和TM
Mabthéra ，Roche)，是目前可商购的。其标明用于治疗患有III-IV期的滤泡淋巴瘤的患者并可与化学疗法联合用于治疗患有扩散CD20阳性大B细胞攻击性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者。因为在单独使用时其效能保持有效且通常比较温和(Teeling等.2004，Blood
104(6)：1793-800)，最常将其与化学疗法联合使用。
Mabthéra ，Roche)，是目前可商购的。其标明用于治疗患有III-IV期的滤泡淋巴瘤的患者并可与化学疗法联合用于治疗患有扩散CD20阳性大B细胞攻击性非霍奇金淋巴瘤(NHL)的患者。因为在单独使用时其效能保持有效且通常比较温和(Teeling等.2004，Blood
104(6)：1793-800)，最常将其与化学疗法联合使用。
[0019] 在LLC-B患者中评估了利妥昔单抗。当将其用于单一疗法中时该抗体仅表现出轻微效力，目前将其与化学疗法联合给药。
[0020] 许多原因可解释在LLC-B患者中利妥昔单抗单一疗法的失败：首先，在体外利妥昔单抗对B细胞有轻微的ADCC活性，而与正常LB相反且在NHL中，LLC-B的LB仅在其表面表达很少的CD20分子(通过流式细胞计数法的定量检测，密度约小5倍)，从而限制了细胞表面上的抗体数量以及相关的细胞毒性功能(尤其是ADCC和活性补体)。
[0021] 可见，集中于包含特异性针对CD20抗原的抗体且能够有效地引起肿瘤细胞(包括轻度表达抗原的那些肿瘤细胞)裂解的可选疗法是很重要的。
[0022] 自身免疫的效应细胞(巨噬细胞)在抗肿瘤反应中发挥了主要作用。它们以失活形式天然存在(在不存在任何病状时)，可通过不同途径在体外或体内将其激活，如病原体的入侵或与免疫复合体表面表达的受体(通过抗体Fc区与FcR结合)的结合或细胞因子，特别是炎症现象期间产生的免疫调节分子。激活诱导细胞溶解从而增加巨噬细胞抗肿瘤活性(Adams D.和Hamilton T.：Activation of macrophages for tumour cell kill：effector mechanismand regulation.In Heppner&Fulton(Eds)，Macrophages and cancer.CRCPress，1988，p.27；Fidler I.：Macrophages and metastases.A biological approachto cancer therapy.Cancer Res，45：4714，1985)。
[0023] 此外，巨噬细胞或源于单核细胞或其前体的其它细胞是抗原呈递细胞。由于它们具有强大的将与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原性肽内吞、消化和呈递给T淋巴细胞的能力，它们能够诱导特异性的免疫反应。
[0024] 为增加利妥昔单抗效力的目标，在体外裂解LLC-B原发性细胞的实验中评估了利妥昔单抗与在干扰素-γ(IFN-γ)存在下先体外后体内激活的巨噬细胞的结合(Lefebvre ML，Stefan W.Krause，Salcedo M，Nardin A.Ex vivoactivated human macrophages kill chronic lymphocytic leukemia cells in thepresence of Rituximab：mechanism of antibody-dependent cellular cytotoxicityand impact of human serum.J.Immunother；vol.29，n°4：388-397，2006)。结果表明增加人血清的浓度强烈地抑制在利妥昔单抗存在下激活的巨噬细胞对LLC-B的强裂解。通过利妥昔单抗-LLC细胞复合体与巨噬细胞表面表达的多种FcR的结合，这种抑制与血清中存在的多克隆免疫球蛋白竞争相关联。这种抑制的强度取决于所用的利妥昔单抗的浓度和效应细胞∶靶细胞的比例(效应细胞∶靶细胞或E∶T)。
[0025] 尽管存在许多治疗癌症、自身免疫性疾病或传染病的治疗工具，仍存在相对现存产品具有明显更强效力和更好安全性的新型免疫疗法产品的实质需求。
发明内容
[0026] 本发明的第一目的是治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的部件试剂盒(a kit of parts)，该部件试剂盒包括在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞和单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的Fc区对CD16的亲和力大于多克隆抗体的Fc区对CD16的亲和力。
[0027] 有利地，在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞是在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的单核细胞，或在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的由单核细胞或单核细胞前体衍生的细胞。
[0028] 有利地，该细胞选自表达CD16的单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)，树突状细胞和全部外周血单核的细胞(外周血单核的细胞或PBMC)。
[0029] 有利地，在其表面表达CD16的细胞选自表达CD16的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞。
[0030] 更具体而言，在其表面表达CD16的单核细胞或单核细胞前体衍生的细胞是巨噬细胞。
[0031] 有利地，由于所述CD16的单克隆抗体的Fc区的高亲和力，所述单克隆抗体不会被多克隆免疫球蛋白(尤其是血清中存在的那些)所取代。
[0032] 有利地，所述单克隆抗体与所述单核细胞或单核细胞前体衍生的细胞的CD16以6 -1
大于2.10M 的亲和力相结合
大于2.10M 的亲和力相结合
[0033] 在一个特别有益的方式中，以单克隆抗体组合物的形式产生所述单克隆抗体，其中每个抗体具有与Fcγ糖基化位点(天冬酰胺297，根据abat)的N连接的糖链，其中在所述组合物的所有抗体的所述糖基化位点上的N连接糖链中，岩藻糖的比例小于65％。
[0034] 在本发明的特定实施方式中，所述单克隆抗体针对的抗原选自抗原5C5(由肾癌细胞表达的肿瘤抗原)、BCR(B细胞受体)、独特型(例如抗FVIII抑制剂抗体的独特型)、TCR(T细胞受体)、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD45、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a、b、c、d)、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、CD154、MUC1(黏蛋白1)、MUC2(黏蛋白2)、MUC3(黏蛋白3)、MUC4(黏蛋白4)、MUC 16(黏蛋白16)、HM1.24(在多发骨髓瘤中过度表达的浆细胞特异性抗原)、生腱蛋白(细胞外基质的蛋白)、GGT(γ-谷氨酰转肽酶)、VEGF(血管内皮生长因子)、EGFR(内皮生长因子受体)、CEA(癌胚抗原)、CSAp(结肠特异性抗原p)、ILGF(胰岛素样生长因子)、胎盘生长因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、蛋白S100(钙结合蛋白的多基因家族)、MART-1(与黑色素瘤相关的肿瘤分化抗原)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)、gp100(100kDa糖蛋白)、淀粉样蛋白、猕猴D抗原、I类和II类MHC分子(如HLA-DR)、突变基因(特别是致癌基因或肿瘤抑制基因)表达形成的抗原、某些已确定肿瘤表达的致癌基因病毒衍生的抗原、在某些肿瘤中过度表达和某些正常组织中轻微表达的普遍抗原(如苗勒管(Mullerian)激素的II型受体)、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染细胞在膜上自身或非自身表达或暴露的分子(如磷脂酰丝氨酸)、和由致病剂(细菌毒素、细菌或寄生虫壁的蛋白复合物、病毒囊膜糖蛋白(例如来自HIV病毒、HBV、HCV和RSV等))表达或分泌的蛋白。
[0035] 优选地，所述单克隆抗体针对CD20。
[0036] 在本发明的优选实施方式中，抗CD20抗体是由2004年11月8日以登录号I-3314保藏在CNCM的细胞株R509产生的，或由2005年11月29日以登录号I-3529保藏在国立微生物保藏中心(CNCM)的细胞株R603产生的(CNCM：Collection Nationale de Culture de Microorganismes，Institut Pasteur，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex15-法国)。
[0037] 有利地，本发明的部件试剂盒预期同时地、依次地或单独地用于治疗。
[0038] 有利地，在本发明的部件试剂盒中，在其表面表达CD16的效应细胞对通过抗体与CD16的作用所优选的所述抗体靶向的细胞具有细胞毒性活性。
[0039] 有利地，在本发明的部件试剂盒中，单克隆抗体通过ADCC活性或通过所述抗体靶向的细胞的吞噬作用在表达CD16效应细胞的存在下诱导细胞毒性。
[0040] 本发明的另一目的是含有本发明所述的部件试剂盒和药物可接受赋形剂的药物组合物。
[0041] 本发明的另一目的涉及本发明的部件试剂盒在药物制备中的应用。
[0042] 本发明的另一目的涉及本发明的部件试剂盒在制备治疗恶性病状的药物中的应用。
[0043] 有利地，所述恶性病状选自固体肿瘤和恶性血液病。有利地，所述固体肿瘤选自黑色素瘤、癌、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。有利地，所述癌是选自由肾癌、乳腺癌、口腔癌、肺癌、胃肠道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、皮肤癌和睾丸癌所组成的组中。
[0044] 有利地，恶性血液病是选自淋巴组织增生、骨髓组织增生、骨髓发育不良综合征和急性骨髓样白血病(例如B型NHL)、急性或慢性B淋巴白血病、伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤、毛状白细胞(tricholeucocyte)白血病、急性或慢性骨髓样白血病、T淋巴瘤和白血病、霍奇金(Hodgkin’s)淋巴瘤、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血病和多发性骨髓瘤。
[0045] 本发明的另一目的涉及本发明的部件试剂盒在制备治疗自身免疫性疾病和/或原发或继发炎症疾病的药物中的应用，所述疾病具有器官特异性或是全身性的，并与致病的自身抗体相关或不相关。
[0046] 有利地，自身免疫性疾病和/或炎症疾病是选自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、类风湿性多发性关节炎、传播性红斑狼疮、硬皮病、原发性干燥综合征(或古热罗-舍格伦(Gougerot-Sjogren)综合征)、自身免疫多发性神经病(例如多发性硬化症)、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、强直性脊椎关节炎、赖特(Reiter’s)综合征、痛风关节炎、乳糜泻、克罗恩(Crohn’s)病、桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎、爱迪生(Addison’s)病、自身免疫肝炎、巴泽多(Basedow’s)病、溃疡性结肠炎、脉管炎(如与ANCA(抗中性白细胞胞质抗体)相关的系统性脉管炎)、自身免疫性血球减少和其他成人和儿童血液病并发症(例如急性或慢性自身免疫性血小板减少)、自身免疫溶血性贫血、新生儿溶血病(HDN)、冷凝集素疾病、血小板减少血栓紫癜和获得性自身免疫性血友病；古德帕斯丘(Goodpasture’s)综合征、膜外肾病、自身免疫性大疱皮肤病、重症肌无力、混合性冷沉球蛋白血症、银屑病、幼年型慢性关节炎、炎症性肌炎、皮肌炎和儿童系统性自身免疫病(包括抗磷脂综合征)。
[0047] 本发明的另一目的涉及本发明的部件试剂盒在制备治疗传染病的药物中的应用。
[0048] 有利地，所述传染病是选自由病毒(人类免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒(HBV、HCV)、非洲淋巴细胞瘤病毒或EBV、巨细胞病毒或CMV、肠病毒、甲型、乙型和丙型流感病毒、多核呼吸病毒或SRV、或HTLV)、细菌和/或它们的毒素(破伤风、白喉、肺炎双球菌、脑膜炎球菌、包含甲氧西林抗性形式的葡萄球菌、克雷伯氏(Klebsiellas)菌、志贺氏(Shigellas)菌、假单胞菌、肠道菌或包括医源性疾病在内的抗生素抗性病状)、寄生虫(疟疾、利什曼虫病、锥虫病)诱发的疾病；以及新出现的疾病，例如切昆汞亚热(Chikungunya)、禽流感、严重急性呼吸综合征病毒或SARS、引起出血性(热如埃博拉(Ebola)或登革(Dengue)热)的病毒或西尼罗(WestNile)病毒；和与生物恐怖主义相关的那些，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花和痘病毒、兔热病(Tularaemia)、出血性发热剂、普鲁斯(brucellosis)病、葡萄球菌B肠毒素、白喉毒素或病毒性脑炎。
[0049] 部件试剂盒
[0050] 术语“部件试剂盒”表示药物组合，该药物组合的基本组分由于它们的常规意义形成功能单位。
[0051] 更具体而言，本发明的部件试剂盒是含有作为活性物质的在其表面表达CD16的效应细胞和单克隆抗体的药物组合，其中所述单克隆抗体的Fc区对CD16的亲和力大于多克隆免疫球蛋白Fc区对CD16的亲和力，所述效应细胞和单克隆抗体可以同时地、单独地或依次地应用于治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病。
[0052] 所述单克隆抗体和所述在其表面表达CD16的效应细胞共同形成单个部件试剂盒形式的组合物，其组分对于同时、单独或随时间交错应用均有效。本发明部件试剂盒还可以是混合物的形式。
[0053] 由于新型的常规效力和常规意义，所述单克隆抗体和所述表达CD16的效应细胞形成功能单位。
[0054] 在其表面表达FcγRIII受体(CD16)的效应细胞
[0055] “在其表面表达CD16的效应细胞”表示在由免疫复合物的结合诱导的细胞激活后具有效应子活性(尤其是ADCC的细胞毒性活性、吞噬作用或在另一领域中的抗原呈递和体液反应特性)的任何细胞，所述免疫复合物由抗体与FcγRIII或CD16膜受体特异性抗原结合而形成。这些细胞需要在其表面表达CD16。
[0056] 有利地，这种细胞可以是源于在其表面表达CD16的单核细胞或单核细胞前体衍生细胞的细胞、CD16+单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞，且不限于此。
[0057] 因此，还可扩展至天然杀伤(NK)细胞和PBMC(外周血单核细胞)细胞。以“NK细胞”表示能够在没有先前免疫下自发细胞毒性活性的巨大颗粒淋巴细胞。以“PBMC”表示任何外周血中的单核的细胞(单核细胞和淋巴细胞)，且在其表面表达CD16。
[0058] 由于单克隆抗体Fc区和细胞表达的CD16受体之间的结合，在存在本发明的单克隆抗体时，这种细胞能够诱导ADCC活性。
[0059] 所述效应细胞优选是巨噬细胞。
[0060] 所述CD16+单核细胞(即在其表面表达CD16)是在其膜表面表达CD16的单核细胞亚群。CD16+单核细胞能够吞噬和诱导ADCC活性。
[0061] 巨噬细胞是固有免疫的主要参与者之一并参与了适应性免疫。它来自于单核细胞的分化。
[0062] 以举例方式，巨噬细胞可以来源于富含单核细胞的细胞悬浮液，包括在适宜的含有M-CSF(单核细胞集落刺激因子)或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的培养基(Roswell Park Memorial Institute的 培养基)中培养的步骤以诱导单核细胞分化成巨噬细胞。例如可在培养6-7天后产生巨噬细胞。
[0063] 还可以通过由在健康个体上执行的细胞单采法(cytapheresis)获得的富含血细胞的组合物，并通过在含有M-CSF(单核细胞集落刺激因子)或GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)的培养基中培养单核细胞的步骤来制备巨噬细胞。
[0064] 任选地，可以有利地在该培养步骤之前先进行分离步骤，在由细胞单采法获得的血液衍生组合物中首先分离单核的细胞、其次红细胞、粒细胞和部分血小板，再进行清除步骤，清洗部分血小板和之前步骤剩余的抗凝血药。
[0065] 通常通过对含有单核细胞的培养液进行密度梯度离心来实现上述细胞悬浮液的单核细胞富集步骤，特别是在密度约为1.0-1.3g/ml的溶液中(如密度为1.077g/ml的Ficoll Paque型溶液(Pharmacia))中离心。
[0066] 任选地，含有巨噬细胞、和/或树突状细胞、和/或NK细胞的组合物可从富含血细胞、尤其是白血球(如单核细胞或其前体)的人源血液衍生组合物获取，特别是如通过细胞单采法获取的血液衍生组合物，所述方法包括以下步骤：
[0067] ·有利地，以适宜的生理溶液稀释所述血液衍生组合物，特别是按其约2-3倍体积；
[0068] ·洗涤所述血液衍生组合物，有利地通过简单离心并洗涤由上述离心获得的沉淀，在适宜的生理洗涤溶液中特别是在袋(转移袋类型)中回收沉淀，例如通过在所述袋上施加压力，然后将所述洗涤溶液排至另一袋或其他容器中，以恢复组合物并去除了任何可能的抗凝血药和任何多种残渣，并清除了血小板；
[0069] ·如果需要，重复上述洗涤步骤，特别是1-2次；
[0070] ·培养经上述洗涤步骤之后获得的血液衍生组合物中含有的细胞，通过将该血液衍生组合物置于适宜培养基中，特别是在有利的疏水袋中放置约6-10天(特别是6-7天)；
[0071] 该培养步骤是：
[0072] ·在清除除可能存在于起始组合物中的单核细胞或其前体以外的所有或部分组分(特别是血小板、红细胞、粒细胞和淋巴细胞)的清除步骤之前，将在培养步骤之前的洗涤步骤之后获得的血液衍生组合物与针对所有或部分上述组分的抗体接触，并回收含有单核细胞或其前体的溶液，而所有或部分上述组分保留固定在抗体上，和/或在清除除巨噬细胞以外的所有或部分组分的清除步骤之后，将培养步骤之后获取的血液衍生组合物与如上文所述的抗体接触，并回收含有巨噬细胞的溶液，而所有或部分上述组分保留固定在抗体上；
[0073] ·和/或在纯化步骤之后，特别是通过洗脱，物理地将巨噬细胞与培养步骤之后获得的组合物的其它组分分离，特别是与血小板、红细胞和淋巴细胞分离。
[0074] 更普遍的是，获取在其表面表达CD16的巨噬细胞的任何其它方法也可应用于本发明。
[0075] 此外，在本发明中以“巨噬细胞”表示从单核细胞获得的任何细胞，按照已确定的方法进行分化，从而在细胞中表达以下膜标记：CD14+、CD16+、CD32+、CD64+、CD11b+。尤其是，CD16+细胞的百分比为至少20％、优选50％、或70％或包含在70-100％之间。
[0076] 单克隆抗体
[0077] 为本发明的目的，“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”的表述是指源于细胞克隆的并具有同一和单一特异性的抗体分子制备物。
[0078] 免疫球蛋白分子是由4条多肽链组成：相同的2条50kDa重链(H，重)和相同的2条25kDa轻链(H，轻)。轻链由可变结构域V和恒定结构域C两个结构域组成，其在空间上彼此独立折叠，称为VL和CL。重链也包含称为VH的V结构域和称为CH1-CH4的3或4个C结构域。每个结构域包含约110个氨基酸且结构相当。2条重链通过二硫桥连接而且每条重链也通过二硫桥连接一条轻链。
[0079] 可变部分形成决定抗体对抗原的特异性的区域，而恒定部分可与效应细胞的Fc受体相互作用或与如补体蛋白的分子相互作用以形成不同的功能特性。
[0080] 关于重链和轻链的可变区，可观察到在序列上可变性分布不均等。实际上，可变区是由4个称为“框架”(FR)(FR1-FR4)的仅轻微变化的区域和具有极强可变性的区域(总共3个“高变”区或CDR(互补决定区)(CDR1-CDR3))所组成的。
[0081] 有利地，本发明的抗体是嵌合的、人源化的或人类的抗体。
[0082] 本发明抗体优选是嵌合的。
[0083] 以“嵌合抗体”表示轻链和重链的可变区与轻链和重链的恒定区属于不同物种的抗体。因此，本发明所述的抗体还具有鼠、大鼠、兔、猴、山羊、或人源的可变区和属于与产生抗体不同的物种的恒定区。在这个方面，可能采用哺乳动物的所有族和种属，尤其是人、猴、大鼠和小鼠、猪、牛、马、猫、犬、例如还有鸟。更优选的是，本发明的抗体的每条重链和每条轻链的恒定区是人类恒定区。本发明这个优选实施方式可降低抗体在人体内的免疫原性从而改善其在对人的给药治疗期间的效力。
[0084] 在本发明的优选实施方式中，本发明的抗体的每条轻链的恒定区是κ型的。任何同种异型(allotype)都适宜于实现本发明，例如Km(1)、Km(1、2)、Km(1、2、3)或Km(3)。
[0085] 在本发明的另一实施方式中，本发明的抗体的每条轻链的恒定区是λ型的。
[0086] 在本发明的特定方面，特别是本发明的抗体的每条重链和每条轻链的恒定区是人类恒定区时，抗体每条重链的恒定区是γ型的。根据这种变化，所述抗体的每条重链的恒定区可以是γ1型、γ2型、γ3型，这三个类型的恒定区具有配合人类补体的特殊特性，或甚至可以是γ4型。重链具有γ型恒定区的抗体被归类为IgG。G型免疫球蛋白(IgG)是由彼此通过二硫桥连接的2条重链和2条轻链构成的异二聚体。在每条链的N末端位置由可变区或可变结构域(重排基因V-J编码轻链的而V-D-J编码重链)构成，其对抗体针对的抗原是特异性的，在C末端位置，轻链是由一个CL结构域构成的恒定区或重链是由3个结构域(CH1、CH2和CH3)构成的恒定区。可变结构域与重链和轻链的CH1和CL结构域结合形成Fab片段，该Fab片段可通过非常灵活的铰链区与Fc区连接，使得每个Fab固定在其抗原靶点上，而介导抗体的效应特性的Fc区保持对效应分子(如FcγR和C1q受体)的易感性。由2个球形结构域Cγ2和Cγ3构成的Fc区在Cγ2结构域水平上被糖基化，2条链的每一条都存在连接于天冬酰胺297上的二分枝(biantenna)的N-多糖。
[0087] 抗体每条重链的恒定区优选是γ1型，因为这种抗体在最多数量的(人类)个体中表现出引发ADCC活性(抗体依赖的细胞毒性)的能力。在这个方面，任何同种异型都适宜于实现本发明，例如G1m(3)、G1m(1、2、17)、G1m(1、17)或G1m(1、3)。
[0088] 可利用本领域技术人员熟知的标准重组DNA技术来构建本发明的嵌合抗体，具体而言利用如在Morrison等.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81：6851-55(1984)所述嵌合抗体构建技术，其中DNA重组技术用于以人免疫球蛋白的相应区域置换源于非人哺乳动物抗体的重链恒定区和/或轻链恒定区。这种抗体及其制备方法也已记载在例如专利EP173494，文献Neuberger，M.S.等.，Nature 1985Mar 21-27；314(6008)：268-70.，以及文献EP 125023中。产生嵌合抗体的方法是本领域技术人员可普遍获取的。例如，可利用每条链的载体分别表达抗体的重链和轻链，或将它们整合到一个载体中。
[0089] 表达载体是核酸分子，该核酸分子中插入了编码抗体每条重链或轻链的可变区的核酸序列和/或优选人类的编码抗体每条重链或轻链的恒定区的核酸序列，以便将所述表达载体引入并保留在宿主中。这些外来核酸片段可以在宿主细胞中表达因为它具有进行表达的独立序列(启动子，多聚腺苷酸化序列)。载体可以是例如质粒，腺病毒，逆转录病毒或噬菌体，而宿主细胞可以是任何哺乳动物细胞，例如SP2/0、YB2/0、IR983F、Namalwa人骨髓瘤、PERC6、CHO细胞系(特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag14和P3X63Ag8.653。
[0090] 为了构建本发明的嵌合抗体的表达载体，可在PCR(聚合酶链式反应)扩增反应期间将合成的信号序列和适宜的限制性位点融合到可变区中。然后将所述可变区与抗体(特别是人IgG1)的恒定区结合。从而利用两个独立载体(每条链一个)或单个载体，将由此构建的基因克隆到在启动子(例如RSV启动子)的控制下和多聚腺苷酸化位点的上游。所述载体还提供本领域技术人员已知的筛选基因，例如dhfr基因、新霉素抗性基因。
[0092] 以人源化抗体表示含有来自于非人抗体的CDRs区而抗体分子的其他部分来自于一个(或多个)人类抗体的抗体。可按照本领域技术人员公知的CDR移植方法(“CDR移植”)制备这种抗体(美国专利5,225,539，US6,180,370；Jones等.，Nature
321(6069)：522-5.(1986)；Verhoeyen 等 .，Bioessays8(2)：74-8(1988)；Riechmann等 .，Nature 332：323-7(1988)；Queen C. 等 .，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(24)：
10029-33(1989)；Lewis A.P. 和 Crowe J.S.，Gene 101(2)：297-302(1991)；Daugherty BL 等 .，Nucleic Acids Res.19(9)：2471-6(1991)；Carter 等 .，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Singer 等 .，J.Immunol.150(7)：2844-57(1993)；Presta 等 .，J.Immunol.，151：2623(1993))。对为制备人源化抗体要移植的人类可变结构域的选择对于降低抗体免疫原性且不改变其对靶点亲和力很重要。在人源化抗体的制备方法中，鼠抗体的可变结构域序列与已知人类可变区的序列文库进行比对并保留与人类可变序列最接近的鼠序列作为人源化的FR区(“框架”)[Riechmann等.，Nature 332：323-7(1988)；
Queen C.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)：10029-33(1989)；Sims等.，J.Immunol.，
151：2296(1993)]。人FR区域的另一筛选方法是将每个鼠FR序列亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的序列和已知的人FR序列文库进行比对，例如为每个FR区选择最接近人FR序列的鼠序列[美国专利2003/0040606；Singer等.，J.Immunol.150(7)：2844-57(1993)；Sato K.and al，Mol.Immunol.31(5)：371-81(1994)；Leung S.O.等.，Mol.Immunol.32(17-18)：
1413-27(1995)]。另一方式是使用了来自于人类抗体重链或轻链的特定亚族的共有序列的特定FR区[Sato K.and al，Mol.Immunol.31(5)：371-81(1994)]。在大多数情况中通过消除位于人FRs中的某些关键残基以保留人源化抗体对其靶点的良好亲和力来完成CDR移植[Holmes M.A.and Foote J.，J.Immunol.158(5)：2192-201(1997)]。
321(6069)：522-5.(1986)；Verhoeyen 等 .，Bioessays8(2)：74-8(1988)；Riechmann等 .，Nature 332：323-7(1988)；Queen C. 等 .，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(24)：
10029-33(1989)；Lewis A.P. 和 Crowe J.S.，Gene 101(2)：297-302(1991)；Daugherty BL 等 .，Nucleic Acids Res.19(9)：2471-6(1991)；Carter 等 .，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Singer 等 .，J.Immunol.150(7)：2844-57(1993)；Presta 等 .，J.Immunol.，151：2623(1993))。对为制备人源化抗体要移植的人类可变结构域的选择对于降低抗体免疫原性且不改变其对靶点亲和力很重要。在人源化抗体的制备方法中，鼠抗体的可变结构域序列与已知人类可变区的序列文库进行比对并保留与人类可变序列最接近的鼠序列作为人源化的FR区(“框架”)[Riechmann等.，Nature 332：323-7(1988)；
Queen C.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)：10029-33(1989)；Sims等.，J.Immunol.，
151：2296(1993)]。人FR区域的另一筛选方法是将每个鼠FR序列亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)的序列和已知的人FR序列文库进行比对，例如为每个FR区选择最接近人FR序列的鼠序列[美国专利2003/0040606；Singer等.，J.Immunol.150(7)：2844-57(1993)；Sato K.and al，Mol.Immunol.31(5)：371-81(1994)；Leung S.O.等.，Mol.Immunol.32(17-18)：
1413-27(1995)]。另一方式是使用了来自于人类抗体重链或轻链的特定亚族的共有序列的特定FR区[Sato K.and al，Mol.Immunol.31(5)：371-81(1994)]。在大多数情况中通过消除位于人FRs中的某些关键残基以保留人源化抗体对其靶点的良好亲和力来完成CDR移植[Holmes M.A.and Foote J.，J.Immunol.158(5)：2192-201(1997)]。
[0093] 本发明的人源化抗体优选应用于体外诊断方法，或体内预防和/或治疗方法。
[0094] 本发明的嵌合或人源化抗体具有对人体有更佳耐受力的优势，且至少与起源抗体一样有效。在特定的有利方法中，所得的嵌合或人源化抗体具有相应天然抗体两倍的细胞毒性。在更为有利的方法中，所得的嵌合或人源化抗体的细胞毒性比相应天然抗体大10倍、或甚至100倍或优选大于500倍。
[0095] 以人类抗体表示每个区域都来自于人类抗体的抗体。这种抗体可源于携带人类抗体基因的转基因鼠或源于人类细胞[Jakobovits等.，Curr OpinBiotechnol.Oct；6(5)：561-6(1995)；Lonberg N.和D.Huszar.Internal Review ofImmunology 13：65-93(1995)；
Tomizuka K.等.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA97(2)：722-727(2000)]。
Tomizuka K.等.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA97(2)：722-727(2000)]。
[0096] 优选通过本领域技术人员已知的重组DNA技术制备本发明的人源化或人类嵌合抗体。优选通过例如选自SP2/0、YB2/0、IR983F、Namalwa人骨髓瘤、PERC6、CHO细胞系(特别是CHO-K-1、CHO-Lec10、CHO-Lec1、CHO-Lec13、CHO Pro-5、CHO dhfr-)、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、293-HEK、BHK、K6H6、NS0、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653且不限于此的分离细胞制备本发明的单克隆抗体。
[0097] 也可通过转基因动物的途径制备本发明的单克隆抗体。转基因是通过将外源DNA引入多细胞生物体的基因组中并可传递至其后代的分子遗传技术。传递至后代是在发育早期将所述DNA稳定整合到胚胎基因组中。
[0098] 例如，本发明范围内可能采用的转基因技术之一是将裸露DNA显微注射到受精哺乳动物卵细胞的原核或胚胎干细胞中，在一定数量的情况下其会导致部分显微注射的DNA整合到宿主基因组中。可以使用其它技术进行转基因，特别是本领域技术人员公知的将外源DNA引入活体细胞的技术，特别是电穿孔、通过磷酸钙沉淀方式的转染、通过经修饰的脂质体或脂类(如 (IN VITROGEN))的转染。
[0099] 优选通过转基因动物的乳制备本发明单克隆抗体。在这种方式中，编码目的蛋白的基因与在乳中特异性表达的基因调控元件(例如WAP基因的启动子、乳清酸性蛋白)结合。在显微镜下将制得的表达载体显微注射到单细胞期的哺乳动物胚胎中。然后将胚胎转入雌性受体中。
[0100] 例如，妊娠一个月后，在其基因组中整合了转基因的第一代哺乳动物(F0)出生，并通过耳活组织PCR分析对其进行鉴定。它们将作为产生第二代转基因哺乳动物的首建者(founders)。根据它们在乳中产生目的蛋白的效率选择首建者以用于产生第二代转基因兔(F1)。
[0101] 通过耳活组织的PCR分析鉴定F1代。然后以非转基因雄性的精子对性成熟的F1雌性受精。以机械手段收集乳并表征重组蛋白以便为大规模制备和发展纯化策略(GLP、pre-GMP、GMP)选择最佳株。
[0102] 平行地，按照FDA和欧洲范例的推荐收集F1转基因雄性的精子(主要精子库(Master Sperm Bank)，MSB)并冷冻保存在液氮中。该精子将被用于非转基因雌性的人工受精以产生第二代(F2)。收集F2转基因雄性的精子(工作精子库(Working Sperm Bank)，WSB)，并在15-20年内用于产生F3转基因雌性，该F3转基因雌性将在乳中产生产业数量的单克隆抗体。在例如专利EP 0527063中描述了这类技术。
[0103] Fcγ受体
[0104] CD16也称为III型Fcγ受体(FcγRIII)，是存在于许多免疫系统细胞中的受体。CD32(FcγRII)和CD64(FcγRI)以及CD16是IgG抗体重链恒定片段(Fc)的特异性受体。
免疫复合物通过IgG的Fc与免疫系统效应细胞中存在的这类CD16、CD32和CD64受体的结合激活了所述效应细胞，特别是激活免疫复合物吞噬作用。
免疫复合物通过IgG的Fc与免疫系统效应细胞中存在的这类CD16、CD32和CD64受体的结合激活了所述效应细胞，特别是激活免疫复合物吞噬作用。
[0105] 本发明的效应细胞在其细胞膜上表达3类Fc受体：CD16、CD32和CD64。
[0106] CD16受体传统上称为“低亲和力受体”，基本上是在单核细胞亚群的PMNs(多形核中性白细胞)、巨噬细胞、树突状细胞和天然杀伤细胞(NK细胞)中构成型表达。CD16涉及了多重效应功能，例如吞噬作用、免疫复合物或颗粒的调理作用、和ADCC活性。
[0107] 本发明部件试剂盒的单克隆抗体具有对本发明效应细胞中存在的Fc受体(尤其是对CD16)表现出强亲和力的Fc区。本发明描述了本发明的单克隆抗体的Fc区和部件试剂盒的效应细胞的CD16之间的协同作用。这种亲和力使得在含抗体和效应细胞的培养基中添加人多价血浆IgG(外周血的重要组分)对所述单克隆抗体和所述效应细胞结合而产生的ADCC活性没有或几乎没有影响。这是由于所述单克隆抗体的Fc区对CD16的亲和力大于生理条件中存在的人IgG的亲和力。因此，在体内不以血清IgG取代目的抗体，也不会降低在体外可观察到的ADCC活性。实际上，血浆和血清含有高浓度的多价免疫球蛋白(也称为多价血浆IgG或多克隆IgG或血清IgG)。所述部件试剂盒的单克隆抗体通过Fc受体(CD16和CD64)诱导效应细胞的活化，其中CD16和CD64通过ADCC或吞噬作用导致细胞裂解。现在普遍公认的是多价血浆IgG通过CD64抑制效应细胞的裂解机制，后者被存在的多价IgG所饱和。
[0108] 本申请显示了部件试剂盒中联合的其Fc区比血浆部分分离的IgG具有对CD16更强的亲和力的单克隆抗体令人惊奇地诱发了ADCC活性，且在体外其不被添加的血浆IgG所抑制，从而使在体内保持治疗活性变得可行。在体内这种治疗活性对应着肿瘤细胞、被致病剂感染的细胞或产生自身抗体的细胞的裂解。
[0109] 因此，有利地，在添加人血浆IgG的情况下单克隆抗体不会被多价IgG所取代。
[0110] 由于抗体Fc区对CD16的强亲和力，所述单克隆抗体会结合到所述效应细胞上，甚至在高血清浓度下这种结合也不会被人多价血浆IgG所取代。
[0111] 因此，本发明的部件试剂盒甚至以低浓度的单克隆抗体也能实现靶细胞的最佳裂解。
[0112] 有利地，所述部件试剂盒的单克隆抗体的浓度小于在传统单一疗法中用于治疗恶性病状、自身免疫性疾病或传染病的具有相同特异性的抗体的浓度。
[0113] 在本发明的特定实施方式中，本发明的单克隆抗体的Fc区与CD16的结合常数至6 -1
少是2.10M 。
少是2.10M 。
[0114] 有利地是按照文献Maenaka等(Katsumi Maena，P.Anton van der Merwe，David I.Stuart，E.Yvonne Jones，和Peter Sondermann；The Human Low AffinityFcy receptors IIa，Iib，and III bind IgG with Fast Kinetics and DistinctThermodynamic Properties.J.Biol.Chem.，Vol.276，Issue 48，44898-44904，November 30，2001)所述的方法来测定本发明抗体的结合常数。
[0115] 在本发明的优选实施方式中，所述部件试剂盒中的单克隆抗体的浓度优选小于1mg/2亿细胞。
[0116] 考虑在病状中或注射后使用本发明上述的部件试剂盒。效应细胞/靶细胞比值不需要太高，即小于10、或甚至1或0.1。
[0117] 在本发明的特定方面，所述单克隆抗体对所述效应细胞CD16的结合亲和力为至6 -1
少2.10M 。
少2.10M 。
[0118] 例如，可通过专利申请WO 01/77181中描述的方法制备本发明的单克隆抗体。这种用于制备能激活表达CD16的效应细胞的单克隆抗体的方法包括以下步骤：
[0119] a)纯化从多种克隆中获取的单克隆抗体，所述多种克隆来自于选自杂交瘤(特别是异源杂交瘤)和通过含有编码所述抗体的基因的载体所转染的动物或人细胞系的细胞系；
[0120] b)将步骤a)中获得的每种抗体添加到不同的反应混合物中，该反应混合物包含：
[0121] i.所述抗体的靶细胞，
[0122] ii.含表达FcyRIII的细胞的效应细胞，
[0123] iii.多价IgG，
[0124] c)测定靶细胞的裂解百分比并筛选可激活引起靶细胞明显裂解的效应细胞的单克隆抗体(依靠FcyRIII的ADCC活性)。
[0125] 对于每种抗原的特异性，本发明的单克隆抗体实际上是含有单克隆抗体的组合物，它们在一级结构水平上都是相同的因为它们来自于相同的细胞克隆。但是，单克隆抗体组合物的所有抗体不会表现出相同的多糖谱。人和动物抗体在其每条重链的CH2域上具有N-连接的寡糖。对于G免疫球蛋白，该寡糖的结合位点是天冬酰胺297(Asn297，根据Kabat)。该天冬酰胺残基也被称为“Fcγ糖基化”。
[0126] 与Asn297结合的寡糖链的末端被称为“还原末端”，而相反末端被称为“非还原末端”。
[0127] 在IgG抗体的Fc区中，有两个Fcγ糖基化位点；因此每个抗体分子可结合两条寡糖链。
[0128] 因此在单克隆抗体组合物中，根据产生的细胞系所赋予的糖基化，所述寡糖链具有不同的结构。但是，这些链具有共同的基础结构：
[0129]
[0130] 这种所有单克隆抗体共有的基础结构可进一步包含以下糖：N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、岩藻糖(fuc)和半乳糖(gal)。N-寡糖的主要糖基化形式如下所示：
[0131]
[0132] 因为每条寡糖链可包含一个或多个这些糖，从而其本身以上文图示的G0、G0F、G1或G1F形式而存在，在单克隆抗体组合物中有许多寡糖的组合，其为单克隆抗体组合物带来每种糖的一定比例，在抗体组合物彼此之间该比例是不同的。因此，源于相同细胞株的集落可产生其中聚糖组合物可以变化的抗体组合物。
[0133] 因此，在应用中令人惊奇地发现岩藻糖比例小于65％的单克隆抗体组合物对CD16具有高亲和力。具体而言，这种类型的单克隆抗体组合物的区域对CD16的亲和力高于多价IgG对CD16的亲和力。此外，所述组合物的单克隆抗体不被血清Ig所取代。
[0134] 例如在专利申请WO 01/77181中给出了制备这种单克隆抗体组合物的方法。在本发明的有利实施方式中，由具有在还原末端的N-乙酰葡糖胺上添加岩藻糖的低酶活性的细胞产生单克隆抗体组合物，此种酶优选岩藻糖基转移酶。
[0135] 在本发明的另一实施方式中，可以使酶(例如岩藻糖苷酶)对单克隆抗体组合物发生作用，以便获得含有所述比例岩藻糖的单克隆抗体组合物。
[0136] 在本发明的一个优选实施方式中，在YB2/0(ATCC CRL-1662)中产生所述单克隆抗体组合物。
[0137] 以优选方式，本发明部件试剂盒的单克隆抗体是针对5C5抗原(由肾癌细胞表达的肿瘤抗原)、BCR(B细胞受体)、独特型(例如抗FVIII抑制剂抗体的独特型)、TCR(T细胞受体)、CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD45、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD66(a、b、c、d)、CD74、CD80、CD86、CD126、CD138、CD154、MUC1(黏蛋白1)、MUC2(黏蛋白2)、MUC3(黏蛋白3)、MUC4(黏蛋白4)、MUC16(黏蛋白16)、HM1.24(在多发骨髓瘤中过度表达的浆细胞特异性抗原)、生腱蛋白(细胞外基质的蛋白)、GGT(γ谷氨酰转肽酶)、VEGF(血管内皮生长因子)、EGFR(内皮生长因子受体)、CEA(癌胚抗原)、CSAp(结肠特异性抗原p)、ILGF(胰岛素样生长因子)、胎盘生长因子、Her2/neu、碳酸酐酶IX、IL-6、蛋白S100(钙结合蛋白的多基因家族)、MART-1(与黑色素瘤相关的肿瘤分化抗原)、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白
2)、gp100(100kDa糖蛋白)、淀粉样蛋白、猕猴D抗原、I类和II类MHC分子(如HLA-DR)、突变基因(特别是致癌基因或肿瘤抑制基因)表达形成的抗原、源于某些肿瘤表达的致癌基因病毒的抗原、在某些肿瘤中过度表达和某些正常组织轻微表达的普通抗原例如苗勒管激素的II型受体、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染的细胞在膜上自身或非自身表达或暴露的分子(如磷脂酰丝氨酸)、和由致病剂(细菌毒素、细菌或寄生虫壁的蛋白复合物、病毒囊膜糖蛋白(例如来自HIV病毒、HBV、HCV和RSV等))表达或分泌的蛋白，但不限于此。
2)、gp100(100kDa糖蛋白)、淀粉样蛋白、猕猴D抗原、I类和II类MHC分子(如HLA-DR)、突变基因(特别是致癌基因或肿瘤抑制基因)表达形成的抗原、源于某些肿瘤表达的致癌基因病毒的抗原、在某些肿瘤中过度表达和某些正常组织轻微表达的普通抗原例如苗勒管激素的II型受体、糖基化或非糖基化蛋白、磷脂、由感染的细胞在膜上自身或非自身表达或暴露的分子(如磷脂酰丝氨酸)、和由致病剂(细菌毒素、细菌或寄生虫壁的蛋白复合物、病毒囊膜糖蛋白(例如来自HIV病毒、HBV、HCV和RSV等))表达或分泌的蛋白，但不限于此。
[0138] 优选地，本发明的抗体针对CD20。
[0139] CD20抗原是存在于成熟B淋巴细胞表面的分子量为35-37kDa的疏水跨膜蛋白(Valentine等.1987，Proc Natl Acad Sci U.S.A.84(22)：8085-9；Valentine等.1989，J.Biol.Chem.264(19)：11282-11287)。它是在B淋巴细胞从早期前B阶段向浆细胞分化的发育期间表达的，在浆细胞阶段此种表达消失。CD20抗原存在于正常B淋巴细胞和恶性B细胞中。更具体而言，CD20抗原在大部分B表型(phenotype)淋巴瘤(80％的淋巴瘤)中表达：它在例如多于90％的淋巴细胞B非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多于95％的B型慢性淋巴样白血病(LLC-B)中表达。CD20抗原在造血干细胞或浆细胞中不表达。
[0140] CD20的功能仍未完全探明，尽管其可作为钙通道并干涉B淋巴细胞分化(Golay 等 .1985，J Immunol.；135(6)：3795-801) 和 增 殖 (Tedder 等 .1986，EurJ Immunol.1986Aug；16(8)：881-7)第一步的调控。
[0141] 在本发明的优选实施方式中，抗CD20抗体的组合物是由YB2/0产生的且岩藻糖比例小于65％。
[0142] 在本发明的特定实施方式中，这种抗体及其制备方法在专利申请WO2006/064121中有描述。
[0143] 有利地，这种抗体的重链的氨基酸序列是如SEQ ID NO：1所示的序列。
[0144] 有利地，这种抗体的轻链的氨基酸序列是如SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3所示的序列。
[0145] 简言之，根据专利申请WO2006/064121的教导，可通过由能表达上文所述轻链和重链的载体所转染的YB2/0细胞获得这种抗体。
[0146] 在本发明的优选实施方式中，抗CD20的单克隆抗体组合物的岩藻糖比例小于65％、优选包含在20-40％之间，或岩藻糖/半乳糖比值小于0.6。
[0147] 在本发明的优选实施方式中，所述部件试剂盒的单克隆抗体是由以登录号CNCM I-3314保藏在CNCM的R509克隆所产生的。
[0148] 在本发明的另一优选实施方式中，所述部件试剂盒的单克隆抗体是由以登录号CNCM I-3529保藏在CNCM的R603克隆所产生的。
[0149] 本申请显示了本发明的部件试剂盒对治疗LLC-B是有效的，因为LLC-B患者的恶性细胞先体外后体内被裂解，甚至在E∶T比值小于或等于10，或甚至5或甚至2，在低浓度抗体下，包括存在人血清时。
[0150] 从而本发明的部件试剂盒可实现由抗体可变区识别的靶的最佳裂解，因为效应细胞与抗体Fc区之间的物理相互作用(结合)，其强到足以不被多价IgG取代。
[0151] 有利地，用于治疗LLC-B的本发明的部件试剂盒中所含的单克隆抗体的浓度小于2
375mg/m。
375mg/m。
[0152] 因为其低毒性、特异性和降低剂量的优势，可用含有抗CD20抗体的部件试剂盒给药而用于治疗以下病状：CD20阳性B淋巴细胞的淋巴组织增生综合征的恶性病状(例如B型NHL)、或急性或慢性B淋巴白血病、自身免疫性疾病和/或炎症疾病(如器官移植排斥、或移植物抗宿主病、类风湿性多发性关节炎、传播性红斑狼疮、硬皮病、原发性干燥综合征(或古热罗-舍格伦综合征)、自身免疫多发性神经病(例如多发性硬化症)、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、强直性脊椎关节炎、赖特综合征、痛风关节炎、乳糜泻、克罗恩病、桥本氏甲状腺炎、爱迪生病、自身免疫性肝炎、巴泽多病、溃疡性结肠炎、脉管炎(如与ANCA(抗中性白细胞胞质抗体)相关的系统性脉管炎)、自身免疫性血球减少和其他成人和儿童血液病并发症(例如急性或慢性自身免疫性血小板减少)、自身免疫溶血性贫血、新生儿溶血病(HDN)、冷凝集素疾病、血小板减少血栓紫癜和获得性自身免疫性血友病；古德帕斯丘综合征、膜外肾病、自身免疫大疱皮肤病、重症肌无力、混合性冷沉球蛋白血症、银屑病、幼年型慢性关节炎、炎症性肌炎、皮肌炎和儿童系统性自身免疫病(包括抗磷脂综合征)，但不限于此。
[0153] 有利地，本发明的部件试剂盒是可注射的溶液。这种可注射的溶液优选是以局部或全身性可注射溶液的形式。在特定实施方式中，对患者给药6次。一种给药是一周内每天或每两天给药一次，然后一月或两月内一周给药一次，一种给药是每月给药三次，治疗可重复几次。
[0154] 在补充实施方式中，按每次注射104-109效应细胞的剂量给药所述效应细胞。
[0155] 在另一补充实施方式中，按每次注射1-500mg抗体的剂量给药本发明的抗体。
[0156] 在本发明的另一特定实施方式中，所述效应细胞重复给药高达10次，每次给药之间的时间间隔在2天-12个月之间。在本发明的另一特定实施方式中，所述单克隆抗体重复给药高达10次，每次给药之间的时间间隔在2天-12个月之间。在本发明的另一实施方式中，所述单克隆抗体和所述效应细胞被同时给药。
[0157] 在本发明的另一实施方式中，所述单克隆抗体和所述效应细胞被依次给药，所述单克隆抗体的给药在所述效应细胞之前。
[0158] 在本发明的另一实施方式中，所述单克隆抗体和所述效应细胞被依次给药，所述单克隆抗体的给药在所述效应细胞之后。
[0159] 本发明的另一目的是含有本发明的部件试剂盒的药物组合物。
[0160] 本发明的另一目的涉及本发明的部件试剂盒在制备治疗恶性病状、自身免疫性疾病和传染病的药物中的应用。
[0161] 这种药物或药物组合物优选含有赋形剂和/或药物可接受载体。
[0162] 所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的与药物用途相容的任何溶液，如盐的、生理的、等渗的、缓冲的溶液等，以及悬浮液、凝胶、粉末等。本发明的组合物还可含有选自分散剂、助溶剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂等的一种或多种试剂或载体。此外，本发明的组合物可含有其它试剂或活性成分。
[0163] 本发明的另一目的是本发明的部件试剂盒在药物制备中的应用。
[0164] 本发明的另一目的是本发明的部件试剂盒在制备治疗恶性病状的药物中的应用。
[0165] 有利地，这种恶性病状是选自固体肿瘤和恶性血液病。固体肿瘤选自黑色素瘤、癌、肉瘤、神经胶质瘤和皮肤癌。所述癌是选自由肾癌、乳腺癌、口腔癌、肺癌、胃肠道癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫癌、膀胱癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、皮肤癌和睾丸癌所组成的组中。
[0166] 恶性血液病选自淋巴组织增生、骨髓组织增生、骨髓增生异常综合征和急性骨髓样白血病(例如B型NHL)、急性或慢性B淋巴白血病、伯基特淋巴瘤，毛状白细胞白血病、急性或慢性骨髓样白血病、T淋巴瘤和白血病、霍奇金淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血病和多发性骨髓瘤，但不限于此。
[0167] 本发明的另一目的是本发明的部件试剂盒在制备预期治疗自身免疫性疾病和/或原发或继发炎症疾病的药物中的应用，所述疾病具有器官特异性或是全身性的，并与致病的自身抗体相关或不相关，这些疾病选自器官移植排斥、或移植物抗宿主病、类风湿性多发性关节炎、传播性红斑狼疮、硬皮病、原发性干燥综合征(或古热罗-舍格伦综合征)、自身免疫多发性神经病(例如多发性硬化症)、I型糖尿病、自身免疫性肝炎、强直性脊椎关节炎、赖特综合征、痛风关节炎、乳糜泻、克罗恩病、桥本氏甲状腺炎、爱迪生病、自身免疫性肝炎、巴泽多病、溃疡性结肠炎、脉管炎(如与ANCA(抗中性白细胞胞质抗体)相关的系统性脉管炎)、自身免疫性血球减少和其他成人和儿童血液病并发症(例如急性或慢性自身免疫性血小板减少)、自身免疫溶血性贫血、新生儿溶血病(HDN)、冷凝集素疾病、血小板减少血栓紫癜和获得性自身免疫血友病；古德帕斯丘综合征、膜外肾病、自身免疫大疱皮肤病、重症肌无力、混合性冷沉球蛋白血症、银屑病、幼年型慢性关节炎、炎症性肌炎、皮肌炎和儿童系统性自身免疫病(包括抗磷脂综合征)，但不限于此。
[0168] 本发明的另一目的是本发明部件试剂盒在制备治疗传染病的药物中的应用。
[0169] 有利地，所述传染病选自由病毒(人类免疫缺陷病毒或HIV、乙型或丙型肝炎病毒(HBV、HCV)、非洲淋巴细胞瘤病毒或EBV、巨细胞病毒或CMV、肠病毒、甲型、乙型和丙型流感病毒引起的流感、多核呼吸病毒或SRV、或HTLV)、细菌和/或它们的毒素(破伤风、白喉、肺炎双球菌、脑膜炎球菌、葡萄球菌(包含甲氧西林抗性形式)、克雷伯氏菌、志贺氏菌、假单胞菌、肠道菌或包括医源性疾病在内的抗生素抗性病状)、寄生虫(疟疾、利什曼虫病、锥虫病)诱发的疾病；以及新出现的疾病，例如切昆汞亚热、禽流感、严重急性呼吸综合征病毒或SARS、引起出血性发热(如埃博拉或登革热)的病毒或西尼罗病毒；和与生物恐怖主义相关的那些，如炭疽、食物中毒、瘟疫、天花和痘病毒、兔热病、出血性发热剂、普鲁斯病、葡萄球菌B肠毒素、白喉毒素或病毒性脑炎，但不限于此。
[0171] 图1：通过竞争试验研究抗D R297 EMABling抗体和AD1抗体与巨噬细胞CD16(FcγRIII受体)的结合。
[0172] 图2：在多种浓度的多克隆免疫球蛋白(IVIg)存在下，巨噬细胞诱发的EMABling R297抗体和AD1抗体的ADCC活性。
[0173] 图3：在多种浓度的免疫球蛋白(IVIg)和6.25μg/ml浓度的抗CD163G8抗体存在下，巨噬细胞诱发的EMABling R297抗体和AD1抗体的ADCC活性
[0174] 图4：在多种浓度的免疫球蛋白(IVIg)存在下，由EMABling R297抗体和AD1抗体诱导的CD16+巨噬细胞对Rh+红细胞的吞噬作用
具体实施方式
[0175] 实施例
[0176] 实施例1：单核细胞向巨噬细胞的分化
[0177] 通过Ficol和Percol密度梯度的分级从外周血中分离单核细胞，然后在含10％SVF并添加了M-SCF(单核细胞集落克隆因子)(50ng/ml)的RPMI培养基中进行培养。7天之后，获得的巨噬细胞是CD14+，CD16+，CD32+，CD64+，CD11b+，CD1a-，CD80-，CD83-表型。
[0178] 因此，M-SCF分化可使巨噬细胞表面表达CD16。
[0179] 实施例2：抗D抗体与巨噬细胞表达的CD16的相互作用
[0180] 将抗D R297抗体(也称为“EMABling R297”)的结合与AD1抗体的结合进行比较。在文献WO 01/77181中描述了抗D R297抗体，并且该抗体是按此文献描述的方法所产生的。该抗体是在YB2/0细胞(ATCC CRL-1662)中产生的。
[0181] 将R297抗体和巨噬细胞CD16的结合与AD1抗体(如文献WO 01/77181中描述的，由异源骨髓瘤表达的)和巨噬细胞CD16的结合进行比较。
[0182] 抗CD16抗体(产生者克隆3G8)的取代试验可测量单克隆抗体与这些巨噬细胞的CD16受体的结合，无关于其特异性。
[0183] 在多种浓度(0-83μg/ml)的抗D抗体(R297或AD1)和确定浓度的偶联荧光染料的抗CD163G8抗体(3G8-PE)中温育纯化的巨噬细胞。
[0184] 洗涤之后，通过流式细胞计数法评估抗体3G8-PE与巨噬细胞CD16受体的结合。能够将自身结合到CD16上的抗体进入了与3G8抗体结合的竞争中，结果，导致了MFI(平均荧光强度)的降低。结果以荧光平均值(MFI)表示，其是待估算抗体数量的函数。
[0185] 图1显示了与AD1抗体相比R297抗体与巨噬细胞CD16的结合非常牢固。
[0186] 在平稳状态下，所述EMABling抗体诱导的取代比AD1抗体大至少6倍。
[0187] 实施例3：抗CD20EMAB6和EMAB603抗体与巨噬细胞表达的CD16的相互作用[0188] 将抗CD20EMAB603抗体(由以编号I-3529保藏在CNCM的R603克隆产生)和EMAB6抗体(由以编号I-3314保藏在CNCM的R509克隆产生)和巨噬细胞CD16的结合与利妥昔单抗和巨噬细胞CD16的结合进行比较。按专利申请WO2006/064121中特别是26-33页描述的方法产生抗CD20EMAB6和EMAB603抗体。此外，产生这种抗体的克隆可在CNCM分别按登录号CNCM I-3314和CNCM I-3529获取。
[0189] 抗CD16抗体(产生者克隆3G8)的取代试验可测量单克隆抗体与CD16受体的结合，无关于其特异性。
[0190] 在多种浓度(0-83μg/ml)的抗CD20抗体(EMAB6、EMAB603或利妥昔单抗)和确定浓度的偶联荧光染料的抗CD163G8抗体(3G8-PE)中温育巨噬细胞。
[0191] 洗涤之后，通过流式细胞计数法评估抗体3G8PE与巨噬细胞CD 16受体的结合。能够将自身结合到CD16上的抗体进入了与3G8抗体结合的竞争中，结果导致了MFI(平均荧光强度)的降低。结果以荧光平均值(MFI)表示，其是待估算抗体数量的函数。
[0193] 结果：EMABling R603和EMAB6抗体与巨噬细胞CD16的相互作用比以利妥昔单抗所获得的相互作用大得多。
[0194] 因为该试验是在没有抗原靶点的存在下进行的，因此本发明的抗CD20抗体具有与巨噬细胞CD16牢固结合的能力。
[0195] 实施例4：抗D/Rh+红细胞/巨噬细胞ADCC活性。多价IVIg 的作用。
[0196] 通过ADCC技术研究了抗D抗体的细胞毒性能力。在多种浓度的多价免疫球蛋白(IVIg) 存在下将抗D抗体、巨噬细胞(在M-CSF中分化的单核细胞)和猕猴D+红细胞(效应细胞/靶细胞比值接近2/1)在37℃温育16h。然后通过比色法定量在上清液中由裂解的红细胞所释放的血红蛋白的量，来测量由所述抗体诱导的细胞毒性活性。
以裂解百分比表示特异性裂解结果。
以裂解百分比表示特异性裂解结果。
[0197] 图2的结果表明存在巨噬细胞时，在高浓度的IVIg存在下EMABlingR297抗体具有强的持续ADCC活性，相反地AD1抗体在不存在IVIg时单独诱导了ADCC引起的裂解。
[0198] 因此，没有多价免疫球蛋白时，两个抗D抗体(EMABling R297和AD1)达到29％的ADCC活性。相反地，在浓度为5mg/ml的多价免疫球蛋白下，EMABling抗体表现出至少20倍的更高的活性(23％裂解相对于AD1的1％)。在更高浓度的多价免疫球蛋白(25mg/ml)下这种优势仍存在，EMABling和AD1抗体相应的裂解百分比是16和1％。
[0199] 实施例5：抗D/Rh+红细胞/巨噬细胞ADCC活性。多价IVIg 的作用。
[0200] 按实施例4所述的相同方案，还研究了存在Raji细胞和巨噬细胞(在M-CSF中分化的单核细胞)时抗CD20的ADCC活性。在巨噬细胞、Raji细胞和多种浓度的多价IVIg 存在下温育抗CD20抗体(由R603克隆或利妥昔单抗产生的)。37℃温育16h之后，通过比色法定量在上清液中由Raji细胞释放的胞内LDH(乳酸脱氢酶)的量，来测量由抗体诱导的ADCC活性。以裂解百分比表示特异性裂解结果。
[0201] 结果表明在表达CD16的巨噬细胞和 的存在下，抗CD20R603抗体的ADCC活性比利妥昔单抗诱导的ADCC活性至少大2倍。这种ADCC活性取决于由巨噬细胞表达的CD16，例如由抗CD163G8的抑制子效应所示。
[0202] 实施例6：抗D/Rh+红细胞/巨噬细胞ADCC活性。
[0203] 存在IVIg时CD16的突出性
[0204] 存在最高浓度的试验IVIg时，抗CD16抗体、3G8的添加抑制了由EMABling抗体诱导的ADCC，这表明诱导的裂解取决于巨噬细胞表达的CD16(图3)。
[0205] 实施例7：存在IVIg时由EMABling R297抗体诱导的CD16+巨噬细胞对猕猴+红细胞的吞噬作用。
[0206] 通过流式细胞计数法研究了抗D R297抗体诱导CD16+巨噬细胞对猕猴+红细胞的吞噬作用的能力。在多种浓度的多价IVIg 存在下，将抗D抗体、由PKH67标记的巨噬细胞(在M-CSF中分化的单核细胞)和由PKH26标记的猕猴+红细胞(效应细胞/靶细胞比值是5/1)在4℃和37℃温育3h。
[0207] 结果对应PKH67/PKH26双标记的百分比，即吞噬了至少一个红细胞。
[0208] 结果：在4℃，在细胞计数法中巨噬细胞和红细胞出现在不同窗口中，每个都以特定荧光染料标记。吞噬百分比非常低，没有IVIg时达到4％，存在IVIg时是1-2％。4℃的这些值可按公式系统地推算出37℃的吞噬百分比。
[0209] 在37℃，对于两个试验抗体(R297EMABling和AD1)，在没有IVIg时PKH67/PKH26双标记的百分比增加。存在IVIg时，只有EMABling抗体具有吞噬Rh+红细胞的能力，而AD1抗体则相反。因此，在0、1或2mg/ml的IVIg下，吞噬百分比保持在15-20％之间，显示了添加IVIg并不抑制由EMABling抗体诱导的吞噬作用。
[0210] 在1mg/ml的浓度下，EMABling抗体比AD1抗体至少大5倍。浓度大于2mg/ml时，EMABling抗体的吞噬百分比是16.9％，而AD1抗体的不明显(0值)。
[0211] 实施例8：存在IVIg时由R603抗体诱导的CD16+巨噬细胞对猕猴+红细胞的吞噬作用
[0212] 也研究了存在IVIg时由R603抗体诱导的CD16巨噬细胞对CD20Raji细胞的吞噬作用。
[0213] 通过流式细胞计数法研究了抗CD20抗体诱导CD16+巨噬细胞对Raji细胞的吞噬作用的能力。在多种浓度的多价IVIg 存在下，将抗CD20抗体、由PKH67标记的巨噬细胞(在M-CSF中分化的单核细胞)和由PKH26标记的Raji细胞(效应细胞/靶
细胞比值是5/1、10/1和20/1)在4℃和37℃温育3h。
细胞比值是5/1、10/1和20/1)在4℃和37℃温育3h。
[0214] 结果对应PKH67/PKH26双标记的百分比，即吞噬了至少一个Raji细胞。
[0215] 结果：
[0216] 在4℃，在细胞计数法中巨噬细胞和Raji细胞出现在不同窗口中，每个都以特定荧光染料标记。吞噬百分比非常低，没有或有IVIg时均小于5％。4℃的这些值可按公式系统地推算出37℃的吞噬百分比。
[0217] 在37℃，对于两个试验抗体(抗CD20R603和利妥昔单抗)，在没有IVIg时PKH67/PKH26双标记的百分比增加。
[0218] 存在IVIg时，只有EMABling抗体具有比利妥昔单抗大2倍、4倍、或甚至10倍的吞噬Raji细胞的能力。因此，在0、1或2mg/ml的IVIg存在下，吞噬百分比总保持在大于利妥昔单抗所诱导的吞噬百分比，显示了存在IVIg时EMABling抗体诱导CD16+巨噬细胞的吞噬作用。
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