技术领域
[0001] 本
发明涉及基因数据变异解读领域，更具体涉及一种BRCA1/2基因变异的解读方法。
背景技术
[0002] BRCA1/2基因是重要的抑癌基因，通过同源重组修复(homologous recombination repair,HRR)途径对于DNA双链断裂进行修复，由于基因突变导致的BRCA1/2基因功能
缺陷，修复功能受阻，临床上表现为某些类型
肿瘤的发生。因此，BRCA1/2基因变异情况是评估
乳腺癌(男性及女性)、卵巢癌、
前列腺癌等其它肿瘤发病
风险、PARP(poly ADP-ribose polymerase)是否获益的关键标志物，也是评价
预后、
化疗药物敏感性、制定个体化
治疗方案的重要辅助评价指标，具有十分重要的临床意义。
[0003] BRCA1(NM_007294.3)和BRCA2(NM_000059.3)基因编码区域长度分别为5592bp及10257bp，无明确热点变异区域。按照ACMG/AMP致病等级分级和ENIGMA变异分类标准，BRCA1/2基因变异可分为5类：致病的(5类)，可能致病的(4类)，意义不明确的(3类)，可能良性的(2类)及良性的(1类)。其中5类和4类的胚系(gBRCAm)和
体细胞突变(sBRCAm)都是具有临床参考意义的变异类型。
[0004] 目前，BRCA1/2变异解读规则未能实现完全统一。BRCA ENIGMA
数据库在2017年建立了解读规则，同年，BRCA数据解读中国专家组也针对BRCA1/2建立了国内的专家共识。但两种解读规则未考虑到变异为胚系突变时，应分析家系共分离的情况。还有一些机构使用ACMG/AMP协会于2015年针对单基因遗传病制定的解读标准，但此标准不完全适用于BRCA1/2的解读并且不能针对体细胞突变进行注释。国际上已有多个数据库收集变异位点并进行注释，其中包括Clinvar、LOVD、BRCAexchange、OncoKB等，但变异位点的解读规则没有统一的评级标准，存在主观判读因素，增加了临床应用的困难。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种可用于BRCA1/2胚系突变和体细胞突变的基因变异解读方法，统一评级标准，使解读过程更容易流程化，更加匹配临床需求。
[0006] 进一步地，将BRCA1/2变异信息按照HGVS格式要求输出到注释文件，注释文件信息包括：基因名称、转录本信息、
染色体编号、基因组
位置、HGVS格式
碱基变化、HGVS格式
氨基酸变化、变异类型、人群
频率、
软件预测、参考数据库的变异注释信息。
[0007] 进一步地，BRCA1/2变异致病分类、变异分类及致病概率包括：致病的(Pathogenic)，5类，致病概率为＞0.99，可能致病的(Likely Pathogenic)，4类，致病概率为0.95～0.99；意义不明确的(Uncertain Significance)，3类，致病概率为0.05～0.949；可能良性的(Likely Benign)，2类，致病概率0.001～0.049；良性(Benign)，1类，致病概率为＜0.001。
[0008] 进一步地，按照致病性变异证据由强到弱顺序可分为4个等级：非常强(PVS1)、强(PS1～PS6)、中等(PM1～PM5)及支持证据(PP)；良性变异证据由强到弱分为3个等级：独立证据(BA)、强(BS1～BS4)及支持证据(BP1～BP6)。
[0009] 进一步地，优化PVS1证据模
块内容，增加2个证据注释，包括：
[0010] (1)需考虑可能恢复BRCA1/2基因功能的自然存在的框内RNA异构体的变异；
[0011] (2)需考虑在出现起始密码子发生变异时，其它转录本中是否有可以使用的起始密码子。
[0012] 进一步地，对原ACMG/AMP中描述的BRCA1/2外显子交界区域变异位点进行更新，去掉BRCA1c.442-1及BRCA2c.670+1的变异。
[0013] 进一步地，优化PS证据模块内容，增加2个证据模块，包括：
[0014] (1)变异经mRNA
水平的实验证实能够改变剪接(PS5)；
[0015] (2)移除密码子的小
片段框内缺失变异情况(PS6)。
[0016] 进一步地，优化PM证据模块内容，明确3个证据模块，包括：
[0017] (1)关注BRCA1/2重要结构域，BRCA1基因的Ring(氨基酸起始及终止：1～101)和BRCT(氨基酸起始及终止：1650～1863)结构域及外显子边界，BRCA2基因的DBD(氨基酸起始及终止：2481～3186)结构域及外显子边界(PM1)；
[0018] (2)使用gnomAD、1000Genome、ExAC数据库作为人群频率参考数据库(PM2)；
[0019] (3)去除原ACMG/AMP指南中PM3关于隐性遗传病的描述。
[0020] 进一步地，优化PP证据模块内容，修正2条证据，包括：
[0021] (1)去除原ACMG/AMP指南中PP2关于突变类型与造成
疾病发生原因的描述；
[0022] (2)确定可靠信誉来源的支持性数据库为BRCA Exchange、LOVD、ClinVar、dbBRCA及OncoKB(PP4)。
[0023] 进一步地，优化BA证据模块内容，修正BA证据模块，包括：
[0024] 使用gnomAD、1000Genome、ExAC数据库作为人群频率参考数据库(BA1)。
[0025] 进一步地，优化BS证据模块内容，修正BS证据模块，包括：
[0026] 修正BS2于早期疾病完全外显的描述，更改为该变异编码的氨基酸改变与已确认的1类良性变异相同，但发生改变的
基础核苷酸不同，且无证据表明该变异会导致剪切事件。
[0027] 进一步地，优化BP证据模块内容，修正2条证据，包括：
[0028] (1)去除原ACMG/AMP指南中BP1关于变异类型与疾病关联性的描述；
[0029] (2)确定可靠信誉来源的支持性数据库为BRCA Exchange、LOVD、ClinVar、dbBRCA及OncoKB(PP4)。
[0030] 进一步地，使用FATHMM_MKL和dbscSNV软件对剪切位点变异进行预测。
[0031] 进一步地，当BRCA1/2变异为体细胞突变时，PS2、PM5、PP1、PP3、BS4、BP2证据不参与变异评级。
[0032] 本发明所提供的BRCA1/2变异解读方法，首次将胚系突变和体细胞突变的解读流程进行整合，根据BRCA1/2的变异特点，增加必要证据模块，去除不符合解读的证据模块。此方法更贴近临床需求，更易于解读的流程化。
具体实施方式
[0033] 为了使本技术领域的人员更好地理解本
申请方案，下面将结合申请
实施例对本技术方案进行清楚完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0034] 术语解释：
[0035] HGVS：人类基因组变异协会(HGVS:Human Genome Variation Society)，其建立的命名规则目的在于对基因信息、转录信息、蛋白信息的变异情况给予标准化的命名方式，形成国际学术界通用的规范。
[0036] IARC：国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer),致
力于癌症病因的研究，全球范围内癌症流行病学调查和研究工作，参与制定基因变异分类系统。
[0037] ACMG/AMP指南：美国遗传协会(ACMG,American College of Medical Genetics)和美国分子病理协会(AMP,Association for Molecular Pathology)，共同颁布和制定了人类基因变异致病性解读指南。
[0038] ENIGMA:胚系突变基因等位基因解读实证联盟(ENIGMA,Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles),致力于BRCA1/2基因变异解读工作和标准的制定。
[0039] ClinVar:是NCBI主办的与疾病相关的人类基因组变异数据库。它是一个开放的数据库，整合了dbSNP、dbVar、Pubmed、OMIM等多个数据库在遗传变异和临床表型方面的数据信息，提交结果由专家进行审核并形成标准。
[0040] LOVD:莱顿开放变异数据库(LOVD,Leiden Open Variation Database),是一个开放、开源的变异解读数据库，对变异位点进行收集及制定解读标准。
[0041] BRCAexchange:是专
门针对BRCA1/2基因变异收录及解读的开放、开源的数据库，按照ENIGMA标准进行解读，并将结果提交联盟专家进行审核。
[0042] dbBRCA-Chinese:该数据库是由澳门大学创建的首个中国人群BRCA突变数据库，共收录43197名中国人BRCA数据，1523个突变位点，为中国人BRCA变异特点和解读研究提供了重要的依据。
[0043] OncoKB：OncoKB是由Memorial Sloan Kettering Cancer Center(MSK)维护的全面的精准肿瘤学
知识库，包含来自FDA、NCCN、ASCO、ClinicalTrials和科学文献的专业指导方针和建议，治疗策略和肿瘤专家或肿瘤协会共识。数据库将变异位点进行了1～4级的临床证据和
生物学证据分级。
[0044] 如前所述，为准确地进行变异解读，本申请先将BRCA1/2变异信息按照HGVS格式要求输出到注释文件，注释文件信息包括：基因名称、转录本信息、染色体编号、基因组位置、HGVS格式碱基变化、HGVS格式氨基酸变化、变异类型、人群频率、软件预测、参考数据库的变异注释信息。
[0045] 为确认流程筛选的5类、4类变异位点的真实性，用IGV对位点进行人工复核。以下情况请注意可能存在
假阳性：
[0046] (1)[D]Directional：支持该突变的reads都是同一个方向的；
[0047] (2)[TN]Tumor in Normal：肿瘤样本中的突变在对照样本中有count支持；
[0048] (3)[MV]Multiple Variants：该位点有多个突变；
[0049] (4)[MM]Multiple Mismatches：该位点发生碱基错配；
[0050] (5)[HDR]High Discrepancy Regions：支持该突变的大部分reads在100-200bp区域内存在3个及以上的突变；
[0051] (6)[AI]Adjacent Indels：突变临近Indeld导致错误比对；
[0052] (7)[E]Ends of reads：突变位于reads末端的后30bp；
[0053] (8)[MN]Mononucleotide repeats：突变临近单碱基重复，如“AAAAAAAA......”；
[0054] (9)[DN]Dinucleotide repeats:突变临近2个碱基重复，如“TGTGTGTGTGTG......”；
[0055] (10)[TR]Tandem Repeats:：突变临近3个碱基以上的短重复单元，如“GTGGTGGTG......”；
[0056] (11)[AO]Ambiguous Other:：突变临近低复杂度等无法具体描述的区域。
[0057] 如前述，为评定变异结果，本申请变异证据等级按照由强到弱进行分类，将致病性变异证据由强到弱顺序分为4个等级：非常强(PVS1)、强(PS1～PS6)、中等(PM1～PM5)及支持证据(PP)；良性变异证据由强到弱分为3个等级：独立证据(BA)、强(BS1～BS4)及支持证据(BP1～BP6)，证据分类描述见表1和表2。
[0058] 与ENIGMA指南一致，本申请中BRCA1/2变异致病分类、变异分类及致病概率包括：致病的(Pathogenic)，5类，致病概率为＞0.99，可能致病的(Likely Pathogenic)，4类，致病概率为0.95～0.99；意义不明确的(Uncertain Significance)，3类，致病概率为0.05～
0.949；可能良性的(Likely Benign)，2类，致病概率0.001～0.049；良性(Benign)，1类，致病概率为＜0.001。变异判读按照表4的判读标准，进行最终的打分判定。
[0059] 表1.致病变异证据等级分类描述
[0060]
[0061]
[0062] 表2.良性变异证据等级分类描述
[0063]
[0064]
[0065] 表3.BRCA1和BRCA2外显子交界区域变异
[0066]
[0067] 表4.变异分类判读规则
[0068]
[0069] 为验证本申请构建的解读方法对变异解读的准确性，下面将结合更具体的实施案例来进一步说明本申请的有益效果。为更好地进行案例说明，本申请将2例真实的中国人BRCA1/2检测结果的解读过程作为实施案例进行阐述，阐述内容包括：患者信息、变异信息、变异真实性评价、变异解读过程及判读结果。
[0070] 实施案例1
[0071] 患者信息：女，35岁；肿瘤类型：乳腺浸润性小管腺癌；分期：T2N0Mx；分型：Luminal A型；家族史：无。
[0072] 变异信息：BRCA1，chr17:41258552，c.135-2A>G，，杂合变异。
[0073] 变异真实性评价：根据
配对样本(FFPE/血液)分析，该变异属于胚系突变，IGV结果判读真实，Sanger验证结果为阳性。
[0074] 变异解读过程：
[0075] (1)受检者在本次检测中发现致病的胚系突变；
[0076] (2)该变异为BRCA1基因的一个剪切位点变异c.135-2A>G，该剪切位点未收录在意义不明确的外显子交界区变异中，可能影响蛋白功能(PVS1)；
[0077] (3)该变异在gnomAD、1000Genome、ExAC数据库总人群数据中正常对照人群中均未发现的变异(PM2)；
[0078] (4)该变异使用dbscSNV软件预测结果为有害(PP2)；
[0079] (5)该变异在ClinVar及LOVD数据库收录，为致病性的变异(PP4)；
[0080] 判读结果：依据本申请的变异解读方法，判定该变异为致病的突变(Pathogenic：PVS1+PM2+PP2+PP4)。
[0081] 实施案例2
[0082] 患者信息：女，29岁；肿瘤类型：卵巢高级别
浆液性腺癌；分期：IIIB；家族史：无。
[0083] 变异信息：BRCA2，chr13:32914385，c.5895delT，p.His1966fs，变异频率为23％。
[0084] 变异真实性评价：根据配对样本(FFPE/血液)分析，该变异属于体细胞突变，IGV结果判读真实，Sanger验证结果为阳性。
[0085] 变异解读过程：
[0086] (1)该变异为BRCA2基因的一个移码突变c.5895delT(p.His1966fs)，导致蛋白发生截短变异(PVS1)；
[0087] (2)该变异在gnomAD、1000Genome、ExAC数据库总人群数据中正常对照人群中均未发现的变异(PM2)；
[0088] (3)该变异为非重复区框内缺失突变，导致的
蛋白质长度变化(PM3)。
[0089] 判读结果：依据本申请的变异解读方法，判定该变异为致病的突变(Pathogenic：PVS1+PM2+PM3)。
[0090] 以上仅为本申请的实施案例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有何种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所做的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的
权利要求范围之内。
