褐孔菌内酯、其制法及其药物组合物与应用
阅读：1032发布：2020-11-27
专利汇可以提供褐孔菌内酯、其制法及其药物组合物与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从褐孔菌属 真菌 斜生褐孔菌中提取出的新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）、其制备方法、包含该化合物的药物组合物及其在 预防 和/或 治疗 肿瘤 及蛋白酪 氨 酸激酶（protein tyrosine kinase，PTKs）相关 疾病 中的应用。褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）具有抑制活性的作用；具有抑制人肝癌细胞Bel‑7402生长的作用。褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）可预防、缓解和/或治疗PTKs活性异常升高相关疾病如肿瘤、经皮腔内 血管成形术 （Percutaneous transluminal coronary intervention，PCI）术后 再狭窄 、动脉粥样硬化、 高血压 、多发性硬化症、糖尿病 视网膜 病变、子宫内膜异位症、 牛 皮癣等 皮肤 病和哮喘等疾病。，下面是褐孔菌内酯、其制法及其药物组合物与应用专利的具体信息内容。
1.式I所示的化合物褐孔菌内酯
2.如权利要求1所述的化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取一定量的斜生褐孔菌药材，用95％的乙醇提取三次，减压回收溶剂，得到乙醇浸膏；
(2)将步骤(1)中的乙醇浸膏混悬于水，先用氯仿萃取，然后用乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇萃取，最终粗分成氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水四个部分；
(3)将乙酸乙酯萃取部分减压浓缩，并经硅胶柱色谱多次分离，使用氯仿-丙酮及氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，每500ml为一流份，检测、收集得到褐孔菌内酯(Phaeoporlactone)粗品，再经制备型HPLC纯化得到化合物褐孔菌内酯(Phaeoporlactone)纯品；
其中步骤(3)中制备型HPLC的分离条件为甲醇-水-甲酸体积比30:70:1，流速8ml/min，
227nm波长检测，取500μL进样，在tR＝20min得褐孔菌内酯(Phaeoporlactone)纯品。
3.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的式I化合物以及药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3的药物组合物，所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、滴丸、微丸或注射剂。
5.权利要求1所述的化合物在制备治疗蛋白酪氨酸激酶的相关疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5的应用，其特征在于，所述的蛋白酪氨酸激酶的相关疾病选自肿瘤、PCI术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、多发性硬化症、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位症、牛皮癣和哮喘。
7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自肝癌。
褐孔菌内酯、其制法及其药物组合物与应用
技术领域
[0001] 本发明属于医药领域，具体地涉及一个从褐孔菌属真菌斜生褐孔菌中提取出的新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）、其制备方法、包含该化合物的药物组合物及其在预防和/或治疗肿瘤及PTKs活性异常升高相关疾病中的应用。
背景技术
[0002] 斜生褐孔菌[Phaeoporus obliquus(Pers.:Fr.)J.Schrotet.或Inonotus obliquus(Pers.:Fr.)Pilat或Polyporus obliquus Pers.:Fr.]，是伞菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科、褐孔菌属真菌，曾用名桦褐孔菌。斜生褐孔菌具有抗糖尿病、抗癌、防治艾滋病、提高免疫等作用。
[0003] 酪氨酸磷酸化在许多细胞调节过程中有重要作用，主要体现在T细胞和B细胞的活化、对外来刺激的反应、有丝分裂、血管增生、神经递质传导、细胞周期的生长控制、转录调节、葡萄糖摄取、肿瘤发生及细胞分化、形成和凋亡等过程。酪氨酸蛋白激酶（Protein tyrosine kinases，PTKs）功能紊乱可能导致许多疾病。目前PTKs活性已成为衡量细胞增殖恶变的标志之一。鉴于PTKs在肿瘤分子病原学上的重要作用，人们尝试利用PTKs抑制剂抑制肿瘤细胞生长及一些增生性疾病，如PCI术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、多发性硬化症、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位症、牛皮癣等皮肤病和哮喘等疾病。
[0004] 从广义上抗肿瘤药可分为两代药物。第一代为传统的细胞毒化疗药物，如铂类和抗代谢类抗癌药；第二代为分子靶向治疗药物，这一类药物通常是指特异地对一个或多个肿瘤相关蛋白进行调控的药物。手术、化疗、放疗是当今治疗肿瘤的主要手段，但各有弊端，主要是毒副作用较大。目前抗肿瘤药物研发面临的挑战，一是多种抗肿瘤药物远远不能满足临床需求，急需开发更多的新药；二是毒副作用大，选择性差，治疗效果不理想；三是靶向抗肿瘤药物也存在耐药问题，疗效越明显的药物耐药性表现越为突出；四是长期应用靶向抗肿瘤药物对机体的影响不容忽视。因此开发第三代新型的高效、低毒、高选择性的抗肿瘤新药仍是一个重要的研究课题，具有重要的创新意义。
发明内容
[0005] 本发明解决的技术问题是，一方面提供了一种新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone），其结构如式（I）所示：
[0006]
[0007] 本发明的另一方面提供了制备化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）的方法。
[0008] 本发明的又一个方面涉及一种药物组合物，其包括化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）以及药学上可接受的载体。
[0009] 本发明的再一方面涉及化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）预防和/或治疗蛋白酪氨酸激酶（PTKs）相关疾病的应用，蛋白酪氨酸激酶（PTKs）相关疾病包括但不限定于肿瘤，PCI术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、多发性硬化症、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位症、牛皮癣等皮肤病和哮喘等疾病药物中的应用。特别是在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
[0010] 为解决本发明的技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0011] 一种新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
[0012] （1）取一定量的斜生褐孔菌药材，用95%的乙醇提取三次，得到浸膏；
[0013] （2）将步骤（1）中的乙醇浸膏混悬于水，先用氯仿萃取，然后用乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇萃取，最终粗分成氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水等四个部分；
[0014] （3）将乙酸乙酯萃取部分减压浓缩，并经硅胶柱色谱分离，使用氯仿-丙酮及氯仿-甲醇系统进行梯度洗脱，每500ml为一流份，检测、收集得到褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）粗品，再经制备型HPLC纯化得到化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）纯品。
[0015] 其中步骤（3）中制备型HPLC的分离条件为甲醇-水-甲酸（30:70:1，V:V:V），流速8ml/min，227nm波长检测，取500μL进样，在tR=20min得褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）纯品。
[0016] 经鉴定，得到的新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）的结构如式（I）所示[0017]
[0018] 通过药理活性实验发现，本发明的式I化合物具有和抑制蛋白酪氨酸激酶PTKs作用。可应用于制备预防和/或治疗PTKs活性异常升高相关疾病的药物。所述的PTKs相关疾病包括但不现定于肿瘤、PCI术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、多发性硬化症、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位症、牛皮癣等皮肤病和哮喘等疾病。根据与抗肿瘤相关的药理实验可知，新化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）具有较好的抗肿瘤药理作用，尤其是抑制人肝癌细胞的生长。
[0019] 有益技术效果：
[0020] a)褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）为真菌斜生褐孔菌中提取、分离的单体化合物，具有制备工艺简单的优点。
[0021] b)其原材料已可栽培，具有很好的应用与开发前景。
[0022] c)蛋白酪氨酸激酶（PTKs）相关疾病包括但不限定于肿瘤，PCI术后再狭窄、动脉粥样硬化、高血压、多发性硬化症、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位症、牛皮癣等皮肤病和哮喘等疾病药物中的应用。特别是在制备预防和/或治疗肝癌的药物中的应用。
[0023] 本发明还涉及一种含有药物有效剂量的式（I）化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
[0024] 根据本发明的实施方案，式（I）化合物还包括其药学上可接受的盐、水合物、酯以及前体药物。
[0025] 本发明还涉及含有作为活性成份的式（I）化合物以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常式（I）化合物占药物组合物总重量的0.1～95%。在单元剂型中式（I）化合物一般含量为0.1至100mg。
[0026] 本发明所述的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的式（I）化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。
[0029] 给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂（包括真溶液和胶体溶液）、乳剂（包括水包油型、油包水型和复乳）、混悬剂、注射剂（包括水针剂、粉针剂和输液）、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等。固体剂型可以是片剂（包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片）、胶囊剂（包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊）、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气（粉）雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。
[0030] 本发明的式（I）化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0031] 为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯毗咯烷酮、聚乙二丙醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯毗咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与构椽酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。
[0032] 还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
[0033] 为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、月桂酸聚乙二醇甘油酯、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄菩胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
[0034] 为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。
[0035] 为了将给药单元制成胶囊，将式（I）化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明的式（I）化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。
[0036] 例如，将式（I）化合物制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、l,3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
[0038] 为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的式（I）化合物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
[0039] 本发明的药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明药物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。式（I）化合物的每天的合适剂量范围：本发明的式（I）化合物的用量为0.001～100mg/kg体重，上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药，这取决于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。每一种治疗所需总剂量可分成多次或按一次剂量给药。本发明的式（I）化合物或药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。
具体实施方式
[0040] 下面的实施例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。
[0041] 一、褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）的制备
[0042] 实施例1从斜生褐孔菌中提取分离褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）的方法：
[0043] 斜生褐孔菌药材22kg，用95%的乙醇提取三次，得到浸膏710g，取700g乙醇浸膏混悬于水，先用氯仿萃取，然后用乙酸乙酯萃取，最后用正丁醇萃取，粗分成氯仿（424g）、乙酸乙酯（51g）、正丁醇（152g）、水（67g）等四个部分。取乙酸乙酯萃取部分50g，经硅胶柱色谱多次分离，氯仿-丙酮及氯仿-甲醇系统梯度洗脱，每500ml为一馏份，第18份中得到褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）粗品，再经制备型HPLC纯化（30%甲醇-水，流速8ml/min，227nm波长检测），取500μL进样，在tR=20min得到化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）纯品52mg，为黄褐色粉末。
[0044] 化合物褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）理化性质和波谱数据如下：
[0045] 熔点：132-133℃；
[0046] (-)ESIMS：m/z179[M-H]-，359[2M-H]-；分子式：C9H8O4；
[0047] cm-1：3349，3245，1730，1646，1616，1596，1522，1477，1347，1300，1264，1217，1182，1165，1089，1060，998，955，877，818，677，578；
[0048] UV：λmax206，227，267，307nm；
[0049] 1H-NMR（500MHz，C5D5N）：δ8.11（1H，s，H-8），7.00（1H，s，H-5），4.36（1H，t，J=6.0Hz，H-3），2.77（1H，t，J=6.0Hz，H-4）；
[0050] 13C-NMR（125MHz，C5D5N）：δ165.2（C-1），67.4（C-2），27.3（C-4），114.4（C-5），146.5（C-6），153.2（C-7），116.9（C-8），133.4（C-9），16.7（C-10）。
[0051] 二、药理活性实验
[0052] 实验例1褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）在蛋白酪氨酸激酶抑制剂筛选模型实验[0053] 采用酶联免疫吸附方法，从大鼠脑组织中分离和提取酪氨酸激酶，用poly-Glu-Tyr(PGT)作为底物，包被微孔板。PGT的酪氨酸残基可以被PTKs磷酸化，再用HRP标记的磷酸化特异性单克隆抗体作为探针，与磷酸化的酪氨酸残基特异性结合，通过显色，测定其吸光度，以反应PTKs的活性。
[0054] 1）大鼠脑组织中PTK的提取；
[0055] 2）酶标板包被；
[0056] 3）PTK抑制剂筛选：先将化合物和PTK粗提物加入酶标板，37℃孵育；加入激酶缓冲液稀释的ATP，37℃孵育；移除板中反应液，洗涤；加入抗体复合物，37℃孵育；移除板中抗体复合物，洗涤；加入TMB显色液室温避光反应；加入终止液，于450nm测OD值。
[0057] 抑制率%=(OD正常-OD样品)/(OD正常-OD空白)*100%
[0058] 表1褐孔菌内酯对在蛋白酪氨酸激酶抑制剂筛选模型实验结果
[0059]
[0060] 在蛋白酪氨酸激酶抑制剂筛选模型实验中，本发明化合物在10μg/ml剂量时对蛋白酪氨酸激酶有较好的抑制作用。抑制率达到73.59%，其IC50值为4.989μg/ml。
[0061] 实验例2褐孔菌内酯（Phaeoporlactone）对体外Bel-7402人肝癌肿瘤细胞生长抑制实验
[0062] 四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的formazon，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率，通过计算即能获得肿瘤细胞生长抑制率。
[0063] 选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，胰酶消化后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，接种在96孔培养板中，每孔4000个细胞，37℃，5%CO2培养24h。实验组加入不同浓度的样品和阳性对照药5-Fu，对照组则换含等体积溶剂的培养液，37℃，5%CO2培养3d。弃去上清液，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入100μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀后，在酶标仪上测定波长570nm处的光密度值。肿瘤细胞生长抑制率(%)=(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)*100%[0064] 表2褐孔菌内酯对体外Bel-7402人肝癌肿瘤细胞生长抑制实验结果
[0065]
[0066] 在对体外Bel-7402人肝癌肿瘤细胞生长抑制实验中，阳性对照药选用的是5-氟尿嘧啶（5-Fu），本发明化合物在5μg/ml浓度时与阳性对照药IC50值相当。
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