可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用
阅读：78发布：2024-02-18
专利汇可以提供可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种可编码ArtRD蛋白基因，基因序列如SEQ ID NO：4所示，这种基因所编码的ArtRD蛋白，主要在血管平滑肌细胞(VSMC)中，能促进VSMC表型转换，加重血管重构，ArtRD蛋白的表达及其对应 抗体 的制备，为下一步研究心脑 血管 疾病 治疗 策略提供研究 基础 。，下面是可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用专利的具体信息内容。
1.检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测高血压试剂盒中的应用；所述ArtRD蛋白基因的基因序列如SEQ ID NO：4所示，由该基因序列编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
2.检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测血管平滑肌细胞表型转化试剂盒中的应用；所述ArtRD蛋白基因的基因序列如SEQ ID NO：4所示，由该基因序列编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
3. ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的抑制剂在制备降低血管平滑肌增殖迁移试剂中的应用；所述ArtRD蛋白基因的基因序列如SEQ ID NO：4所示，由该基因序列编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为含有干扰序列如SEQ ID NO：
14所示的shRNA慢病毒载体。
可编码ArtRD蛋白基因及其蛋白和应用
技术领域
背景技术
[0002] 长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)泛指长度大于200nt，不能翻译产生蛋白质的一类转录本。与编码蛋白质的mRNA相比，lncRNA种类更多，组织表达特异性更强，表达丰度较低，物种间的保守性也较差。lncRNA虽不能翻译合成蛋白质，但仍具有强大的基因调控能力，能够通过对编码蛋白质的RNA的调控，参与到生物发育、疾病发生等诸多环节当中。事实上，lncRNA与能够编码蛋白质的mRNA具有众多相似之处：他们的转录均依赖于RNA聚合酶II，且都需要经历剪接、加帽、加尾等转录后修饰，部分lncRNA也能够与细胞核糖体结合，这些特征都提示部分lncRNA可能具有潜在编码蛋白质的能力。由于目前lncRNA的发现多依赖于高通量测序(RNA-seq)，而其注释主要依靠生物信息学工具，正因如此，许多隐藏在lncRNA序列中的较短的开放阅读框(open reading frame,ORF)被忽视掉了。前期已有部分研究，报道了在线虫和果蝇等低等生物中发现从lncRNA中合成的短肽，而在哺乳动物中，也相继发现了三种从注释为lncRNA的转录本中编码出的短肽，参与骨骼肌收缩及损伤后修复等重要生物学功能。然而，以上报道均是在研究lncRNA时偶然的发现，并没有形成一套固定的研究方法，相信还会有更多的潜藏在lncRNA中的具有重要功能的蛋白质被发掘。
[0003] 分布在血管壁中层的血管平滑肌细胞，与血管功能关系密切，生理状态下血管平滑肌细胞的增殖能力和分泌活性都很低；然而在受到胞外不良因素刺激后，平滑肌细胞会发生去分化，失去成熟平滑肌细胞的功能和分化标志，而增殖和迁移能力显著增强。血管平滑肌细胞的表型转换是动脉粥样硬化、高血压的血管重构中的关键环节。因此，寻找到调控血管平滑肌细胞表型转换的因素，有助于更好地理解心脑血管疾病发生发展的机制，为寻找新的治疗策略提供线索，这也是多年来全球科学家共同努力攻克的命题。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于(1)提供一种可编码ArtRD蛋白基因；(2)基因序列如SEQ ID NO：4所编码的ArtRD蛋白；(3)由ArtRD蛋白制备出抗体；(4)ArtRD蛋白作为靶点在生物学上检测、标志物中或在平滑肌细胞表型转化试剂中的应用。
[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 一种可编码ArtRD蛋白基因，其所述基因序列如SEQ ID NO：4所示。
[0007] 由基因序列SEQ ID NO：4编码的ArtRD蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0008] 包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
[0009] 包含ArtRD蛋白的融合蛋白，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
[0010] 一种重组蛋白载体，由空载体和插入该空载体的ArtRD蛋白基因组成。
[0011] 进一步，空载体为PGEX-4t-1或pcDNA3.1(+)。
[0012] 由基因序列SEQ ID NO：4编码的ArtRD蛋白作为抗原制备得到的抗体。
[0013] 进一步，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
[0014] 检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测高血压试剂盒中的应用。
[0015] 检测ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的试剂在制备检测血管平滑肌细胞表型转化试剂盒中的应用。
[0016] ArtRD蛋白基因或ArtRD蛋白的抑制剂在制备降低血管平滑肌增殖迁移试剂中的应用。
[0017] 进一步，所述抑制剂为含有干扰序列如SEQ ID NO：14所示的shRNA慢病毒载体。
[0018] 本发明的有益效果在于：从lncRNA中研究出可编码为ArtRD蛋白的基因，并克隆出的一种血管组织表达特异性的ArtRD蛋白，识别其生物学功能，ArtRD蛋白能够促进血管平滑肌细胞表型转换，参与高血压及血管重塑等病理过程的发生发展。本发明SEQ ID NO：4所示可编码ArtRD蛋白基因，及其可表达的ArtRD蛋白对进一步研究血管平滑肌细胞病理生理功能、血管重构相关疾病发生发展提供基础。附图说明
[0019] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0020] 图1为ArtRD原核表达SDS-PAGE鉴定；
[0021] 图2为ArtRD原核表达纯化蛋白SDS-PAGE鉴定
[0022] 图3为ArtRD纯化后特异性抗体SDS-PAGE鉴定；
[0023] 图4为ArtRD在大鼠不同组织中的表达情况；
[0024] 图5为FLAG-ArtRD过表达于HEK293a细胞，IP及WB检测；
[0025] 图6为慢病毒shRNA干扰ArtRD表达后，VSMC分化标记蛋白改变情况；
[0026] 图7为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，VSMC分化标记蛋白改变情况；
[0027] 图8为FLAG-ArtRD质粒转染VSMC后，ArtRD与FLAG表达及共定位情况。
[0028] 其中：图1泳道M：蛋白分子量标志
[0029] 泳道1：未经IPTG诱导；
[0030] 泳道2：0.5mM IPTG诱导后；
[0031] 泳道3：37℃0.5mM IPTG诱导后上清液；
[0032] 泳道4：37℃0.5mM IPTG诱导后沉淀；
[0033] 图2：泳道M：蛋白分子量标志；
[0034] 泳道1：未经GST亲和层析柱纯化蛋白溶液；
[0035] 泳道2：GST亲和层析柱通过蛋白溶液；
[0036] 泳道3：GST亲和层析柱洗脱液。
具体实施方式
[0037] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038] 部分材料如下：
[0039] 1.载体和感受态细胞：
[0040] PGEX-4t-1质粒(钟鼎生物保存)，pcDNA3.1(+)质粒(Invitrogen)，TOP10菌株(钟鼎生物保存)，DH5α感受态细胞(TIANGEN)。
[0041] 2.分子生物学试剂与培养基：
[0042] 限制性内切酶及T4连接酶(NEB)，PCR相关试剂(TAKARA)，WB所用抗体均购自Abcam公司，WB SDS-PAGE配置试剂盒购自碧云天公司，RASAL2-AS1shRNA由汉恒生物合成，anti-FLAG M2beads购自Sigma公司，DMEM高糖培养基及胎牛血清购自Gibco公司。
[0043] 3.细胞：
[0044] 大鼠VSMC A10细胞系、HEK293a细胞系均由第三军医大学大坪医院心血管病实验室保种。
[0045] 4.实验动物：
[0046] 新西兰白兔(雄性，2-2.5kg)购自南京模式动物研究所。
[0047] 实施例一、ArtRD的发现
[0048] 通过长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)芯片检测，比较了自发性高血压大鼠(SHR)与正常血压大鼠(WKY)主动脉组织中差异性表达的lncRNA。在差异性表达的lncRNA中，关注到了一条在Refseq数据库中注释为lncRNA的转录本NR_027983，由于其位于RASAL2基因反义链上，将其命名为lncRNA RASAL2-AS1(RASAL2antisense1)，如序列SEQ ID NO：1所示。lncRNA RASAL2-AS1在高血压大鼠的主动脉组织中高表达，并且特异性分布于血管组织中，在人的转录本NR_027982human RASAL2-AS1(如序列SEQ ID NO：2所示)和小鼠转录本NR_027984mouse RASAL2-AS(如序列SEQ ID NO：3所示)的基因组中具有同源序列，上述序列在数据库中均注释为lncRNA。
[0049] 数据库对于lncRNA的注释基于生物信息学分析，但并未通过实验验证其实际能否编码。使用NCBI ORF Finder在线工具分析lncRNA RASAL2-AS1的编码潜能时，意外地发现其外显子中包含了一段长为354bp的开放阅读框(ORF)，提示其可能编码蛋白质，如序列表SEQ ID NO：4所示。
[0050] 实施例二、ArtRD表达载体的制备与原核表达：
[0051] (1)ArtRD原核表达载体构建及表达检测：
[0052] 采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因ArtRD，引物序列如下：
[0053] F：CCGGAATTCATGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCT，如SEQ ID NO：10所示；
[0054] R：GATGCGGCCGCCTAGGTCTGATCTTGGACAG，如SEQ ID NO：11所示。
[0055] 1)双酶切连接至PGEX-4t-1载体的EcoR I和Not I酶切位点之间以获得重组质粒PGEX-4t-1-ArtRD，再将该质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，选取测序完全正确的单克隆，用于后续实验。ArtRD基因序列见序列SEQ ID NO：6。
[0056] 2)通过重组质粒PGEX-4t-1-ArtRD表达出的蛋白含有GST-tag，蛋白大小理论分子量为39.63kDa，氨基酸序列见SEQ ID NO：7。
[0057] 3)质粒转化：将质粒1μl加入100μl感受态细菌中，置冰上20min，42℃热激90sec，迅速置冰中5min，加入600μl LB培养液，37℃，220rpm振摇1h，离心后全部涂布于含50μg/ml Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。
[0058] 4)异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导pGEX-4T-1-ArtRD载体融合蛋白的表达：挑取转化平板上的单克隆接种于含50μg/ml AMP的3ml LB培养液的试管中，37℃220rpm振摇过夜，次日按体积比1:100接种于50μg/ml AMP的30ml LB培养液中，37℃220rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8(约2h)；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃220rpm振摇4h，诱导融合蛋白表达；取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000g，离心10min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。进行12％SDS-PAGE检测分析，目标蛋白主要存在于沉淀中，考马斯亮蓝染色显带，结果见附图1所示。
[0059] 5)包涵体蛋白的变复性：将菌体沉淀重悬于20ml lysis buffer(20mM Tris-HCl contain 1mM PMSF and bacteria protease inhibitor cocktail,pH 8.0)，超声破碎(功率400W，工作4sec，间歇8sec，共20min)；将超声破碎的细胞裂解液4℃10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液(20mM Tris，1mM EDTA，2M尿素，1M NaCl，1％Triton X-100，pH8.0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液(20mM Tris，5mM DTT，8M尿素pH8.0)溶解包涵体，4度放置过夜；18～25℃，15000rpm离心15min；将上述溶液滴加20mM Tris-HCl 100mM NaCl pH8.0缓冲液中，逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于20mM Tris-HCl，100mM NaCl，pH8.0溶液中透析过夜。
[0060] 6)融合蛋白的GST柱亲和纯化及结果分析：利用低压层析系统，包涵体复性溶液以0.5ml/min流速上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱；用GST Binding-Buffer以0.5ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用GST Elution-Buffer(20mM Tris-HCl，50m MGSH，0.15M NaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH8.0进行透析过夜；进行12％SDS-PAGE分析，结果见附图2所示。
[0061] (2)ArtRD真核表达载体构建：
[0062] 1)采用基于逆转录PCR方法合成FLAG-ArtRD基因序列：使用TAKARA RNAiso试剂从大鼠胸主动脉平滑肌细胞提取总RNA，使用TAKARA一步法逆转录试剂盒，用随机引物逆转录获得总cDNA文库。设计FLAG-ArtRD扩增特异性引物，引入EcoR I及Xba I双酶切位点，上游引物：5’-CCGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAAAGGCGCTTCCCTTTCTTC-3’(引入FLAG-tag，及EcoR I酶切位点)如序列SEQ ID NO：12所示；下游引物：5’-CGTCTAGACTAGGTCTGATCTTGGACAGCTGGTGCACCGGT-3’(引入Xba I酶切位点)，如序列SEQ ID NO：13所示。使用TAKARA PrimeSTAR Max Polymerase进行PCR扩增。PcDNA3.1(+)-FLAG-ArtRD插入片断序列如序列SEQ ID NO：8所示；翻译编码的FLAG-ArtRD融合蛋白序列如SEQ ID NO：9所示。
[0063] 2)将PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，使用QIAquick Gel Extraction Kit切胶回收，限制性内切酶双酶切后，使用QIA quick PCR Purification Kit进行DNA纯化，再将纯化后的目的DNA片段使用NEB Quick Ligation Kit连接入真核表达pcDNA3.1(+)载体，再转化DH5-α感受态细胞，铺LB平板37°过夜。
[0064] 3)挑取单克隆，摇菌培养，测序，质粒鉴定无误后保存并用于后续实验。
[0065] 实施例三、ArtRD特异性抗体的制备
[0066] 1免疫动物：以实施案例一种原核表达出的ArtRD蛋白进行BCA蛋白浓度测定后，免疫2只新西兰白兔(2-2.5kg)，皮下免疫400ug/次，2-3周免疫一次，免疫4次。采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对ArtRD蛋白的效价，待效价大于1:50,000进行最终采血制备抗血清，并准备纯化。
[0067] 2抗血清(抗体)效价检测：
[0068] 1)抗血清间接ELISA效价检测：根据实验需要设计好包被板，并在板条上做上标记；包被：用PBS包被液将ArtRD蛋白、GST蛋白抗原稀释成需要的浓度，混匀后加入板条中，每孔100ul，4℃冰箱过夜。包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白包被浓度：5ug/ml,100ul/孔包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)；封闭：包被好后，弃去包被液，洗板3次，每孔加入200ul封闭液，37℃恒温箱1h。取出酶标板，弃去内液，洗板1次；一抗反应：抗血清按1/500，3倍稀释，每孔100ul，37℃恒温箱1h；二抗反应：取出酶标板，弃去内液，洗板3次，向每孔中加入100ul稀释好的酶标二抗，酶标二抗：羊抗兔-HRP，1/5000。37℃恒温箱1小时。显色取出酶标板，弃去内液，洗板4次，每孔先加入100ul TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃，15min。终止反应每孔加入100ul 1M HCL溶液，终止反应。即刻在酶标仪上450nm读数，将OD值大于设定的阴性对照OD值的2.1倍的孔对应的稀释度，定为该样品的效价。
[0069] 2)抗体效价检测结果：
[0070] 包被抗原：ArtRD蛋白、GST蛋白
[0071] 包被浓度：5ug/ml，100ul/孔
[0072] 包被缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
[0073] 二抗：羊抗兔-HRP，1/5000
[0074] 抗血清效价大于121K。
[0075] 3抗体纯化：
[0076] 将ArtRD蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将兔子抗血清与PBS等量混合后缓慢上样，待抗体结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4℃透析过夜，再进行纯度，浓度和效价测定。然后将GST蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，用上步所得洗脱液(即所需纯化抗体)缓慢上样，收集流出液，即最终得到的纯化ArtRD抗体，再进行相关纯度、浓度和效价测定。
[0077] 4抗体鉴定：
[0078] 1)通过ELISA检测上步中经过GST蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱最终得到的纯化ArtRD抗体的效价，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定；通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度。最终得到纯化抗体效价大于512K。
[0079] 2)抗体浓度鉴定：0.2mg/ml缓冲液：磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)
[0080] 3)抗体纯度鉴定：纯化后抗体进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。电泳条带见附图3。
[0081] 上述ArtRD原核表达及特异性抗体合成委托南京钟鼎生物有限公司实施。
[0082] 实施例四、ArtRD表达水平的鉴定。
[0083] 在获得ArtRD特异性抗体后，能够使用该抗体进行自然状态下ArtRD蛋白的检测。使用Thermo Fisher T-PER组织蛋白提取试剂提取了大鼠多种组织的蛋白，并通过蛋白质免疫印迹实验(WB)检测该段蛋白质天然表达情况及组织分布情况，结果见附图4。依据WB结果可知，ArtRD分子量为12.9kDa，且特异性分布于血管组织，据此，将其命名为Arteridin，缩写为ArtRD。
[0084] 在检测了自然状态下ArtRD表达水平后，使用上述构建的FLAG-ArtRD过表达质粒，利用QIAGEN Attractene转染试剂将过表达质粒转染入HEK293a工具细胞中，经过48小时表达，提取蛋白质用于后续实验。提取出的蛋白质一部分直接使用ArtRD特异性抗体进行WB检测；另一部分使用Sigma anti-FLAG M2beads进行免疫沉淀(IP)，再将IP后的蛋白使用ArtRD特异性抗体进行WB检测，结果见附图5。结果表明，FLAG-ArtRD过表达载体成功表达于HEK293a细胞。
[0085] 同时，将FLAG-ArtRD过表达质粒转染入大鼠原代血管平滑肌细胞，经过48小时表达，将细胞固定，再分别使用小鼠来源的抗FLAG抗体及抗ArtRD特异性抗体进行免疫荧光染色，二抗使用不同颜色荧光标记。经过共聚焦显微镜观察，可见FLAG蛋白与ArtRD蛋白共定位，成功过表达于大鼠原代血管平滑肌细胞中，结果见附图8。
[0086] 以上实验证明ArtRD在自然状态下特异性表达于血管组织，FLAG-ArtRD过表达质粒能够成功克隆ArtRD，使之过表达于哺乳细胞中。
[0087] 实施例五、ArtRD蛋白质的生物学功能
[0088] 针对lncRNA RASAL2-AS1序列设计了多条探针(委托广州锐博生物有限公司)，使用RNA荧光原位杂交技术(FISH)，发现lncRNA RASAL2-AS1特异性分布于血管组织中层，即血管平滑肌细胞(VSMC)层。同时使用ArtRD特异性抗体，进行蛋白质免疫荧光染色，发现ArtRD蛋白特异性分布于血管平滑肌细胞(VSMC)中，提示其功能在于调控VSMC功能。
[0089] 使用Q-PCR，实验发现相较于正常血压大鼠(WKY)，lncRNA RASAL2-AS1在自发性高血压大鼠(SHR)胸主动脉组织中显著高表达，其表达的差异性出现于高血压稳定后，提示其功能在于加重高血压后的血管重构。因血管平滑肌细胞的表型转换是动脉粥样硬化、高血压的血管重构中的关键环节，所以表明ArtRD蛋白对于VSMC表型转换中的作用。首先，使用RASAL2-AS1shRNA慢病毒，shRNA序列：GTGGCAAGACCAAGATAATGT，如SEQ ID NO：14所示，敲降了VSMC中RASAL2-AS1，VSMC分化标记蛋白(α-SMA，Calpinin)表达量显著上升，参见附图6，另外，VSMC的增殖迁移能力也显著下降；同时，使用FLAG-ArtRD过表达质粒在VSMC中过表达ArtRD，附图7表示VSMC分化标记蛋白表达量显著上升。
[0090] 综上，表明ArtRD促进了VSMC由收缩型向分泌型表型转换，加重血管重构，能够成为潜在的检测、治疗靶点。
[0091] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
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